CN109422804B

CN109422804B - ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109422804B
Application number: CN201710790200.5A
Authority: CN
Inventors: 任东涛; 常颖; 李媛; 杨海莲
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-09-05
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2037-09-05
Also published as: CN109422804A

Abstract

本发明公开了一种ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用。本发明保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白或编码ZmMKK10蛋白的基因或编码ZmMKK10融合蛋白的基因的应用：促进植物死亡；促进植物局部组织死亡；培育抗菌植物。ZmMKK10蛋白是：序列3所示蛋白质；将序列3所示蛋白质第239位氨基酸残基和第245位残基均由丝氨酸突变为天冬氨酸得到的蛋白质；将序列3所示蛋白质第124位氨基酸残基由赖氨酸突变为精氨酸得到的蛋白质。植物被致病菌感染后，ZmMKK10蛋白在植物体内被磷酸化激活，引起乙烯和H₂O₂积累，进而引起被感染区域的细胞死亡，避免植物的其它部分被致病菌侵染，从而提高整体植株对致病菌的抗性。

Description

ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

植物在长期的进化过程中，逐渐建立起一套完整的信号系统以感知和适应外界环境的变化，从而调控自身的生长和发育过程。在植物体内复杂的信号传递网络中，蛋白质磷酸化和蛋白质去磷酸化过程扮演着非常重要的角色。这种可逆的蛋白质翻译后修饰是调控细胞响应各种外源刺激信号的重要调节机制。

玉米是世界上重要的粮食作物之一，在农业和工业上占有重要地位，既是人类食品，又是畜禽饲料，也是重要的工业原料。随着全球人口增长，畜牧业迅速发展和利用玉米加工液体燃料乙醇需求的迅速攀升，玉米的需求量大幅度增加。但是，低温、盐渍、干旱和病虫害等各种生物与非生物胁迫严重影响玉米的生长发育和产量。因此，如何提高玉米对逆境的适应以及通过分子生物学手段改良玉米综合抗逆性，培育抗逆新品种，已成为我国乃至世界农业持续高效发展的重大课题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用。

本发明保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白或编码ZmMKK10蛋白的基因或编码ZmMKK10融合蛋白的基因的应用，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)促进植物死亡；

(a2)促进植物局部组织死亡；

(a3)培育抗菌植物。

所述植物局部组织死亡可为被致病菌感染部分死亡。

植物被致病菌感染后，ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白在植物体内被磷酸化激活，进一步促使下游的ZmMPK3蛋白/ZmMPK7蛋白发生磷酸化，引起乙烯和H₂O₂积累，进而引起被感染区域的细胞死亡，避免植物的其它部分被致病菌侵染，从而提高整体植株对致病菌的抗性。

所述抗菌可为抗致病菌。

所述致病菌可为真菌或细菌。

应用基因(编码ZmMKK10蛋白的基因或编码ZmMKK10融合蛋白的基因)培育抗菌植物的方法具体为：将所述基因导入出发植物，得到转基因植物。所述基因具体通过重组质粒导入出发植物。所述重组质粒中，所述基因为诱导表达形式。所述诱导表达的诱导剂可为DEX。所述诱导表达的诱导因子可为特定致病菌或特定致病菌的特征蛋白。

本发明还保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白的应用，为如下(b1)或(b2)：

(b1)促进植物体内乙烯的积累；

(b2)增加植物体内乙烯的含量。

本发明还保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)促进植物体内过氧化氢的积累；

(c2)增加植物体内过氧化氢的含量。

本发明还保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)：

(d1)直接磷酸化下游ZmMPK3蛋白；

(d2)直接磷酸化下游ZmMPK7蛋白。

本发明还保护ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白的应用，为如下(e1)至(e9)中的任一种：

(e1)与ZmMPK2蛋白结合；

(e2)检测ZmMPK2蛋白；

(e3)纯化ZmMPK2蛋白；

(e4)与ZmMPK3蛋白结合；

(e5)检测ZmMPK3蛋白；

(e6)纯化ZmMPK3蛋白；

(e7)与ZmMPK7蛋白结合；

(e8)检测ZmMPK7蛋白；

(e9)纯化ZmMPK7蛋白。

以上任一所述ZmMKK10蛋白可为如下(f1)至(f4)任一所述：

(f1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第239位氨基酸残基和第245位残基均由丝氨酸(Ser，S)突变为天冬氨酸(Asp，D)得到的蛋白质；

(f3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第124位氨基酸残基由赖氨酸(Lys，K)突变为精氨酸(Arg，R)得到的蛋白质；

(f4)将(f1)至(f3)任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

以上任一所述ZmMKK10融合蛋白可为如下(g1)至(g7)任一所述：

(g1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(g2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第239位氨基酸残基和第245位残基均由丝氨酸(Ser，S)突变为天冬氨酸(Asp，D)得到的蛋白质；

(g3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第124位氨基酸残基由赖氨酸(Lys，K)突变为精氨酸(Arg，R)得到的蛋白质；

(g4)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(g5)将序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第249位氨基酸残基和第255位残基均由丝氨酸(Ser，S)突变为天冬氨酸(Asp，D)得到的蛋白质；

(g6)将序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质自N端第134位氨基酸残基由赖氨酸(Lys，K)突变为精氨酸(Arg，R)得到的蛋白质；

(g7)将(g1)至(g6)任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

以上任一所述ZmMKK10蛋白的编码基因为如下(h1)至(h5)中任一所述的DNA分子：

(h1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(h2)编码区如下的DNA分子：将序列表中序列2第715-717位核苷酸由“TCT”突变为“GAT”且第733-735位核苷酸由“TCG”突变为“GAT”；

(h3)编码区如下的DNA分子：将序列表中序列2第370-372位核苷酸由“AAG”突变为“AGG”；

(h4)在严格条件下与(h1)至(h3)任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(h5)与(h1)至(h3)任一限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

以上任一所述ZmMKK10融合蛋白的编码基因为如下(k1)至(k8)中任一所述的DNA分子：

(k1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(k2)编码区如下的DNA分子：将序列表中序列4第715-717位核苷酸由“TCT”突变为“GAT”且第733-735位核苷酸由“TCG”突变为“GAT”；

(k3)编码区如下的DNA分子：将序列表中序列4第370-372位核苷酸由“AAG”突变为“AGG”；

(k4)序列表中序列6所示的DNA分子；

(k5)将序列表中序列6第825-827位核苷酸由“TCT”突变为“GAT”且第843-845位核苷酸由“TCG”突变为“GAT”得到的DNA分子；

(k6)将序列表中序列6第480-482位核苷酸由“AAG”突变为“AGG”得到的DNA分子；

(k7)在严格条件下与(k1)至(k6)任一限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(k8)与(k1)至(k6)任一限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

本发明还保护所述ZmMKK10蛋白或所述ZmMKK10融合蛋白。本发明还保护所述ZmMKK10蛋白的编码基因。本发明还保护所述ZmMKK10融合蛋白的编码基因。

以上任一所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为玉米或拟南芥，更具体可为玉米自交系B73或哥伦比亚生态型拟南芥。

以上任一所述ZmMPK2蛋白可为序列表的序列7编码的蛋白质。

以上任一所述ZmMPK3蛋白可为序列表的序列8编码的蛋白质。

以上任一所述ZmMPK7蛋白可为序列表的序列9编码的蛋白质。

本发明的发明人发现：ZmMKK10蛋白在植物体被磷酸化激活，进一步促使下游的ZmMPK3蛋白/ZmMPK7蛋白发生磷酸化，最后引起细胞死亡；在拟南芥中，ZmMKK10蛋白通过激活MPK3/MPK6引起乙烯和H₂O₂积累，进而引起细胞死亡。

附图说明

图1为ZmMKK10基因的组织表达分析的结果。

图2为ZmMKK10蛋白在玉米体内功能探究的结果。

图3为实施例3中功能验证试验的步骤5至8的结果。

图4为实施例3中功能验证试验的步骤9至12的结果。

图5为实施例4中功能验证试验的步骤5至8的结果。

图6为实施例4中功能验证试验的步骤9和10的结果。

图7为酵母双杂交试验的结果。

图8为实施例6的步骤三的结果。

图9为实施例6的步骤四的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。各个蛋白电泳图中，*代表检测到的非特异条带。

pSuper1300载体(the pSuper1300vector)：Yiting Shi,etc；EthyleneSignaling Negatively Regulates Freezing Toleranceby Repressing Expression ofCBF and Type-A ARR Genesin Arabidopsis；The Plant Cell,Vol.24:2578–2595,June2012。

pTA7002载体(pTA7002vector)：Shuqun Zhang,etc；Activation of SalicylicAcid–Induced Protein Kinase,aMitogen-Activated Protein Kinase,InducesMultipleDefense Responses in Tobacco；The Plant Cell,Vol.13,1877–1889,August2001。

pBSK载体：addgene。Flag抗体(anti-Flag)：Sigma公司，货号为F3165。GFP抗体(anti-GFP)：Sigma公司，货号为SAB4301138。tubulin抗体(anti-tubulin)：Sigma公司，货号为T5168。MPK3抗体：Sigma公司，货号为M8318。MPK6抗体：Sigma公司，货号为A7104。

Ponceau S染液：含0.1g/100ml丽春红和5％(体积比)乙酸的水溶液。

实施例1、ZmMKK10基因的克隆及分析

一、ZmMKK10基因的克隆

1、玉米材料的准备

取玉米自交系B73种子，用氯气灭菌后，在灭菌水中泡胀24h后催芽12-24h，胚芽鞘露出约1cm后种于蛭石中，在光照(28℃，14h)/黑暗(22℃，10h)条件下培养。培养约1周后，将处于三叶期的玉米幼苗进行取材并液氮速冻，-80℃保存。

2、RNA的提取

将所取的玉米材料在研钵中研磨破碎，分装约100μL至预冷的1.5mL离心管中，用小棒再次研磨充分。将研磨好的粉末转入到已加入1mL TRIzol试剂的离心管中，旋涡振荡混匀后室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀10s后室温放置5min。12000×g、4℃离心15min，吸取上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10min。12000×g、4℃离心10min后弃上清，用70％冰乙醇清洗沉淀。7500×g、4℃离心5min后吸掉上清，沉淀于冰上晾干后溶于100μL无菌水，测定RNA浓度和质量。加入3倍体积的无水乙醇和1/10倍体积的3M醋酸钾(pH5.8)，轻弹混匀后于-80℃重沉30min。7500×g、4℃离心15min，弃上清后用无菌水溶解RNA至所需浓度。

3、cDNA的合成

将得到的RNA去除DNA污染后进行cDNA的合成(用Promega的M-MLV反转录试剂盒进行)。取2.5μg RNA样品与5μL无菌水、5μL Oligo(dT)₁₆(10μM)、0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)混匀后65℃预变性15min，迅速置于冰上2min。加入3μL 5×M-MLV缓冲液、1.5μLdNTPs(10mM)和0.5μL M-MLV(200U/μL)混匀后，于42℃反应90min，95℃变性5min，4℃终止反应，得到的cDNA立即取出于-20℃保存备用。

4、ZmMKK10基因克隆

以上述cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

ZmMKK10-LP：5’-CATATGGCTCTCGCAGGAGACG-3’；

ZmMKK10-RP：5’-ACTAGTCTACGCCTCGGCGACC-3’。

PCR反应体系(20μL)：ddH₂O 12.4μL，5×Phusion Buffer-GC 4μL，10mM dNTP 0.4μL，引物(10μM)各1μL，玉米叶片cDNA 1μL，Phusion DNA聚合酶0.2μL。

PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性20s、56℃复性30s、72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到约1.1Kb PCR产物。将目的条带切胶并使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。将目的片段连接至pBSK载体，测序鉴定。经过测序确证克隆片段具有序列表中序列2所示的核苷酸，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为ZmMKK10蛋白(又称ZmMKK10^WT蛋白)。将编码ZmMKK10蛋白的基因命名为ZmMKK10基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

二、ZmMKK10基因的组织表达分析

每份组织在三株不同植株上取材，每种组织取三个平行。

取玉米自交系B73种子，种于大田中，在抽雄期时分别取根、茎、叶、花丝、苞叶、穗轴和雄穗，于液氮速冻并-80℃保存。

按照步骤一中的方法提取总RNA并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRPremix ExTaq试剂盒进行real time-qPCR反应。PCR反应程序如下：95℃，30s；95℃，5s；60℃，35s；40个循环。反应完成后，利用公式2^-ΔΔCt进行数据的计算处理，本文实验以Actin基因(GRMZM2G126010)为参照基因与目的基因同时扩增。

荧光定量PCR所用引物序列为：

Actin-QF:5’-GATGATGCGCCAAGAGCTG-3’

Actin-QB:5’-GCCTCATCACCTACGTAGGCAT-3’

ZmMKK10-QF:5’-CTCCAAGCTCGACCAAGGC-3’

ZmMKK10-QB:5’-GGACCTTGAGCGCGTAGA-3’

结果见图1。ZmMKK10基因在抽雄期玉米的根、茎、叶、花丝、苞叶、穗轴和雄穗组织中都有表达，叶中的转录水平最高，茎次之，穗轴和雄穗中转录水平最低。

三、相关蛋白质序列

ZmMKK10^WT蛋白自N端第124位氨基酸残基由赖氨酸(Lys，K)突变为精氨酸(Arg，R)，模拟ZmMKK10蛋白的非磷酸化状态，将该突变后的蛋白质命名为ZmMKK10^KR蛋白。

ZmMKK10^WT蛋白自N端第239位氨基酸残基和第245位残基均由丝氨酸(Ser，S)突变为天冬氨酸(Asp，D)，模拟ZmMKK10蛋白的磷酸化状态，将该突变后的蛋白质命名为ZmMKK10^DD蛋白。

实施例2、ZmMKK10蛋白在玉米体内功能探究

一、重组质粒的构建

以pSuper1300载体为出发载体，构建得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：与pSuper1300载体相比，重组质粒甲的差异仅在于：在SpeI和SacI酶切位点之间正向插入了DNA片段甲(DNA片段甲为序列表的序列4所示的双链DNA分子)。DNA片段甲编码C端融合GFP标签的ZmMKK10^WT蛋白。C端融合GFP标签的ZmMKK10^WT蛋白如序列表的序列3所示。序列表的序列4中，第1-1110位核苷酸编码ZmMKK10^WT蛋白，第1117-1836位核苷酸编码GFP标签。

以pSuper1300载体为出发载体，构建得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：与重组质粒甲相比，重组质粒乙的差异仅在于用DNA片段乙取代了DNA片段甲。与DNA片段甲相比，DNA片段乙的差异仅在于将序列表的序列4所示DNA分子的第370-372位核苷酸由“AAG”突变为了“AGG”。DNA片段乙表达C端融合GFP标签的ZmMKK10^KR蛋白。

以pSuper1300载体为出发载体，构建得到重组质粒丙。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：与重组质粒甲相比，重组质粒丙的差异仅在于用DNA片段丙取代了DNA片段甲。与DNA片段甲相比，DNA片段丙的差异仅在于将序列表的序列4所示DNA分子的第715-717位核苷酸由“TCT”突变为了“GAT”且第733-735位核苷酸由“TCG”突变为了“GAT”。DNA片段丙表达C端融合GFP标签的ZmMKK10^DD蛋白。

以pSuper1300载体为出发载体，构建得到重组质粒丁。根据测序结果，对重组质粒丁进行结构描述如下：与pSuper1300载体相比，重组质粒丁的差异仅在于：在SpeI和SacI酶切位点之间正向插入了GFP基因(GFP基因如序列表的序列4中第1117-1836位核苷酸所示)。

二、功能验证

试验质粒分别为：重组质粒甲、重组质粒乙、重组质粒丙或重组质粒丁。

1、取玉米自交系B73种子，进行萌发和培养(26℃，黑暗条件，7天)，得到黄化苗。

2、取步骤1得到的黄化苗，制备叶肉细胞原生质体。

3、用试验质粒转化步骤2得到的叶肉细胞原生质体(每10mg试验质粒配比5×10⁶～9×10⁶个原生质体)，然后黑暗条件下培养8-10h。

4、完成步骤3后，进行细胞死亡率统计。

进行细胞死亡率统计的方法：在显微镜下观察，将表面皱缩的原生质体的数目记为X(为死亡原生质体数目)，将表面圆润的原生质体的数目记为Y(为正常原生质体数目)，细胞死亡率＝X/(X+Y)。

细胞死亡率的结果见图2A。ZmMKK10^WT蛋白和ZmMKK10^DD蛋白都具有促进细胞死亡的作用，ZmMKK10^KR蛋白没有上述作用。

5、完成步骤3后，进行蛋白表达鉴定。

进行蛋白表达鉴定的方法：收集原生质体，提取总蛋白，进行Western Blot。分别采用GFP抗体(用于检测C端融合GFP标签的蛋白)和tubulin抗体(用于检测内参蛋白)作为一抗。

蛋白表达鉴定的结果见图2B。

图2中，vector代表重组质粒丁的相应结果，ZmMKK10^WT代表重组质粒甲的相应结果，ZmMKK10^DD代表重组质粒丙的相应结果，ZmMKK10^KR代表重组质粒乙的相应结果。

实施例3、ZmMKK10在拟南芥体内功能的研究

一、重组质粒的构建

以pTA7002载体为出发载体，构建得到重组质粒pTA-ZmMKK10^WT。根据测序结果，对重组质粒pTA-ZmMKK10^WT进行结构描述下：在pTA7002载体的XhoI和SpeI酶切位点之间正向插入了DNA分子I(DNA分子I为序列表的序列6所示的双链DNA分子)。序列表的序列6中，第1-80位核苷酸为Ω增强子，第81-1223为开放阅读框(第81-107位核苷酸编码Flag标签，第111-1223位核苷酸编码ZmMKK10^WT蛋白)。重组质粒pTA-ZmMKK10^WT表达N端融合Flag标签的ZmMKK10^WT蛋白。N端融合Flag标签的ZmMKK10^WT蛋白如序列表的序列5所示。

以pTA7002载体为出发载体，构建得到重组质粒pTA-ZmMKK10^KR。根据测序结果，对重组质粒pTA-ZmMKK10^KR进行结构描述如下：与重组质粒pTA-ZmMKK10^WT相比，重组质粒pTA-ZmMKK10^KR的差异仅在于用DNA分子Ⅱ取代了DNA分子Ⅰ。与DNA片段Ⅰ相比，DNA片段Ⅱ的差异仅在于将序列表的序列6所示DNA分子的第480-482位核苷酸由“AAG”突变为了“AGG”。重组质粒pTA-ZmMKK10^KR表达N端融合Flag标签的ZmMKK10^KR蛋白。

以pTA7002载体为出发载体，构建得到重组质粒pTA-ZmMKK10^DD。根据测序结果，对重组质粒pTA-ZmMKK10^DD进行结构描述如下：与重组质粒pTA-ZmMKK10^WT相比，重组质粒pTA-ZmMKK10^DD的差异仅在于用DNA分子Ⅲ取代了DNA分子Ⅰ。与DNA片段Ⅰ相比，DNA片段Ⅲ的差异仅在于将序列表的序列6所示DNA分子的第825-827位核苷酸由“TCT”突变为了“GAT”且第843-845位核苷酸由“TCG”突变为了“GAT”。重组质粒pTA-ZmMKK10^DD表达N端融合Flag标签的ZmMKK10^DD蛋白。

二、制备转基因植株

试验质粒分别为：重组质粒pTA-ZmMKK10^WT、重组质粒pTA-ZmMKK10^KR、重组质粒pTA-ZmMKK10^DD或pTA7002载体。

1、将试验质粒导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、采用花芽浸泡法将步骤1得到的重组农杆菌对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转化，收获种子，即为T0代植株的种子。

3、将T0代植株的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，可以萌发并正常生长的植株为抗生素阳性植株(T1代植株)。

4、抗生素阳性的T1代植株自交后，收获种子，即为T1代植株的种子。

5、将T1代植株的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，如果抗生素阳性植株(T2代植株)和非抗生素阳性植株的数量比约为3:1，相应的T1代植株为杂合型的转基因植株。

6、抗生素阳性的T2代植株自交后，收获种子，即为T2代植株的种子。

7、将各个T2代植株的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，如果某一T2代植株的后代植株全部为抗生素阳性植株(T3代植株)，则这些T3代植株为纯合的转基因植株。

采用重组质粒pTA-ZmMKK10^WT进行上述步骤，得到的纯合的转基因植株命名为ZmMKK6^WT转基因植株。

采用重组质粒pTA-ZmMKK10^KR进行上述步骤，得到的纯合的转基因植株命名为ZmMKK6^KR转基因植株。

采用重组质粒pTA-ZmMKK10^DD进行上述步骤，得到的纯合的转基因植株命名为ZmMKK6^DD转基因植株。

pTA7002载体进行上述步骤，得到的纯合的转基因植株命名为Vector转基因植株。

三、功能验证

试验种子分别为：ZmMKK6^WT转基因植株的种子，ZmMKK6^KR转基因植株的种子，ZmMKK6^DD转基因植株的种子，Vector转基因植株的种子、哥伦比亚生态型拟南芥的种子。

1、取试验种子，先进行干燥处理，然后采用氯气消毒法对其表面进行灭菌处理。

2、在超净台内，向装有完成步骤1的种子的离心管中加入1mL无菌水，漩涡混匀并于4℃避光处理48h。

3、完成步骤2后，取种子，播种在含1％蔗糖的固体1/2MS培养基上，置于植物光照培养箱(光照16h/黑暗8hr，恒温22℃，湿度50-60％，光照强度100μmol m^-2s^-1)中培养5-7天。

4、完成步骤3后，将幼苗移栽到营养土中，22℃、光暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗)。

5、步骤4中培养4周的幼苗分成两组(每组20株)，一组喷施15μM DEX水溶液(该组用+DEX表示)，另一组喷施水(该组用-DEX表示)，然后正常培养24h，然后观察植株生长状况并拍照。照片见3A。不进行DEX诱导的情况下，各组转基因植株的后代植株均能正常生长。进行DEX诱导后，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株出现死亡现象(死亡现象指的是死亡过程中发生的干枯和萎蔫现象，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株的最终死亡率为100％)、，ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株出现死亡现象(ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株的最终死亡率为90％以上)，ZmMKK6^KR转基因植株的后代植株生长正常，Vector转基因植株的后代植株生长正常，哥伦比亚生态型拟南芥的后代植株生长正常。

6、步骤4中培养4周的幼苗分成两组(每组20株)，一组喷施15μM DEX水溶液(该组用+DEX表示)，另一组喷施水(该组用-DEX表示)，然后正常培养16h，然后取莲座叶片提取总蛋白进行Western Blot。采用Flag抗体(用于检测N端融合Flag标签的蛋白)作为一抗。丽春红染色(用于检测内参蛋白rubisc L)的结果见图3B。不管是否存在DEX诱导，Vector株系的植株均不表达目的蛋白。没有进行DEX诱导的情况下，ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株、ZmMKK6^KR转基因植株的后代植株和ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株均不表达目的蛋白。进行DEX诱导的情况下，ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株、ZmMKK6^KR转基因植株的后代植株和ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株均表达目的蛋白。

7、步骤4中培养4周的幼苗分成两组(每组20株)，一组喷施15μM DEX水溶液(该组用+DEX表示)，另一组喷施水(该组用-DEX表示)，然后正常培养16h，然后剪取不同植株相同叶位的莲座叶，进行伊万斯蓝染色。结果见图3C。不进行DEX诱导的情况下，各组转基因植株的后代植株均不着色。进行DEX诱导后，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株有较深的着色，ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株有较深着色，ZmMKK6^KR转基因植株的后代植株基本无着色，Vector转基因植株的后代植株基本无着色，哥伦比亚生态型拟南芥的后代植株基本无色。

8、步骤4中培养4周的幼苗，取相同叶位的叶片，将叶片分为两组(每组约10个叶片)。第一组(该组用+DEX表示)：将叶片浸泡于盛有10mL双蒸水的15mL离心管中，抽真空20min后室温轻摇2h，测定溶液中的离子值，记为S0；然后将加入15μMDEX水溶液诱导16h后，测定溶液中离子值S1；沸水浴15min后，测定溶液中离子值S_总。第二组(该组用-DEX表示)：用水代替15μMDEX水溶液，其他同第一组。叶片的离子泄露率为：(S1-S0)/(S_总-S0)。结果见图3D。与未进行DEX诱导相比，进行DEX诱导后，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株的离子泄露增高，ZmMKK6^WT转基因植株的后代植株的离子泄露增高，ZmMKK6^KR转基因植株的后代植株的离子泄露基本无变化，Vector转基因植株的后代植株的离子泄露基本无变化，哥伦比亚生态型拟南芥的后代植株的离子泄露基本无变化。

9、步骤4中培养4周的ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株，剪取相同叶位的莲座叶，先用不同溶液浸泡处理1小时(不同溶液分别为：2μMAVG溶液、该组用+AVG/DEX表示；100μMCoCl₂溶液、该组用+CoCl₂/DEX表示；10μM STS溶液、该组用+STS/DEX表示；水，该组用+DEX表示)，然后在含15μMDEX的液体1/2MS培养基中浸泡16小时，然后进行伊万斯蓝染色。结果见图4A。乙烯合成抑制剂(AVG和CoCl₂)对ZmMKK10^DD蛋白引起的细胞死亡具有抑制作用。

10、步骤4中培养4周的ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株，取相同叶位的叶片，先用不同溶液浸泡处理1小时(不同溶液分别为：2μMAVG溶液、该组用+AVG/DEX表示；100μMCoCl₂溶液、该组用+CoCl₂/DEX表示；10μM STS溶液、该组用+STS/DEX表示；水，该组用+DEX表示)；然后浸泡于盛有10mL双蒸水的15mL离心管中，抽真空20min后室温轻摇2h，测定溶液中的离子值，记为S0；然后将叶片加入15μMDEX水溶液诱导16h后，测定溶液中离子值S1；沸水浴15min后，测定溶液中离子值S_总。结果见图4B。乙烯合成抑制剂(AVG和CoCl₂)对ZmMKK10^DD蛋白引起的离子泄漏率增高具有抑制作用。

11、步骤4中培养4周的ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株，取相同叶位的叶片，先用不同溶液浸泡处理1小时(不同溶液分别为：2μMAVG溶液、该组用+AVG/DEX表示；100μMCoCl₂溶液、该组用+CoCl₂/DEX表示；10μM STS溶液、该组用+STS/DEX表示；水，该组用+DEX表示)，然后浸泡于密闭瓶(内有含15μMDEX的液体1/2MS培养基)中，诱导生长16h后用GC522气相色谱仪测定乙烯含量。结果见图4C。乙烯合成抑制剂(AVG和CoCl₂)对ZmMKK10^DD蛋白引起的乙烯产量增高具有抑制作用。

12、步骤4中培养4周的ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株，剪取相同叶位的莲座叶，先用不同溶液浸泡处理1小时(不同溶液分别为：2μMAVG溶液、该组用+AVG/DEX表示；100μMCoCl₂溶液、该组用+CoCl₂/DEX表示；10μM STS溶液、该组用+STS/DEX表示；水，该组用+DEX表示)，然后在含15μMDEX的液体1/2MS培养基中浸泡，从DEX诱导开始每间隔4小时叶片样本，提取总蛋白进行Western Blot。采用Flag抗体(用于检测N端融合Flag标签的蛋白)作为一抗。丽春红染色(用于检测内参蛋白rubisc L)的结果见图4D。

实施例4、ZmMKK10在拟南芥体内功能的研究

功能缺失突变体mpk3(SALK_100651)简称mpk3突变体。

功能缺失突变体mpk6(SALK_127507)简称mpk6突变体。

ZmMKK6^DD转基因植株为实施例3的步骤三得到的。

一、ZmMKK6^DD/mpk3的制备

1、ZmMKK6^DD转基因植株(父本)与mpk3突变体(母本)杂交，收获F0代种子。

2、取步骤1得到的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上(具有潮霉素抗性的植株为ZmMKK10^DD杂合体)，将可以正常生长的抗生素阳性植株移栽到营养土中，筛选mpk3突变杂合体(F1代植株)，得到双杂合体。

3、将步骤2得到的双杂合体自交并收获种子。

4、将步骤3得到的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，从可以正常生长的抗生素阳性植株中通过两次鉴定获得目的植株。第一次鉴定采用westernblot，提取植株叶片的总蛋白，进行western blot(采用Flag抗体作为一抗)。第二次筛选是从westernblot鉴定为阳性的植株中筛选mpk3突变纯合体(F2代植株)。

5、将步骤4得到的mpk3突变纯合体自交并收获种子。

4、将各个mpk3突变纯合体的种子播种于含15mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，如果某一mpk3突变纯合体的后代植株全部为抗生素阳性植株(F3代植株)，则这些F3代植株为ZmMKK6^DD/mpk3植株。

鉴定mpk3突变杂合体和mpk3突变纯合体的方法如下：

取植株叶片，提取基因组DNA作为模板，分别采用mpk3-RP和Lba1组成的引物对甲和mpk3-LP和mpk3-RP组成的引物对乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲和引物对乙均能扩增得到约1Kb的扩增产物、该植株为mpk3突变杂合体，如果采用引物对甲能扩增得到约1Kb的扩增产物且采用引物对乙不能得到约1Kb的扩增产物、该植株为mpk3突变纯合体。

mpk3-LP:5’-CATGAATAAAAGAACAGGCAAAG-3’；

mpk3-RP:5’-TTGGTGTTTTTGTTGTCATGG-3’；

Lba1:5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’。

二、ZmMKK6^DD/mpk6的制备

用mpk6突变体代替mpk3突变体，按照步骤一的方法，得到ZmMKK6^DD/mpk6植株。

鉴定mpk6突变杂合体和mpk6突变纯合体的方法如下：

取植株叶片，提取基因组DNA作为模板，分别采用mpk6-RP和Lba1组成的引物对甲和mpk6-LP和mpk6-RP组成的引物对乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲和引物对乙均能扩增得到约1Kb的扩增产物、该植株为mpk6突变杂合体，如果采用引物对甲能扩增得到约1Kb的扩增产物且采用引物对乙不能得到约1Kb的扩增产物、该植株为mpk6突变纯合体。

mpk6-LP：5’-CTCTGGCTCATCGCTTATGTC-3’；

mpk6-RP：5’-ATCTATGTTGGCGTTTGCAAC-3’；

Lba1:5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’。

三、功能验证

试验种子分别为ZmMKK6^DD/mpk3植株的种子，ZmMKK6^DD/mpk6植株的种子，ZmMKK6^DD转基因植株的种子。

1、同实施例3的步骤三的1。

2、同实施例3的步骤三的2。

3、同实施例3的步骤三的3。

4、同实施例3的步骤三的4。

5、步骤4中培养4周的幼苗，剪取相同叶位的莲座叶，在含15μMDEX的液体1/2MS培养基中浸泡，每间隔4小时叶片样本，提取总蛋白进行Western Blot。采用Flag抗体(用于检测N端融合Flag标签的蛋白)、MPK3抗体或MPK6抗体作为一抗。结果见图5A。在ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株中有46kDa和43kDa两个激酶被激活，在ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株和ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株中46kDa和43kDa两个激酶分别消失。结果表明，46kDa和43kDa两个激酶分别是MPK6和MPK3。

6、同实施例3的步骤三的5。结果见图5B。不进行DEX诱导的情况下，各组植株的后代植株均能正常生长。进行DEX诱导后，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株出现死亡现象，ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株死亡现象明显减弱，ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株死亡现象轻微减缓。

7、参见实施例3的步骤三的7。结果见图5C。不进行DEX诱导的情况下，各组转植株的后代植株均不着色。进行DEX诱导后，ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株有较深的着色，ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株的叶片着色现象明显减弱，ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株的叶片着色明显减弱。

8、参见实施例3的步骤三的8。结果见图5D。ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株的叶片有较高的离子泄露，ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株的叶片离子泄露明显减弱，ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株的叶片离子泄露明显降低。

步骤5至8的结果表明，ZmMKK10通过激活MPK3/MPK6引起细胞死亡。

9、步骤4中培养4周的幼苗以及平行处理的Vector转基因植株的幼苗，取相同叶位的叶片浸泡于密闭瓶(内有含15μMDEX的液体1/2MS培养基)中，诱导生长16h后用GC522气相色谱仪测定乙烯含量。结果见图6A。Vector转基因植株的叶片并不产生乙烯，而ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株的叶片产生较高的乙烯。相对于ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株来说，ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株的叶片中产生的乙烯明显下降，ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株的叶片中产生的乙烯也明显下降。

10、步骤4中培养4周的幼苗以及平行处理的Vector转基因植株的幼苗，取相同叶位的叶片(每组约10个叶片)浸泡于含有含15μMDEX的液体1/2MS MS培养基中，诱导生长16h后用DAB于室温染色2h，然后用90％乙醇脱色。结果见图6B。Vector转基因植株的叶片并没有着色，而ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株的叶片有较深的着色。相对于ZmMKK6^DD转基因植株的后代植株来说，ZmMKK6^DD/mpk6植株的后代植株的叶片着色明显下降，ZmMKK6^DD/mpk3植株的后代植株的叶片的着色也明显下降。

步骤9和步骤10的结果表明，ZmMKK10激活MPK3/MPK6引起乙烯和H₂O₂积累。

将ZmMKK6^WT转基因植株代替ZmMKK6^DD转基因植株，按照实施例4进行操作，结果与ZmMKK6^DD转基因植株的相应结果一致。

实施例5、酵母双杂交试验

pGADT7载体：Clotech公司，货号630442。

pGBKT7载体：Clotech公司，货号630443。

AH109酵母菌株：北京华越洋生物公司，NRR00030。

将猎物基因(猎物基因即ZmMKK10^KR片段，为将序列表的序列2所示DNA分子的第370-372位核苷酸由“AAG”突变为“AGG”得到的DNA分子)插入pGADT7载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到猎物质粒，命名为AD-ZmMKK10^KR。pGADT7载体又称AD-vector。

将诱饵基因插入pGBKT7载体的NdeI和SalI酶切位点之间，得到诱饵质粒。诱饵基因为ZmMPK2片段(序列表的序列7所示DNA分子)时，得到的诱饵质粒命名为BD-ZmMPK2。诱饵基因为ZmMPK3片段(序列表的序列8所示DNA分子)时，得到的诱饵质粒命名为BD-ZmMPK3。诱饵基因为ZmMPK7片段(序列表的序列9所示DNA分子)时，得到的诱饵质粒命名为BD-ZmMPK7。pGBKT7载体又称BD-vector。

将猎物质粒和诱饵质共同导入AH109酵母菌株中，通过营养缺陷型培养基筛选出与ZmMKK10^KR蛋白能够互作的蛋白。

结果见图7。ZmMPK2蛋白、ZmMPK3蛋白、ZmMPK7蛋白均可以与ZmMKK10^KR蛋白互作。

实施例6、体外磷酸化试验

一、构建重组质粒

将ZmMKK10^WT片段(序列表的序列2所示DNA分子)插入载体pGEX4T-1的NdeI和XhoI的酶切位点之间，得到重组质粒1。重组质粒1表达N端融合GST标签的ZmMKK10^WT蛋白。

将ZmMKK10^KR片段(将序列表的序列2所示DNA分子的第370-372位核苷酸由“AAG”突变为“AGG”得到的DNA分子)插入载体pGEX4T-1的NdeI和XhoI的酶切位点之间，得到重组质粒2。重组质粒2表达N端融合GST标签的ZmMKK10^KR蛋白。

将ZmMKK10^DD片段(将序列表的序列2所示DNA分子的第715-717位核苷酸由“TCT”突变为了“GAT”且第733-735位核苷酸由“TCG”突变为了“GAT”得到的DNA分子)插入载体pGEX4T-1的NdeI和XhoI的酶切位点之间，得到重组质粒3。重组质粒3表达N端融合GST标签的ZmMKK10^DD蛋白。

将ZmMPK2基因(序列表的序列7)插入到pET28a(+)载体的NdeI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒4。重组质粒4表达N端融合His标签的ZmMPK2蛋白。

将ZmMPK3基因(序列表的序列8)插入到pET28a(+)载体的NdeI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒5。重组质粒5表达N端融合His标签的ZmMPK3蛋白。

将ZmMPK7基因(序列表的序列9)插入到pET28a(+)载体的NdeI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒6。重组质粒6表达N端融合His标签的ZmMPK7蛋白。

二、制备蛋白

将重组质粒1导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。培养重组菌，菌液OD_600nm值＝1.5时加入IPTG并使其浓度为0.5mM，然后16℃诱导30min，收集菌体。将菌体进行破碎，收集上清液，采用谷胱甘肽琼脂糖(GE公司)进行纯化，得到N端融合GST标签的ZmMKK10^WT蛋白。用重组质粒2代替重组质粒1，进行上述操作，得到N端融合GST标签的ZmMKK10^KR蛋白。用重组质粒3代替重组质粒1，进行上述操作，得到N端融合GST标签的ZmMKK10^DD蛋白。

将重组质粒4导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。培养重组菌，菌液OD_600nm值＝0.8时加入IPTG并使其浓度为0.1mM，然后16℃诱导10小时，收集菌体。将菌体进行破碎，收集上清液，采用镍柱交联琼脂糖(GE公司)进行纯化，得到N端融合His标签的ZmMPK2蛋白。用重组质粒5代替重组质粒4，进行上述操作，得到N端融合His标签的ZmMPK3蛋白。用重组质粒6代替重组质粒4，进行上述操作，得到N端融合His标签的ZmMPK7蛋白。

三、体外磷酸化实验

反应体系(30μL)：含1μg GST融合蛋白、5μg His融合蛋白、10mM MgCl₂、500μMATP、1mM DTT、1μCi[γ-³²P]ATP)，余量为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液。

GST融合蛋白为步骤二制备的N端融合GST标签的ZmMKK10^WT蛋白、N端融合GST标签的ZmMKK10^KR蛋白或N端融合GST标签的ZmMKK10^DD蛋白。His融合蛋白为步骤二制备的N端融合His标签的ZmMPK2蛋白、N端融合His标签的ZmMPK3蛋白或N端融合His标签的ZmMPK7蛋白。

室温反应30min，然后加入10μL4×SDS上样缓冲液终止反应。

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并放射性自显影检测激酶活性。

结果见图8。ZmMPK3蛋白和ZmMPK7蛋白能够被ZmMKK10^WT蛋白磷酸化，ZmMPK2蛋白不能被ZmMKK10^WT蛋白磷酸化。ZmMPK3蛋白和ZmMPK7蛋白能够被ZmMKK10^DD蛋白磷酸化，ZmMPK2蛋白不能被ZmMKK10^DD蛋白磷酸化。ZmMPK3蛋白、ZmMPK7蛋白和ZmMPK2蛋白均不能被ZmMKK10^KR蛋白磷酸化。

结果表明，ZmMKK10蛋白下游的MPK蛋白可能是ZmMPK3蛋白和ZmMPK7蛋白。

四、体外磷酸化实验

反应体系(30μL)：含5μg N端融合GST标签的ZmMKK10^WT蛋白、500μM ATP、1mM DTT、1μCi[γ-³²P]ATP)，二价金属化合物，余量为pH7.5、20mM Tris-HCl缓冲液。

二价金属化合物为MgCl₂或者MnCl₂。

二价金属化合物在反应体系中的浓度分别为：0mM、1mM、10mM、20mM或50mM。

室温反应30min，然后加入10μL4×SDS上样缓冲液终止反应。

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并放射性自显影检测磷酸化活性。

结果见图9。ZmMKK10^WT蛋白在Mg²⁺条件下可以自磷酸化，在Mn²⁺条件下不能自磷酸化。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> ZmMKK10蛋白及其编码基因和应用

<130> GNCYX171647

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Ala Leu Ala Gly Asp Glu Arg Leu Pro Pro Phe His Leu Ser Leu

1 5 10 15

Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Val Gln Glu Ser Ser Phe Arg His Ala

20 25 30

Asn Pro Pro Ser Ser Thr Lys Ala Ile Ala Arg Asn Lys Arg Leu Pro

35 40 45

Pro Phe His Leu Ser Leu Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gln Glu

50 55 60

Pro Ser Ser Arg His Ala Asn Pro Pro Val Ala Ala Pro Glu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Thr Pro Leu Ala Arg Ser Thr Gln Phe Arg Leu Ala Asp Phe Asp

85 90 95

Arg Leu Ala Val Leu Gly Arg Gly Asn Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val

100 105 110

Arg His Arg Glu Thr Cys Ala Leu Tyr Ala Leu Lys Val Leu His Glu

115 120 125

Asp Ala Gly Ala Glu Ala Asp Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Pro Phe

130 135 140

Val Val Arg Cys His Ala Val Leu Pro Ala Ser Cys Ser Ala Gly Asp

145 150 155 160

Val Ala Leu Leu Leu Glu Leu Val Asp Gly Gly Ser Leu Asp Ala Val

165 170 175

Ser Arg Arg Arg Gly Ala Phe Ala Glu Ala Ala Leu Ala Glu Val Ala

180 185 190

Ala Gln Ala Leu Ser Gly Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Arg Val Val

195 200 205

His Leu Asp Val Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ala Thr Ala Ala Gly Glu

210 215 220

Ile Lys Val Ala Asp Phe Gly Ile Ala Arg Val Leu Ser Arg Ser Gly

225 230 235 240

Asp His Cys Thr Ser Tyr Val Gly Thr Ala Ala Tyr Met Ser Pro Glu

245 250 255

Arg Phe Asp Pro Glu Ala His Gly Gly His Tyr Asp Pro Cys Ala Ala

260 265 270

Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Thr Val Leu Glu Leu Leu Met Gly Arg

275 280 285

Tyr Pro Leu Leu Pro Ala Gly Gln Gln Pro Asn Trp Ala Ala Leu Met

290 295 300

Cys Ala Ile Cys Phe Gly Glu Pro Pro Ala Leu Pro Asp Gly Ala Ala

305 310 315 320

Ser Pro Glu Leu Arg Ser Phe Ile Ser Ala Cys Leu His Lys Asp Tyr

325 330 335

Cys Arg Arg Ala Ser Val Ala Glu Leu Leu Ala His Pro Phe Ile Val

340 345 350

Gly Arg Asp Val Leu Ala Ser Arg Asp Ala Leu Gln Gln Leu Val Ala

355 360 365

Glu Ala

370

<210> 2

<211> 1113

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atggctctcg caggagacga gagacttccg ccattccacc tctcgctgaa cgtcccctcc 60

cgtcccgccg tccaggagtc gtccttccgc cacgccaacc ctccaagctc gaccaaggct 120

atcgcaagaa acaagagact tccgccgttc catctctcgc tgaacgtccc ctcccgtccc 180

gccgcccagg agccgtcctc ccgccacgcc aaccctcctg tggccgcgcc ggagccggcc 240

tcgactccgc tcgcacggtc gacccagttc cgcctcgccg acttcgacag gctcgccgtc 300

ctgggccgcg ggaacggcgg caccgtgtac aaggtgcgcc accgcgagac gtgcgcgctc 360

tacgcgctca aggtcctgca cgaggacgcc ggcgccgagg ctgacatcct gggccgcctc 420

gcctcgccgt tcgtcgtccg gtgccacgcc gtcttgccgg ccagctgctc cgccggcgac 480

gtggcccttc tcctcgagct ggtggacggc gggtccctcg acgcggtcag ccgccggcgc 540

ggggcgttcg cggaggccgc gctcgcggag gtggcggcgc aggcgctctc cgggctggcc 600

tacctccacg cccgccgcgt cgtgcacctc gacgtcaagc cgtcgaacct gctcgccacc 660

gcggccggcg agatcaaggt cgccgacttc ggcatcgcca gggtgctctc ccgatctggc 720

gaccactgca cgtcgtacgt gggcaccgcc gcgtacatga gcccggagcg cttcgacccg 780

gaggcgcacg gcgggcacta cgacccctgc gccgccgacg tctggagcct cggggtcact 840

gtcctggagc tcctcatggg ccgctacccc ctgcttcccg ccgggcagca acccaactgg 900

gcggcgctca tgtgcgccat ctgcttcggc gagccgcctg cgctgcccga cggcgcggcg 960

tcaccggagc ttcggagctt catctctgcg tgcctgcaca aagactactg caggagggcg 1020

tccgtggcag agcttctcgc tcacccgttc atcgtcggga gggacgtgct ggcgtcgagg 1080

gacgcgctac aacagctggt cgccgaggcg tag 1113

<210> 3

<211> 611

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ala Leu Ala Gly Asp Glu Arg Leu Pro Pro Phe His Leu Ser Leu

1 5 10 15

Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Val Gln Glu Ser Ser Phe Arg His Ala

20 25 30

Asn Pro Pro Ser Ser Thr Lys Ala Ile Ala Arg Asn Lys Arg Leu Pro

35 40 45

Pro Phe His Leu Ser Leu Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gln Glu

50 55 60

Pro Ser Ser Arg His Ala Asn Pro Pro Val Ala Ala Pro Glu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Thr Pro Leu Ala Arg Ser Thr Gln Phe Arg Leu Ala Asp Phe Asp

85 90 95

Arg Leu Ala Val Leu Gly Arg Gly Asn Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val

100 105 110

Arg His Arg Glu Thr Cys Ala Leu Tyr Ala Leu Lys Val Leu His Glu

115 120 125

Asp Ala Gly Ala Glu Ala Asp Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Pro Phe

130 135 140

Val Val Arg Cys His Ala Val Leu Pro Ala Ser Cys Ser Ala Gly Asp

145 150 155 160

Val Ala Leu Leu Leu Glu Leu Val Asp Gly Gly Ser Leu Asp Ala Val

165 170 175

Ser Arg Arg Arg Gly Ala Phe Ala Glu Ala Ala Leu Ala Glu Val Ala

180 185 190

Ala Gln Ala Leu Ser Gly Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Arg Val Val

195 200 205

His Leu Asp Val Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ala Thr Ala Ala Gly Glu

210 215 220

Ile Lys Val Ala Asp Phe Gly Ile Ala Arg Val Leu Ser Arg Ser Gly

225 230 235 240

Asp His Cys Thr Ser Tyr Val Gly Thr Ala Ala Tyr Met Ser Pro Glu

245 250 255

Arg Phe Asp Pro Glu Ala His Gly Gly His Tyr Asp Pro Cys Ala Ala

260 265 270

Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Thr Val Leu Glu Leu Leu Met Gly Arg

275 280 285

Tyr Pro Leu Leu Pro Ala Gly Gln Gln Pro Asn Trp Ala Ala Leu Met

290 295 300

Cys Ala Ile Cys Phe Gly Glu Pro Pro Ala Leu Pro Asp Gly Ala Ala

305 310 315 320

Ser Pro Glu Leu Arg Ser Phe Ile Ser Ala Cys Leu His Lys Asp Tyr

325 330 335

Cys Arg Arg Ala Ser Val Ala Glu Leu Leu Ala His Pro Phe Ile Val

340 345 350

Gly Arg Asp Val Leu Ala Ser Arg Asp Ala Leu Gln Gln Leu Val Ala

355 360 365

Glu Ala Gly Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

370 375 380

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

385 390 395 400

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

405 410 415

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

420 425 430

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

435 440 445

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

450 455 460

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

465 470 475 480

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

485 490 495

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

500 505 510

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

515 520 525

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

530 535 540

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

545 550 555 560

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

565 570 575

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

580 585 590

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

595 600 605

Leu Tyr Lys

610

<210> 4

<211> 1836

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atggctctcg caggagacga gagacttccg ccattccacc tctcgctgaa cgtcccctcc 60

cgtcccgccg tccaggagtc gtccttccgc cacgccaacc ctccaagctc gaccaaggct 120

atcgcaagaa acaagagact tccgccgttc catctctcgc tgaacgtccc ctcccgtccc 180

gccgcccagg agccgtcctc ccgccacgcc aaccctcctg tggccgcgcc ggagccggcc 240

tcgactccgc tcgcacggtc gacccagttc cgcctcgccg acttcgacag gctcgccgtc 300

ctgggccgcg ggaacggcgg caccgtgtac aaggtgcgcc accgcgagac gtgcgcgctc 360

tacgcgctca aggtcctgca cgaggacgcc ggcgccgagg ctgacatcct gggccgcctc 420

gcctcgccgt tcgtcgtccg gtgccacgcc gtcttgccgg ccagctgctc cgccggcgac 480

gtggcccttc tcctcgagct ggtggacggc gggtccctcg acgcggtcag ccgccggcgc 540

ggggcgttcg cggaggccgc gctcgcggag gtggcggcgc aggcgctctc cgggctggcc 600

tacctccacg cccgccgcgt cgtgcacctc gacgtcaagc cgtcgaacct gctcgccacc 660

gcggccggcg agatcaaggt cgccgacttc ggcatcgcca gggtgctctc ccgatctggc 720

gaccactgca cgtcgtacgt gggcaccgcc gcgtacatga gcccggagcg cttcgacccg 780

gaggcgcacg gcgggcacta cgacccctgc gccgccgacg tctggagcct cggggtcact 840

gtcctggagc tcctcatggg ccgctacccc ctgcttcccg ccgggcagca acccaactgg 900

gcggcgctca tgtgcgccat ctgcttcggc gagccgcctg cgctgcccga cggcgcggcg 960

tcaccggagc ttcggagctt catctctgcg tgcctgcaca aagactactg caggagggcg 1020

tccgtggcag agcttctcgc tcacccgttc atcgtcggga gggacgtgct ggcgtcgagg 1080

gacgcgctac aacagctggt cgccgaggcg ggtaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg 1140

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1200

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1260

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 1320

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1380

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1440

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1500

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1560

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1620

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1680

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 1740

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 1800

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaa 1836

<210> 5

<211> 380

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His Met Ala Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Glu Arg Leu Pro Pro Phe His Leu Ser Leu Asn Val Pro Ser Arg Pro

20 25 30

Ala Val Gln Glu Ser Ser Phe Arg His Ala Asn Pro Pro Ser Ser Thr

35 40 45

Lys Ala Ile Ala Arg Asn Lys Arg Leu Pro Pro Phe His Leu Ser Leu

50 55 60

Asn Val Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gln Glu Pro Ser Ser Arg His Ala

65 70 75 80

Asn Pro Pro Val Ala Ala Pro Glu Pro Ala Ser Thr Pro Leu Ala Arg

85 90 95

Ser Thr Gln Phe Arg Leu Ala Asp Phe Asp Arg Leu Ala Val Leu Gly

100 105 110

Arg Gly Asn Gly Gly Thr Val Tyr Lys Val Arg His Arg Glu Thr Cys

115 120 125

Ala Leu Tyr Ala Leu Lys Val Leu His Glu Asp Ala Gly Ala Glu Ala

130 135 140

Asp Ile Leu Gly Arg Leu Ala Ser Pro Phe Val Val Arg Cys His Ala

145 150 155 160

Val Leu Pro Ala Ser Cys Ser Ala Gly Asp Val Ala Leu Leu Leu Glu

165 170 175

Leu Val Asp Gly Gly Ser Leu Asp Ala Val Ser Arg Arg Arg Gly Ala

180 185 190

Phe Ala Glu Ala Ala Leu Ala Glu Val Ala Ala Gln Ala Leu Ser Gly

195 200 205

Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Arg Val Val His Leu Asp Val Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Leu Leu Ala Thr Ala Ala Gly Glu Ile Lys Val Ala Asp Phe

225 230 235 240

Gly Ile Ala Arg Val Leu Ser Arg Ser Gly Asp His Cys Thr Ser Tyr

245 250 255

Val Gly Thr Ala Ala Tyr Met Ser Pro Glu Arg Phe Asp Pro Glu Ala

260 265 270

His Gly Gly His Tyr Asp Pro Cys Ala Ala Asp Val Trp Ser Leu Gly

275 280 285

Val Thr Val Leu Glu Leu Leu Met Gly Arg Tyr Pro Leu Leu Pro Ala

290 295 300

Gly Gln Gln Pro Asn Trp Ala Ala Leu Met Cys Ala Ile Cys Phe Gly

305 310 315 320

Glu Pro Pro Ala Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ser Pro Glu Leu Arg Ser

325 330 335

Phe Ile Ser Ala Cys Leu His Lys Asp Tyr Cys Arg Arg Ala Ser Val

340 345 350

Ala Glu Leu Leu Ala His Pro Phe Ile Val Gly Arg Asp Val Leu Ala

355 360 365

Ser Arg Asp Ala Leu Gln Gln Leu Val Ala Glu Ala

370 375 380

<210> 6

<211> 1223

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ctcgaggtat ttttacaaca attaccaaca acaacaaaca acaaacaaca ttacaattac 60

tatttacaat tacaattacc atggactaca aggacgacga tgacaagcat atggctctcg 120

caggagacga gagacttccg ccattccacc tctcgctgaa cgtcccctcc cgtcccgccg 180

tccaggagtc gtccttccgc cacgccaacc ctccaagctc gaccaaggct atcgcaagaa 240

acaagagact tccgccgttc catctctcgc tgaacgtccc ctcccgtccc gccgcccagg 300

agccgtcctc ccgccacgcc aaccctcctg tggccgcgcc ggagccggcc tcgactccgc 360

tcgcacggtc gacccagttc cgcctcgccg acttcgacag gctcgccgtc ctgggccgcg 420

ggaacggcgg caccgtgtac aaggtgcgcc accgcgagac gtgcgcgctc tacgcgctca 480

aggtcctgca cgaggacgcc ggcgccgagg ctgacatcct gggccgcctc gcctcgccgt 540

tcgtcgtccg gtgccacgcc gtcttgccgg ccagctgctc cgccggcgac gtggcccttc 600

tcctcgagct ggtggacggc gggtccctcg acgcggtcag ccgccggcgc ggggcgttcg 660

cggaggccgc gctcgcggag gtggcggcgc aggcgctctc cgggctggcc tacctccacg 720

cccgccgcgt cgtgcacctc gacgtcaagc cgtcgaacct gctcgccacc gcggccggcg 780

agatcaaggt cgccgacttc ggcatcgcca gggtgctctc ccgatctggc gaccactgca 840

cgtcgtacgt gggcaccgcc gcgtacatga gcccggagcg cttcgacccg gaggcgcacg 900

gcgggcacta cgacccctgc gccgccgacg tctggagcct cggggtcact gtcctggagc 960

tcctcatggg ccgctacccc ctgcttcccg ccgggcagca acccaactgg gcggcgctca 1020

tgtgcgccat ctgcttcggc gagccgcctg cgctgcccga cggcgcggcg tcaccggagc 1080

ttcggagctt catctctgcg tgcctgcaca aagactactg caggagggcg tccgtggcag 1140

agcttctcgc tcacccgttc atcgtcggga gggacgtgct ggcgtcgagg gacgcgctac 1200

aacagctggt cgccgaggcg tag 1223

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 7

atggcgatga tggtggatcc tccgaatgga atcgggaacc aaggaaagca ttactactca 60

atgtggcaga ccttatttga gatagacacc aaatatgtac cgatcaagcc cattggtcga 120

ggagcttatg ggatagtttg ttcatccatt aatcgtgaaa caaatgagaa agtagcaata 180

aagaagatac acaacgtttt cgacaaccgt gtggatgcac tacggacctt gcgggagctg 240

aaactccttc gccatctccg gcatgagaat gtcattgctt tgaaggatat aatgatgcca 300

atacacagga gaagctttaa ggatgtgtac ttggtatacg aactcatgga tactgatttg 360

caccagataa tcaaatcacc tcagggcctt tccaatgacc actgccagta ttttcttttt 420

cagttgctcc gaggactcaa atatctccat tcagcagaaa tactccacag agacctaaaa 480

cctggaaacc tgctggtgaa tgcaaattgt gatctgaaga tatgtgattt tggtctcgca 540

cgtacaaaca gtagcaaagg ccagttcatg actgaatacg tcgtcacccg ctggtacaga 600

gctcctgagc tgctcctctg ctgcgacaac tacggcacat ccatagacgt ctggtctgtt 660

gggtgcatct ttgctgagct ccttggccgc aagccaatat ttccaggaac tgaatgcctg 720

aatcaactca agctcatagt gaacgtcctc ggcaccatga gtgaggctga cctagagttc 780

atcgacaacc caaaggctcg gagatacatc aagtcccttc cctatacccc tggtgttccc 840

ctcgtaagta tgtacccaca tgcgcaccct cttgccattg atctgttgca gaagatgctc 900

atcttcgacc ccaccaaaag gatcagtgtc accgaggctc tcgagcaccc ttacatgtcc 960

cctctgtatg atccaagcgc aaatccccca gcccaagtgc ccatcgatct ggacatagac 1020

gaaaacatca gctcagagat gatccgggaa atgatgtggc aggagatgct tcactaccac 1080

cctgaagttg ccacagcaat aagcatgtca tga 1113

<210> 8

<211> 1131

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 8

atgagctccg ccggaggcat ggacgggtct ccgccggtcg ccgaattcca gccgacggtg 60

acgcacggcg gccggttcct ccggtacaat atcttcggca acctgttcga gatcacgcgc 120

aagtaccagc ctcccgtcat gcccatcggc cgcggcgcct acgggatcgt ctgctcggtg 180

atgaacttcg agacgaggga gatggtggcc atcaagaaga tcgccaacgc cttcgacaac 240

cacatggacg ccaagcgcac gctccgggag atcaagctga tgcggcacct cgaccacgag 300

aacatcatcg gcatcaggga cgtgatcccg ccgccgatcc cgcgggcttt caacgacgtg 360

tacatcggca tggagttcat ggagacggac ctccaccaga tcatccgctc cgggcaggag 420

ctgtcggagg agcactgcca gtacttcctg taccagatcc tgcgcgggct caagtacatc 480

cactccgccg gcgtgatcca ccgcgacctc aagcccagca acctgctgct cagcgccaac 540

tgcgacctca agatctgcga cttcgggctg gcgcgcccgt cctccgacag cgacatgatg 600

acggagtacg tggtgacgcg gtggtaccgc gcgcccgagc tgctgctcaa ctccaccgac 660

tactcggcgg ccatcgacgt ctggtccgtc ggctgcatct tcatggagct catcgaccgc 720

cgcccgctct tccccggccg cgaccacatg caccagatgc gcctcataac cgaggtgatt 780

ggaacgccga cggacgacga gctcggcttc acccggaacg aggacgcgcg gaagtacatg 840

cgccacctcc cgcaattccc gcgccggccg ttcgcgagcc tgttcccccg ggtgcagccc 900

ctcgcgctgg acctcatcga gcgcatgctc accttcaacc cgctgcagag gatcacagtt 960

gcggaggcgc tggcgcaccc gtatctggag cggctacacg acgtcgacga cgagcccgtc 1020

tgcacggagc cgttctcgtt cgacttcgag cggcaggctc tgacagaaga ccagatgaag 1080

cagctgatat tcaacgaggc catcgagctg aaccccagtt tccgatatta g 1131

<210> 9

<211> 1197

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 9

atggacggcg gggggcagcc cccggacacg gagatgacag acgccggctt gggcggcggg 60

gggcagccgc cgccgccgcc gcagcagccg gcgggcgggg ccgggatgat ggagaacatc 120

cacgcgacgc tcagccacgg tggccgcttc atccagtaca acatcttcgg caacgtgttc 180

gaggtcacct ccaagtacaa gccccccatc ctccccatcg gcaagggcgc ctacggcatc 240

gtctgctcgg cgctcaactc cgagacggca gagcaggtgg ccatcaagaa gatcgccaac 300

gccttcgaca acaagatcga tgccaagcgc acgctccgcg agatcaagct gctccgccac 360

atggaccacg agaatattgt tgcaataaga gatatcatac ctcctccatt gagggaggca 420

ttcaatgatg tgtatattgc ctatgaattg atggatactg atctgcatca aattattcgt 480

tcaaatcaag ctttgtcaga ggagcactgt cagtattttc tttatcaaat tcttcgtggc 540

ttgaagtata tacattcagc aaatgtcctt caccgtgact tgaagcctag caatcttctt 600

ttgaatgcaa actgtgacct caagatatgt gattttgggc ttgctcgcac cacctcagaa 660

actgatttta tgactgaata tgttgtcaca agatggtata gagcaccaga gcttttattg 720

aactcctctg aatatactgc tgccattgat gtgtggtctg tgggctgtat atttatggaa 780

ctgatggacc gaaaaccctt gtttcctgga agagatcatg tccatcagct acgtctacta 840

atggagctca ttggaacacc gaatgaggct gatcttgatt ttgtaaatga aaatgcaaga 900

agatatatcc gccaacttcc ctgtcatgct agacagtcct tccctgaaaa atttccacat 960

gtacaacctt tagcaattga cctagtggaa aagatgctaa cttttgatcc tagacagaga 1020

ataactgttg aaggcgcact tgcacaccct tacttggcat cacttcatga cataagtgat 1080

gagccagtct gctcaatgcc cttcagcttc gacttcgagc agcatgcatt atctgaagaa 1140

cagatgaagg atctgatcta ccaagaggct cttgcattca acccagatta ccagtag 1197

Claims

1.ZmMKK10蛋白或ZmMKK10融合蛋白的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）促进植物体内乙烯的积累；

（b2）增加植物体内乙烯的含量；

所述ZmMKK10蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述ZmMKK10融合蛋白为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或者由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。