CN116671395A - 一种牧草种质资源抗寒性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法：(1)将牧草繁殖于育苗穴盘内，培育至八叶期后，土壤持水量自然降低至5‑30％，将完整植株密封，依次按照前置期、冷冻期、后置期处理后，取出放回育苗穴盘，修剪地上部分，室温放置3‑10天复苏，测定再生株高；(2)以再生株高为数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得a、b和x0值，其中a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平，先利用公式求导PHmax值，利用反函数计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值。本发明以牧草完整植株为材料、在未破坏原始根系构型的条件下进行冷冻胁迫，并以胁迫后的再生新植株为测定对象，更贴近田间多年生牧草特性。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，属于牧草种质资源鉴定技术领域。
背景技术
我国因南方人口密集、北方地广人稀的人口分布特征，造成当前畜牧业以北方为核心。而北方气候干旱、土壤盐碱化程度高，特别是冬季严寒，不利于大多数优质高产暖季型牧草种植，造成北方牧草种植面积大、载畜量不高的现状。我国《十四五饲草产业发展规划》中明确指出我国审定的604个草品种中，缺少适应高寒、高纬度地区种植的高产优质暖季型饲草品种，是当前我国畜牧农业中亟需解决的主要问题。
筛选抗寒性牧草种质资源是牧草抗寒育种的首要任务。当前多数高大型禾草属暖季型牧草，因抗寒性差，在长江以北自然越冬率低。而狼尾草属和高粱属的野生乡土种质可在长江以北以多年生方式自然生长，部分种质可耐-20℃极寒气候，是当前高大型禾草最具价值的遗传亲本。因此，精准的筛选、鉴定野生乡土狼尾草属和高粱属种质抗寒性，可为高大型禾草抗寒育种提供必要的材料支撑。
当前牧草抗寒性鉴定方法不精准、不系统。在前期公开的抗寒性鉴定专利中(CN102650622A、CN109729870A、CN110308247A、CN112816426A)，均以低温胁迫后叶片电导率、可溶性糖含量等生理指标为测定依据判断其最终抗寒性。但大多数牧草在越冬期地上部枯萎，在返青期后地上部分茎叶才重新再生。本技术以牧草冷冻胁迫后再生能力的多年生性状为目标，提供一种牧草种质资源抗寒性鉴定的新方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明第一个目的是提供一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法。
本发明第二个目的是提供一种牧草抗寒曲线拟合及参数计算的方法。
本发明第三个目的是提供一种牧草种子快速萌发的发芽液。
本发明第四个目的是提供一种牧草盆栽鉴定种植所需的配方土。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明保护一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)牧草种质处理：将牧草通过种子萌发或种茎扦插等方式繁殖于育苗穴盘的配方土内，培育至八叶期后，土壤持水量自然降低至5-30％，完整植株移入保鲜袋真空密封，依次按照前置期(4℃放置6-24小时)、冷冻期(-3至-15℃放置0-5小时，具体放置时间大于0小时，小于等于5小时)、后置期(4℃放置12-36小时)处理后，从保鲜袋中取出放回育苗穴盘，以留茬5±1cm为标准修剪地上部分，室温放置3-10天复苏，测定再生株高。
(2)牧草抗寒曲线拟合及参数计算：以再生株高为数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得a、b和x0值，其中a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平。先利用公式/>求导PHmax值，利用反函数/> 计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值。
在本申请的优选技术方案中，所述育苗穴盘优选32孔穴深11cm的穴盘，土壤持水量优选10％，前置期优选12小时，冷冻温度优选-15℃，冷冻处理优选1、2、3、4和5小时五个处理，以不冷冻处理为0小时对照，后置期优选24小时。
在本申请的优选技术方案中，所述种子萌发的发芽液配方，包含：浓度为10-7mol/L的赤霉素、体积占比0.5％的过氧化氢。
在本申请的优选技术方案中，所述配方土以泥炭土、过筛水晶砂、过筛黄土、营养液、生石灰按质量比4：2：1：2：0.005充分混合。
在本申请的优选技术方案中，所述泥炭土优选Pindstrup(0-6mm)土壤基质，过筛水晶砂优选1-3mm颗粒，过筛黄土优选0.6-1.5mm颗粒，营养液优选以色列海法Poly-Food水溶肥以1：1000进行配制，生石灰优选慧灰高纯度生石灰粉。
第二方面，本发明还保护前文所述的牧草抗寒曲线拟合及参数计算方法。
第三方面，本发明还保护前文所述的种子萌发所用的发芽液，其配方包含浓度为10-7mol/L的赤霉素、体积占比0.5％的过氧化氢。
第四方面，本发明还保护前文所述的配方土。
有益效果
本发明开发牧草的抗寒鉴定体系，以牧草完整植株为材料、在未破坏原始根系构型的条件下进行冷冻胁迫，并以胁迫后的再生新植株为测定对象，更贴近田间多年生牧草特性，测定的再生株高显著简便于电导率、可溶性糖等生理指标，整体流程更简捷、高效。
本发明以低温多处理后的再生株高为目标性状，利用数学方程拟合抗寒曲线并以FH50(50％ Freezing Hours)或FT50(50％ Freezing Temperature)值代表最终抗寒性，相较于单一低温处理可以更精准、全面的反应出不同牧草种质的抗寒特征。
本发明使用的发芽液，无论是牧草栽培品种还是野生种质籽粒，均可在1-2天实现萌发，极大的破除了牧草种子休眠对发芽率的影响。
本发明使用的配方土更有利于牧草根系快速生长、发育，为后续低温胁迫实验的重复性和精准度提供了可靠的育苗基质。
附图说明
图1为牧草抗寒性鉴定试验流程。其中，第一步(Step1)为牧草标准化育苗，周期依据叶龄在1-10周内；第二步(Step2)为牧草地下部分的土壤控水期，自然控水至饱和田间持水量的10％；第三步(Step3)为牧草完整植株的冷冻前置期，完整植株保鲜袋真空后放入4℃存放12-24小时；第四步(Step4)为胁迫期，将前置后牧草真空袋转入-3℃～-15℃内存放1-5小时，以一直存放4℃未-3℃～-15℃低温胁迫的牧草为0小时对照；第五步(Step5)为后置期，将胁迫期的牧草真空袋转回4℃存放12-24小时；第六步(Step6)为复苏期，将后置期的牧草真空袋取出，打开真空袋将完整牧草放回育苗穴盘内继续生长；第七步(Step7)测定3-10天后的再生株高。
图2为牧草抗寒曲线拟合及计算。其中，A为陵山狼尾草、东非狼尾草Whittet、杂交狼尾草“苏牧4号”和美洲狼尾草Tift23B在-15℃环境冷冻胁迫0、1、2、3、4、5小时后的再生株高及其数学模型Sigmoid三参数方程拟合曲线；B为Sigmoid三参数方程计算出的PHmax下降一半时拟合曲线对应的X值，记为FH50。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本发明保护一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，所述方法选自如下方法一或方法二：
方法一包括如下步骤：
(1)牧草种质处理：将牧草通过种子萌发或种茎扦插等方式繁殖于育苗穴盘的配方土内，培育至八叶期土壤持水量自然降低至10-30％，完整植株移入保鲜袋真空密封，依次按照前置期(4℃放置12-24小时)、冷冻期(-15℃放置1、2、3、4、5小时)、后置期(4℃放置12-24小时)处理后，从保鲜袋中取出放回育苗穴盘，以留茬5cm为标准修剪地上部分，室温放置3-10天复苏，测定再生株高；
(2)牧草抗寒曲线拟合及参数计算：以冷冻期放置0、1、2、3、4、5小时6个处理后的再生株高为数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得y0、a、b和c值，其中a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平。先利用公式求导PHmax值，利用反函数/>计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值，并定义为FH50(50％ Freezing Hours)，即牧草在某一温度下冷冻胁迫的半致死时间；
方法二包括如下步骤：
(1)牧草种质处理：将牧草通过种子萌发或种茎扦插等方式繁殖于育苗穴盘的配方土内，培育至八叶期后，土壤持水量自然降低至5-30％，完整植株移入保鲜袋真空密封，依次按照前置期(4℃放置6-24小时)、冷冻期(-3、-6、-9、-12和-15℃分别放置3小时)、后置期(4℃放置12-36小时)处理后，从保鲜袋中取出放回育苗穴盘，以留茬5±1cm为标准修剪地上部分，室温放置3-10天复苏，测定再生株高；
(2)牧草抗寒曲线拟合及参数计算：以再生株高为数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得a、b和x0值，其中a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平。先利用公式/>求导PHmax值，利用反函数/> 计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值，并定义为FT50(50％Freezing Temperature)，即牧草在某冷冻胁迫时间下的半致死温度。
下文举例说明本发明优选的具体实施方式，但本发明不限于此。
实施例1
(1)牧草种质育苗
供试材料：狼尾草属国家审定品种东非狼尾草Whittet(品种审定编号：241)和陵山狼尾草(品种登记号：570)，杂交狼尾草新品系‘苏牧4号’和美洲狼尾草种质Tift23B。
将以上四种狼尾草种子依次进行7.5％过氧化氢0.5h、3％过氧化氢2h、2％次氯酸钠0.5h、无菌水0.5h的振荡漂洗后，放置培养皿内并加入10ml发芽液(含有10-7mol/L的赤霉素、体积占比0.5％的过氧化氢)，25℃避光培养2-5天，萌发种子根系约2cm即可移栽。
以Pindstrup(0-6mm)泥炭土、1-3mm过筛水晶砂、0.6-1.5mm过筛黄土、营养液(可溶性肥：水按1：1000配制)、慧灰高纯度生石灰粉按质量比4：2：1：2：0.005进行混合，获得配方土，并按5kg/穴盘的标准均匀装入32孔穴盘(穴孔深11cm)内。将萌发后的种子单粒移入每个穴孔，培养至一叶期后，温室内正常培养，在三叶期每穴施用0.1g缓释性复合肥。
(2)牧草抗寒胁迫流程
待牧草长至十叶期，转移待测牧草完整植株至新育苗穴盘内，底部接水托盘加满水至根系土壤吸水至饱和持水量后称重，计算出每穴牧草植株的平均土壤饱和含水量。清空底部接水托盘，放置温室内开始控水期，将牧草植株平均土壤持水量自然降低至饱和量的10％，以达到后续冷冻胁迫中土壤不结冰的效果。
将完整植株移入保鲜袋真空密封后，依次按照前置期(4℃放置12小时)、冷冻期(-15℃放置1、2、3、4、5小时)、后置期(4℃放置24小时)处理，以无冷冻期的4℃放置为平行0h对照。后置结束后，将真空袋内对照和胁迫后的植株取出放回育苗穴盘内，留茬5cm修剪地上部分，并浸泡在营养液(可溶性肥：水按1：1000配制)24小时后，温室内正常复苏培养生长，待对照平均再生株高长至10-12cm内(不同对照品种需3-10天内不等)，测定包含对照在内的1、2、3、4、5小时胁迫后的再生株高。
整个流程包含控水期、前置期、胁迫期、后置期和复苏期5个主要步骤。具体流程如图1所示。
(3)牧草抗寒曲线拟合及参数计算
以胁迫期放置0、1、2、3、4、5小时6个处理后的再生株高为Y变量数据组，相对应的0、1、2、3、4、5为X变量数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得a、b和x0值，先利用公式/>求导PHmax值，再利用反函数/>计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值，并定义为FH50，其中，a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平。拟合曲线和FH50值如图2所示。
结果可以看出，北方多年生的东非狼尾草Whittet和陵山狼尾草抗寒曲线呈“抛物线”特征，FH50值均在4h左右。可在南方多年生的杂交狼尾草‘苏牧4号’抗寒曲线呈指数下降特征，FH50值均在1h左右。一年生美洲狼尾草仅在对照组可再生新植株，胁迫组均无再生能力。FH50越大其抗寒性越强。以上抗寒曲线特征参数值FH50均与狼尾草属种质实际抗寒性相符，说明本发明方法可快速、精准的鉴定包含狼尾草属和其他牧草种质在内的抗寒性。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.一种牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)牧草种质处理：将牧草通过种子萌发或种茎扦插方式繁殖于育苗穴盘的配方土内，培育至八叶期后，土壤持水量自然降低至5-30％，完整植株移入保鲜袋真空密封，依次按照前置期、冷冻期、后置期处理后，从保鲜袋中取出放回育苗穴盘，以留茬5±1cm为标准修剪地上部分，室温放置3-10天复苏，测定再生株高；
其中，前置期为4℃放置6-24小时，冷冻期为-3至-15℃放置0-5小时，后置期为4℃放置12-36小时；
(2)牧草抗寒曲线拟合及参数计算：以再生株高为数据组，用数学模型Sigmoid三参数进行拟合，获得a、b和x0值，其中a为y变量的最大值，b为拟合曲线的陡度，x0代表拟合曲线最大半激活水平；先利用公式/>求导PHmax值，利用反函数/> 计算当PHmax下降一半时拟合曲线上对应的X值。
2.根据权利要求1所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，所述育苗穴盘为32孔穴深11cm的穴盘。
3.根据权利要求1或2所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，土壤持水量自然降低至10％，完整植株移入保鲜袋真空密封。
4.根据权利要求1所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，前置期处理12小时，冷冻温度-15℃，冷冻处理时间选自1、2、3、4和5小时，后置期处理24小时。
5.根据权利要求1所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，前置期处理12小时，冷冻温度选自-3、-6、-9、-12和-15℃，冷冻处理时间3小时，后置期处理24小时。
6.根据权利要求1或2所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，所述种子萌发的发芽液配方，包含：浓度为10-7mol/L的赤霉素、体积占比0.5％的过氧化氢。
7.根据权利要求1或2所述的牧草种质资源抗寒性鉴定的方法，其特征在于，所述配方土以泥炭土、过筛水晶砂、过筛黄土、营养液、生石灰按质量比4：2：1：2：0.005充分混合；优选的，所述泥炭土为0-6mm土壤基质，过筛水晶砂为1-3mm颗粒，过筛黄土为0.6-1.5mm颗粒，营养液以水溶肥以1：1000进行配制，生石灰为高纯度生石灰粉。
8.权利要求1所述的牧草抗寒曲线拟合及参数计算方法。
9.权利要求1所述的种子萌发所用的发芽液，其配方包含浓度为10-7mol/L的赤霉素、体积占比0.5％的过氧化氢。
10.权利要求1所述的配方土。
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|---|---|---|---|
| CN202310708987.1A CN116671395A (zh) | 2023-06-15 | 2023-06-15 | 一种牧草种质资源抗寒性鉴定方法 |
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| CN202310708987.1A CN116671395A (zh) | 2023-06-15 | 2023-06-15 | 一种牧草种质资源抗寒性鉴定方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117999999A (zh) * | 2024-04-09 | 2024-05-10 | 平利县八仙云雾茶业有限公司 | 用于实现冬季茶树的防冻方法及系统 |
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2023
- 2023-06-15 CN CN202310708987.1A patent/CN116671395A/zh active Pending
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