CN117568392A - 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用 - Google Patents

一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117568392A
CN117568392A CN202410050370.XA CN202410050370A CN117568392A CN 117568392 A CN117568392 A CN 117568392A CN 202410050370 A CN202410050370 A CN 202410050370A CN 117568392 A CN117568392 A CN 117568392A
Authority
CN
China
Prior art keywords
zmmpk1
corn
drought stress
mutant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410050370.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张敬波
赵晗舒
郭贞慧
牟立军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202410050370.XA priority Critical patent/CN117568392A/zh
Publication of CN117568392A publication Critical patent/CN117568392A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y207/00Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用。本发明以野生型玉米ND101、zmmpk1‑1突变体和zmmpk1‑2突变体为材料,探究不同的材料在干旱条件下的表型和农艺性状,结果表明,相比玉米ND101,zmmpk1‑1突变体和zmmpk1‑2突变体在干旱胁迫条件下,叶片表面温度、相对含水量、气孔开度、成活率均降低;并且大田试验结果表明,zmmpk1‑1突变体和zmmpk1‑2突变体的株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长等农艺性状相比野生型也有显著差异,玉米ZmMPK1基因是干旱胁迫正调控因子。

Description

一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用。
背景技术
植物对干旱的适应性是其在水分稀缺的环境中生存和繁衍的能力。干旱是全球范围内普遍存在的环境压力,而植物为了在这种条件下存活,发展出了多种适应性机制。总体来说,植物对干旱的适应性是一个复杂的生态和生理过程,涉及到许多不同的适应性机制。这些机制可以单独作用或共同作用,目的是使植物在水分稀缺的环境中存活并繁衍。
玉米是三大主要作物之一,是粮食、饲料和燃料兼用作物,玉米的高产稳产对我国粮食安全和社会发展具有重要意义。玉米对盐胁迫和干旱胁迫都很敏感,耕地盐渍化和生育期的干旱胁迫是导致我国玉米减产的主要非生物逆境胁迫。研究表明,超表达玉米ZmMKK1或ZmSIMK1基因,表现为耐盐表型(Gu L, Liu Y, Zong X, et al. Overexpressionof maize mitogen-activated protein kinase gene, ZmSIMK1 in Arabidopsisincreases tolerance to salt stress[J]. Molecular biology reports, 2010, 37:4067-4073;Cai G, Wang G, Wang L, et al. A maize mitogen-activated proteinkinase kinase, ZmMKK1, positively regulated the salt and drought tolerance intransgenic Arabidopsis[J]. Journal of Plant Physiology, 2014, 171(12): 1003-1016),另外,玉米基因ZmMPK3、ZmMEKK1、ZmMKK4被报道表达上调(Wang P, Du Y, Li Y, etal. Hydrogen peroxide–mediated activation of MAP kinase 6 modulates nitricoxide biosynthesis and signal transduction in Arabidopsis[J]. The Plant Cell,2010, 22(9): 2981-2998;Kong X, Pan J, Zhang M, et al. ZmMKK4, a novel group Cmitogen‐activated protein kinase kinase in maize (Zea mays), confers salt andcold tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant, cell & environment, 2011,34(8): 1291-1303;Cai G, Wang G, Wang L, et al. A maize mitogen-activatedprotein kinase kinase, ZmMKK1, positively regulated the salt and droughttolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Journal of Plant Physiology, 2014,171(12): 1003-1016.)。关于热胁迫逆境下,最近的研究报道ZmMKK9-ZmMPK20-ZmRIN2级联负调控高温诱导的气孔打开,从而增强耐热性,在这个级联中,ZmMKK9与ZmMPK20相互作用并使其磷酸化。随后,ZmMPK20与ZmRIN2相互作用,阻止了ZmRIN2的自泛素化和降解,稳定的ZmRIN2通过一种未知的机制负调控高温诱导的气孔打开,从而帮助植物适应高温胁迫(Cheng C, Wu Q, Wang M, et al. Maize MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE 20mediates high-temperature–regulated stomatal movement[J]. Plant Physiology,2023, 193(4): 2788-2805.)。
综上所述,MAPKs是调节非生物胁迫中重要的一类基因,在植物适应逆境胁迫下发挥着重要的作用,目前并未有关于MAPKs基因在干旱胁迫反应中的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供在于调控植物,尤其是玉米的干旱胁迫,提高干旱条件胁迫下植物的农艺性状。
本发明提供了玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控植物干旱胁迫中的应用。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的叶片表面温度。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的相对含水量。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的失水率。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的气孔运动。
优选的,所述调控干旱胁迫下植物的气孔运动为调控干旱胁迫下植物的气孔开度。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的农艺性状。
优选的,所述农艺性状包括株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长中的一种或多种。
优选的,所述调控植物干旱胁迫包括正调控所述玉米ZmMPK1基因的表达提高植物抗干旱胁迫能力。
优选的,所述植物为玉米。
有益效果:
本发明以野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体(相比野生型玉米ND101在ZmMPK1基因缺失2bp)和zmmpk1-2突变体(相比野生型玉米ND101在ZmMPK1基因缺失5bp)为材料,探究不同的材料在干旱条件下的表型和农艺性状,结果表明,相比玉米ND101,zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体在干旱胁迫条件下,叶片表面温度、相对含水量、气孔开度、成活率均降低;并且大田试验结果表明,zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长等农艺性状相比野生型也有显著差异,玉米ZmMPK1基因是干旱胁迫正调控因子。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为玉米材料zmmpk1-1、zmmpk1-2和ND101的序列对比结果;
图2为玉米材料zmmpk1-1、zmmpk1-2和ND101干旱表型评测结果;其中,A为表型照片;B为叶片表面温度测定结果;C为相对叶片含水量统计结果,****表示p< 0.0001;D为存活率统计结果,**表示p<0.01;E为离体叶片失水率检测结果;
图3为玉米材料zmmpk1-1、zmmpk1-2和ND101的气孔开度及气孔密度统计结果;其中,A为玉米材料在ABA处理前后气孔开度表型,标尺为10=μm;B为气孔开度统计结果,****表示p< 0.0001,n≥80;C为气孔密度统计统计结果,n=30;
图4为玉米材料zmmpk1-1、zmmpk1-2和ND101吐丝期农艺性状考察结果;其中,A和B为大田条件下,吐丝期生长的表型,标尺=30 cm;C~G依次为生物量、相对含水量、株高、穗位高和SPAD统计结果,柱状图表示平均值±标准差;****表示p< 0.0001;***表示p<0.001;**表示p< 0.01;*表示p< 0.05;
图5为玉米材料zmmpk1-1、zmmpk1-2和ND101成熟期农艺性状考察结果;其中,A为成熟期穗子的表型,标尺=10 cm;B~H依次为秃尖率、穗重、穗长、穗宽、穗行数、行粒数和百粒重统计结果,柱状图表示平均值±标准差;****表示p< 0.0001;***表示p< 0.001;**表示p< 0.01;*表示p< 0.05。
具体实施方式
本发明提供了玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控植物干旱胁迫中的应用。
在本发明中,所述调控植物干旱胁迫优选包括正调控所述玉米ZmMPK1基因的表达提高植物抗干旱胁迫能力。本发明所述植物优选为玉米。本发明所述玉米ZmMPK1基因的登录号为Zm00001d024568,编码一种蛋白激酶。本发明以野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体(相比野生型玉米ND101在ZmMPK1基因缺失2bp)和zmmpk1-2突变体(相比野生型玉米ND101在ZmMPK1基因缺失5bp)为材料,探究ZmMPK1基因对植物干旱胁迫的影响,结果表明ZmMPK1基因缺失,即ZmMPK1基因功能异常,玉米抗干旱胁迫能力降低,具体表现表现为,zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体叶片表面温度、相对含水量、气孔开度、成活率均低于野生型玉米ND101,并给在大田条件下种植zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体,株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长等农艺性状相比野生型也有显著差异。
基于野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的差异,玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控干旱胁迫下植物的叶片表面温度中的应用同样属于本发明的保护范围。
基于野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的差异,玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控干旱胁迫下植物的相对含水量中的应用同样属于本发明的保护范围。
基于野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的差异,玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控干旱胁迫下植物的失水率中的应用同样属于本发明的保护范围。
基于野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的差异,玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控干旱胁迫下植物的气孔运动中的应用同样属于本发明的保护范围。在本发明中,所述调控干旱胁迫下植物的气孔运动优选为调控干旱胁迫下植物的气孔开度。
基于野生型玉米ND101、zmmpk1-1突变体和zmmpk1-2突变体的差异,玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在提高干旱胁迫下植物的农艺性状中的应用同样属于本发明的保护范围。在本发明中,所述农艺性状优选包括株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长中的一种或多种,进一步优选为株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
材料与方法
1.试验材料
1.1植物材料
玉米(Zea mays L.)ND101(中国农业大学作物功能基因组学与分子育种研究中心,与文章Cao H, Liu Z, Guo J, Jia Z, Shi Y, Kang K, Peng W, Wang Z, Chen L,Neuhaeuser B, Wang Y, Liu X, Hao D, Yuan L. ZmNRT1.1B (ZmNPF6.6) determinesnitrogen use efficiency via regulation of nitrate transport and signalling inmaize. Plant Biotechnol J. 2023 Oct 2. 中材料部分的自交系一致);
玉米Crispr/Cas9突变体材料zmmpk1-1:采用常规的Crispr/Cas9技术,对玉米ND101的ZmMPK1基因进行敲除,经转化、鉴定获得,与玉米ND101相比,ZmMPK1基因CDS上第670 bp-671 bp碱基缺失,造成在第224个氨基酸处移码突变,具体序列差异如图1;
玉米Crispr/Cas9突变体材料zmmpk1-2:采用常规的Crispr/Cas9技术,对玉米ND101的ZmMPK1基因进行敲除,经转化、鉴定获得,与玉米ND101相比,ZmMPK1基因CDS上第668-672 bp碱基缺失,造成第223个氨基酸处开始移码突变,具体序列差异如图1;
1.2菌种
大肠杆菌采用DH5-α(购买自北京市诺维赞公司);农杆菌采用GV3101(购买自北京博迈德公司)。
1.3载体
P1300-GFP载体。
2.相关试剂
2.1工具酶及相关生物化学试剂及其相关用途如表1所示。
表1 工具酶及相关试剂
2.2试验方法
2.2.1干旱表型评测
按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60 mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70%。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种至装有准备好的混合土的花盆中,使玉米种子在距离土壤培养基表面的2-3 cm深处生长。种子萌发出土2-3 cm时将长势不齐的苗去掉,保证每盆苗子数量相等,每个玉米种子随机分为正常浇水(Watering)组和干旱处理(Drought)组,进行如下处理:
干旱处理组:幼苗长至两叶一心期时,在托盘里加满水,土壤充分吸水后倒掉剩余的水,开始干旱处理(不浇水自然干旱);
正常浇水组:在托盘里隔4天补充水。
(1)干旱表型测定
正常浇水组和干旱处理组处理期间随机移动花盆位置,待植株表型差异明显时拍照,结果表明在干旱处理下zmmpk1-1和zmmpk1-2突变体比野生型表现出极明显的干旱敏感表型(图2中A);
(2)植物表面温度测定
将在植物房间(温度25℃,光周期为14 h光照/10 h黑暗,湿度为50%-60%)中生长7天的植物材料移至土中,向托盘中浇足量的水,保证所有花盆都吸满水,之后3天用CCD(vario CAM HD)红外相机拍照,结果表明在野生型和两个突变体正常生长10天时进行了红外相机拍摄叶片表面温度,zmmpk1-1和zmmpk1-2突变体叶温显著低于野生型ND101(图2中B);
(3)玉米叶片相对含水量测定
在玉米苗期耐旱鉴定实验中,干旱处理后观察野生型与突变新材料的耐旱性表型,植株表型差异明显时拍照,此时取样用于统计野生型与转基因植株的叶片含水量差异:
剪取整棵植株除第一片叶剩余的所有叶片,立即用电子天平称量叶片鲜重,之后放入50 mL离心管中,加入适量水,使叶片完全浸入水中,吸水3 h 后,用吸水纸擦干叶片水分,用电子天平称量叶片的重量即为饱和鲜重,每个处理组重复取样4次。将样品放入烘箱中,65°C烘干至恒重并记录叶片干重,利用以下公式计算叶片相对含水量,结果如图2中C和表2。
相对含水量(%)=(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)×100%。
表2 叶片相对含水量测定结果(%)
根据图2中C和表2可以看出,在正常浇水下,各株系的叶片相对含水量保持一致,大约在92%左右,在干旱处理下,野生型ND101的相对含水量约为83%,zmmpk1-1和zmmpk1-2两个突变体的相对含水量分别为62%和67%。
2.2.2玉米植物存活率
按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60 mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70%。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种至装有准备好的混合土的花盆中,使玉米种子在距离土壤培养基表面的2-3 cm深处生长,每个株系种10盆,每盆10棵,浇适量水,设置5个重复。正常生长7天后,停止浇水进行干旱处理,持续干旱直到植物萎蔫后开始复水,复水后每天观察植株的存活情况,差异最明显时统计各株系的存活率,存活率(%)=存活植株数目/总植株数目×100%,结果如图2中D和表3所示。
表3 植物存活率(%)
根据图2中D和表3可以看出,两个突变体的存活率显著低于野生型ND101。
2.2.3玉米离体叶片失水率检测
(1)按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70%。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种在花盆中,每个株系种5盆,每个盆中播种4粒种子,浇适量水。
(2)待幼苗正常生长至V3期(14天左右),第三片叶完全展开,上午9点左右,选取生长健康,大小一致的幼苗,剪取第三片叶,放于称量纸上,用电子天平称量初始鲜重,每组样品4片叶,每个株系4个生物学重复,分别在0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h和8 h称量叶片重量,利用以下公式计算离体叶片失水率,需要注意的是本实验应尽量避开阴雨天,选择相对干燥的环境进行实验,以免空气湿度较大会影响实验的准确性。结果如图2中E和表4所示。
失水率(%)=(初始鲜重-失水后的重量)/初始鲜重×100%
表4 玉米离体叶片失水率检测结果(%)
根据图2中E和表4可以看出,在离体叶片失水实验中,zmmpk1-1和zmmpk1-2的叶片在离体半小时就严重失水,失水速度是野生型的2.85倍。
综合表2~4和图2可以看出,ZmMPK1基因能迅速响应干旱胁迫的信号,是干旱响应中关键的正向调节因子。
2.2.4气孔运动和对ABA的敏感性分析
2.2.4.1玉米叶片气孔开度测定
(1)按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70 %。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种在花盆中,每个株系种5盆,每个盆中播种4粒种子,浇适量水。
(2)幼苗正常生长至 V1 期(7天左右),第一片叶完全展开,选取生长健康,大小一致的6株幼苗,剪下第一片叶,在叶片中间部位剪取1-2 cm,放入装有8 mL MES-KOH缓冲液(10 mM MES-KOH ,pH=5.7,10 mM KCl,50μM CaCl2)的培养皿中,叶片下表皮接触缓冲液,使叶片全部浸入缓冲液中,放置在培养箱中。
(3)待叶片光照3 h,使气孔充分打开,取出3片叶,用吸水纸擦干叶片水分,在叶片的下表皮上涂抹指甲油,晾干5 min 左右,用透明胶带粘取叶片下表皮,置于载玻片上展平,40倍光学显微镜下观察气孔开放状态,每个叶片随机拍20个视野。
(4)向每个株系另外3片叶所在的缓冲液中加入2.4 μL 50 mM 的ABA存储液(终浓度15 μM),充分混匀,继续放于光照培养箱中。
(5)待叶片处理2 h后,取出处理的叶片,重复步骤(3)的操作,每个叶片随机拍20个视野。
(6)用 Image J 软件测量步骤(3)和步骤(4)选取视野的气孔开度,结果如图3中B所示,其中步骤(3)和步骤(4)选取的部分视野如图3中A所示。
根据图3中A~B可以看出,在ABA处理前后,zmmpk1-1和zmmpk1-2两个突变体的气孔开度均大于野生型,野生型ND101的气孔开度在ABA处理前后分别是5.05 µm和3.07 µm,zmmpk1-1的气孔开度在ABA处理前后分别是8.62 µm和5.18 µm,zmmpk1-2的气孔开度在ABA处理前后分别是8.6 µm和6.32 µm ,进一步推算突变体在ABA诱导气孔关闭过程中的的速度慢于野生型,因此暗示突变体zmmpk1在响应干旱胁迫时,气孔关闭速度较慢,另外突变体zmmpk1本身气孔张开的程度较大,导致植株蒸腾较大,因此保水能力差,因此表现出干旱敏感的表型。
2.2.4.2玉米叶片气孔密度测定
(1)按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70 %。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种在花盆中,每个株系种5盆,每个盆中播种4粒种子,浇适量水。
(2)幼苗正常生长至 V3 期(14天左右),第三片叶完全展开,选取生长健康,大小一致的幼苗,剪下第三片叶,靠近叶尖的1/4 处剪取3 cm,在叶片的下表皮上涂抹指甲油,晾干5 min 左右,用透明胶带粘取叶片下表皮,置于载玻片上展平,在10倍光学显微镜下观察气孔的密度,从叶片边缘起的第四排气孔开始拍照,叶脉上下各拍一张,每个株系6片叶,3次生物学重复,计算统记气孔密度,气孔密度=气孔数目/视野面积,结果表明,zmmpk1-1和zmmpk1-2两个突变体的气孔密度与野生型无明显差异(图3中C),因此排除突变体由于气孔密度变化导致干旱的原因。
以上结果说明,ZmMPK1基因可能是通过调节气孔运动过程中气孔开度的变化来响应干旱胁迫。
实施例2
1.ABA处理玉米幼苗
按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60 mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70%。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种在花盆中,每个株系种5盆,每个盆中播种4粒种子,浇适量水。待幼苗正常生长10天左右,幼苗根部清洗干净,随机分为实验组和对照组,实验组将幼苗根部放入含有20 μM ABA水溶液的棕色广口瓶中(防止ABA见光分解,也可用锡箔纸包裹避光),对照组除不添加 ABA,其余操作与处理组相同,分别在0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h取样用于RNA提取和基因定量分析。
2.PEG处理玉米幼苗
按照营养土:蛭石:河沙=1:1:1比例混合配置实验所需土壤基质,用90 mm×60 mm的筛子过筛后等重量分装至实验所用花盆中,使花盆中持水量达到70%。将玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2的种子分别播种在花盆中,每个株系种5盆,每个盆中播种4粒种子,浇适量水。待幼苗正常生长10天左右,幼苗根部清洗干净,随机分为实验组和对照组,实验组将幼苗根部放入含有15% PEG6000的棕色广口瓶中,对照组除不添加PEG6000,其余操作与处理组相同,分别在0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h取样用于RNA提取和基因定量分析。
实施例3
田间表型及农艺性状调查
试验于2022-2023年分别在海南和北京上庄试验基地开展,在高氮地块(施用180千克/公顷尿素)种植玉米ND101、突变体材料zmmpk1-1和突变体材料zmmpk1-2,种植密度为100000 株/公顷,栽培管理同一般田间生产,于齐穗期进行拍照,测定农艺性状,包括株高、穗位高、生物量、含水量及SPAD测定,于成熟期进行穗部拍照及进行性状考察,考察指标有穗重、穗行数、行粒数、百粒重、粒长、粒宽等,结果如图4~5和表5~7。
表5 齐穗期农艺性状考察结果
表6 齐穗期农艺性状考察结果
表7 成熟期农艺性状考察结果
根据图4和表5~6可以看出,在田间条件下,突变体zmmpk1长势明显弱于野生型(图4中A和B)。相比于野生型,突变体zmmpk1的生物量降低了近35%(图4中C),相对含水量降低了近10%(图4中D),株高降低近20%(图4中E),穗位高降低10%(图4中F),SPAD下降约5%(图4中G)。以上结果表明大田条件下,ZmMPK1基因的缺失严重抑制了玉米的生长,其中一个重要的原因是其相对含水量降低造成,与其干旱不耐受存在相关性。
根据图5和表7可以看出,在田间条件下,zmmpk1突变体秃尖严重,其秃尖率较野生型显著增加(图5中A),统计显示较野生型而言增加了近1.7倍(图5中B),穗粒数显著少于野生型,该表型是典型干旱不耐受导致的,从侧面证明zmmpk1突变体产量的减少由于干旱敏感造成。通过对玉米穗子进行考种结果证明,相对于野生型而言,zmmpk1突变体穗重减少30%(图5中C),zmmpk1突变体穗长减少10%(图5中D),zmmpk1突变体穗行数减少2行(图5中F),zmmpk1突变体行粒数减少41%(图5中G),zmmpk1突变体的穗宽与百粒重没有明显差异(图5中E和H)。ZmMPK1的缺失严重导致玉米减产,是影响玉米产量重要的基因,其中主要表现在穗部秃尖率的增加,穗粒数的减少。
根据上述内容可以看出,玉米ZmMPK1基因可以调控植物干旱胁迫,ZmMPK1基因缺失导致玉米抗干旱胁迫的能力降低。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白在调控植物干旱胁迫中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的叶片表面温度。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的相对含水量。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的失水率。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的气孔运动。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述调控干旱胁迫下植物的气孔运动为调控干旱胁迫下植物的气孔开度。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括:所述玉米ZmMPK1基因或其编码蛋白调控干旱胁迫下植物的农艺性状。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述农艺性状包括株高、穗位高、生物量、含水量、SPAD值、穗重、穗行数、行粒数、百粒重和粒长中的一种或多种。
9.根据权利要求1~8任一项所述的应用,其特征在于,所述调控植物干旱胁迫包括正调控所述玉米ZmMPK1基因的表达提高植物抗干旱胁迫能力。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述植物为玉米。
CN202410050370.XA 2024-01-15 2024-01-15 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用 Pending CN117568392A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410050370.XA CN117568392A (zh) 2024-01-15 2024-01-15 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410050370.XA CN117568392A (zh) 2024-01-15 2024-01-15 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117568392A true CN117568392A (zh) 2024-02-20

Family

ID=89890410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410050370.XA Pending CN117568392A (zh) 2024-01-15 2024-01-15 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117568392A (zh)

Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040209325A1 (en) * 2003-01-31 2004-10-21 Yinong Yang Mitogen-activated protein kinase and method of use to enhance biotic and abiotic stress tolerance in plants
CN101386646A (zh) * 2008-10-29 2009-03-18 中国农业科学院作物科学研究所 一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用
CN101608184A (zh) * 2009-04-03 2009-12-23 山东农业大学 棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用
US20100257621A1 (en) * 2006-10-03 2010-10-07 Monsanto Technology Llc Methods for Hybrid Corn Seed Production and Compositions Produced Therefrom
AU2011203289A1 (en) * 2001-11-09 2011-07-28 Basf Plant Science Gmbh Protein kinase stress-related polypeptides and methods of use in plants
CN102533811A (zh) * 2010-12-15 2012-07-04 华中农业大学 枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力
CN104862325A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 河南师范大学 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高种子活力上的应用
CN106520780A (zh) * 2016-11-01 2017-03-22 石家庄市农林科学研究院 一种提高植物抗旱能力的基因及其应用
CN106636031A (zh) * 2016-12-19 2017-05-10 北京市农林科学院 植物抗旱相关蛋白AsTMK1及其编码基因和应用
CN107177610A (zh) * 2017-06-28 2017-09-19 西北农林科技大学 一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法
CN107338231A (zh) * 2016-05-03 2017-11-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 OsMPK21-1蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
CN107338230A (zh) * 2016-05-03 2017-11-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 OsMPK11蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
CN109182357A (zh) * 2018-10-12 2019-01-11 山东大学 玉米促分裂原活化蛋白激酶基因ZmMPK20在调控气孔运动及植物耐热中的应用
CN110066773A (zh) * 2018-01-22 2019-07-30 中国农业大学 玉米ZmMPK11蛋白或其编码基因在调节植物耐逆性中的应用
CN110396510A (zh) * 2018-12-21 2019-11-01 北京市农林科学院 一种抗旱的蛋白及其编码基因和其应用
CN110713994A (zh) * 2018-06-27 2020-01-21 中国农业科学院作物科学研究所 一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用
CN112280785A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 西南大学 甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法
CN113025636A (zh) * 2021-05-08 2021-06-25 西南大学 甘蓝型油菜BnMAPK1基因在提高植物耐荫性中的应用及方法
CN114752579A (zh) * 2020-12-25 2022-07-15 中国农业大学 ZmMAPK蛋白及其编码基因在调控植物低温胁迫耐性中的应用
CN115807017A (zh) * 2022-12-01 2023-03-17 福建师范大学 番茄基因SlMAPK12在调控番茄抗旱性中的应用
CN116622666A (zh) * 2022-02-14 2023-08-22 中国农业科学院作物科学研究所 调控植物抗旱性的方法及TaMPK3在调控植物抗旱性中的应用

Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011203289A1 (en) * 2001-11-09 2011-07-28 Basf Plant Science Gmbh Protein kinase stress-related polypeptides and methods of use in plants
US20040209325A1 (en) * 2003-01-31 2004-10-21 Yinong Yang Mitogen-activated protein kinase and method of use to enhance biotic and abiotic stress tolerance in plants
US20100257621A1 (en) * 2006-10-03 2010-10-07 Monsanto Technology Llc Methods for Hybrid Corn Seed Production and Compositions Produced Therefrom
CN101386646A (zh) * 2008-10-29 2009-03-18 中国农业科学院作物科学研究所 一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用
CN101608184A (zh) * 2009-04-03 2009-12-23 山东农业大学 棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其应用
CN102533811A (zh) * 2010-12-15 2012-07-04 华中农业大学 枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力
CN104862325A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 河南师范大学 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高种子活力上的应用
CN107338231A (zh) * 2016-05-03 2017-11-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 OsMPK21-1蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
CN107338230A (zh) * 2016-05-03 2017-11-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 OsMPK11蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
CN106520780A (zh) * 2016-11-01 2017-03-22 石家庄市农林科学研究院 一种提高植物抗旱能力的基因及其应用
CN106636031A (zh) * 2016-12-19 2017-05-10 北京市农林科学院 植物抗旱相关蛋白AsTMK1及其编码基因和应用
CN107177610A (zh) * 2017-06-28 2017-09-19 西北农林科技大学 一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法
CN110066773A (zh) * 2018-01-22 2019-07-30 中国农业大学 玉米ZmMPK11蛋白或其编码基因在调节植物耐逆性中的应用
CN110713994A (zh) * 2018-06-27 2020-01-21 中国农业科学院作物科学研究所 一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用
CN109182357A (zh) * 2018-10-12 2019-01-11 山东大学 玉米促分裂原活化蛋白激酶基因ZmMPK20在调控气孔运动及植物耐热中的应用
CN110396510A (zh) * 2018-12-21 2019-11-01 北京市农林科学院 一种抗旱的蛋白及其编码基因和其应用
CN112280785A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 西南大学 甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法
CN114752579A (zh) * 2020-12-25 2022-07-15 中国农业大学 ZmMAPK蛋白及其编码基因在调控植物低温胁迫耐性中的应用
CN113025636A (zh) * 2021-05-08 2021-06-25 西南大学 甘蓝型油菜BnMAPK1基因在提高植物耐荫性中的应用及方法
CN116622666A (zh) * 2022-02-14 2023-08-22 中国农业科学院作物科学研究所 调控植物抗旱性的方法及TaMPK3在调控植物抗旱性中的应用
CN115807017A (zh) * 2022-12-01 2023-03-17 福建师范大学 番茄基因SlMAPK12在调控番茄抗旱性中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIUJI WU等: "Overexpression of ZmMAPK1 enhances drought and heat stress in transgenic Arabidopsis thaliana", 《PLANT MOL BIOL》, vol. 88, 26 May 2015 (2015-05-26), pages 429 - 443 *
YAN ZHOU等: "Overexpression of a multiple stress-responsive gene, ZmMPK4, enhances tolerance to low temperature in transgenic tobacco", 《PLANT PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY》, vol. 58, 5 July 2012 (2012-07-05), pages 174 - 181, XP028935157, DOI: 10.1016/j.plaphy.2012.06.020 *
佚名: "https://maizegdb.org/gene_center/gene/Zm00001d024568", 《MAIZEGDB》, 14 January 2024 (2024-01-14), pages 1 - 2 *
佚名: "登录号:XM_008664632.4", 《GENBANK》, 31 August 2020 (2020-08-31), pages 1 - 2 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hameed et al. Leaf structural modifications for drought tolerance in some differentially adapted ecotypes of blue panic (Panicum antidotale Retz.)
CN113455365B (zh) 一种普通野生稻种茎盆栽保存方法
Shan et al. Printed sowing improves grain yield with reduced seed rate in machine-transplanted hybrid rice
Musselman et al. Localized ecotypes of Thuja occidentalis L. in Wisconsin
CN105766295A (zh) 一种华顶杜鹃苗木的人工繁育方法
Xu et al. Root morphological characteristics of Lespedeza davurica (L.) intercropped with Bothriochloa ischaemum (L.) Keng under water stress and P application conditions
Liu et al. Effects of the vegetative propagation method on juvenility in Robinia pseudoacacia L.
Zhou et al. Establishment and optimization of a hydroponic system for root morphological and nutritional analysis of citrus
Oakes et al. Ex vitro rooting of American chestnut improves acclimatization survival and plantlet quality
CN116671395A (zh) 一种牧草种质资源抗寒性鉴定方法
CN117568392A (zh) 一种蛋白激酶在玉米干旱胁迫中的应用
Adelberg et al. Photoautotrophic shoot and root development for triploid melon
CN105103829A (zh) 一种湿地植物小叶章的室内人工培养方法
CN111096173B (zh) 通过调节环境因子促进笔筒树发育的方法
Vijayakumar et al. Effect of different moisture regimes on the yield, quality and water use efficiency of Chrysanthemum var. Marigold
Al Habib et al. Recovery of three different varieties of tobacco (Nicotiana tabacum L.) under waterlogging stress
Bell et al. Boron requirements of plants
Walenta et al. Vernalization response of plants grown from spikelets of spring and fall cohorts of jointed goatgrass
Yahya et al. Direct shoot regenaration of Tectona grandis (teak) for production of planting material
Sharma et al. Impact of protective condition and media on growth of seedling in Guava cv. L-49 in north western-Haryana, India
de Oliveira et al. Efficient in vitro plantlet development and acclimatization of Cattleya elongata Barb. Rodr., a Brazilian endemic and neglected species
CN114646727A (zh) 一种植物节水抗旱功能的鉴定方法
CN112273219A (zh) 一种利用杂交结合f1代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法
Roberts et al. The impact of substrate and irrigation interval on the post-transplant root growth of container-grown zinnia and tomato
KR100371863B1 (ko) 칼레드 품종 장미의 조직배양묘 순화방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination