CN113832164A

CN113832164A - 蚕豆抗盐基因F-box及其应用

Info

Publication number: CN113832164A
Application number: CN202111273343.1A
Authority: CN
Inventors: 沙爱华; 陈银华; 郝树琳; 黄林涛; 蒋浩中; 王燕娟
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN113832164B

Abstract

本发明提供蚕豆抗盐基因F‑box及其应用。本发明首次从蚕豆中克隆到抗盐F‑box基因Vf062764.1，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸长度为1749bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括582个氨基酸。本发明实验发现蚕豆抗盐F‑box基因Vf062764.1能够显著提高拟南芥和烟草的抗盐性。本发明所述的抗盐基因将促进抗盐植物新品种(系)的培育进程。

Description

蚕豆抗盐基因F-box及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物工程技术领域，具体涉及蚕豆抗盐基因F-box及其应用。

背景技术

近年来全球气候正在不断变化，土壤盐渍化对农业生产危害严重，盐胁迫已经成为造成作物减产的主要非生物胁迫之一，预计超过50％的耕地都将遭受盐胁迫的侵害。因此，解决植物耐盐问题是实现农业可持续发展的重要挑战。

传统作物抗盐育种周期长、投入大且受抗盐种质资源狭窄等因素的制约，导致当前抗盐育种进展缓慢。在有限的土壤资源下，改良作物的品质，提高作物耐盐能力已经成为目前亟待解决的事情。随着测序技术的不断发展，转录组测序(RNA-seq)技术是目前使用最多最广泛的测序技术，可以快速地获得某一组织或细胞在特定条件下的所有转录本信息，RNA-seq可以帮助快速筛选鉴定与盐胁迫有关的基因。通过分子生物学的手段对蚕豆耐盐的分子机制进行深入研究，并找出潜在的耐盐基因，对培育耐盐品种蚕豆具有重要的作用。我们通过鉴定蚕豆的抗盐种质资源，找到了极端耐盐的蚕豆种质后，以极端抗盐和极端敏感蚕豆种质作为材料，采用RNA-seq方法分析盐胁迫条件下抗盐种质与敏感种质的基因表达差异，从中鉴定了抗盐基因Vf062764.1，并在拟南芥中通过过表达载体超量表达，证实了Vf062764.1能够提高拟南芥耐盐性，可以作为一种抗盐基因资源用于植物的抗盐育种。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供蚕豆抗盐基因F-box及其应用。

本发明的目的之一在于提供了一种蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1，以解决当前抗盐基因资源匮乏的现状。

本发明的目的之二在于提供一种蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1制备方法，实现该基因在蚕豆中快速、准确分离。

本发明目的之三在于提供蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1在提高植物抗盐性中的应用。这些植物包括烟草、拟南芥。

本发明技术方案主要包括以下内容：

分析鉴定到一种蚕豆抗盐基因Vf062764.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为1749bp。

一种由基因Vf062764.1编码的蚕豆抗盐蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由582个氨基酸组成。

蚕豆抗盐基因Vf062764.1的制备方法，包括以下步骤：

以经过质量浓度0.8％氯化钠浸泡24h后的蚕豆种子为材料，提取总RNA，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增该基因片段，回收PCR产物。

PCR扩增所使用的全长引物为(下划线序列为构建载体的接头序列)：

上游引物Vf062764.1-F1：

5’-CGACGACAAGACCGTGATGAATACTGTTAAAAAACTCAAGAG-3’

下游引物Vf062764.1-R1：

5’-GAGGAGAAGAGCCGTCTACAAAATTATGAGCTGACAGTG-3’。

蚕豆抗盐基因Vf062764.1的拟南芥过表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)取前述回收的蚕豆抗盐基因PCR产物，加入buffer、DTT、dATP和T4 DNA聚合酶I，在PCR仪上22℃～65℃处理至少20min；

(2)取载体，加入Apai酶、buffer、ddH₂O，37℃水浴锅中酶切5h；

(3)取酶切产物加入至步骤(1)的产物中，混合均匀后22℃～65℃处理至少5min，得混合物；

(4)取混合物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选重组转化子。

上述载体并不特别限定为某一类型。任何可以将外源基因导入植物的表达载体都可用于本发明。

优选的，步骤(1)，在PCR仪上22℃处理30min，75℃处理20min。

优选的，步骤(3)，混合均匀后22℃处理10min，65℃处理5min。

本发明所取得的效果：

本发明采用的是不依赖于连接反应克隆(LIC)技术，基于同源重组的基本原理，利用T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性在待插入片段以及线性载体的末端产生单链突出，通过同源序列在体外完成交换重组，从而达到基因克隆目的。这种克隆方法不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆到该载体中，流程简单。两者在体外条件下孵化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口从而得到正确重组子。LIC技术充分满足了上述要求，不仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，并且操作简便且连接效率高，已经被越来越多的研究者应用。

本发明提供的抗盐基因Vf062764.1的作用主要体现在可提高植物抗盐性，可广泛运用于抗盐植物新品种(系)的选育。

本发明首次从蚕豆中克隆到一个新的抗盐基因，进一步通过构建过表达载体在拟南芥和烟草中超量表达后进行抗盐性鉴定，结果发现超量表达Vf062764.1基因的拟南芥和烟草抗盐性优异。本发明为培育抗盐植物新品种(系)提供了珍贵的基因资源。

附图说明

图1：Vf062764.1基因cDNA编码核苷酸序列的扩增结果。M:D2000 Plus Marker。

图2：导入重组质粒PJG045-Vf062764.1质粒的农杆菌PCR鉴定。1-7均为单克隆编号，H₂O为空白对照。“M”为Marker。

图3：RT-PCR检测过表达载体超量表达Vf062764.1拟南芥植株中Vf062764.1的表达。M：DL2000 Plus marker；上图为全长引物检测，泳道1-14分别为水、质粒、WT、转基因株系1-11。M，Marker；下图为特异性引物检测，泳道1-14分别为水、质粒、WT、转基因株系1-11。M，Marker。

图4：超量表达Vf062764.1拟南芥在盐胁迫下的表型。A图为不同盐浓度下转基因拟南芥3株过表达系与空载种子萌发率比较；B图为不同盐浓度下转基因拟南芥3株过表达系与空载种子根长比较；C图为200mM氯化钠处理7d转基因株系与空载体对照苗期耐盐性表型比较。

图5：烟草在盐胁迫下的生长情况。1、2和3分别代表过表达Vf062764.1烟草植株、空载烟草植株和不注射烟草植株。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1：蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1的获得

以0.8％氯化钠胁迫处理24h蚕豆种子为材料，使用快速通用植物RNA提取试剂盒(北京华越洋)提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(美国Promega)，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为2×Taq Plus MasterMix(Dye)10ul，上游引物Vf062764.1-F1 10uM 1ul，下游引物Vf062764.1-R1 10uM 1ul，cDNA 1ul，ddH₂O 7ul，总体积20ul；扩增程序为94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃延伸2min；全长引物序列为：

Vf062764.1-F1：

5’-CGACGACAAGACCGTGATGAATACTGTTAAAAAACTCAAGAG-3’

Vf062764.1-R1：

5’-GAGGAGAAGAGCCGTCTACAAAATTATGAGCTGACAGTG-3’

由武汉天一辉远生物工程公司合成，下划线序列为构建载体的接头序列。

利用胶回收试剂盒(北京索莱宝)回收PCR产物。接着将回收产物与由pCAMBIA-1300改造而来的PJG045载体(Zhao J,Liu Q,Zhang H,Jia Q,Hong Y,Liu Y.The rubiscosmall subunit is involved in tobamovirus movement and Tm-2²-mediated extremeresistance.Plant Physiol.2013；161(1):374-383)连接，得到重组质粒PJG045-Vf062764.1，转化大肠杆菌感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性重组子，PCR测定序列如SEQ IDNO.1。

分离到Vf062764.1基因cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，序列长度为1749bp；

蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1的编码序列为上述基因中第1至第1749位所述的核苷酸序列。编码的蛋白质氨基酸序列由582个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：蚕豆抗盐F-box基因Vf062764.1过表达载体的构建

取3.9ul实施例1的Vf062764.1基因胶回收产物，加入0.5ul buffer 3(NEB公司)，0.25ul 100uM DTT(promega公司)，0.25ul 100uM dATP(Promega公司)，0.1ul T4 DNApolemerase I(NEB公司)，在PCR仪上22℃处理30min；75℃处理20min。

取30ul PJG045载体，加入5ul Apai酶(大连宝生物工程有限公司)，10ul 10×Tbuffer，55ul ddH₂O，37℃水浴锅中酶切5h。

取5ul PJG045酶切产物加入上述用T4 DNA polemerase I处理的Vf062764.1基因产物中，混合均匀后22℃处理10min，65℃处理5min。

从上述处理过的载体和Vf062764.1基因混合物中取5ul转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

用菌落PCR方法筛选重组转化子。PCR反应体系为dNTP Mixture 2.5mM 1.6ul，10×Ex Taq Buffer Mg²⁺Plus 2.0ul，上游引物Vf062764.1-F1 10uM 0.5ul，下游引物Vf062764.1-R1 10uM 0.5ul，Ex Taq酶5U/ul 0.2ul，ddH₂O 15.2ul，总体积20ul。用灭菌牙签蘸取少量重组转化子后加入PCR反应液中。扩增程序为94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共28个循环，72℃延伸2min。

鉴定到的阳性重组子在LB培养基中，37℃摇床，150rpm过夜，取200ul送到武汉天一辉远生物工程公司测序，确定为编码正确的重组转化子。

注：转化烟草所用载体为PVX-LIC载体(Zhao J,Liu Q,Hu P,Jia Q,Liu N,Yin K,Cheng Y,Yan F,Chen J,Liu Y.An efficient Potato virus X-based microRNAsilencing in Nicotiana benthamiana.Sci Rep.2016Feb 3；6:20573.doi:10.1038/srep20573.PMID:26837708；PMCID:PMC4738334)，处理载体的酶为SmaI酶，全长引物为Vf062764.1-F2(5’-CGACGACAAGACCCTATGAATACTGTTAAAAAACTCAAGAG-3’)和Vf062764.1-R2(5’-GAGGAGAAGAGCCCTCTACAAAATTATGAGCTGACAGTG-3’)，其余实验步骤参照上述拟南芥载体构建部分。

实施例3农杆菌拟南芥转化与培养

制备GV3101农杆菌并活化，将重组质粒PJG045-Vf062764.1转入感受态农杆菌中，制备农杆菌浸染液。拟南芥哥伦比亚野生型Col-0种子播种于培养基质(营养土：蛭石为1:2体积比混合)中，在人工温室中培养，在拟南芥初果期未开花时采用蘸花法将拟南芥未开花角果浸泡在侵染液中20-30s，然后将侵染的植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中常规培养，直至成熟后收获种子并使用潮霉素进行转基因阳性苗筛选至T3代纯合后进行后续试验。转基因阳性苗的鉴定分别使用基因全长引物Vf062764.1-F1、Vf062764.1-R1和特异性引物Vf062764.1-F3(5’-GGCTTCTCCGCACCTCAAAA-3’)、Vf062764.1-R3(5’-TATTCCATCTTCCAGCGCCT-3’)扩增，检测Vf062764.1在拟南芥中的表达。

实施例4过表达PJG045-Vf062764.1拟南芥抗盐性鉴定

将实施例3中过表达PJG045-Vf062764.1拟南芥、空载体对照的T3代种子进行萌发率、根长和苗期耐盐性的表型鉴定，萌发7d后观察到转基因拟南芥和空载体对照相比种子萌发数量较多；观察10d后的根长表型发现转基因拟南芥较空载体对照根的长度显著增加；苗期耐盐性表型鉴定结果显示转基因拟南芥较空载体对照相比叶片多绿，长势较好。由此，Vf062764.1基因能够显著提高拟南芥的抗盐性，该基因可用于植物抗盐育种。

实施例5烟草叶片注射与培养

制备GV3101农杆菌并活化，将重组质粒PVX-LIC--Vf062764.1转入感受态农杆菌中，制备农杆菌悬菌液，悬菌液中培养液与菌体体积比为1:1。当烟草长到4-5叶时，开始对最顶端完全展开的新叶进行注射。用一次性注射器分别吸取1mL悬菌液，将注射器针头去掉，用手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中，每棵烟草注射3片叶子。注射过的烟草植株置于生长室内，25℃，14h光照/10h黑暗的光周期下培养1周。

实施例6过表达PVX-LIC-Vf062764.1烟草抗盐性鉴定

对烟草植株分别进行过表达Vf062764.1注射、空载体注射和不注射。将注射1周后的烟草进行200mM NaCl的盐胁迫处理，每个小钵子每天注入50mL NaCl溶液，1周后观察表型并记录试验结果。结果显示在高盐胁迫下，过表达Vf062764.1基因植株与空载植株和不注射植株相比，植株长势较好，叶片萎蔫程度低，根系发达，表现出更高的抗盐能力，推测Vf062764.1基因可能在盐胁迫过程中发挥关键性作用，可用于植物或作物抗盐育种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，但并不构成对本发明的限定，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 蚕豆抗盐基因F-box及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1749

<212> DNA

<213> Vicia faba L

<400> 1

atgaatactg ttaaaaaact caagagtgag tcaactgagt tgcctgattg tgttatatcg 60

catatctttt ccatgttaag tttgaagaat ttggtgaaaa ctagtgcttt gtccaaacaa 120

tggtatcacg aatggggatt taggaaagat ctcatctttg atctccagaa cttgtttgac 180

tttaatacaa ttccagactt accaataacc cttccactct ttcaacgctt tcaatgtcaa 240

tttgccacaa gattggatta cttcatgcag aaatatcctg gtgtcatcat ccgttcaatc 300

cgagtcaatt ttccattagg tgccgatcat acttatgcca ttgatagatt gattcgcaaa 360

ggacttctta agggtgctaa tcgtattgag ctcctcttcg caaatgaaac tgattttcaa 420

ataaaccaat tcagatttgt atttcctttc ttgtttggct ccaattctct cacatatcta 480

cacctacaga actgctgtat agaagcaact atggactttt ctgggttgaa gaatttgaga 540

acacttgtgt tgcatcaagt tcctgtgaag caaaatatcc ttcaggatct gtgtcttaac 600

tgcatccatc ttgagaactt cactcttaat gaatgtacgt tcatatccga cttaagaata 660

actagttcaa tgttgcttca tttgaacatt aactgcggac gtataattac aaacaggaat 720

attgatatca ttgcaccaaa actcttatcc attgaatatt cttcggactg tttctatcac 780

ctacgcatag tgaacattaa ggctcatatg ttatccaagt ttagctatag atctattaac 840

atttttaata ttgtcgattt ttctggactg aaaaatgtga caacaattgt gtttgatgga 900

atccgtgaat gtctccaatg tcatgtcata tctcatttgt tttctaaatg tctccaactt 960

gaagatgtca cctttaagga gtgcaacatc aagtgtgata tgaaaattat cggtgcaaag 1020

ttgtgtcgtt tgagaataat tgattgtccc tataagaatc attgttctta taagatagat 1080

atcgatgctt tgaacctctc atcctttgaa tatatgggtc acactttcat gaggcctata 1140

atctctctca aggctccaaa gttatcgaag gttttttggg atgtaggtcc aagaatggaa 1200

gatatatata actttgatac aattgcaaga ttacatctac ttcaggattt aactatgaat 1260

atgggcagtc ctcagatatc cgagttaagg aaggatttgg ttcgatttca acatcttaca 1320

caattgaaat tgtttattgt gggagcatat aagcctgata tggactactt ttggatttta 1380

gatattgcaa tggcttctcc gcacctcaaa acactttttg taactattca aaatgaacat 1440

acagaaatct ctcatatggt tgaatctcaa aggcaaagaa gagagtatgt gaggtttatt 1500

cacaatggtt taaaatatgt ggagttacat ggctgtgttt gctccataga tgtaattgag 1560

ttagctagtc atctattgag gagtgcaact ttgcttaaac aaattacttt gagttcttgt 1620

cacaattact atataggcgc tggaagatgg aatatggatt cccatggttg ttgttggttt 1680

gaacggaatg ttattcatga gcatctaaaa gatgaagtaa atgaacactg tcagctcata 1740

attttgtag 1749

<210> 2

<211> 582

<212> PRT

<213> Vicia faba L

<400> 2

Met Asn Thr Val Lys Lys Leu Lys Ser Glu Ser Thr Glu Leu Pro Asp

1 5 10 15

Cys Val Ile Ser His Ile Phe Ser Met Leu Ser Leu Lys Asn Leu Val

20 25 30

Lys Thr Ser Ala Leu Ser Lys Gln Trp Tyr His Glu Trp Gly Phe Arg

35 40 45

Lys Asp Leu Ile Phe Asp Leu Gln Asn Leu Phe Asp Phe Asn Thr Ile

50 55 60

Pro Asp Leu Pro Ile Thr Leu Pro Leu Phe Gln Arg Phe Gln Cys Gln

65 70 75 80

Phe Ala Thr Arg Leu Asp Tyr Phe Met Gln Lys Tyr Pro Gly Val Ile

85 90 95

Ile Arg Ser Ile Arg Val Asn Phe Pro Leu Gly Ala Asp His Thr Tyr

100 105 110

Ala Ile Asp Arg Leu Ile Arg Lys Gly Leu Leu Lys Gly Ala Asn Arg

115 120 125

Ile Glu Leu Leu Phe Ala Asn Glu Thr Asp Phe Gln Ile Asn Gln Phe

130 135 140

Arg Phe Val Phe Pro Phe Leu Phe Gly Ser Asn Ser Leu Thr Tyr Leu

145 150 155 160

His Leu Gln Asn Cys Cys Ile Glu Ala Thr Met Asp Phe Ser Gly Leu

165 170 175

Lys Asn Leu Arg Thr Leu Val Leu His Gln Val Pro Val Lys Gln Asn

180 185 190

Ile Leu Gln Asp Leu Cys Leu Asn Cys Ile His Leu Glu Asn Phe Thr

195 200 205

Leu Asn Glu Cys Thr Phe Ile Ser Asp Leu Arg Ile Thr Ser Ser Met

210 215 220

Leu Leu His Leu Asn Ile Asn Cys Gly Arg Ile Ile Thr Asn Arg Asn

225 230 235 240

Ile Asp Ile Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ser Ile Glu Tyr Ser Ser Asp

245 250 255

Cys Phe Tyr His Leu Arg Ile Val Asn Ile Lys Ala His Met Leu Ser

260 265 270

Lys Phe Ser Tyr Arg Ser Ile Asn Ile Phe Asn Ile Val Asp Phe Ser

275 280 285

Gly Leu Lys Asn Val Thr Thr Ile Val Phe Asp Gly Ile Arg Glu Cys

290 295 300

Leu Gln Cys His Val Ile Ser His Leu Phe Ser Lys Cys Leu Gln Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Thr Phe Lys Glu Cys Asn Ile Lys Cys Asp Met Lys Ile

325 330 335

Ile Gly Ala Lys Leu Cys Arg Leu Arg Ile Ile Asp Cys Pro Tyr Lys

340 345 350

Asn His Cys Ser Tyr Lys Ile Asp Ile Asp Ala Leu Asn Leu Ser Ser

355 360 365

Phe Glu Tyr Met Gly His Thr Phe Met Arg Pro Ile Ile Ser Leu Lys

370 375 380

Ala Pro Lys Leu Ser Lys Val Phe Trp Asp Val Gly Pro Arg Met Glu

385 390 395 400

Asp Ile Tyr Asn Phe Asp Thr Ile Ala Arg Leu His Leu Leu Gln Asp

405 410 415

Leu Thr Met Asn Met Gly Ser Pro Gln Ile Ser Glu Leu Arg Lys Asp

420 425 430

Leu Val Arg Phe Gln His Leu Thr Gln Leu Lys Leu Phe Ile Val Gly

435 440 445

Ala Tyr Lys Pro Asp Met Asp Tyr Phe Trp Ile Leu Asp Ile Ala Met

450 455 460

Ala Ser Pro His Leu Lys Thr Leu Phe Val Thr Ile Gln Asn Glu His

465 470 475 480

Thr Glu Ile Ser His Met Val Glu Ser Gln Arg Gln Arg Arg Glu Tyr

485 490 495

Val Arg Phe Ile His Asn Gly Leu Lys Tyr Val Glu Leu His Gly Cys

500 505 510

Val Cys Ser Ile Asp Val Ile Glu Leu Ala Ser His Leu Leu Arg Ser

515 520 525

Ala Thr Leu Leu Lys Gln Ile Thr Leu Ser Ser Cys His Asn Tyr Tyr

530 535 540

Ile Gly Ala Gly Arg Trp Asn Met Asp Ser His Gly Cys Cys Trp Phe

545 550 555 560

Glu Arg Asn Val Ile His Glu His Leu Lys Asp Glu Val Asn Glu His

565 570 575

Cys Gln Leu Ile Ile Leu

580

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacgacaag accgtgatga atactgttaa aaaactcaag ag 42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggagaaga gccgtctaca aaattatgag ctgacagtg 39

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgacgacaag accctatgaa tactgttaaa aaactcaaga g 41

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggagaaga gccctctaca aaattatgag ctgacagtg 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcttctccg cacctcaaaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tattccatct tccagcgcct 20

Claims

1.蚕豆抗盐基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.蚕豆抗盐蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述蚕豆抗盐基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增所使用的引物为：

上游引物：5’-CGACGACAAGACCGTGATGAATACTGTTAAAAAACTCAAGAG-3’

下游引物5’-GAGGAGAAGAGCCGTCTACAAAATTATGAGCTGACAGTG-3’。

5.权利要求1所述蚕豆抗盐基因的拟南芥过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取蚕豆抗盐基因PCR产物，加入buffer、DTT、dATP和T4 DNA聚合酶I，在PCR仪上22℃～65℃处理至少20min；

(2)取载体，加入Apai酶、buffer、ddH₂O，37℃水浴锅中酶切5h；

(4)取混合物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选重组转化子。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)，在PCR仪上22℃处理30min，75℃处理20min。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)，混合均匀后22℃处理10min，65℃处理5min。

8.权利要求1所述蚕豆抗盐基因或权利要求2所述蚕豆抗盐蛋白在提高植物抗盐性方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或拟南芥。