CN102533811A

CN102533811A - 枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力

Info

Publication number: CN102533811A
Application number: CN2010105960447A
Authority: CN
Inventors: 刘继红; 黄小三
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳中分离、克隆得到枳(Poncirustrifoliata)MAPK基因(PtrMAPK)。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；它包含1128bp的开放阅读框，编码375个氨基酸，等电点为5.51，预测的分子量为43kD。将本发明所述的基因PtrMAPK导入到烟草进行功能验证，获得的转基因烟草植株抗旱能力明显提高。本发明为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力

技术领域

本专利属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到促分裂蛋白激酶基因PtrMAPK，然后将该基因导入到模式植物烟草中进行功能验证，获得的转基因植株抗干旱能力明显提高。

背景技术

植物在生长发育过程中经常受到外界不良环境的影响，其中干旱已被证明是最具破坏力一种非生物逆境，严重影响植物的生长、发育及产量。然而，植物受到不利的外部环境刺激时，并不是被动地接受。事实上，植物在漫长的演变过程中，已经建立了一套应答逆境胁迫的机制，涉及到植物对逆境信号的感受、逆境信号的传递，以及相应受体对逆境信号的识别与转导等三个阶段，此过程受一个错综复杂的信号通路调控。现在大家普遍认为蛋白质磷酸化在植物调控信号传导中应对非生物逆境起着非常重要的作用，它是植物体内一种普遍存在的适应外界环境变化的调节机制，尽管一些家族的蛋白也参与蛋白的磷酸化，但促分裂原蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)在植物将细胞外的刺激转到细胞内这一转导过程中起着很重要的作用。

MAPKs是一类丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，MAPK级联途径有三类激酶组成并通过依次磷酸化将逆境信号传递下去，即MAPKKKKs→MAPKKs→MAPKs。植物体受到外界不良环境胁迫，并将其转化为信号刺激并传递给其胞内受体，然后通过MAPK级联途径将信号放大并传递下去(Zhang et al.，2006；Nadarajah and Sidek，2010)，进而激活植物体内一些抗逆基因的表达，使植物主动适应环境以生存下去。MAPKs级联途径的最上游激酶MAPKKKs可以接受不同信号刺激，引起下游相应基因MAPKKs的表达，进而使MAPKs磷酸化激活，被激活的MAPKs根据需要有不同的去处，它转移到细胞内或细胞核，在那里它磷酸化下游的蛋白质启动细胞的响应(Pedley and Martin，2005；Fiil et al.，2009；Nadarajah and Sidek，2010)。在这个意义上说，蛋白激酶MAPK是级联的最后一个元件，是信号转导从上游到靶基因的一个主要通道。

目前已经从高等植物中分离出数量众多的蛋白激酶，仅在拟南芥基因组序列测定过程中就发现了20种MAPKs、10种MAPKKs、60种MAPKKKs，MAPKs的家族至少可以分为A、B、C、D 4类：研究发现A类MAPKs主要响应环境以及与激素有关的一些事件。对B类MAPKs的研究相对A类要少一些，但研究发现B类MAPKs也参与了由环境胁迫引起的细胞内信号传导，以及细胞分裂过程中的一些事件。自从植物第一个编码MAPK的基因上世纪90年代首先被克隆出来，到现在为止MAPK已从几种植物中分离得到(

et al.，2010；Nadarajah and Sidek，2010)。此外，一些MAPK已经被证明参与干旱的信号传导，如拟南芥中AtMPK4和AtMPK6(Ichimura et al.，2000；Nadarajah and Sidek，2010)，水稻中的OsMAPK5和OsMAPK6(Xiong and Yang，2003；Rolila and Yang，2007)。揭开这些信号因素为抗旱的基因工程提供一个可行的方法，因为在其他地方已被证明(Umezawa et al.，2006)。

必须指出的是，虽然MAPK已经从不同的植物当中被克隆，但大部分蛋白激酶在干旱胁迫中的功能仍有待进一步的验证。另一方面，值得注意的是：有关MAPK的大部份信息来源于拟南芥、水稻、烟草、番茄，但有关果树MAPK解却很有限。研究表明：尽管MAPK信号通路在真核生物进化有一定的保守性，但这种级联的组成和具体组成部分的功能却存在一定的不同(Morris，2001；

et al.，2010).枳对柑橘产业中应用广泛的一种砧木，但是它很容易受到干旱，这就造成其在那些的水资源有限，周期性发生干旱地区的使用。虽然有较多的研究表明MAPK基因已经在一些植物中克隆，但在枳中尚未见该基因克隆及功能验证的报道，更未见应用枳MAPK基因转化植物提高抗旱的文献报道。

发明内容

本发明目的在于从枳(Poncirus trifoliata)中分离克隆出MAPK类促分裂蛋白激酶，申请人将这个蛋白激酶命名为PtrMAPK，并且通过农杆菌介导遗传转化方法鉴定它的抗旱功能，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

本发明是这样实现的：

申请人基于植物基因克隆技术从枳(Poncirus trifoliata)中克隆得到一个新基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在SEQ ID NO：1所述序列的73-1200bp处为该基因的编码区；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，它包含1128bp的开放阅读框，编码375个氨基酸，等电点为5.51，预测的分子量为43kD。

申请人设计了克隆上述的基因PtrMAPK的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：正向引物：5’-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3’(对应SEQ ID NO：3)；反向引物：5’-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3’(对应SEQ ID NO：4)。

利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的基因PtrMAPK转化模式植物(烟草)，使该基因在烟草中超表达，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrMAPK基因具有调控烟草抗旱性的功能。

在本发明的实施例部分，我们阐述了枳PtrMAPK促分裂蛋白激酶的分离、功能验证和应用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK的核苷酸序列，其中73-1200bp处为该基因的编码区。

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK的编码的氨基酸序列，它包含1128bp的开放阅读框，编码375个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是克隆枳基因PtrMAPK的引物对的核苷酸序列。

图1是本发明的技术流程图。

图2：是本发明的PtrMAPK基因在脱水、盐和低温胁迫下的表达。其中：图2A是本发明的基因在枳田间苗(未转基因)室温下脱水不同时间点的表达模式；图2B是枳的田间苗(未转基因)在4度处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明的基因相对表达量；图2C是枳的田间苗(未转基因)在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量。

图3：是本发明的PtrMAPK基因亚细胞定位。图中：图3A，GFP基因(对照)在明场(图左)、紫外线(UV)光(中)下的成像，右图为二者叠加后的成像；图3B，PtrMAPK基因在明场(左)、UV光(中)下的成像，右图为二者叠加后的成像。

图4：是本发明的其中一个实施例的超表达载体图。

图5：是本发明的一个实施例亚细胞定位用的载体图。

图6：是PtrMAPK转烟草后，选取两个转基因系(OE2和OE19)用RT-PCR分析外源基因PtrMAPK的超表达。

图7：是本发明中实施例转PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)生长30天后室温脱水90分钟后失水率(图7A)、植株表型(图7B)和电导率(图7C)。

图8：是本发明中实施PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)生长60天后干旱21天后的表型(图8A)、电导率(图8B)和叶绿素含量(图8C)

图9：是本发明中实施例PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)生长30天后干旱20天后复水3天成活率及表型。其中图9A是转PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)干旱20天后复水3天的成活率统计，图9B是PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)干旱处理前的图片，图9C是OE2和OE19及非转基因植株(WT)干旱20后复水3天的图片。

图10：是本发明中实施例转PtrMAPK基因株系OE2和OE19及非转基因植株(WT)生长30天后室温脱水90分钟后或移栽土壤中生长60天控水21天的活性氧染色结果。图10A脱水90分钟的DAB和NBT染色。图8B为控水21天后的NBT和DAB染色。

图11：是本发明中实施例转PtrMAPK基因烟草OE2和OE19和非转基因植株(WT)控水前及控水7天后SOD(图11A)、CAT(图11B)和POD(图11C)三种酶活性测定。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1，PtrMAPK基因分离克隆及表达分析

以MAPK为关键词搜索柑桔EST数据库(HarvEST：Citrus ver.0.51)，得到7个相近序列，这些由DNAstar(公用软件)组成一个unigene，通过序列分析软件(ORF Finder)发现基因MAPK缺少5端编码序列，利用5‘RACE试剂盒(Clontech，PaloAlto，CA，USA)扩增出一个完整的ORF 序列，该序列用Primer Premier 5.0设计引物GSP1(GSP，5’-CCACACATCTATTGCAGCAGTGTAGTCAG-3’)，用RT-PCR方法扩出5端序列。将扩增的5端序列及已有的MAPK一个unigene利用软件DNAstar重叠成一条序列。25℃脱水下从枳叶片抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PtrMAPK基因全长。RNA抽提使用Trizol试剂盒(购自TakaRa，Code：D9108A，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)，利用抽提的1μg总RNA样品经1U的DNaseI(购自Fermentas公司)室温处理30分钟后，加入1μl EDTA(25mM)，于65℃温育10分钟。第一链cDNA的合成用MBI反转录试剂盒(货号：K1621，购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作)。扩增基因PtrMAPK引物对为：正向引物：PtrMAPK Forward，5’-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3’(对应SEQ ID NO：2)；反向引物：PtrMAPK Reverse，5’-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3’(对应SEQ ID NO：3)。25μl的反应体系中包括100ng cDNA，1×缓冲液，2.5mM MgCl₂，0.25mM dNTP，0.5U Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶购自Fermentas公司，Lithuania)，0.5μM上述引物。PCR反应在ABI9700(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：94℃，5分钟，94℃变性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸90秒，35个循环；循环完成后72℃延伸15分钟。产生一条单一PCR条带产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用E.Z.N.A

DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司)进行连接反应，按说明书操作，连接反应体系中插入PtrMAPK基因与pMD18-T载体的摩尔比为3∶1连接反应总体积是10μl，其中包括5μl的2×缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4.5μl纯化的PCR产物，0.5μl T载体。16℃过夜连接。取10μl连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由上海联合基因公司完成)，测序结果表明，本发明克隆PtrMAPK基因全长为1339bp(见SEQ ID NO：1所示)，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，将这个基因命名为PtrMAPK，它包括1128bp的编码阅读框，编码375个氨基酸，等电点为5.51，预测的分子量为43kD。BLASTX分析该序列与已知的(所有已发表的文献和数据库)的植物序列高度同源。推导的PtrMAPK基因的氨基酸序列与报道的杨树(PtMAPK，XP_002314017)、烟草(NtMAPK，BAB79636)、黄瓜(CsMAPK，AAZ57337)的序列高度同源。多序列比对结果显示PtrMAPK基因包括11个保守的蛋白激酶亚区，在其VII和VIII亚区之间也存在一个催化区域，其中保守的TxY基序在此起关键作用。Motifscan预测氨基酸PtrMAPK有四个磷酸化位点，一个蛋白激酶ATP结合区(Protein kinases ATP-binding region signature)。

为分析PtrMAPK基因是否对脱水、盐和低温处理响应，采用实时定量PCR分析该基因在上述处理下的表达。结果表明，虽然盐胁迫处理下该基因表达量变化不大(见图2A)，但脱水处理(见图2A)和低温(见图2C)均能诱导该基因表达，表明它是一个逆境应答候选基因。

实施例2，PtrMAPK基因亚细胞定位

本实施例利用洋葱表皮研究PtrMAPK基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PtrMAPK基因整个ORF，并在其扩增引物两端加上NcoI和SpeI两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD18-T载体上，从而得到一个PMD18-T_N/S-PtrMAPK重组载体。同时用NcoI和SpeI去切PMD18-T_N/S-PtrMAPK和pCAMBIA1302(见图3)，回收产物并连接，从而构建了一个重组载体，从而得到pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重组载体。在确认序列无误后，将pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重组载体及对照载体(pCAMBIA1302)用热击法(参照：萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)分别转入农杆菌EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行：(1).划平板，挑单克隆(含有重组质粒的农杆菌)于3ml YEB培养基(含卡那霉素(Km)40μg/ml，利福平(Rif)25mg/L)，28℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀约0.6。2.用手术刀将洋葱内表皮划成1cm²大小，撕下置于报道的MS基本培养基(含3％蔗糖，0.75％琼脂，不含激素)上暗培养24小时。3.按体积比为1∶1000比例，接种50μl农杆菌菌液于50ml YEB(含Km 40μg/ml，Rif25μg/ml)中，28℃振荡培养12-24小时。4.4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。5.加入50mlYEB培养基(含有10mM MgCl₂)。将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。6.吸干表面菌液，置于MS基本培养基(含3％蔗糖，0.75％琼脂，不含激素)上上28℃培养两天。用Olympus BX61型显微镜观察报告基因定位情况。亚细胞定位结果表明：含对照载体的农杆菌转化的洋葱表皮细胞中GFP荧光充满整个细胞(附图4A)，而含PtrMAPK基因载体的农杆菌浸染的洋葱表皮中GFP荧光只在细胞核中(附图4B)，证明PtrMAPK是核定位基因。

实施例3，植物转化载体构建

根据pMV载体(切除GUS基因的植物二元转化载体pBI121中，由华中农业大学园艺林学学院叶志彪教授惠赠)的多克隆位点和PtrMAPK基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer Premier 5.0软件设计出扩增PtrMAPK基因整个编码区的上、下游PCR引物(该引物对就是扩增本发明PtrMAPK基因cDNA序列的引物对)。其序列如下所示：

Forward primer：5’-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3’

Reverse primer：5’-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3’

以PtrMAPK基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为60℃。PCR反应体系及扩增程序同实施例1。双酶切体系：反应总体积为40μl，其中含有PCR的纯化产物8μl，10×T缓冲液(购TakaRa自公司)6μl及0.1％BSA 4μl，Kpn I及Sal1各2μl，双蒸水18μl。在37℃酶切过夜后纯化回收。pMV载体的双酶切体系：反应总体积为40μl，其中含有经过质粒提取获得的pMV载体DNA 8μl，10×M缓冲液(购自TakaRa公司)4μl，Kpn I及Xho I各2μl，加双蒸水24μl。于37℃酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入PtrMAPK基因与载体pMV的摩尔比为3∶1，反应总体积为10μl，其中含有10×Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，PtrMAPK基因的双酶切回收产物6μl，pMV载体的双酶切回收产物2μl。在16℃反应14-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pMV-PtrMAPK重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PtrMAPK导入到农杆菌EHA105中。真核表达载体pMV-PtrMAPK构建流程见图5所示。

实施例4，烟草的遗传转化

应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PtrMAPK导入到根癌农杆菌EHA105中，根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

1.根癌农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28℃180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.3～0.8时作浸染。

2.浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5cm×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8～10分钟，期间不断振荡。

3.共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25℃暗培养3天。

4.筛选培养：经共培养3天后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗3～5次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的筛选培养基中。

5.生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。

6.烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。

烟草转化苗所用培养基见表1。

表1 烟草转化苗所用培养基配方

注：表1中培养基中激素和抗生素成分的定义：6-BA-6-苄基氨基嘌呤；NAA-萘乙酸；Cef-头孢霉素；Km-卡那霉素。

7.阳性转基因烟草初步确定

按照实施例4的方法得到转PtrMAPK基因的烟草抗性芽，按如下步骤提取烟草叶片总DNA：1、烟草叶片DNA提取

取适量的转基因烟草的叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700μl 65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB，配方：100mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(pH 8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)CTAB，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4％(体积)巯基乙醇，混匀)，65℃温浴60-90分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒混匀；10000g，离心10分钟；取上清，加600μl氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000g，离心15分钟；取上清450μl，加入900μl预冷无水乙醇，420μl 5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000g，离心10分钟；弃上清后，用1ml 75％的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。

阳性植株鉴定步骤如下：设计引物NPTII和基因特异引物进行PCR扩增鉴定阳性苗。鉴定为可能的阳性植株移栽后独立收获种子(T1代种子)，4℃春化处理3天，取0.1g在1.5ml的离心管中，先用70％酒精浸泡种子20秒，接着用灭菌双蒸水洗一次，再加入1ml 2.5％NaCl0表面消毒7分钟，充分振荡，弃去NaCl0后用灭菌双蒸水洗3次，最后用接种针将灭好的种子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培养基的上，结果表明本发明获得的抗性苗在抗性平板上能正常生长，为绿色，而非抗性苗则黄化死去。成活的植株移栽再收获T1代种子，T2代种子用于播种及抗性分析。

实施例5，烟草转化植株的分子及生理鉴定

1、烟草叶片DNA提取

取适量烟草转化植株的叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700μl 65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB，配方：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5MNaCl，50mM EDTA(pH 8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)CTAB，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4％(体积)巯基乙醇，混匀)，65℃温浴60-90分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒混匀；10000g，离心10分钟；取上清，加600μl氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000g，离心15分钟；取上清450μl，加入900μl预冷无水乙醇，420μl 5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000g，离心10分钟；弃上清后，用1ml75％的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。

2、阳性转基因植株PCR检测

采用引物NPTII和基因特异引物进行PCR扩增。引物序列、反应程序及体系分别见表2、表3和表4。采用特异引物进行PCR鉴定。

表2 引物序列信息

表3 PCR反应程序

表4 PCR反应体系

3、转基因植株的超表达分析

对PCR鉴定呈阳性的2个T2代株系(OE2和OE19)采用半定量RT-PCR进行超表达分析，转基因株系叶片RNA提取、cDNA合成方法同实施例1，所用引物为基因特异引物(正向引物5’-CGTTTGCTCGGTGTTGAATA-3’；反向引物5’-CTCTTCGTAACGGTGGAGGA-3’)，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，30个循环；循环完成后72℃延伸10分钟。用Tubulin做内对照，引物序列为：正向引物5′-TACATAAACGTCACTCTCGATCAC-3′；反向引物5′-TCCAGGACAAGGAGGGTAT-3′。表达分析结果表明，2个转基因株系中的PtrMAPK基因表达均比未转化植株高(见图6)，选取这两个转基因株系做进一步研究。

实施例6，转基因植株的抗性评价

将同批收的烟草未转化植株(WT)和转PtrMAPK超表达纯系(OE2、OE19)种子灭菌处理后播于常用的MS基本培养基，取每个系30天大的幼苗置于培养皿上自然脱水90分钟，每10分钟测定鲜重，以脱水前的材料(刚开培养皿盖时)为对照，计算失水率；并测定最后一个时间点(脱水90分钟)的电导率。结果表明，在90分钟的失水过程中，#2和#19失水均较WT慢(图7A)，从表型上看，2个转基因株系的叶片失水程度明显比未转化植株低(图7B)，失水90分钟后OE2和OE19电导率较WT低(图7C)。

将WT、OE2和OE19盆栽苗生长60天后，先正常浇水，然后开始控水进行干旱胁迫。结果表明：控水第20天时，OE2和OE19下部叶片部分萎蔫，而WT此时开始死亡(图8A)，干旱20后OE2和OE19株系的电导率比WT低(图8B)，而叶绿素含量则高于WT(图8C)。上述测定结果表明，转PtrMAPK基因的烟草植株抗脱水和抗旱能力比未转化植株(WT)明显增强。分析30天大小的WT、OE2和OE19盆栽苗干旱20天后复水3天的成活率表明，WT的成活率明显低于OE2和OE9(图9A)，表型比较也证明这一结果(图9B，图9C)。

实施例7，转基因植株和未转化植株脱水和干旱下活性氧积累及干旱7天后抗氧化酶活性测定

为阐明转基因植株抗旱的生理机制，对脱水和干旱后未转化植株(WT)及两个转基因株系(OE2和OE9)活性氧积累进行组织化学染色，分别采用二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑(NBT)对H₂O₂及O₂-积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)。结果表明，脱水90分钟后，转基因植株中DAB和NBT染色均明显低于WT(图10A)；同样，干旱处理20天后，转基因植株中的染色程度仍比WT轻(图10B)，表明转基因植株在脱水和干旱处理后积累的活性氧显著低于未转化植株。由于活性氧生成与体内的抗氧化酶活性有很大的关系，因此对干旱处理7天后WT和转基因株系(OE2和OE9)三种重要的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性进行分析，测定结果显示，在干旱7天后，转基因植株中三种酶活性均比未转化植株高(图11)，表明转基因植株清除活性氧能力比WT强，与它们体内活性氧积累少一致。

主要参考文献

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Claims

1.一种分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.一种分离自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：2所述。

3.一种克隆权利要求1或2所述基因PtrMAPK的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所述。

4.权利要求1或2所述的基因在植物抗旱中的应用。

5.权利要求4所述的应用，其中包括在柑橘抗旱中的应用。