CN115948430A - 梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具有公开了一种梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用。本发明梨醛脱氢酶基因PusALDH1的核苷酸序列选自如下a）、b）或c)：a）其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；b)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；c)在严格条件下与a）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。将本发明所述的基因PusALDH1瞬时转入梨果实进行功能验证，以转入空载体梨果实为对照，获得的PusALDH1基因过表达梨果实的PusALDH1基因表达量和香气含量明显升高。表明本发明所克隆的PusALDH1基因具有提高果实香气含量的功能；本发明的基因可以作为未来果实品质改良的重要候选基因，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

Description

梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用。

背景技术

梨经济价值很高，是重要的温带地区果树之一，有两千多个品种和三千多年的栽培历史，在全球50多个国家均有种植。根据地理分布，梨属植物可分为两大类群：西方梨(也叫做欧洲梨)和东方梨(也叫做亚洲梨)。西洋梨主要分布于欧洲、美洲、澳大利亚和非洲等区域。亚洲梨主要分布于中国、日本、韩国等国家。我国是亚洲梨生产中心，在我国栽培的主要梨品种可分为白梨、秋子梨、砂梨和新疆梨四大栽培种。西洋梨和亚洲梨生物学特征不同，大多数西洋梨果实的果肉偏绵软、香气浓烈，而大多数亚洲梨果实的果肉偏脆，汁水清甜，香气偏淡。

外观、糖、酸、可溶性固形物、石细胞和香气等性状是影响梨果实品质的主要因素。在梨长期驯化和育种过程中，与风味、产量和抗病性等性状相比，香气并不是人们优先考虑的因素。然而，香气对梨果实整体风味有重要影响，是提高梨感官质量和消费者接受度的重要特征之一。香气成分复杂，主要由芳香族挥发性有机化合物组成。迄今为止，已有多个梨品种的香气被报道。例如，在33个秋子梨和12个西方梨中分别检测到108和335种挥发性化合物，包括烷烃类、醛类、醇类、酯类、酮类、烯烃类和含硫化合物等。不同梨品种香气含量差异较大，而西洋梨的香气浓郁度远高于亚洲梨。我国主栽的白梨、砂梨系统大多数品种香味较淡，对我国鲜梨出口创汇造成重大影响。目前，梨果实香气研究主要围绕其代谢产物的解析进行，对梨果实香气合成的分子机制的研究很少。

南果梨属于秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim)，其色泽鲜艳、果肉细腻，风味足，香气浓，是一个古老的地方优质品种和香气机理研究的良好材料。醛脱氢酶(ALDH)超家族能够氧化各种醛。根据底物的不同，ALDH可进一步分为氨基醛脱氢酶(AMADH)、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和苯甲醛脱氢酶(BALDH)，在植物挥发性气体产生中起着不同功能。关于ALDH家族基因参与梨果实香气合成还未见任何报道。

基于我国梨果实香气偏淡和香气代谢机理研究较少，本发明通过开展关于调控梨果实香气合成的基因克隆及功能研究，研究结果为梨果实香气的分子调控网络和机制提供重要信息，有助于梨果实品质的改良，提升了我国梨产业竞争力，对提高果树经济效益具有重要的科学意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明首先保护一种梨PusALDH1基因，其选自如下a)、b)或c)：

a)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

b)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；

c)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

第二方面，本发明保护前文所述的梨PusALDH1基因编码的蛋白。

作为本申请的优选技术方案，所述梨PusALDH1基因编码的蛋白，其选自如下A)或B)：

A)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

B)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同活性的由1)衍生的蛋白。

第三方面，本发明还保护扩增前述梨PusALDH1基因全长或任一片段的引物对。

作为本申请的优选技术方案，所述引物对如SEQ ID No.3～4所示。

第四方面，本发明还保护含有前述梨PusALDH1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、基因工程菌。

优选的，所述重组表达载体通过如下方法构建：将所述的基因PusALDH1插入到pCAMBIA1301的XbaI和BamHI位点之间得到重组表达载体35S-PusALDH1-GFP。

本发明还保护前文所述的梨PusALDH1基因，和/或，前文所述的蛋白，和/或，前文所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、基因工程菌在如下(1)-(4)中的应用：

(1)在调节果实香气中的应用；

(2)在制备调节果实香气的产品中的应用；

(3)在培育座果园艺作物中的应用；

(4)在植物育种中的应用。

优选的，所述果实为番茄或梨果实。

申请人构建所述梨醛脱氢酶基因PusALDH1的植物超表达载体并转化番茄，以转入pCAMBIA1301-GFP载体的番茄植株为对照，获得的转基因番茄果实的PusALDH1基因表达量和香气含量显著升高。

申请人构建所述梨醛脱氢酶基因PusALDH1的植物超表达载体并通过注射瞬时转化梨，以转入pCAMBIA1301-GFP载体的梨为对照，获得的梨果皮PusALDH1基因表达量和香气含量显著升高。

本发明还保护一种提高果实香气含量的方法，通过将含有前文所述的基因转入目的植物即可实现。

促进所述的基因PusALDH1的表达，可促进果实香气含量提高。

本发明的有益效果

本发明提供的一种梨醛脱氢酶PusALDH1及其及其编码基因和应用，与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明提供的梨醛脱氢酶基因PusALDH1，经生物学功能验证具有促进香气合成的作用。根据实施例部分的记载，将PusALDH1基因在番茄中过表达或者在梨果实中瞬时表达，均能够显著提高果实中香气含量。

(2)本发明提供的PusALDH1基因促进果实香气合成，赋予果实特征风味，为提高园艺作物果实品质提供理论依据，为通过调节果实香气来提高消费者喜好度，进而提高经济效益奠定基础。

附图说明

图1为本发明克隆的梨PusALDH1基因的琼脂糖凝胶电泳图。其中，左侧条带为Marker；右侧为本发明克隆的梨PusALDH1基因。

图2为本发明克隆的梨PusALDH1基因编码蛋白与拟南芥At1g23800，烟草(NtALDH，CAA71003)，金鱼草(AmBALDH，FJ151199)的氨基酸序列比对结果。

图3为茉莉酸甲酯处理后‘南果梨’果实香气含量和PusALDH1基因表达量以及相关性分析(P＝0.0015)。

图4为本发明梨醛脱氢酶PusALDH1亚细胞定位图。

图5为本发明克隆的梨PusALDH1基因在番茄植株过量表达对果实香气的影响。A：转空载体番茄植株；B-D：#1、#6、#10：阳性转PusALDH1基因番茄株系。E：转PusALDH1基因番茄株系鉴定；F：香气含量。

图6为本发明克隆的梨PusALDH1基因在‘南果’梨果实过量瞬时过表达对果实香气的影响。A：基因表达量；B：香气含量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

申请人从‘南果梨’中分离克隆得到一个新基因PusALDH1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，长度为1605bp。

本发明还提供了所述的梨醛脱氢酶基因PusALDH1编码的氨基酸序列，该基因编码535个氨基酸，所述的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

利用qRT-PCR技术分析了在茉莉酸甲酯处理前后果皮PusALDH1基因的表达模式，并对PusALDH1相对表达量和香气含量进行比较分析，结果表明PusALDH1相对表达量与香气含量显著正相关，表明本发明克隆的梨PusALDH1基因是参与香气合成的候选基因。

实施例1，梨PusALDH1基因的克隆和构建植物超表达载体

1.梨PusALDH1基因的克隆

以盛花后120d的‘南果梨’果肉为试材，参照植物多糖多酚总RNA提取试剂盒的操作手册进行提取其RNA。提取完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的质量，并用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的浓度和质量。cDNA第一条链的合成参照ThermoScientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PusALDH1基因的扩增，其引物对的核苷酸序列如下所示：

F1：5’-gagaacacgggggactctagaATGGCGACTCGGAGGGTCGG-3’(SEQ ID NO.3)，

R1：5’-gcccttgctcaccatggatccTAGCCATGCAGGATTCTTCA-3’(SEQ ID NO.4)。

25μL PCR反应体系如下：12.5μL PrimeSTAR Max Premix(2×)(购自TakaRa公司)，0.3μM正向引物F1，0.3μM反向引物R1，100ng cDNA，灭菌蒸馏水补齐到25μL。PCR程序如下：98℃预变性3min；32个扩增循环，包括98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸3min，循环完成后72℃延伸10min，之后在10℃下保温。扩增完成后，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测到单一目的条带的PCR产物，按照胶回收试剂盒(购自诺唯赞，中国)使用说明提取步骤，回收特异目的条带(图1)。

2、构建梨PusALDH1基因的植物超表达载体

回收纯化的PCR产物与pCAMBIA1301-GFP载体进行连接反应，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α中，用基因特异性引物进行PCR检测，呈阳性的菌液进行测序(由金唯智公司完成)。测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1605bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因(图2)，将该基因命名为PusALDH1，得到正确的重组目的载体命名为35S-PusALDH1-GFP。应用热激法将重组载体35S-PusALDH1-GFP和对照空载35S-GFP分别转入农杆菌GV3101中。

实施例2，茉莉酸甲酯处理后梨PusALDH1基因表达量和香气的相关性分析

1、茉莉酸甲酯处理后梨PusALDH1基因的qRT-PCR分析

将新鲜采摘的成熟‘南果梨’浸泡在3mmol/L的茉莉酸甲酯溶液5分钟，清水溶液作为对照，收集处理中和对照组果皮组织样品。采用实施例1介绍的方法提取总RNA、合成cDNA。选用梨Pbr038418.1作为内参基因，引物的核苷酸序列如下：

F2：5’-GATGGTGCTATGAAGATGCCAAATG-3’(SEQ ID NO.5)，

R2：5’-TCCCGAGCATCACGATAGATTCAC-3’(SEQ ID NO.6)。

利用Primer Premier 5.0在PusALDH1基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物的核苷酸序列如下：

F3：5’-TCACCAATCTCTCCAACCGTCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)，

R3：5’-TCAGCGACATGAGCAATCACTTCC-3’(SEQ ID NO.8)。

qRT-PCR采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(购自诺唯赞公司)，按照说明书介绍严格进行。

20μL qRT-PCR反应体系包括：10μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，7.8μL灭菌超纯水，1μL cDNA，0.4μL正向引物(10μM)，0.4μL反向引物(10μM)，0.4μL 50×ROXReference Dye 1。使用36孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR仪(型号：LightCycler 480，Roche公司)进行PCR。qRT-PCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s，60℃30s，40个循环，溶解曲线为95℃15s，60℃60s，95℃15s。3次重复，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算公式2^-ΔΔCt获得PusALDH1基因的相对表达量(图5)。

2、茉莉酸甲酯处理后梨果实香气含量

茉莉酸甲酯处理‘南果梨’果实方法同本实施例2第一部分。处理组和对照组样品均采用四分法去除果皮和果核，使用压榨机匀浆后，在20ml顶空瓶中加入5ml新榨梨果实匀浆、5ml饱和NaCl溶液以及5μl内标溶液(0.82g/L 3-壬酮/甲醇混合溶液)，再置入一颗12*4.5cm磁力搅拌子，用聚四氟乙烯丁基合成橡胶隔片密封。顶空固相微萃取(HS-SPME)分离萃取挥发性成分。

萃取器材为65μm PDMS/DVB萃取头(Supelco Co.,Bellefonte,PA,USA)，使用时先提前于250℃老化30min，接着将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，在磁力搅拌器上40℃加热震荡萃取30min，然后将萃取头取出插入气质联用仪(布鲁克320GC-450MS)，250℃解吸5min检测分析。GC-MS条件如下：色谱柱为BR-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，采取不分流进样，进样口温度为250℃；升温程序如下：柱子起始温度为35℃，保持8min，以5℃/min的速率升至140℃，保持2min，再以10℃/min的速率，升至270℃，保持5min。载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，检测器温度为250℃，连接杆温度为280℃。电子轰击(EI)电离源，电子能量70eV，灯丝电流为0.25mA，电子倍增器电压为1200V，扫描范围为29～370μ，离子源温度为230℃，传输线温度为280℃。

定性方法如下：未知化合物谱图经计算机检索的同时与NIST 2013谱库相匹配，结合人工图谱解析及保留指数比对进行初步分析。定量方法如下：按峰面积归一化法求得各成分相对含量，并选择3-壬酮为内标进行定量。3-壬酮质量浓度为0.82g/L，用量为5μL。各组分的含量(μg/g)＝[各组分的峰面积÷内标的峰面积*内标质量浓度(g/L)×5μL]÷样品量(g)。最终，将获得的所有组分化合物含量相加作为香气总量。

通过整合qRT-PCR和GC-MS测定的结果发现茉莉酸甲酯处理后，梨PusALDH1基因的相对表达量与香气含量成显著的正相关(P＝0.0015，图5)，表明本发明克隆的梨PusALDH1基因是参与香气合成的候选基因。

实施例3，梨醛脱氢酶PusALDH1蛋白的亚细胞定位

取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌(含有35S-PusALDH1-GFP重组载体或者35S-GFP对照空载体)，在含有100mg·L^-1利福平和100mg·L^-1卡那霉素的固体LB培养基划线培养，28℃培养2d，挑取单菌落至1mL含有同样抗生素的液体LB培养基中，28℃、180rpm培养过夜，取500μL菌液至50mL LB液体培养基中，28℃、200～220rpm培养至OD600为0.8。收集菌液，弃上清，倒扣离心管沥干液体。加入诱导液(10mM MgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH＝5.5)，重悬菌液。室温24-26℃，避光，摇床上摇晃诱导3h以上。通过1mL注射器从本生烟草背面注射，暗处理24h后正常培养。2-3天后通过激光共聚焦显微镜观察。将35S-PusALDH1-GFP和对照空载体35S-GFP农杆菌分别注射到烟草的表皮细胞中，通过检测GFP荧光的位置来确定PusALDH1蛋白定位的定位情况。结果显示PusALDH1-GFP在烟草表皮细胞中的瞬时表达，绿色荧光与细胞膜染料FM4-64重叠，且未在细胞其他地方发现绿色荧光。表明PusALDH1是一个膜定位蛋白(图4)。

实施例4，番茄的遗传转化

1、根癌农杆菌介导的番茄遗传转化具体操作步骤如下：

(1)番茄种子的消毒灭菌：先用70％乙醇处理番茄种子30s，然后用无菌水洗涤3遍，再用2.5％次氯酸钠处理5min，最后用无菌水洗涤4遍。将种子接种至萌发培养基(1/2MS+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂粉，pH＝5.8)上，25℃培养，先在暗条件下培养3d，然后移至昼夜比为16/8h、光照强度为2000-3000lux的光周期条件下培养4-5d。

(2)番茄外植体的培养：取播种7-8d的番茄无菌苗，在超净工作台上用无菌手术刀将番茄子叶切成0.5cm²左右的小块，置于培养基(MS+30g·L^-1蔗糖+9g·L^-1琼脂粉+2.0mg·L^-1玉米素，pH＝5.8)上，正面朝上，盖一张滤纸，组培室黑暗培养1天。

(3)根癌农杆菌的培养：首先将含有重组载体35S-PusALDH1-GFP或者对照空载体35S-GFP的农杆菌进行活化，其方法同实施例3。然后挑取单菌落至1mL含有同样抗生素的液体LB培养基中，28℃、180rpm培养过夜，取800μL菌液至50mL LB液体培养基中，28℃、180rpm培养12h-16h。

(4)侵染转化：取步骤(3)培养好的根癌农杆菌，移至50mL离心管，5000rpm离心7min，然后用MS液体培养基重悬沉淀，调节OD在0.5～0.8之间，将重悬根癌农杆菌菌液转至无菌锥形瓶，将经过预培养1d的番茄外植体浸入重悬根癌农杆菌菌液中浸泡侵染8-10min，侵染期间不断振荡。用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，将其置于培养基(MS+30g·L^-1蔗糖+9g·L^-1琼脂粉+2.0mg·L^-1玉米素+100mg·L^-1乙酰丁香酮，pH＝5.8)上25℃暗培养2d。

(5)头孢霉素筛选抗性芽：将步骤(4)经暗培养2d的番茄子叶外植体，用含有400mg·L^-1头孢霉素的无菌水洗一遍，然后再用无菌水清洗3-5遍，将其继代于筛选培养基(MS+30g·L^-1蔗糖+9g·L^-1琼脂粉+2.0mg·L^-1玉米素+400mg·L^-1头孢酶素，pH＝5.8)上进行抗性筛选，组培室培养15天。之后将其继代于筛选培养基(MS+30g·L^-1蔗糖+9g·L^-1琼脂粉+0.2mg·L^-1玉米素+400mg·L^-1头孢酶素，pH＝5.8)上，且每15天更换一次培养基。

(6)生根诱导与移栽：待抗性芽伸长至1.5cm左右且有明显的节间，切取抗性芽扦插于培养基(1/2MS+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂粉+2.0mg·L^-1IBA+200mg·L-1头孢酶素，pH＝5.8)中诱导生根。从生根培养基中取出根系生长良好的番茄再生植株，用自来水将其根系冲洗干净，置于灭菌的蛭石中遮荫保湿炼苗，25℃光照培养箱中培养7-10d。抗性植株适应外部环境后，将其转移至营养土中，25℃自然光照生长。

2、阳性转PusALDH1基因番茄苗的初步鉴定

按照实施例4的方法得到番茄再生植株，利用实施例1步骤提取番茄果实RNA，反转录cDNA作为PCR模板，用引物对(F1，SEQ ID NO.3和R1，SEQ ID NO.4)进行PCR扩增鉴定阳性苗，以侵染转化pCAMBIA1301空载体的番茄果实cDNA和基因SIACTIN作为对照，引物的核苷酸序列如下：

F4：5’-GAAATAGCATAAGATGGCAGACG-3’(SEQ ID NO.9)，

R4：5’-ATACCCACCATCACACCAGTAT-3’(SEQ ID NO.10)。

对照组番茄果实DNA不能扩增出目的条带，能扩增出目的条带的再生番茄植株被初步鉴定为阳性转基因番茄株系(图5A-E)。

实施例5，过表达梨PusALDH1基因番茄果实香气含量测定

按照实施例2的方法测定PusALDH1转基因和对照组番茄果实香气含量，结果显示转基因番茄相比对照组香气含量明显增加，达到17％-54％(图5F)。

实施例6，瞬时转化梨果实香气含量测定

按照实施例3中的方法活化含有35S-PusALDH1-GFP重组载体的农杆菌，然后用灭菌的牙签挑取线上的单克隆，放入100mL锥形瓶中，加入30mL含有100mg/L卡那霉素和100mg·L^-1利福平的液体LB培养基，在28℃的摇床中200rpm培养12小时，用50mL离心管5000rpm离心5分钟收集菌体，每个离心管中加入10mL诱导液(10mM MgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH＝5.5)重悬菌体后，再次离心，分别加入侵染液用分光光度计调节菌液OD值为0.6-0.8之间，在摇床上60rpm室温诱导3个小时左右，用去掉针头的注射器将菌液注射到成熟南果梨果实中，每次实验注射7个果实，重复3次实验，放到21℃的培养箱中暗培养24小时，再放到21℃、光照强度弱、光周期为16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，培养2天。最后，切开果实，取所有果实注射部位果肉混合样品，按照实施例2的方法测定PusALDH1过表达和对照组梨果实PusALDH1基因表达水平和香气含量，结果显示过表达组相比对照组PusALDH1基因表达量和香气含量明显增加，分别提高了2.4倍和2.7倍(图6)。

由上述实施例可知，本发明提供的梨醛脱氢酶基因PusALDH1，经关联分析、亚细胞定位、番茄转基因稳定过表达以及梨果实瞬时过表达等实验验证表明具有促进果实香气积累的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨醛脱氢酶PusALDH1及其编码基因和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgactc ggagggtcgg ctcgcttttg aatcgttcct tcacttctgc ttctatgttt 60

tccaaaggga ggtcttcttc tgtggttaga ggaattggta aatatagcac cgatgcttcc 120

attgagtcac caatctctcc atccgtcaaa gtaaattata ctcagcttct aattaatgga 180

caatttgtag attctgcatc agggaaaact tttcccacat tggacccccg gactggggaa 240

gtgattgctc atgtcgctga aggcgatgct gaagatgtaa accgcgcagt ttctgctgcc 300

cgcaaggcct ttgatgaagg accgtggcct aagatgacag cttatgaaag atcacgagtc 360

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tgggataatg ggaagccatt tgaacaggct gctaaaattg aagtaccaat ggtagttcgg 480

ttttttcgtt actatgctgg atttgcggac aagattcatg gtctcacggt tccagctgat 540

ggagagtatc atgtgcaaac cttgcatgaa cctatcggtg ttgcaggtca gattatacca 600

tggaatttcc ctcttctcct gtttgcttgg aaggttgcgc ctgctttagc atgcggcaac 660

accattgttt tgaagtcctc agagcagaca ccattgtctg ctctatatgc agcaactctg 720

ttgcaagagg ccggacttcc tccaggtgtt ttgaatgtgg ttagtggttt tggtccaact 780

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gagcttggcg ggaaatcccc gttcattgta tgtgaggatg ctgatgtaga taaggctgtt 960

gagatggcac atttcgctct attctttaat cagggtcaat gctgctgctc tggttctcgt 1020

acttttgtac atgaaaaagt atatgatgag ttcttagaga aagcaaaagc ccgtgctgag 1080

agacgccttg ttggagaccc gttcaaaggg ggcattgagc aaggtcctca gatcgattcg 1140

gtccaatttg agaagatcct gaagtacata gattacggtg ttaaagctgg agctaaactg 1200

gaaaccggag gagagagggt tggcacaaag ggtttctata ttaagcccac cgtattctca 1260

gatgttcagg atgacatgtc aatagcttgc gaagagatat ttggtccggt gcagaccatc 1320

ttgaagtaca aggatctgaa tgaggtgata cgaagagcaa ataactctcg ctatggactt 1380

gctgcagggg tctttacaca aaacatagac actgcaaaca cattgactcg agcattgcgc 1440

gtcggtagtg tatttataaa ctgctactat gtctttgatg cctctattcc ttttggaggg 1500

tacaagatga gtggaatcgg aagagagaaa ggcatttccg gtctttccaa ttacttgcaa 1560

gtcaaggctg ttgtcacccc cctgaagaat cctgcatggc tatga 1605

<210> 2

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Arg Arg Val Gly Ser Leu Leu Asn Arg Ser Phe Thr Ser

1               5                   10                  15

Ala Ser Met Phe Ser Lys Gly Arg Ser Ser Ser Val Val Arg Gly Ile

            20                  25                  30

Gly Lys Tyr Ser Thr Asp Ala Ser Ile Glu Ser Pro Ile Ser Pro Ser

        35                  40                  45

Val Lys Val Asn Tyr Thr Gln Leu Leu Ile Asn Gly Gln Phe Val Asp

    50                  55                  60

Ser Ala Ser Gly Lys Thr Phe Pro Thr Leu Asp Pro Arg Thr Gly Glu

65                  70                  75                  80

Val Ile Ala His Val Ala Glu Gly Asp Ala Glu Asp Val Asn Arg Ala

                85                  90                  95

Val Ser Ala Ala Arg Lys Ala Phe Asp Glu Gly Pro Trp Pro Lys Met

            100                 105                 110

Thr Ala Tyr Glu Arg Ser Arg Val Leu Leu Arg Phe Ala Asp Leu Ile

        115                 120                 125

Glu Lys His Asn Asp Glu Ile Ala Ala Leu Glu Thr Trp Asp Asn Gly

    130                 135                 140

Lys Pro Phe Glu Gln Ala Ala Lys Ile Glu Val Pro Met Val Val Arg

145                 150                 155                 160

Phe Phe Arg Tyr Tyr Ala Gly Phe Ala Asp Lys Ile His Gly Leu Thr

                165                 170                 175

Val Pro Ala Asp Gly Glu Tyr His Val Gln Thr Leu His Glu Pro Ile

            180                 185                 190

Gly Val Ala Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Leu Phe

        195                 200                 205

Ala Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu Ala Cys Gly Asn Thr Ile Val Leu

    210                 215                 220

Lys Ser Ser Glu Gln Thr Pro Leu Ser Ala Leu Tyr Ala Ala Thr Leu

225                 230                 235                 240

Leu Gln Glu Ala Gly Leu Pro Pro Gly Val Leu Asn Val Val Ser Gly

                245                 250                 255

Phe Gly Pro Thr Val Gly Ala Ser Leu Ala Gly His Met Asp Val Asp

            260                 265                 270

Lys Phe Ala Phe Thr Gly Ser Thr Asp Thr Gly Lys Lys Ile Leu Glu

        275                 280                 285

Leu Ala Ala Lys Ser Asn Leu Lys Lys Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly

    290                 295                 300

Lys Ser Pro Phe Ile Val Cys Glu Asp Ala Asp Val Asp Lys Ala Val

305                 310                 315                 320

Glu Met Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys

                325                 330                 335

Ser Gly Ser Arg Thr Phe Val His Glu Lys Val Tyr Asp Glu Phe Leu

            340                 345                 350

Glu Lys Ala Lys Ala Arg Ala Glu Arg Arg Leu Val Gly Asp Pro Phe

        355                 360                 365

Lys Gly Gly Ile Glu Gln Gly Pro Gln Ile Asp Ser Val Gln Phe Glu

    370                 375                 380

Lys Ile Leu Lys Tyr Ile Asp Tyr Gly Val Lys Ala Gly Ala Lys Leu

385                 390                 395                 400

Glu Thr Gly Gly Glu Arg Val Gly Thr Lys Gly Phe Tyr Ile Lys Pro

                405                 410                 415

Thr Val Phe Ser Asp Val Gln Asp Asp Met Ser Ile Ala Cys Glu Glu

            420                 425                 430

Ile Phe Gly Pro Val Gln Thr Ile Leu Lys Tyr Lys Asp Leu Asn Glu

        435                 440                 445

Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Ser Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Gly Val

    450                 455                 460

Phe Thr Gln Asn Ile Asp Thr Ala Asn Thr Leu Thr Arg Ala Leu Arg

465                 470                 475                 480

Val Gly Ser Val Phe Ile Asn Cys Tyr Tyr Val Phe Asp Ala Ser Ile

                485                 490                 495

Pro Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ile Gly Arg Glu Lys Gly Ile

            500                 505                 510

Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Leu Gln Val Lys Ala Val Val Thr Pro Leu

        515                 520                 525

Lys Asn Pro Ala Trp Leu

    530

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaacacgg gggactctag aatggcgact cggagggtcg g 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccttgctc accatggatc ctagccatgc aggattcttc a 41

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatggtgcta tgaagatgcc aaatg 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcccgagcat cacgatagat tcac 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaccaatct ctccaaccgt caaag 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcagcgacat gagcaatcac ttcc 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaatagcat aagatggcag acg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atacccacca tcacaccagt at 22

Claims (9)

1.梨PusALDH1基因，其选自如下a）、b）或c)：

其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；

在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的梨PusALDH1基因编码的蛋白。

3.根据权利要求2所述的梨PusALDH1基因编码的蛋白，其选自如下A)或B)：

A)如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列;

B) SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同活性的由1）衍生的蛋白。

4.扩增权利要求1所述梨PusALDH1基因全长或任一片段的引物对；优选的，所述引物对

如SEQ ID No.3~4所示。

5.含有权利要求1所述梨PusALDH1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，将所述的基因PusALDH1插入到pCAMBIA1301的XbaI和BamHI位点之间得到重组表达载体35S-PusALDH1-GFP。

7.权利要求1所述的梨PusALDH1基因，和/或，权利要求2-3任一所述的蛋白，和/或，权利要求5所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、基因工程菌在如下（1）-（4）中的应用：

（1）在调节果实香气中的应用；

（2）在制备调节果实香气的产品中的应用；

（3）在培育座果园艺作物中的应用；

（4）在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述果实为番茄或梨果实。

9.一种提高果实香气含量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因转入目的植物即可实现。

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