CN102144033A - 具有修饰的生长特征的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及分子生物学领域并且涉及改进植物中多种经济上重要的生长特征的方法。更特别地，本发明涉及通过调节编码HUB1(组蛋白单泛素化1)多肽的核酸或者编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸在植物中的表达来修饰植物生长特征的方法。所述修饰的生长特征包括修饰光调节的表型，如修饰的昼夜节律钟和/或昼夜节律钟应答，或修饰的植物结构。

Description

具有修饰的生长特征的植物及其制备方法
本发明一般涉及分子生物学领域并且涉及通过调节编码HUB1(组蛋白单泛素化1)的核酸或者编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸在植物中的表达来修饰多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码HUB1的核酸或者编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或者其他对照植物具有修饰的生长特征。本发明还提供了迄今为止未知的HUB1编码核酸，和可用于本发明方法的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生经常含有异源性遗传组分的植物，所述异源性遗传组分可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后将该遗传物质导入植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期活力(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。
种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜(canola)和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。
许多作物的一个重要性状是早期活力。提高早期活力是温带和热带稻栽培种中现代稻育种程序的重要目标。长根对于水中播种的稻的正确土壤锚定是重要的。当稻直接播种到被淹没的田间并且当植物必须快速出水时，较长的根与萌发势有关。当实施播种机播种时，较长的中胚轴和胚芽鞘对于好的幼苗萌出是重要的。将早期活力改造到植物中在农业中是重要的。例如，弱的早期活力局限于对于基于欧洲大西洋部玉米带种质的玉米杂种的引入产生限制。
另一有趣的性状是植物的开花时间。植物的生存期可分为如下时期，如萌发、营养性生长、生殖生长和衰老。开花时间是播种和生殖生长开始之间经过的时间。它是植物生命中关键的时刻，其决定了从营养生长向生殖生长的过渡，在一些植物中与衰老的开始重合。在许多植物中，这是苗顶端分生组织停止形成叶子并且开始形成花的时间点，对形态发生具有重要影响，影响例如所形成的器官数目和植物的总体大小和形状。开花时间也影响植物中的其他产量相关的性状。通常，早开花品种显示出较少的分枝或者分蘖并且因此较不浓密。此类性状对于农民例如简化作物管理是有利的。另一方面，延迟的开花可以导致植物具有更多营养器官，例如，更多叶子，这在许多作物，尤其在收获的营养器官的作物如莴苣中是所希望的性状。植物的营养和生殖期的相对持续时间直接影响其种子产量。在一些植物中，开花时间的控制是一种用于避免胁迫如干旱的不利影响的机制。开花时间也可以影响作物的质量性状，例如饲料作物中的草本质量，其中开花的延迟可以导致更高的消化率。开花时间影响培养期的长度。作物的开花时间的修饰可以导致延长栽培的地理区域并且因此增加栽培面积的可能性。它也可以导致植物更适于给定环境中的农业，例如，早期开花可以允许在如下地区中的晚种植，在所述地区中，作物建立可以受到低温的不利影响或者可以允许早收获以避免季节结束时的生物和非生物压力，因此导致作物产量的增加。因此，控制开花时间的能力是重要的因素，在农业领域具有许多工业应用。
对于作物植物，也重要的是充分应答它们所暴露的昼夜节律。对环境中规则改变的预期通过缩短环境改变和其生理应答之间的延迟而给予了植物生长优势。例如，黎明前光合作用途径的活化允许最佳地使用光照期，或者适时活化干旱胁迫应答保护植物免于温暖夏季下午的水分短缺。
另一重要的性状是提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界作物减产的主要原因，对于多数作物植物，将平均产量减少50％以上(Wang等，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫的耐受性的能力对于世界上的农场主将具有主要的经济利益并且将允许在不利条件下和否则不可能栽培作物的领域中栽培作物。
因此，通过优化上述因素之一可以提高作物产量。
取决于最终用途，某些产量性状的修饰可以相对于其他性状是有利的。例如，对于诸如粮草或木材生产或生物燃料来源的应用，植物的营养部分的增加可以是想要的，对于诸如面粉、淀粉或油生产的应用，种子参数的增加可以是尤其想要的。甚至在种子参数中，一些可以比其他有利，这取决于应用。多种机理可以促进提高种子产量，无论其为增加的种子大小或增加的种子数目的形式。
增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法是通过修饰植物的内在生长机理，如细胞周期、昼夜节律或者涉及植物生长或防御机理的多种信号途径。
昼夜节律控制植物代谢、生理和发育的许多方面。植物利用环境信号，如每日光暗周期或者规则的温度变动来保持生物学计时机理。该机理已知为昼夜节律钟，通常表示为所称作的振荡子，其由一组蛋白质组成，这些蛋白质以正和负转录反馈环的复杂模式相互作用，综述见McClung(PlantCell 18，792-803，2006)和Gardner等人(Biochemical Journal 397，15-24，2006)。该振荡子通过外部信号(如光，通过植物光敏素和隐花色素感知)校准，这些信号通过“输入途径”传递到振荡子。振荡子又控制许多途径(“输出途径”)，这些途径调节受到每日环境改变影响的生理过程。综述在Barak等人(Trends in Plant Science 5，517-522，2000)中给出并且包括例如，诱导开花、花瓣的打开、气孔的打开或关闭、下胚轴的生长、子叶和叶子的运动、叶绿体的运动、与光合作用和有关的生物化学和生理学过程相关的基因的表达、细胞质钙浓度，和蛋白质像磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的磷酸化状态。
现在已经发现通过调节植物中编码植物中HUB1(组蛋白单泛素化1)的核酸的表达，可以改变植物中的许多生长特征。
背景
泛素化在调节蛋白质更新中起关键作用。泛素是高度保守的76氨基酸蛋白质并且是细胞中最丰富的蛋白质之一。发现泛素蛋白质与其他蛋白质如翻译后修饰关联。已经表明多泛素化——四个以上泛素的连接——指导蛋白质降解。泛素缀合需要三种酶或蛋白质复合体的顺序作用，这些酶即泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)，和泛素-蛋白质连接酶(E3)。泛素最初在ATP依赖的反应中连接到E1酶。泛素活化后，它通过硫酯键被转移到E2酶。最后，E3连接酶用连接的泛素将底物和E2连接在一起。一旦多泛素链在底物上装配，那么该底物被捕获并且被26S蛋白酶体降解。底物识别步骤通过E3连接酶介导，E3连接酶通常含有作为E2的“停靠位点”的RING结构域。E3连接酶蛋白质以两种形式出现：作为直接结合E2和它们的底物的单链E3，和作为多亚基复合体，其中RING指蛋白是基本组分。E3连接酶的分类是基于结构域像E6-AP C-末端、U盒或者ReallyInteresting Gene(RING)结构域的存在。RING结构域是一种特定类型的锌指结构域，其结合两个锌原子并且参与蛋白质-蛋白质相互作用。已经公认泛素依赖的蛋白质降解是细胞周期、DNA修复、转录、蛋白质质量控制和免疫应答的重要的调节手段。
hub1(组蛋白单泛素化1)突变体，也称作hub1-1、ang4-1或rdo4，属于angusta类别的隐性突变体，其特征是减小的叶子尺寸和狭窄叶片(Berná等，Genetics 152，729-742，1999)，和缩短的种子休眠期(Peeters等，Physiol.Plant.115，604-612，2002；Liu等，Plant Cell 19，433-444，2007)。萌发试验(其中在7天后对发芽种子的百分数打分)表明该百分数与野生型种子相比更高。然而，幼苗生长依赖于培养基中蔗糖的存在(Liu等，2007)。突变植物与野生型相比很小并且具有狭窄叶子，并且根生长受到不利影响(Fleury等，Plant Cell 19，417-432，2007)。拟南芥中处于强CaMV35S启动子控制下的HUB1基因的过表达导致具有增加的叶子尺寸的植物(Cnops等，WO2006/027310)。推测(Liu等，2007和Fleury等，2007)HUB1涉及染色质重建，但是HUB1也可以涉及蛋白质降解：表明BRE1——HUB1的酵母同源物——与RAD6和蛋白酶体相互作用(Xiao等，Mol.Cell.Biol.25，637-651，2005)并且HUB1或HUB2还与Staring密切合作，Staring是也涉及蛋白质降解的一种蛋白质(Chin等，J.Biol.Chem.277，35071-35079，2002)。
概述
令人惊奇地，现在已经发现调节编码HUB1多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有修饰的生长特征，尤其修饰的光调节的表型、增加的种子产量、增加的胁迫抗性、增加的早期活力的植物。
根据一个实施方案，提供了相对于对照植物修饰植物的生长特征的方法，包括调节植物中编码HUB1多肽的核酸的表达。所述修饰的生长特征包括相对于对照植物增加的种子产量、增加的胁迫抗性、增加的早期活力和修饰的光调节的表型，但是不包括增加的营养生物量。
本发明还包括HUB1的显性阳性突变体的构建；因此，在另一实施方案中，提供了HUB1的显性阳性突变体形式和其用于改进植物的生长特征的用途。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式的通过肽键连接在一起的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合未分枝形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而缺少所述转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比N端融合或C端融合小约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的实例
  残基   保守性取代   残基   保守性取代
  Ala   Ser   Leu   Ile；Val
  Arg   Lys   Lys   Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met   Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe   Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser   Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr   Ser；Val
  Glu   Asp   Trp   Tyr
  Gly   Pro   Tyr   Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val   Ile；Leu
  Ile   Leu，Val
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然发生形式的蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然发生的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然发生的氨基酸残基的添加。蛋白质“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，它们包含天然发生的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然发生的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然发生的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标记肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(标记肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来自共同的祖先基因。
结构域
术语”结构域″指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语”基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语”杂交″是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交体形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cbb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交体：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。
cL＝双链体的长度(以碱基对计)。
dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。本领域技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)，BMC Bioinformatics.；6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF的其他3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因该启动子的修饰，或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 GenomeMethods 6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。一般，“中等强度启动子”意指在低于强启动子的水平上，尤其在所有情况下低于处于35S CaMV启动子控制下所得水平的水平下驱动编码序列表达的启动子。
有效连接
如本文中所用的术语”有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
Figure BDA0000046184160000141
遍在启动子
遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导性启动子
诱导性启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。
根特异性启动子的实例在下面的表2b中列出：
表2b：根特异性启动子的实例
Figure BDA0000046184160000151
种子特异性启动子主要在种子组织中具有转录活性，但不一定仅仅在种子组织中具有转录活性(在渗漏表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育和/或种子萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳、糊粉粒、和/或胚特异性的。种子特异性启动子的实例在下面的表2c中显示。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(PlantBiotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，将其公开并入本文作为参考，就好像完整给出一样。
表2c：种子特异性启动子的实例
Figure BDA0000046184160000162
Figure BDA0000046184160000171
Figure BDA0000046184160000181
如本文定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。
可以用于实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下面的表2d中显示。
表2d：绿色组织特异性启动子实例
  基因   表达   参考文献
  玉米正磷酸二激酶   叶特异性   Fukavama等，2001
  玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶   叶特异性   Kausch等，2001
  稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶   叶特异性   Liu等，2003
  稻小亚基Rubisco   叶特异性   Nomura等，2000
  稻β扩展蛋白EXBP9   根特异性   WO 2004/070039
  木豆小亚基Rubisco   叶特异性   Panguluri等，2005
  豌豆RBCS3A   叶特异性
组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中具有转录活性，基本上排除植物的任何其他组织，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。可用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例在下面的表2e中显示。
表2e：分生组织特异性启动子的实例
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。
调节
术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加的或减少的。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
表达
术语“表达”或“基因表达”指一种或多种特定基因或者基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其指基因或基因构建体转录为结构RNA(rRNA，tRNA)或者mRNA，其随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语”增加的表达”或“过量表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。
在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。
若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其它真核基因。
内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5′末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可以分离自生物或者可以是人造的，例如，通过化学合成。
降低的表达
本文中提及的”降低的表达”或“降低或基本去除”表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％，或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。
为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含调节序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其它一般细节，见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。
一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。″反义″核酸序列包含与编码蛋白质的″有义″核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区″指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区″指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5′和3′非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和′加帽′及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修饰是本领域众所周知的。
这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。
根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。
当在内源基因上存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。
另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-36 1992和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。
通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA，Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的，Schwab等，Plant Cell 18，1121-1133，2006。
为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
选择性标记(基因)/报道基因
“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供
Figure BDA0000046184160000271
抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。本领域技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。
因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)。
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的或在基因组文库中存在的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然发生的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然发生的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中(该核酸序列)的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸序列的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
转化
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、胼胝体组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由
Figure BDA0000046184160000311
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet 208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ und Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenicplastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA激活标签化
T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是基因组内定向诱导的局部损伤的缩写并且意指用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且存在无论靶生物如何可一般应用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量
术语”产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。
早期活力
早期活力(尤其在植物生长早期期间活跃、健康、良好平衡的生长)可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期活力的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期活力可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。
增加/改善/增强
术语“增加”，”改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。
绿色指数
本文所用的“绿色指数”从植物的数字图像计算而来。对于属于图像上植物物体的每个像素，计算绿色值与红色值的比值(用于编码颜色的RGB模式)。将绿色指数表示为绿色与红色比值超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下，和在降低的养分有效性生长条件下，在开花之前测量最后成像中植物的绿色指数。相比，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后第一次成像中植物的绿色指数。
植物
如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、Eragrostis tef、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(紫苜蓿)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryzaspp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(蓖麻)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(马铃薯)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(两色蜀黍)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(普通小麦)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
发明详述
令人惊奇地，现在已经发现调节植物中编码HUB1多肽的核酸的表达得到了相对于对照植物具有修饰的生长特征的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了相对于对照植物改变植物中生长特征，尤其修饰光调节的表型的方法，包括调节植物中编码HUB1多肽或其部分的核酸的表达。在一个具体实施方案中，HUB1被异常表达，所述修饰的光调节的表型包括修饰植物的昼夜节律钟、修饰昼夜节律钟下游途径，如修饰的光合能力(通过减少的光合色素、质体结构中的缺陷来示例)、发育基因的修饰的表达模式，和/或修饰的植物发育，其通过改变的开花时间或者修饰的植物结构(包括叶子形态、花形态或者下胚轴长度)来示例。根据另一实施方案，本发明提供了相对于对照植物改进植物中生长特征，尤其增加的早期活力、增加的萌发势和/或增加的产量(生物量和/或种子产量)的方法，包括调节植物中编码HUB1多肽的核酸的表达，和/或包括调节编码HUB1的靶蛋白和/或与HUB1相互作用的蛋白质的基因的表达。
调节(增加或减少)编码HUB1多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码HUB1多肽或其部分的核酸。如本发明使用的术语基因的“异常表达”包括基因的下调的表达以及该基因编码的蛋白质的降低的活性，这通过例如降低该蛋白质的浓度(减少的合成或增加的降解)或通过在蛋白质中引入突变以降低内在活性或者与配体、辅因子或其他相互作用因子相互作用的能力来实现。下调表达的方法在定义部分中提供。
下文中对“用于本发明方法的蛋白质”的任何参考指如本文定义的HUB1多肽。下文中对“用于本发明方法的核酸”的任何参考指能够编码此类HUB1多肽或其部分的核酸。待引入植物(因此可用于实施本发明方法)的核酸是编码现在描述类型蛋白质的任何核酸，其在下文中也称作“HUB1核酸”或“HUB1基因”。
如本文定义的“HUB1多肽”指包含RING结构域的泛素-蛋白质连接酶(E3连接酶)。E3连接酶介导底物蛋白质的泛素化。优选地，HUB1多肽属于RING HCa类别的E3连接酶蛋白质(Stone等，Plant Physiol.137，13-30，2005)。RING结构域是特定类别的锌指结构域并且涉及蛋白质-蛋白质相互作用。优选地，RING结构域是C3HC4型RING结构域并且对应于Pfam条目PF00097。C3HC4结构域具有下面的共有序列(Lorick等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11364-11369，1999)：
Figure BDA0000046184160000391
(辅因子配位残基通过粗体下划线标出，也见图2中的多比对)。优选地，共有序列是C3HC4据报导结合2个金属辅因子，尤其锌；第一个辅因子推定被前四个配位残基(图1B(i)中的数字1到4)结合，第二个辅因子推定被后四个配位残基(图1B(i)中的数字5到8)结合。
如本发明使用的术语“HUB1多肽”也包括具有降低的自身多泛素化但是具有正常的、降低的或者完全消除的底物泛素化活性(HUB1多肽的显性阳性形式)的突变体形式。在一种此类显性阳性形式中，C3HC4结构域(图1B(i))的Cys残基nr 1和2被突变成Ser残基(图1B(ii)和(iii))。
备选地，HUB1蛋白质的同源物以优选性递增顺序具有与SEQ ID NO：2表示的氨基酸至少18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的总体序列同一性，条件是同源蛋白包含如上面列出的保守基序。使用总体比对算法，如GAP程序(GC G Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选使用默认参数确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比，当考虑仅仅保守结构域或基序(如RING结构域，见实施例3)时，序列同一性将通常更高。
优选地，当用于构建系统树，如图3中描绘的系统树时，所述多肽序列与包含SEQ ID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽组而不是包含RING结构域的蛋白质的任何其他组聚类。
术语“结构域”、“标记”和“基序”在文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation(用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能)，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(瑞士生物信息学研究所(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可以使用常规技术如通过序列比对而鉴定。
用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的全局性(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法(以百分数计)而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列或氨基酸或针对选择的结构域或保守基序测定了序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法尤其有用(SmithTF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
此外，HUB1多肽(至少在它们的天然形式)通常介导组蛋白H2B的单泛素化。用于测量体外泛素化的工具和技术是本领域公知的，见例如，Fleury等(2007)或Liu等(2007)。其他细节在实施例6中提供。
此外，HUB1多肽当根据本发明以及实施例部分概述的方法在稻或拟南芥中表达时，产生了植物，所述植物具有修饰的光调节的表型、增加的早期活力、增加的萌发势和/或增加的种子产量相关的性状，包括(但不限于)种子总数、饱满种子数或总种子重量。
本发明还提供了HUB1多肽的显性阳性形式。在一个显性阳性形式(HUB1pm)中，C3HC4结构域(图1B(i))的Cys残基nr 1和2被突变成Ser残基(图1B(ii)和(iii))。令人惊奇地，H2B单泛素化不受这些点突变的影响(图5，HA-Ab)而HUB1的自体多泛素化活性受到不利影响。底物的存在也降低了自体多泛素化活性，提示不存在底物时，HUB1蛋白质可以通过蛋白质降解去除。该降低的自身调节可以导致蛋白质的稳定化，从而产生具有增强活性的蛋白质的显性阳性形式。
野生型HUB1的过表达对植物生长具有积极影响，因此预期HUB1的显性阳性或稳定化形式可以允许进一步改进这些生长效应(见实施例16)。也推测基本上阻止两个Zn结合位点之一中辅因子结合的其他突变将对蛋白质功能具有相当的效果；这些其他突变包括任一类型的突变，包括插入诱变以破坏或增加可读框。如本发明中使用的术语“HUB1多肽”从而也包括具有降低的自体多泛素化但是具有正常的、降低的或者完全消除的底物泛素化活性的突变体形式。
因此，根据本发明的另一实施方案，提供了分离的多肽，其选自：
(i)编码如上文定义的HUB1蛋白质的多肽序列，其在它的RING结构域中包含一个或多个突变，所述突变基本上阻止Zn结合位点中的辅因子结合，并且其中所述一个或多个突变降低自体多泛素化而不影响底物泛素化；
(ii)SEQ ID NO：28所代表的HUB1多肽序列；
(iii)多肽序列，其以优选性升序与SEQ ID NO：28代表的氨基酸序列有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性，并且包含RING结构域，所述RING结构域包含如(i)中定义的一个或多个突变；
(iv)上面(i)，(ii)或(iii)中给出的任一氨基酸序列的功能片段，条件是该功能片段包含RING结构域，所述RING结构域包含如(i)中定义的一个或多个突变。
优选地，如上面(i)中定义的HUB1多肽序列是这样的HUB1多肽，其中一个辅因子的结合基本上被阻止，更优选地，第一个辅因子的结合被阻止。
根据本发明的进一步实施方案，也提供了编码如上面(i)到(iv)定义的HUB1多肽的分离的核酸分子，或者能够在严格条件下与编码如上面(i)到(iv)定义的HUB1多肽的分离的核酸的互补序列杂交的核酸；优选地，所述分离的核酸如SEQ ID NO：49表示。
在进一步的实施方案中，本发明提供了相对于相应野生型植物中的表达水平，在过表达HUB1多肽的植物中具有改变的表达水平的基因。此外，本发明提供了调节这些基因表达的手段，其又允许调节它们所控制的生物学过程。本发明提供了通过操作涉及HUB1多肽调节途径的下游因子来模拟HUB1多肽水平和/或活性的方法。该策略允许微调HUB1多肽的效果。而HUB1多肽的过表达或下调可以是多效性的和/或可以具有多效效果，本发明提供了通过使用本发明定义的HUB1多肽靶基因以更受控的和定向的方式改变植物特征的方法。特定生物学过程的调节现在是可能的并且可以产生具有改变特征的植物，其可以在农业和园艺学中具有尤其有用的应用，如在正常或胁迫条件下生长的植物的改进的产量相关性状。
因此，根据本发明，提供了增强植物中一种或多种产量相关性状的方法，包括修饰植物中一种或多种核酸的表达和/或修饰一种或多种蛋白质的水平和/或活性，所述核酸或蛋白质与表G到K中所列的任一种基因基本上相似，并且其中所述一种或多种产量相关性状相对于相应的野生型植物被改变。此外，本发明提供了修饰植物中昼夜节律钟、修饰光合作用能力和/或修饰植物发育的方法。
本发明通过用编码SEQ ID NO：2的多肽序列的SEQ ID NO：1所表示的核酸序列转化植物，以及包含HUB1基因中突变(hub1-1，Fleury等，2007)的植物来阐明。然而，本发明的实施不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文定义的任何HUB1编码核酸或HUB1多肽，或者HUB1的任何显性阳性突变体来实施。备选地，可以将植物进行诱变以产生内源HUB1基因的突变形式，其具有与显性阳性突变体或hub1-1突变体相同的功能特征。产生此类型突变的技术是本领域公知的(如TILLING或位点特异性重组(Thomson和Ow，Genesis 44，465-476，2006))。此外，表G到K中所列(包括SEQ ID NO：50到SEQ ID NO：243)的任一种基因或者此类基因的直向同源物可以用于本发明的方法中。
编码HUB1多肽的核酸的实例在本文实施例1的表A中给出。此类核酸可用于实施本发明的方法。实施例1的表A中给出的氨基酸序列是SEQID NO：2代表的HUB1多肽的直向同源物和旁系同源物的示例性序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文定义。通过进行所称作的倒数blast(reciprocal blast)检索可以容易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物。通常，这包括首次BLAST，涉及用查询序列(例如，使用实施例1的表A中所列的任一序列)对任何序列数据库，如公众可获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准的默认值)，当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准的默认值)。可以任选过滤BLAST结果。然后将过滤的结果或非过滤的结果的全长序列针对查询序列所来源的生物的序列进行反向BLAST(第二次BLAST)(当查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2时，第二次BLAST将因此针对拟南芥序列)。然后比较第一次和第二次BLAST的结果。如果来自第一次BLAST的高阶命中与查询序列来自相同物种，那么鉴定了旁系同源物，然后向后BLAST将理想地导致查询序列在最高命中中；如果第一次BLAST中的高阶命中与查询序列不来自相同的物种，那么鉴定了直向同源物，并且向后BLAST时优选导致查询序列在最高命中中间。
高阶命中是具有低E值的那些命中。E值越低，得分越显著(或者换句话说，命中偶然被发现的机会越低)。E值的计算是本领域公知的。除了E值外，还通过同一性百分比对比较打分。同一性百分比指两个比较的核酸(或者多肽)序列之间在特定长度上相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着是邻接树，以帮助显示相关基因的聚类或者鉴定直向同源物和旁系同源物。
在表G、H和I中提供了涉及昼夜节律钟、昼夜节律钟的输出应答和/或发育的蛋白质的实例。表J、K和L中列出了与HUB1相互作用的蛋白质的实例。所有这些蛋白质(包括直向同源物)可用于本发明的方法中，下文中称作“可用于本发明方法的其他蛋白质”。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括编码实施例1表A中给出的任一氨基酸序列或可用于本发明方法的其他蛋白质的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文定义。也可用于本发明方法的是编码实施例1表A中给出的任一氨基酸序列或可用于本发明方法的其他蛋白质的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物具有与其所来源的未修饰蛋白质基本上相同的生物和功能活性。
此外，可用于实施本发明方法的核酸变体包括编码HUB1多肽的核酸的部分、与编码HUB1多肽的核酸杂交的核酸、编码HUB1多肽的核酸的剪接变体、编码HUB1多肽的核酸的等位变体和通过基因改组得到的编码HUB1多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的核酸变体、与编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸杂交的核酸、编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的剪接变体、编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的等位变体，和通过基因改组得到的编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的变体也可用于实施本发明的方法。
编码HUB1多肽或可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸不必是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了修饰植物中生长特征的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸序列，或者编码实施例1的表A或表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。
例如，通过对核酸进行一个或多个缺失可以制备核酸的部分。所述部分可以以分离形式使用或者它们可以融合到其他编码(或非编码)序列以便例如，产生结合几种活性的蛋白质。当融合到其他编码序列时，翻译时所产生的多肽可以比为该蛋白质部分预测的更大。
可用于本发明方法的部分编码如本文定义的HUB1多肽，并且具有与实施例1的表A或表G到K中给出的氨基酸序列基本上相同的生物活性。优选地，所述部分是实施例1的表A中给出的任一核酸的部分，或者是编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，所述部分长为至少200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900，3000个连续核苷酸或更多，所述连续核苷酸为实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸序列，或者编码实施例1的表A或表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，所述部分是SEQ ID NO：1的核酸或编码表G到K中给出的蛋白质的核酸的部分。优选地，该部分编码HUB1多肽序列的片段，其当用于构建系统树(如图3中描绘的系统树)时，与包含SEQ ID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽组而不是与包含RING结构域的任何其他蛋白质的组聚类。
可用于本发明方法的另一核酸变体是这样的核酸，其在降低的严格性条件下，优选在严格条件下与编码如本文定义的HUB1多肽的核酸或编码表G到K任一个中给出的蛋白质的核酸杂交，或者与如本文定义的部分杂交。
根据本发明，提供了在植物中修饰生长特征的方法，包括在植物中导入并表达核酸，所述核酸能够与实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸杂交，或者包括在植物中导入并表达核酸，所述核酸能够与编码实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
可用于本发明方法的杂交序列编码如本文定义的HUB1多肽，具有与实施例1的表A或表G到K中给出的氨基酸序列相同的生物活性。优选地，所述杂交序列能够与实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸杂交的互补序列，或与任一这些序列的部分杂交，部分如生物定义，或者杂交序列能够与编码实施例1的表A或表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选地，杂交序列能够与SEQ ID NO：1表示的核酸的互补序列或者与其部分杂交。
对于HUB1，杂交序列优选编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列当全长并且用于构建系统树，如图3中描绘的系统树时，与包含SEQID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽的组聚类而不是包含RING结构域的蛋白质的任何其他组聚类。优选地，所述杂交序列编码具有C3HC4型RING结构域的蛋白质。
可用于本发明方法的另一核酸变体是编码如上面定义的HUB1多肽或编码可用于本发明的其他蛋白质的剪接变体，剪接变体如本文定义。
根据本发明，提供了修饰植物中生长特征的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸序列的剪接变体，或者编码如实施例1的表A或表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是SEQ ID NO：1代表的核酸的剪接变体，或者编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码的HUB1氨基酸序列当用于构建系统树，如图3中描绘的系统树时，与包含SEQ ID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽组聚类而不是与包含RING结构域的蛋白质的任何其他组聚类。优选地，所述剪接变体编码具有C3HC4型RING结构域的蛋白质。
可用于实施本发明方法的另一核酸变体是编码如上文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的等位变体，等位变体如本文定义。
根据本发明，提供了修饰植物中生长特征的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中或者表G到K中给出的任一核酸的等位变体，或者包括在植物中导入并表达编码实施例1的表A中或者表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的等位变体。
可用于本发明方法的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO：2的HUB1多肽或者实施例1的表A中或者表G到K中所述任一氨基酸基本上相同的生物活性。等位变体存在于自然中，并且包括在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。优选地，等位变体是SEQ ID NO：1的等位变体或者编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物或者表G到K中给出的蛋白质的核酸的等位变体。优选地，所述等位变体编码的HUB1氨基酸序列当用于构建系统树，如图3中描绘的系统树时，与包含SEQ ID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽组聚类而不是与包含RING结构域的蛋白质的任何其他组聚类。优选地，所述等位变体编码具有C3HC4型RING结构域的蛋白质。
基因改组或定向进化也可以用于产生编码如上文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明的其他蛋白质的核酸的变体；术语“基因改组”如本文定义。
根据本发明，提供了在植物中修饰生长特征的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A或表G到K中给出的任一核酸序列的变体，或者包括在植物中导入并表达编码实施例1的表A或表G到K中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，所述变体核酸通过基因改组得到。
优选地，通过基因改组得到的变体核酸编码的HUB1氨基酸序列当用于构建系统树，如图3中描绘的系统树时，与包含SEQ ID NO：2(At2g44950)表示的氨基酸序列的HUB1多肽组聚类而不是与包含RING结构域的蛋白质的任何其他组聚类。
此外，通过定向诱变也可以得到核酸变体。一些方法可用于实现位点定向诱变，最常用的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Eds.)。
编码可用于本发明方法的HUB1多肽或其他蛋白质的核酸可来自任何天然或人工来源。核酸可以在其组成和/或遗传环境中通过有意的人为操作从其天然形式修饰。优选地，HUB1多肽编码核酸或编码可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸来自植物，尤其优选来自双子叶或单子叶植物。来自双子叶植物的HUB1多肽编码核酸优选来自十字花科(Brassicaceae)，更优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
本发明方法的实施产生了具有修饰的生长特征的植物。具体地，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有修饰的光调节表型、增加的萌发势、增加的早期活力、增加的胁迫抗性、改变的果实形状和/或增加的种子产量的植物。术语“种子产量”在本文的“定义”部分更详细描述。应该指出的是如本发明使用的术语“修饰的生长特征”或“产量”不包括营养生物量(如根、叶子、茎)，当HUB1的显性阳性突变体用于本发明的方法时除外。
本文对修饰的生长特征的引用也包括光调节的表型的修饰，其包括但不限于，昼夜节律钟的改变，和昼夜节律钟下游途径(昼夜节律钟输出应答)的修饰。修饰的下游途径包括修饰的光合能力、涉及植物发育的基因的改变的表达和修饰的植物发育的一种或多种。昼夜节律钟的修饰包括昼夜节律钟输入基因以及振荡子基因和输出基因的修饰的表达。如本发明使用的“修饰的昼夜节律钟输出应答”或“修饰的下游途径”包括光合能力的修饰，如植物细胞中光合色素(叶绿素a和b和总的类胡萝卜素类)浓度的修饰、修饰的质体结构或者修饰的叶绿体结构。如本发明使用的“修饰的昼夜节律钟输出应答”或“修饰的下游途径”也包括涉及植物发育的基因的改变的表达和植物发育的修饰，如改变的结构(包括缩短的下胚轴长度、改变的叶子形态、改变的花形态)和/或改变的开花时间。
因此，本发明提供了修饰昼夜节律钟输入基因、振荡子基因或者输出基因和/或发育基因的表达的方法，所述方法优选包括调节HUB1多肽的表达。这些基因的一些在染色体上彼此位置接近。因此，HUB1可以用作转录调节物用于形成聚类的基因的转录同步。此类聚类的实例是光合基因、昼夜节律钟基因或发育基因。由于受调节的HUB1表达导致的昼夜节律钟输入基因、振荡子基因、输出基因、发育基因和/或表G到K中所列的基因(或其直向同源物)的修饰的表达又可以导致改善的植物生长特征，如增加的产量或增加的胁迫耐受性。因此，本发明提供了改善植物生长特征的方法，该方法包括由于受调节的HUB1表达引起的昼夜节律钟输入基因、振荡子基因、输出基因和/或发育基因的受调节的表达。本发明还提供了改善生长特征的方法，包括表G到K中所列任一基因或此类基因的直向同源物的受调节的表达。上面描述了鉴定基因的直向同源物的方法。受调节的表达可以是增加的或减少的表达。
本发明还提供了改变植物发育，尤其改变开花时间和/或修饰植物结构的方法。
开花时间是播种和生殖生长开始之间所经过的时间。用于确定开花开始的常规方法包括在放大情况下解剖植物以确定分生组织处营养或生殖结构的存在；监测花序的出现，也称作“出现”或“抽穗时间”，或者监测花期。用于确定田间作物中开花开始的广泛使用的方法涉及重复视力检查样地以估计样地中存在的开花植物的数目。在农业经济学中通常接受的是，当样地中50％的植物显示出出现的花序，那么样地正“开花”。再一个方法在WO 2007/093444中描述，该方法是基于取自正生长植物的数字图像的计算机分析。
术语植物结构包括植物的外观或形态，包括任何一种或多种结构特征或其结构特征的组合。此类结构特征包括植物的任何细胞、组织或器官或细胞、组织或器官组的形状、大小、数目、位置、质地、排列和模式，所述细胞、组织或器官包括根、叶、枝条、茎或分蘖、叶柄、藻丝、花、花序(对于单子叶植物和双子叶植物)、圆锥花序、花瓣、气孔、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种皮、糊粉粒、纤维、形成层、木材、心材、薄壁组织、通气组织、筛分子、韧皮部或维管组织等等。修饰的结构因此包括植物的修饰生长的所有方面。
优选地，根据本发明的植物显示出修饰的结构，所述修饰的结构包括相对于对照植物矮化生长、修饰的叶形态、修饰的下胚轴形态的一种或多种。因此，根据本发明，提供了修饰植物结构的方法，所述植物结构尤其是矮化生长、修饰的叶形态、修饰的下胚轴形态、改变的花形态的一种或多种，所述方法包括调节编码如本文定义的HUB1多肽的核酸序列的表达。本文使用的术语“矮化生长”意指植物高度的缩短，而不影响器官大小，给予植物浓密表型，与矮小或者微型生长(其中各比例被保持但是总体植物生长减少)相反。
已知HUB1蛋白质中的RING结构域涉及蛋白质-蛋白质相互作用。在本发明中，表明HUB1与多种蛋白质相互作用(实施例22)。除了同源二聚化和与其旁系同源物HUB2的二聚化外，HUB1也与GCN5相互作用，GCN5是一种组蛋白酰化酶，参与胁迫应答、防御、信号转导、转录、代谢、运输。GCN5也通过影响WUSCHEL和AGAMOUS的表达而参与花发育。HUB1的另一种相互作用因子——MYB转录因子At1g58220涉及对植物激素刺激(如脱落酸、茉莉酸和水杨酸)的应答。本发明从而也提供了改变对胁迫应答、防御应答、激素信号转导和花发育的一种或多种的应答的方法，所述方法包括调节HUB1表达。
本文对改进的生长特征的引用也意指植物的一种或多种可收获部分的生物量(重量)的增加，具体地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施导致相对于对照植物的种子产量具有增加的种子产量的植物。改进的生长特征也包括增加的萌发势(增加的萌发速度)、增加的早期活力和增加的胁迫抗性，尤其非生物胁迫抗性。还观察到与对照植物相比，细胞大小增加了(尤其在叶子中)。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每平方米生长的(establish)植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加等等。
本发明提供了相对于对照植物增加植物产量，特别是种子产量的方法，该方法包括调节植物中编码如本文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的表达。
因为本发明的转基因植物具有增强的产量，所以这些植物可能显示出相对于对照植物在其生命周期的对应阶段的生长速率增加的生长速率(在至少部分其生命周期中)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如萌发速度(萌发势)、早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部过程均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节核酸在植物中的表达，所述核酸编码本文中所定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质。
发生产量和/或生长速率的增加，不管与对照植物相比，植物处于非胁迫条件还是植物暴露于多种胁迫。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％或30％，优选小于25％、20％或15％，更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。“轻微胁迫”是植物暴露的常见生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冷温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫通常是病原体，如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
具体地，本发明的方法可以在非胁迫条件或在轻微干旱条件下进行以相对于对照植物具有改进的生长特征。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施产生了在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的与在相当条件下生长的对照植物相比具有改进的生长特征的植物。因此，根据本发明，提供了在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的植物中改进生长特征的方法，该方法包括调节植物中编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的表达。此外，本发明方法的实施也产生了相对于在相当的条件下生长的对照植物，在严重干旱条件下生长的具有改进的生长特征的植物。因此，根据本发明，提供了在严重干旱条件下生长的植物中改进生长特征的方法，该方法包括调节植物中编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的表达。
本发明方法的实施产生了相对于在相当的条件下生长的对照植物，在盐胁迫条件下生长的具有改进的生长特征的植物。因此，根据本发明，提供了在盐胁迫条件下生长的植物中改进生长特征的方法，该方法包括调节植物中编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的表达。术语盐胁迫不局限于食盐(NaCl)，而是可以是下面的一种或多种：NaCl，KCl，LiCl，MgCl2，CaCl2，等等。
本发明方法的实施产生了相对于在相当的条件下生长的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下生长的具有改进的生长特征的植物，换句话说，根据本发明的植物在氮吸收中具有增加的效率。因此，根据本发明，提供了在氮缺乏条件下生长的植物中改进生长特征的方法，该方法包括调节植物中编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的表达。营养缺乏可以由营养物的缺乏引起，所述营养物如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼，等等。
本发明包括通过本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物、或其部分包含编码如上文所定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供构建体，其包含
(a)编码如上文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码HUB1多肽的核酸如上文定义。可用于本发明方法的蛋白质如上面定义并且包括表G到K中所列的蛋白质和其直向同源物。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。
用包含上述核酸之一的载体转化植物。技术人员公知必须存在于载体上的遗传元件，以便成功转化、选择和繁殖含有目的序列的宿主细胞。目的序列有效连接一个或多个控制序列(至少启动子)。
有利地，任何类型的启动子，无论天然还是合成的，都可以用于驱动核酸序列的表达，但是该启动子优选为植物来源的。组成型启动子尤其可用于方法中。优选地，组成型启动子也是遍在启动子。稻GOS2可用于单子叶植物中并且CaMV35S可用于双子叶植物中。在一些情况下，组成型启动子优选不是强组成型启动子(如CaMV35S启动子)并且强度弱于稻GOS2启动子。然而，为了得到增加的早期活力和/或萌发势，强组成型启动子也是有用的。在其他情况下，器官特异性的、组织特异性或细胞特异性启动子更合适。关于多种启动子类型的定义见本文的“定义”部分。
应该清楚的是本发明的适用性不局限于SEQ ID NO：1表示的HUB1多肽编码核酸，本发明的适用性也不局限于组成型启动子驱动时或种子特异性启动子驱动时HUB1多肽编码核酸的表达。
在本发明的一个实施方案中，组成型启动子优选为中等强度启动子，其弱于稻GOS2启动子和CaMV35S启动子，如高速泳动族蛋白(HMGP)启动子，优选地，启动子是来自稻的HMGP启动子。还优选地，组成型启动子由基本上类似于SEQ ID NO：6的核酸序列代表，最优选地，组成型启动子如SEQ ID NO：6代表。关于组成型启动子的进一步实例见本文的“定义”部分中的表2a。
根据本发明的另一实施方案，编码HUB1多肽的核酸优选连接到种子特异性启动子。种子特异性启动子优选为WSI18启动子，更优选地，WSI18启动子来自稻，进一步优选地，WSI18启动子通过基本上类似于SEQ IDNO：7的核酸序列代表，最优选地，该启动子由SEQ ID NO：7代表。也可用于实施本发明方法的其他种子特异性启动子的实例在上面“定义”部分中的表2c中显示。
任选地，一种或多种终止子序列可用于引入植物中的构建体中。
额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量，如定义部分中所述。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描述了选择性标记。标记基因一旦不再需要可以从转基因细胞中除去或者切除。用于标记去除的技术是本领域公知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
本发明还提供了产生相对于对照植物具有修饰的生长特征的转基因植物的方法，包括在植物中导入并表达编码如上文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的任一核酸。
更特别地，本发明提供了产生具有修饰的生长特征，尤其增加的(种子)产量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中导入并表达编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的任一核酸。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物。文中的“定义”部分更加详细的描述了术语“转化”。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
Figure BDA0000046184160000571
和Willmitzer的上述出版物。
通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术是本领域技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文所定义的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的分离的核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
本发明还涉及植物的可收获部分，如种子、果实、花，所述可收获部分包含编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的重组核酸。本发明还涉及来自、优选直接来自这种植物的可收获部分的产物，如干燥丸剂或粉剂、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明优选的特征，受调节的表达是增加的表达。在本领域内详细记载了用于增加核酸或基因、或基因产物表达的方法并且实例在定义部分中提供。
如上面提到的，用于调节编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸；然而，实施该方法，即修饰生长特征的效果也可以用其他公知的技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA活化标记、TILLING、同源重组或诱变。这些技术的描述在定义部分中提供。
本发明还包括如本文所述的编码HUB1多肽或可用于本发明方法的其他蛋白质的核酸的用途，和这些HUB1多肽或可用于本发明方法的其他蛋白质的用途，用于修饰植物中上述生长特征的任一种。
编码如本文所述的HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸，或者HUB1多肽自身或可用于本发明方法的另一蛋白质可用于育种程序，其中鉴定可以与HUB1多肽编码基因遗传连锁或与编码可用于本发明方法的另一蛋白质的基因遗传连锁的DNA标记。所述核酸/基因，或HUB1多肽自身，或可用于本发明方法的其他多肽可用于限定分子标记。该DNA或蛋白质标记然后可用于育种程序中来选择具有如在本发明方法中上文定义的修饰的生长特征的植物。
编码HUB1多肽的核酸/基因或编码可用于本发明方法的另一蛋白质核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变通过植物的诱变处理引入等位基因变异；备选地，程序可以以一组非有意引起的所谓的“天然”来源的等位变体开始。然后例如通过PCR开始等位变体的鉴定。接着是选择具有所讨论序列并且得到提高的产量的超级等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码HUB1多肽或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码HUB1多肽的这种用途或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码HUB1多肽的核酸或编码可用于本发明方法的另一蛋白质的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码HUB1多肽的核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码HUB1多肽的核酸序列在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等，(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook，(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
本发明方法产生具有如前文所述的修饰的生长特征的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增加性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
附图描述
本发明现参考以下附图描述，其中：
图1小图A代表SEQ ID NO：2的氨基酸序列；RING结构域以粗体标出；小图B显示了用于产生HUB1pm的诱变策略：(i)具有8个锌结合残基的野生型HUB1 RING结构域，其中X为任一氨基酸；(ii)HUB1基因序列上诱变策略，其中选择两个Cys残基用于诱变(斜体且加下划线)成Ser。(iii)HUB1pm的具有两个丝氨酸残基的经诱变HUB1 RING结构域。
图2代表HUB1蛋白质的多重比对。CAO22034的N-末端部分(600个氨基酸)没有在比对中显示。
图3显示了HUB1蛋白质的系统树。该树如实施例2中所述的构建。
图4代表双元载体，用于处于稻HMGP启动子(pHMGP)控制下的HUB1编码核酸在稻(Oryza sativa)中增加的表达。
图5组蛋白H2B(HA抗体)的HUB1介导的单泛素化和HUB1自体泛素化活性(HA活性)。
图6在短日照、长日照和连续光照条件下生长21天后Ler、hub1-1和OE-HUB1株系的莲座。
图7来自在短日照(SD)、长日照(LD)和连续光照(CL)下体外生长的样品的叶绿素a和b的测量。“hub1-1”和“hub1-1pale”样品都生长在相同平板上。
图8SD生长的Ler和hub1-1叶子的TEM图像。
图9短日照生长的21天龄Ler、OE-HUB1和hub1-1植物的提取的下胚轴。
图10在长日照条件下Ler、hub1-1和OE-HUB1体外生长的幼苗的叶面积测量。
图11在短日照条件下Ler、hub1-1和OE-HUB1体外生长的幼苗的叶面积测量。
图12来自SD生长的体外植物的窄hub1-1叶的远轴边上的刺突样结构(箭头)。
图13hub1-1和野生型Ler花的简图。
图14HUB1中差别表达的发育基因的器官特异性表达模式。
图15拟南芥HUB1株系中的萌发势。DAV＝春花后的天数(n＝30)。OE7a和OE17x5是HUB1过表达的株系，Ler和hub1(突变体)是对照。
图16以log2转换值给出的拟南芥Ler野生型和OE-HUB1株系中表皮细胞大小。
图17拟南芥Ler野生型、hub1-1突变体和两个过表达HUB1株系的长角果面积测量。
图18Ler野生型、hub1-1突变体和HUB1过表达株系的长角果。
图19Ler野生型、hub1-1突变体和两个HUB1过表达株系的种子面积测量。
图20Ler野生型、hub1-1突变体和两个HUB1过表达株系的种子产量(每株植物的种子克数)。
图21小图A显示了对野生型(Ler)背景中HUB1和HUB1pm过表达叶子宽度的影响；#1247代表HUB1过表达株系并且#1249是HUB1pm过表达株系。未转化的Ler用作对照。小图B显示了受hub1-1突变体背景中过表达HUB1pm影响的成熟叶子宽度。#1248代表hub1-1背景中WTHUB1过表达株系，#1250代表hub1-1背景中HUB1pm过表达株系。未转化的hub1-1用作对照。数字1到11代表莲座的两个胚轴和叶子1到9。
图22与Col-0和hub1-4突变体相比，sl-1和sl-2T-DNA插入株系的表型表征。A-在WT、sl-1和sl-2开花时间时(28DAS)所有四种基因型的完整植株图。B-四个株系的开花时间分析证明hub1-4开花比其他的早得多(也在图A中显示)(除了sl-2中稍微缩短)。另一方面，在开花时莲座叶的数目对于所有突变株系具有不同的趋势，因为为sl-1，sl-2和hub1-4报告了其显著减少。C-对于几乎所有叶子，sl-1的叶面积严重减小，而在sl-2的情况下，所述减小小得多，如同在一些情况下，所述减小表明是显著的。上面的小图：黑色的条形是Col-0，白色条形为sl-1；底部小图：黑色条形为Col-0，灰色条形为sl-2。E-与野生型植物相比，sl-1和sl-2的花茎(flowerstem)直径也减小了。以显著性水平5％(p＝0.05)进行所有斯氏t检验。
实施例
本发明现将参考仅作为说明的下列实施例加以描述。下列实施例不意图彻底定义或限制本发明范围。
DNA操作：除非另外指出，根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等(1994)，Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols的卷1和卷2中所述的标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法在BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定与SEQ ID NO：1的核酸序列或SEQ ID NO：2的蛋白质序列相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与用于本发明方法中的核酸序列相关的序列(全长cDNA、EST或基因组的)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，用于本发明方法中的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如，E值可以增加以显示较低的严紧性匹配。这样，可以鉴定短的几乎精确的匹配。
表A提供了与SEQ ID NO：1的核酸序列和SEQ ID NO：2的蛋白质序列相关的核酸序列的列表。
表A：HUB1多肽的实例：
在一些情况下，相关序列已经被试验性装配并被研究机构如基因组研究研究所(Institute for Genomic Research(TIGR))公开。Eukaryotic GeneOrthologs(EGO)数据库可用于鉴定此类相关序列，通过关键词检索或者通过使用BLAST算法用目的核酸或多肽序列进行鉴定。
实施例2：HUB1多肽序列的比对
使用进行性比对的ClustalW 2.0算法(Larkin等，Bioinformatics 23，2947-2948，2007)进行多肽序列的比对。默认值为空位开放罚分10，空位延伸罚分0.1，所选的权重矩阵为Gonnet(如果比对多肽)。可以进行微小手工编辑以进一步优化比对。HUB1多肽之间的序列保守性基本上在多肽的C末端RING结构域中，N-末端结构域通常在序列长度和组成中更可变。HUB1多肽在图2中比对。
使用如ClustalW 2.0程序中提供的邻居连接群集算法从比对构建HUB1多肽的系统树(图3)。图给出1000次重复的自举值。
实施例3：计算HUB1多肽序列之间的总体百分比同一性
可用于实施本发明方法的全长多肽序列之间相似性和同一性的总体百分比用本领域可用的方法之一：MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；software hosted by Ledion Bitincka)确定。MatGAT软件为DNA或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，而不需要数据的预先比对。该程序用Myers和Miller总体比对算法(空位开放罚分12，空位延伸罚分2)进行一系列逐对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽)计算相似性和同一性，然后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示并且序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。
用于比较的参数为：
评分矩阵：Blosum62
第一个空位：12
延伸空位：2
多肽序列的全长上的总体相似性和同一性的软件分析的结果在表B1中显示。百分比同一性在对角线上方给出并且百分比相似性在对角线下方给出。
可用于实施本发明方法的HUB1多肽序列之间的百分比同一性与SEQ ID NO：2(At2g44950)相比可以低至18％氨基酸同一性；然而，当仅仅比较RING结构域时，同一性高得多(表B2)。然而，应该指出酵母BRE1(CAA98640)——HUB1(At2g44950)的功能直向同源物与HUB1具有仅仅18.6％的序列同一性。
Figure BDA0000046184160000681
实施例4：鉴定HUB1多肽序列中包含的结构域
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(Integrated Resource ofProtein Families，Domains and Sites(InterPro))数据库是对于基于文字和序列的搜索常用的签名数据库的集成界面。InterPro数据库将这些数据库组合，所述这些数据库对于良好表征的蛋白质使用不同的方法学和不同程度的生物学信息来得到蛋白质签名。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是多序列比对和隐马尔可夫模型的大集合，覆盖许多共同的蛋白质结构域和家族。Pfam的主机为英国的Sanger研究所(Sanger Institute)服务器。Interpro的主机在英国的欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute)
SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的InterPro扫描结果在表C中给出。
表C：SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要检索号)
Figure BDA0000046184160000701
Figure BDA0000046184160000711
实施例5：HUB1多肽序列的拓扑学预测
TargetP 1.1预测真核生物蛋白质的亚细胞位置。位置分配是基于预测存在N-末端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶定肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的任一种。最终预测所基于的分数不是真实的概率，并且它们不必加到一起。然而，根据TargetP，具有最高分数的位置是最可能的，并且分数之间的关系(可靠性类别)可是指示预测的肯定性如何。可靠性类别(RC)的范围为1到5，其中1表示最强预测。TargetP维持在丹麦技术大学的服务器上(Technical University of Denmark)。
对于预测含有N-末端前序列的序列，也可以预测潜在切割位点。
选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断设置(无、截断的预定设置，或者截断的用户指定的设置)，和切割位点预测的计算(是或否)。
如SEQ ID NO：2代表的多肽序列的TargetP 1.1分析结果在表D中给出。已经选择了“植物”生物组，没有定义截断，并且要求了转运肽的预测长度。如SEQ ID NO：2代表的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。定位实验揭示HUB1存在于细胞核中(Liu等，2007)。
表D：如SEQ ID NO：2代表的多肽序列的TargetP 1.1分析
  长度(AA)   878
  叶绿体转运肽   0.133
  线粒体转运肽   0.342
  分泌途径信号肽   0.017
  其他亚细胞靶定   0.635
  预测的位置   /
  可靠性类别   4
  预测的转运肽长度   /
许多其他算法可用于进行此类分析，包括：
●在丹麦技术大学服务器上提供服务的ChloroP 1.1；
●在澳大利亚布里斯班的昆士兰大学的分子生物学研究所(Institutefor Molecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)服务器上提供的Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor版本1.2；
●在加拿大埃德蒙顿的艾伯塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)服务器上提供的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB2.5；
●在丹麦技术大学服务器上提供服务的TMHMM；
●PSORT(URL：psort.org)
●PLOC(Park and Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
实施例6：HUB1多肽的功能测定法
基于序列同源性，以前已经将HUB1鉴定为BRE1同源物(Hwang等，2003；Stone等，2005，Fleury等，2007)。为了证实所提示的功能为H2B单泛素化E3连接酶，用表位标记的重组HUB1蛋白质进行一系列体外泛素化测定法。在此类测定法中，预期功能BRE1 E3连接酶连接组蛋白H2B上的一个泛素分子，导致H2B分子量的相应增加(Zhu等，Molecular Cell 20，601-611，2005)。
使用GST或His表位标记将编码HUB1和点突变形式(HUB1pm)的cDNAs克隆到重组表达载体中以允许用亲和层析纯化。GST标记的蛋白质被大肠杆菌以许多片段表达并且His标记的蛋白质以包含体沉淀。纯化不溶性His标记的蛋白质级分并通过用递减的尿素浓度的透析系列再折叠，并在再折叠缓冲液中结合到NiNTA珠(Invitrogen)。在HUB1再折叠期间，蛋白质形成高分子量复合体，提示它形成了二聚体。该数据表明如对人Bre1同源物所描述的，在植物中，HUB1活性也依赖于同源二聚化或异源二聚化(Zhu等，2005)。
纯化的蛋白质在如Fleury等，(2007)中所述的体外(自体)泛素化测定法以及组蛋白H2B泛素化测定法中进行自身泛素化测定。在该测定中，纯化的HUB1 E3连接酶与泛素活化和缀合酶(分别为E1和E2)和泛素在含有ATP的缓冲液中组合，并且在搅拌下在37℃温育1小时。通过在SDS上样缓冲液中煮沸停止反应并在6％SDS-PAGE上分离并转移到膜上用于与抗组蛋白H2B或抗HA(针对HA标记的泛素)抗体杂交。通过ECL(GEHealthcare)试剂检测杂交信号并在放射自显影胶片(Amersham HyperfilmECL，GE Healthcare)上显示。His和GST蛋白质级分都是酶活性的并且在体外泛素化测定法中介导组蛋白H2B单泛素化(图5)。
HUB1和HUB1pm都介导组蛋白H2B(17kDa)的单泛素化，其在蛋白质凝胶印迹中看到为H2B的10kDa偏移(图5，下面的HA-Ab)。该27kDa带与H2B特异性抗体和检测HA标记的泛素的HA抗体都具有反应性。在不存在E1，E2或Ub时，没有观察到H2B迁移的偏移。在使用His标记的HUB1的泛素化反应中得到了相似的结果。这些数据一起证实了HUB1是人和酵母BRE1蛋白质的功能同源物。有趣的是，RING结构域中的点突变(HUBpm)没有消除HUB1的H2B单泛素化活性。
在使用全长HUB1和点突变形式的组蛋白H2B单泛素化测定法中，HUB1的自身调节被观察为该蛋白质的高分子量修饰(图5，HA-Ab，上面)。这些修饰与泛素抗体具有反应性，提示HUB1具有自体多泛素化活性。RING结构域中的点突变似乎降低自体多泛素化活性，如通过蛋白质印迹上这些修饰的降低的水平所示(图5，HA-Ab，上面)。GST-HUB1的相等负荷通过GST Ab显示(图5，GST-Ab)。这些数据证实RING结构域是自体泛素化活性所需的。
实施例7：克隆SEQ ID NO：1的核酸序列用于稻转化
使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增用于本发明方法中的编码HUB1的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下，在50μl PCR混合物中使用200ng模板进行PCR。使用的引物为prm09774(SEQ ID NO：3；有义，起始密码子为斜体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgagcacaggcg-3’和prm09775(SEQ ID NO：4；反向，互补的)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatatgtagataggtttaatatcattt-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。然后进行Gateway程序的第一步：BP反应，期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”(根据Gateway术语)pHUB1。质粒pDONR201购自Invitrogen，作为
Figure BDA0000046184160000741
技术的一部分。
包含SEQ ID NO：1的进入克隆然后与用于稻转化的目的载体用于LR反应中。该载体在T-DNA边界内含有作为功能元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒；和预期与已经在进入克隆中克隆的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻HMGP启动子(SEQ ID NO：6)位于该Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，根据本领域公知的方法将所得的表达载体pHMGP::HUB1(图4)转化到农杆菌菌株LBA4044中。
以类似的方法，使用包含用于Gateway重组的AttB位点的引物，可以克隆本发明中公开的其他基因。此类引物的设计是本领域技术人员已知的。
实施例8：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中温育一分钟，随后在2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中温育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。
一个构建体产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
棉花转化
根据US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在20分钟内在3％次氯酸钠溶液中表面消毒并在含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。然后将种子转移到含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于发芽。去除4到6天龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm小块并置于0.8％琼脂上。农杆菌悬浮液(约108个细胞/ml，从用目的基因和合适的选择标记转化的过夜培养物稀释得到)用于接种下胚轴外植体。室温并光照下3天后，将组织转移到具有Murashige和Skoog盐与B5维生素(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCl2，并具有用于杀死残留细菌的50到100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄西林的固体培养基(1.6g/l Gelrite)中。2到3个月(每4到6周传代培养)后分离各细胞系并进一步在选择培养基上培养用于组织扩增(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在2到3个月内在非选择培养基上进一步培养以产生体细胞胚。将具有至少4mm长度的看起来健康的胚转移到具有细小蛭石中SH培养基的管中，补充0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠胺嘌呤和赤霉酸。然后在30℃以16小时光周期培养胚，并将2到3片叶阶段的小植株转移到具有蛭石和营养物的盆中。植物变硬并随后移入温室中用于进一步培养。
实施例9：用SEQ ID NO：1转化的稻的表型评估方法
9.1评估设置
产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室中用于生长和收获T1种子。保留6个事件，其中T1后代对于转基因的存在/缺失以3∶1分离。对于每个这些事件，通过监测可见标记表达选择约10个含有转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和约10个缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机的位置上并排生长。温室条件是短日照(12小时光照)，光照中28℃，黑暗中22℃，和70％的相对湿度。在非胁迫条件下生长的植物以常规间隔浇水以确保水和营养物不受限制，以满足植物需要来完成生长和发育。
4个T1事件在T2代中按照与T1代相同的评估步骤进一步评估，但是每个事件具有更多个体。从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。
干旱筛选
在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。
氮使用效率筛选
来自T2种子的稻植物在除了营养溶液之外的正常条件下生长与盆栽土壤中。花盆从移植到成熟用特定营养溶液浇灌，该溶液含有减少的氮(N)含量，通常低7到8倍。培养的剩余部分(植物成熟，种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长详述的记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
植物生长在由椰子纤维和argex(3∶1比例)组成的基质上。将小植株移植到温室后前两周内使用正常的营养物溶液。前两周后，向营养物溶液加入25mM盐(NaCl)，直到收获植物。然后测量生长和产量相关的参数。
9.2统计学分析：F-检验
将双因子ANOVA(方差分析)用作植物表型特征的总体评估的统计学模型。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植物测量的所有参数进行F-检验。进行F-检验以检查基因在所有转化事件中的效果并验证该基因的总体效果，也称作总体基因效果。F检验的真实总体基因效果的显著性阈值设为5％概率水平。显著F-检验值指向基因效果，表示并不仅仅是该基因的存在或其位置引起表型差异。
因为用重叠的事件进行了两个实验，所以进行了合并分析。这对于检查两个实验上效果的一致性是有用的，并且如果情况是这样的，积累来自两个实验的证据以便在结论中提高置信度。所用的方法是混合模型方法，其考虑了数据的多级结构(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布得到P-值。
9.3测量的参数
生物量相关的参数测量
从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。通过对来自地上植物部分的数字图像上区别于背景的像素总数计数来确定植物地上部分面积(或者叶子生物量)。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，其以平方mm表示。实验表明以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物达到其最大叶子生物量的时间点时测量的面积。早期活力是萌发后三周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表示为总根生物量的增加(测量为在植物寿命中观察到的根的最大生物量)；或者表示为根/枝条指数的增加(测量为在根和枝条的活跃生长期中根质量和枝条质量之间的比值)。
通过对来自地上植物部分的区别于背景的像素总数计数确定早期活力。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，以平方mm表示。结果是萌发后三周植物的结果。萌发势测量为与对照植物相比，播种后1、2或3天后萌发种子的数目。
种子相关的参数测量
将成熟的总圆锥花序收获，计数，装袋，用条形码标记，然后在烘箱中37℃下干燥3天。然后将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。用鼓风装置分离饱满的外壳与空壳。丢弃空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。通过计数分离步骤后剩余的饱满外壳数来确定饱满种子数。通过对从植物收获的所有饱满外壳称重来测量总种子产量。通过对从植物收获的外壳数目计数测量每株植物的总种子数。从计数的饱满种子数和它们的总重量外推千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为总种子产量和地上部分面积(mm2)之间的比值，再乘以因数106。每个圆锥花序的总花数在本发明中定义为种子总数和成熟总圆锥花序数目的比值。如本文定义的种子饱满率是饱满种子数在种子(或小花)总数中占的比例(表示为％)。
实施例10：转基因稻植物的表型评估的结果
在下面的表E中给出了在非胁迫条件下表达HUB1核酸的转基因稻植物的评估结果。对出现势(早期活力)、种子总重量(总的种子产量)、饱满种子数和种子总数观察到5％以上的增加。
表E：表达处于中等强度启动子(HMGP)控制下的HUB1的转基因稻中改进的生长参数：
  参数   T1代中增加％   T2代中增加％   p-值组合分析
  出现势   18.9   35.8   0.007
  种子总重   21.6   24.6   0.006
  饱满种子数   20.6   24.6   0.006
  种子总数   13.8   22.7   0.021
当在胁迫条件下生长时，与对照植物相比，表达HUB1的转基因稻植物显示出一种或多种下面参数的增加：地上面积(或者多叶生物量)、早期活力、萌发势、根生物量、种子总数、饱满种子数、总种子产量(种子总重)、千粒重、收获指数、每个圆锥花序的花数。
实施例11：稻中启动子活性的比较
稻植物用处于CaMV35S启动子、稻GOS2启动子或者稻HMGP启动子控制下的GUS基因转化。植物转化如上述并且每个构建体选择六个单拷贝(或者低拷贝)事件。每个事件播种60粒T1种子，并且通过视觉标记选择挑选转基因幼苗。通过qPCR在终止子上进一步证实转基因的完整性。幼苗叶、茎干和根分别从每个事件9株1周龄植物采样(破坏性采样)。每个事件另外9个转基因植物在温室中生长直到T2种子收获，用于后期采样。样品包括6周龄叶子、年轻花序(开花前1-2天)，和成熟的T2种子。播种35S-GUS转基因稻的两个事件，采样并与具有作为参比和对照的GOS2和HMGP启动子的株系平行地分析。通过标准定量GUS测定法测定启动子活性，结果在表F中显示。
表F：通过定量GUS测定法测定的启动子活性概述。得分是基于每个构建体的平均值(6个事件，54个样品)。1W：一周龄幼苗；6W：六周龄植物。打分系统对应于GUS活性(U/mg总的可溶性蛋白)，如下：-：＜1；+：1-10；++：10-100；+++：100-1000；++++：＞1000。
 启动子   特异性   1W叶子   1W根   1W茎干   6W叶子   花序   T2种子
 PRO0170   组成型   ++   +   +   +   +   +
 PRO0129   组成型   ++   ++   ++   ++   +++   ++
 PRO35S   组成型   ++++   +++   ++   +++   +++   ++
实施例12：拟南芥植物材料、工程化和生长条件
拟南芥Ler的种子从诺丁汉拟南芥原种中心(Nottingham ArabidopsisStock Centre)获得。hub1-1突变体在以前已经被描述为ang4-1(Berna′等，1999)。植物一般在体外生长于萌发培养基上(Valvekens等，1988)。对于根生长实验，在正方形平板(BD Falcon)中含有10g/L植物组织培养琼脂(Lab M)的萌发培养基中以垂直位置播种一排5株植物。生长室条件为16小时光照/8小时黑暗光周期，使用白光(冷白氖灯管；RadiumLampenwerken)，100μEM-2h-1光合有效辐射，和20℃。植物生长在土壤：蛭石(3∶1；v/v)混合物中温室条件下，设置温度在21到30℃之间，相对湿度为50到60％，辐射(自然光和荧光灯)在100到120μEM-2h-1光合有效辐射之间，16小时光照/8小时黑暗光周期。
为了得到HUB1(OE-HUB1)的过表达株系，通过Pfu聚合酶扩增HUB1的可读框(包括ATG和终止密码子)(2637bp)并使用GATEWAY重组策略(Invitrogen)克隆到pDONRT22I载体中以得到ENTRY克隆。ENTRY克隆与pK7WG2载体(Karimi等，Trends Plant Sci.7，193-195，2002)重组得到具有处于35S启动子控制下的ORF的DESTINATION载体。将该构建体引入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)并随后通过花浸入用该根癌农杆菌悬浮液转化Ler植物。T0种子以高密度生长在含有卡那霉素(50μg/ml)，制霉菌素(50μg/ml)和羧苄西林(250μg/ml)的生长培养基上以选择转化体。将这些T1转化体转移到土壤中以得到T2种子。
将Ler野生型、hub1-1突变体和OE-HUB1种子消毒并平板接种在具有1％琼脂的MS培养基上。在黑暗中4℃下春化两晚后，将平板置于生长室中21℃下，相对湿度50-60％，PAR 100-120μE/m2/hr，和16/8小时白天/黑夜方案(长日照(LD)生长条件)中。短日照(CD)生长条件包括8/16小时白天/黑夜方案。
实施例13：拟南芥植物的分析
播种后三周的时间过程内测量hub1-1突变体、HUB1过表达株系和Ler野生型的叶片长度、宽度和面积。在该时间过程中通过在70％乙醇中过夜初步清除叶绿素来对幼叶1和2采样。将经清除的样品转移到100％乳酸中用于保存。将清除的叶子在显微镜载玻片上封固并用安装在Bino-Leica显微镜上的Axiom摄像机(ZEISS，USA)进行照像，用ImageJ1.34软件程序进行叶片长度、宽度和面积的测量。为了进行统计学分析，用在线统计学程序(Uitenbroek，D.G，Binomial.SISA.1997.www.quantitativeskills.com/sisa/distributions/binomial.htm)进行数据的逐对比较。
开花时间的测定：抽苔的开始通过视觉观察并且表示为春花后的天数。
为了测定光合色素，从25天龄体外生长的幼苗收获50mg叶子样品。将样品浸入2ml冷的80％丙酮中并用玻璃珠碾磨。离心样品(4℃下5分钟)并将上清液转移到新管中并用80％丙酮调节到5ml。在-20℃下过夜萃取色素，离心并在分光光度计中塑料比色杯中3个波长(663、646和470nm)下分析。
从(12.21＊A663)-(2.81＊A646)计算叶绿素a含量，
从(20.31＊A646)-(5.03＊A663)计算叶绿素b含量，
从(1000＊A470)-(1.82＊chl a)-(85.02＊chl b)计算总的类胡萝卜素含量。
对于每种情况，计算每50mg鲜重的色素含量。实验重复两次并且一式三份分析每个样品。
微阵列分析：
在发育阶段1.02收获三个株系幼苗的苗端并通过RNeasy(Qiagen)根据手册提取总RNA。样品在Agilent阵列上杂交并将数据归一化。以前景荧光强度测量的2为底的对数进行所有分析。以两步分析表达数据：1)“载玻片内”分析，目的是除去与对应于作为噪音的结合的差别染料应答相关的差异；和2)“载玻片间”分析，目的是估计基因型间的平均差异以及它们的标准误。对于载玻片内分析，应用如下形式的空间线性固定模型
反应＝μ+样条(强度)+残差    (1)
其中反应变量为在37971个基因点测量的前景荧光强度(M)的log2比值。在模型(1)内，染料偏倚通过三次平滑样条曲线(样条(强度))代表，如在用于微阵列数据分析的GenStat菜单中实现。一旦得到了每种基因的经调节的log2比值(M′)，计算经调节的log2R和log2G信号强度。对于载玻片之间的分析，使用方差的两步混合模型分析并用GenStat进行。将24个杂交样品的每一个进行下面形式的线性归一化模型(随机条件用下划线标出)
应答＝μ+阵列+残差                (2)
其中反应变量代表37971个基因特异性标记的经校正的log2转换的Cy3和Cy5荧光强度测量值。12个微阵列的每一个的阵列建模杂交效果作为随机条件添加。
在最后一步，估计所表达基因的比例，它们的差异的重要部分归因于基因型差异，即是遗传的。通过下面形式的混合模型单独分析37971个基因的每一个的来自模型(2)的残差
残差＝μ+染料+重复+基因型ij+阵列+误差                (3)
将基因特异性差异分配成基因特异性固定染料(Cy3和Cy5)、重复(A和B)和基因型效应，和随机点效应。基因型影响基因型ij指三种基因型Ler、hub1-1、OE-HUB1。阵列术语对每个点的效应建模并等于(Gene.Array)相互作用效果。认为该模型中的随机效应是独立的并且正态分布的，平均值为0并且方差为σt 2，其中t＝A(阵列)和E(误差)。
将线性固定模型(3)拟合，计算四种基因型中表达水平差异性的度量Wald统计数字，并为基因型间六个逐对比较的每一个分配显著性。通过对调节的P值建模为均一性和β密度的2成分混合来估计假发现率(FalseDiscovery Rates(FDRs))，如在GenStat中实现，默认参数设置用于估计π0，其是完全无效的特征的比例。最后，施加基因型表达差异的2倍改变以进一步过滤在基因型表达中可能具有统计学和生物学显著性的基因。对数据进行BinGo分析来鉴定在不同的HUB1异常表达的株系中受影响的过度代表和代表不足的生物学过程(Maere等，Bioinformatics 21，3448-3449，2005)。
实施例14：拟南芥中处于CaMV35S启动子控制下的HUB1的过表达导致改进的生长特性
HUB1过表达株系(OE-HUB1)的种子与野生型(Ler)或hub1-1突变株系相比显示出增强的萌发势：将Ler野生型、hub1-1突变体和OE-HUB1种子消毒并平板接种在具有1％琼脂的MS培养基上。在黑暗中4℃下春化两晚后，将平板置于生长室中21℃下，相对湿度50-60％，PAR 100-120μE/m2/hr，和16/8小时白天/黑夜条件中。每日监测萌发并记录萌发的可见迹象。HUB1过表达的生长促进效果观察为与野生型或hub1-1突变体相比转基因幼苗的增强的萌发势。在野生型植物中，多数幼苗在春化后两天(DAV)后萌发(图15)。对于50％的OE-HUB1幼苗，已经在春化后第一天检测到萌发并且在第二天检测到另外50％萌发。在hub1-1突变体中，萌发延迟一天并且对于50％的幼苗，仅仅在第三天观察到萌发。为了分析增强的萌发势的潜在机理，在幼叶生长期间测量Ler和OE-HUB1株系的细胞面积。在生长开始时，OE-HUB1实际上显示出细胞生长的增强，其然而被叶子到达它们的成熟大小的时间所平滑(图16)。从而，对拟南芥生长的阳性HUB1效应在发育早期发生。
此外，研究了hub1-1突变是否将导致长角果和种子发育的改变。为了分析，收获充分生长的绿色长角果(受精后4到8天)并扫描用于分析或拍照得到图像。ImageJ软件程序(Image Processing and Analysis in Java，在Research Services Branch开发，National Institute of Mental Health，Bethesda，Maryland，USA)用于计算扫描的长角果的面积。从扫描的整株植物计数每株植物的长角果数目。
从干燥长角果收获种子并扫描。使用ImageJ程序从扫描图像计算种子面积。通过将200粒种子包裹在已知重量的铝箔中并测量来测定种子重量。将每株植物的种子产量进行t检验分析。发现hub1-1长角果的面积严重减小(图17和18)。hub1-1长角果也含有较少的种子，具有50-80％未受精的种子，导致减少的总种子产量。hub1-1的种子尺寸也较小(图19)。结果，hub1-1植物的总种子产量与Ler野生型相比显著降低(图20)。尽管在hub1-1突变体植物中，长角果和种子参数受到强烈影响，但是在HUB1过表达株系中，没有观察到对种子参数的显著影响。这可能是由于在拟南芥中，种子发育不依赖于细胞生长或者处于35S CaMV启动子控制下的过表达不是最佳的。然而，在HUB1过表达株系中，长角果(果实)形态受到在宽度中增加的面积的改变(图18)。
实施例15：HUB1的诱变和HUB1pm突变体的功能表征
通过PCR介导的位点定向诱变(QuickChange，Stratagene)诱变HUB1的RING结构域中半胱氨酸和组氨酸的八聚体的编码序列，使得Cys1和Cys2被改变成Ser残基(图1，小图B)。重组蛋白被克隆为具有His和GST表位标记的融合蛋白，在大肠杆菌中表达，并且在亲和柱上层析。在如Fleury等(2007)中所述的体外(自体)泛素化测定法中测试纯化的蛋白质的组蛋白H2B单泛素化和自身泛素化活性，也见实施例6。
RING结构域中的点突变降低了自身多泛素化活性，如通过在蛋白质印迹上这些修饰的降低的水平所示(图5，HA-Ab)。通过GST Ab显示了GST-HUB1的相等上样(图5，GST-Ab)。这些数据证明RING结构域是自身泛素化活性所需的。出乎意料地，组蛋白H2B单泛素化不受点突变的影响(图5，HA-Ab)。此外，H2B底物的存在降低了自身多泛素化活性，提示不存在底物时，HUB1蛋白质可以通过蛋白质降解被除去。认为点突变通过减少自身调节从而稳定蛋白质，使得该蛋白质是显性阳性的。然而，在用蛋白酶体抑制剂(MG132)处理的最初测试中，没有观察到HUB1蛋白质的积累，提示其可能不是不稳定的蛋白质而是多泛素化可能具有备选的但是还没有被鉴定的调节功能。
RING结构域主要涉及与E2酶的相互作用并且似乎在本公开中产生的点突变不消除该相互作用或者完全的功能RING结构域不是介导组蛋白修饰绝对必须的。泛素E3连接酶和RING结构域的其他可能的突变将包括靶定保持所述两个锌原子的半胱氨酸和组氨酸八聚体的额外的氨基酸。可能性包括替代保持一个Zn的一个或两个半胱氨酸或者替代保持两个Zn原子的两个或四个半胱氨酸。更严重的改变是缺失整个RING结构域，其将产生与hub1-1突变体相当的突变体。hub1-1表型与Col-0背景中的敲除等位基因相比是非常强的(Fleury等，2007)并且可能提示在RING结构域前面的早期终止密码子引起产生对蛋白质功能具有显性失活效果的截短蛋白质。正在产生抗体来证实在hub1-1株系中HUB1蛋白质的截短。产生了NTAP-标记的HUB1和HUB1pm构建体用于串联亲和力纯化(TandemAffinity Purification)实验用于相互作用组(interactome)研究。泛素E3连接酶的RING结构域通常介导与E2酶的相互作用。然而，在HUB1 RING结构域中产生的点突变对相互作用组具有影响。尽管全长HUB1能够结合同源蛋白HUB2，但是点突变似乎消除了该结合活性。
为了进一步分析HUB1中的RING结构域(当在蛋白质降解中发挥功能时)对植物生长调节的作用，在拟南芥植物中转化了TAP标记的野生型和点突变构建体。蛋白质印迹分析用于检测植物中的蛋白质水平和评估蛋白酶体抑制剂处理对Hub1蛋白质水平的影响。通常，RING结构域中的点突变产生E3连接酶的显性失活形式，其捕获底物但是不介导它们的泛素化并且从而靶标被稳定化。预期由于对底物的滴定效应，点突变转基因植物的表型比无效突变体中的那些更温和。然而，在体外点突变蛋白质的分子表征提示HUB1由于降低的自身调节而被相当稳定化，而没有观察到H2B单泛素化的减少。
实施例16：转基因拟南芥中HUB1pm的过表达改善了植物生长性质
将拟南芥hub1-1突变体或野生型Ler用各自处于CaMV35S启动子控制下的HUB1或HUB1pm编码序列转化，如上述培养。出乎意料地发现Ler背景中HUB1pm突变体的过表达对叶子宽度具有影响，并且增加的叶子宽度对于HUB1pm比HUB1更突出(图21A)；在突变体hub1-1背景中观察到相同的效果，尤其与对照或HUB1转化体相比，HUB1pm转化体的叶子3到9具有增加的叶子宽度(图21B)。
实施例17：处于中等强度启动子控制下的HUB1pm蛋白质的过表达增加了种子产量
将稻用与中等强度启动子(如HMGP启动子)有效连接的HUB1pm编码序列转化并如上述培养。植物具有改进的生长特征，包括下面的一种或多种：增加的生物量、增加的萌发势、增加的早期活力、增加的种子产量、增加的胁迫耐受性。
实施例18：昼夜节律钟基因表达受到受调节的HUB1表达的影响
OE-HUB1微阵列数据表明昼夜节律钟在HUB1异常表达株系中受损。输入基因、钟振荡子基因以及输出基因被检测为在HUB1过表达株系中被上调。为了鉴定真实的HUB1靶基因，从微阵列实验记录了hub1-1突变体和OE-HUB1株系之间受相反调节的基因。表G显示了在hub1-1突变体中被显著下调和在OE-HUB1株系中被上调的43种基因列表，数据根据hub1-1和OE-HUB1之间上升的log2比率排序。在过表达(向上)和突变体(向下)株系之间被相反调节的前43种基因中，18种只在白天被调节，这些被白天调节的基因的8种是前10种的部分(表G)。在这些基因中，检测到昼夜节律钟振荡子组分，如CCA1、LHY和APRR9。此外，F-盒家族蛋白质(FKF1)/adagio 3(ADO3)E3泛素连接酶SCF复合体F-盒亚基和ELF4(分别为At1g68050和At2g40080，都是时钟输入基因)，时钟振荡子基因APRR5(假应答调节物5，At5g24470)，APRR3(假应答调节物3，At5g60100)，和TOC1的表达在hub1-1突变体中被上调，但是在OE-HUB1植物中被下调。一些时钟输出基因，包括叶绿素A-B结合蛋白(如LHCB4.3，At2g40100)在OE-HUB1植物中被上调。这些数据一起证明昼夜节律钟受到HUB1异常表达的影响。为了进一步证实昼夜节律钟的频率或幅度在hub1株系中是否受影响，使用时钟基因的QPCR分析进行了时间过程实验。为此，使用了体外生长的幼苗，其在短日照条件下萌发，12到14天后移动到连续光照条件下。在连续光照下24小时后开始取样，在48小时的时间内每4小时收获地上部分。使用RNeasy(Qiagen)提取RNA，接着进行DNA酶处理。从3ug总RNA开始用第一链合成试剂盒(Invitrogen)制备cDNA。5μl稀释的cDNA(20ng/ul)与SYBR Green和基因特异性引物用于每个反应中。使用标准技术在Bio Rad iCycler中进行QPCR。
初步结果表明在hub1-1突变体中，CCA1表达的幅度降低，在波中具有偏移。
表G：具有负的log2值的hub1-1和OE-HUB1(具有正的log2值)之间被相反调节的基因。基因以hub1-1和OE-HUB1之间上升的log2比例排序，截断log2比值在-1.99。D；白天节的。Log2；表达值。
Figure BDA0000046184160000901
Figure BDA0000046184160000911
Figure BDA0000046184160000921
实施例19：昼夜节律钟的下游途径受到HUB1的受调节的表达的影响
昼夜节律钟的输出基因包括光合能力和质体发育的调节物。为了阐明光依赖性表型hub1-1突变体，将Ler野生型和HUB1过表达植物生长在三种不同的光条件下：长日照(LD)、短日照(SD)和连续光(CL)用于表型表征(图6)。在短日照光条件下生长的hub1-1突变体明显具有灰白色。在长日照条件下，hub1-1生长表型是最温和的并且主要如Fleury等，(2007)中所述。在LD和CL条件下，hub1-1幼苗仅仅显示出偶尔缺少色素。
为了证实hub1-1突变体植物具有降低的光合能力，分析了在三种光方案下生长的植物中的光合色素(即叶绿素a和b)含量和总的类胡萝卜素含量。在SD中，所有色素都减少(图7)。灰白的叶子颜色和降低的色素含量预测质体结构中的缺陷并且该假设得到转录组数据的支持。这在通过透射电子显微镜检查研究光表型下潜在的亚细胞特征时得到证实。通过TEM得到的首次图像显示出hub1-1突变体的改变的类囊体(thylacoid)膜结构(图8)。膜和基粒总量减少并且在子座中存在更多的质体小球。
实施例20：hub1-1的光依赖性表型在短日照条件下被增强
除了降低的光合能力，在hub1-1中昼夜节律钟调节的表型包括缩短的下胚轴长度、减慢的叶子生长和早的开花时间。我们比较了与野生型Ler相比，在HUB1异常表达株系(OE和突变体)中这些时钟相关的表型。植物生长在短日照条件下并且在生长21天后测量了它们的下胚轴长度。hub1-1突变体下胚轴长度缩短(图9)。在黑暗中生长的幼苗中，没有观察到下胚轴长度的差异。
还已经提示受损的质体发育可以影响叶子形态。为了比较三种条件下的生长表型，测量了21天体外生长的幼苗的叶子面积。尽管hub1-1突变体的子叶生长不受影响，但是真叶的展开生长在所有条件下受到严重抑制(图6、10和11)。
此外，在生长于短日照条件下的hub1-1突变体中观察到新的形态学效应。从第三和第四叶向上，一些叶子仅仅发育为钉状结构或者它们的中间叶脉从狭叶的远轴边伸出(图12)。除了钉状结构外，hub1-1突变体还显示出改变的叶子形态，如减慢的生长、狭窄的叶片和改变的叶脉模式。也已经观察到改变的花形态。来自hub1-1突变体植物的花结构揭示花分生组织和器官失去了和/或是异位的(图13)。
此外，hub1-1突变体植物在SD条件以及在两种其他生长条件下都早开花(基于抽苔的开始)。
实施例21：发育基因的改变的表达与hub1-1表型相关
hub1-1突变体植物具有严重的叶子表型，具有减慢的生长、改变的叶脉模式和偶尔表现出伸出的中间叶脉或钉状真叶。HUB1异常表达株系的微阵列数据也显示出许多发育基因如KNAT、WUS、AP2、CLAVATA基因的改变(表H)。图14显示了根据Genevestigator在HUB1微阵列中鉴定的发育基因的表达模式。
表H：在hub1-1和Ler野生型或OE-HUB1株系中差别表达的发育基因。缺失值不是显著的(p)。根据hub1-1和Ler野生型之间上升的比值对基因排序。
Figure BDA0000046184160000951
实施例22：与Ler野生型植物和HUB1OE相比在hub1-1中生物学过程的调节
对微阵列数据进行BiNGO分析(用于确定哪些Gene Ontology(GO)术语在一组基因中被显著过度代表的工具)(实施例13)以鉴定受到HUB1异常表达影响的生物学过程。表I1和I2显示了与Ler野生型植物相比在hub1-1中差别表达的基因列表：
表I1：与Ler相比在hub1-1中下调的基因(SEQ ID NO：244到SEQID NO：835)
  AT1G01010   AT1G55670   AT2G26760   AT3G19820   AT4G18480   AT5G24400
  AT1G02065   AT1G56200   AT2G26760   AT3G20070   AT4G18960   AT5G24400
  AT1G02800   AT1G56200   AT2G27380   AT3G20070   AT4G19350   AT5G24400
  AT1G03120   AT1G56200   AT2G27960   AT3G20070   AT4G19350   AT5G24470
  AT1G03130   AT1G57770   AT2G27960   AT3G20440   AT4G19350   AT5G24470
  AT1G04110   AT1G58290   AT2G27960   AT3G20440   AT4G19560   AT5G24470
  AT1G05190   AT1G58290   AT2G27970   AT3G20440   AT4G19560   AT5G24470
  AT1G05190   AT1G59940   AT2G28000   AT3G20780   AT4G19560   AT5G24470
  AT1G05190   AT1G59940   AT2G29090   AT3G21640   AT4G20050   AT5G26742
  AT1G06570   AT1G60600   AT2G29090   AT3G22200   AT4G20060   AT5G26742
  AT1G06820   AT1G63260   AT2G29090   AT3G22780   AT4G20060   AT5G26742
  AT1G07370   AT1G63970   AT2G30950   AT3G22880   AT4G20060   AT5G27720
  AT1G07370   AT1G63970   AT2G30950   AT3G24560   AT4G20910   AT5G27720
  AT1G07370   AT1G63970   AT2G32250   AT3G24560   AT4G20910   AT5G27720
  AT1G08090   AT1G65470   AT2G32250   AT3G24560   AT4G21270   AT5G35220
  AT1G08520   AT1G66330   AT2G32590   AT3G24730   AT4G24150   AT5G35520
  AT1G08520   AT1G66650   AT2G33480   AT3G25980   AT4G25080   AT5G35630
  AT1G08840   AT1G67440   AT2G33810   AT3G25980   AT4G25080   AT5G37630
  AT1G08840   AT1G67440   AT2G33810   AT3G25980   AT4G25700   AT5G37630
  AT1G08840   AT1G67440   AT2G34420   AT3G27920   AT4G26500   AT5G37630
  AT1G09000   AT1G67740   AT2G34420   AT3G29290   AT4G26500   AT5G37630
  AT1G10470   AT1G68050   AT2G34430   AT3G29290   AT4G26500   AT5G37780
  AT1G10470   AT1G68050   AT2G34430   AT3G29290   AT4G27700   AT5G37780
  AT1G10510   AT1G68480   AT2G34650   AT3G33520   AT4G28190   AT5G37890
  AT1G10510   AT1G68900   AT2G34650   AT3G33520   AT4G28190   AT5G39820
  AT1G10510   AT1G68900   AT2G34650   AT3G44560   AT4G28210   AT5G40280
  AT1G11870   AT1G69040   AT2G37680   AT3G44880   AT4G28210   AT5G40600
  AT1G12770   AT1G69040   AT2G37680   AT3G44880   AT4G28210   AT5G40600
  AT1G12770   AT1G69040   AT2G37860   AT3G47500   AT4G28660   AT5G40600
  AT1G12770   AT1G69440   AT2G37920   AT3G47500   AT4G28980   AT5G41480
  AT1G13690   AT1G69440   AT2G37920   AT3G48110   AT4G29830   AT5G41480
  AT1G13870   AT1G70210   AT2G37920   AT3G48110   AT4G29830   AT5G41480
  AT1G14150   AT1G70210   AT2G38280   AT3G48190   AT4G30950   AT5G42190
  AT1G15570   AT1G70210   AT2G38280   AT3G48470   AT4G30950   AT5G42190
  AT1G15570   AT1G71230   AT2G38280   AT3G48470   AT4G31500   AT5G42190
  AT1G15570   AT1G71230   AT2G39470   AT3G48470   AT4G31500   AT5G43080
  AT1G15820   AT1G71230   AT2G40760   AT3G50210   AT4G31500   AT5G43080
  AT1G18450   AT1G71230   AT2G41720   AT3G50790   AT4G32810   AT5G43080
  AT1G19050   AT1G71230   AT2G41720   AT3G50790   AT4G33790   AT5G45930
  AT1G20610   AT1G71230   AT2G41720   AT3G50790   AT4G34620   AT5G45930
  AT1G20610   AT1G71440   AT2G41980   AT3G51160   AT4G34620   AT5G47110
  AT1G20610   AT1G71440   AT2G43010   AT3G52430   AT4G34620   AT5G47110
  AT1G20930   AT1G71440   AT2G43010   AT3G53130   AT4G35900   AT5G48150
  AT1G20930   AT1G73590   AT2G43280   AT3G54420   AT4G35900   AT5G48150
  AT1G20930   AT1G73590   AT2G43280   AT3G54420   AT4G36920   AT5G48150
  AT1G21970   AT1G73590   AT2G45330   AT3G54420   AT4G36920   AT5G48150
  AT1G21970   AT1G73590   AT2G45330   AT3G54720   AT4G36920   AT5G48150
  AT1G21970   AT1G73590   AT2G45330   AT3G54720   AT4G37000   AT5G48630
  AT1G22770   AT1G74470   AT2G45480   AT3G54720   AT4G37230   AT5G48630
  AT1G22770   AT1G74470   AT2G46340   AT3G54720   AT4G37230   AT5G48630
  AT1G22920   AT1G75350   AT2G46340   AT3G54720   AT4G37580   AT5G48820
  AT1G22920   AT1G75350   AT2G46340   AT3G54720   AT4G37580   AT5G48820
  AT1G22920   AT1G75350   AT2G46340   AT3G55330   AT4G37580   AT5G48820
  AT1G22920   AT1G76570   AT2G46340   AT3G58780   AT4G37580   AT5G49030
  AT1G22920   AT1G77080   AT2G46340   AT3G59400   AT4G37580   AT5G49555
  AT1G22920   AT1G77080   AT2G46820   AT3G59400   AT4G37740   AT5G49880
  AT1G23080   AT1G77850   AT2G48120   AT3G60370   AT4G39100   AT5G49880
  AT1G23080   AT1G78630   AT2G48120   AT3G60830   AT4G39100   AT5G49880
  AT1G23080   AT1G78630   AT3G02380   AT3G60830   AT4G39100   AT5G50280
  AT1G24260   AT1G78630   AT3G02380   AT3G60830   AT4G39100   AT5G50280
  AT1G24340   AT1G80080   AT3G02660   AT3G61470   AT4G39100   AT5G50280
  AT1G24340   AT1G80370   AT3G02660   AT3G61470   AT4G39620   AT5G52570
  AT1G24340   AT1G80370   AT3G02660   AT3G61780   AT4G39620   AT5G53090
  AT1G25580   AT1G80370   AT3G02780   AT3G61780   AT4G39620   AT5G53660
  AT1G26310   AT2G01420   AT3G02780   AT3G61780   AT5G01530   AT5G57030
  AT1G26310   AT2G04160   AT3G03450   AT4G00180   AT5G02250   AT5G57030
  AT1G29410   AT2G04842   AT3G03450   AT4G01710   AT5G02250   AT5G57030
  AT1G30610   AT2G04842   AT3G04630   AT4G02560   AT5G02250   AT5G57050
  AT1G30610   AT2G04842   AT3G06350   AT4G02560   AT5G04560   AT5G57050
  AT1G30610   AT2G05620   AT3G06350   AT4G02770   AT5G04560   AT5G60540
  AT1G32200   AT2G13680   AT3G06350   AT4G03270   AT5G04560   AT5G60540
  AT1G32200   AT2G16500   AT3G06430   AT4G03270   AT5G06240   AT5G60540
  AT1G32200   AT2G16500   AT3G06430   AT4G03270   AT5G06240   AT5G61510
  AT1G33060   AT2G16500   AT3G06430   AT4G03280   AT5G06240   AT5G62430
  AT1G33280   AT2G17620   AT3G07390   AT4G04350   AT5G07280   AT5G62430
  AT1G42970   AT2G17620   AT3G07430   AT4G04350   AT5G08170   AT5G63050
  AT1G43710   AT2G17620   AT3G07430   AT4G04350   AT5G08170   AT5G63050
  AT1G43710   AT2G18020   AT3G07430   AT4G04900   AT5G08170   AT5G63050
  AT1G43710   AT2G18020   AT3G07500   AT4G10180   AT5G10140   AT5G63790
  AT1G44110   AT2G18020   AT3G07500   AT4G10180   AT5G10140   AT5G64050
  AT1G44110   AT2G20000   AT3G10390   AT4G10180   AT5G10330   AT5G64520
  AT1G44110   AT2G20000   AT3G10390   AT4G10180   AT5G10330   AT5G65060
  AT1G44446   AT2G20000   AT3G10670   AT4G10180   AT5G10330   AT5G65060
  AT1G44446   AT2G20000   AT3G10670   AT4G10180   AT5G10360   AT5G65070
  AT1G45474   AT2G20000   AT3G10670   AT4G10350   AT5G10360   AT5G65070
  AT1G45474   AT2G20000   AT3G11670   AT4G 12550   AT5G10360   AT5G65080
  AT1G47530   AT2G21710   AT3G11670   AT4G 12980   AT5G10480   AT5G65080
  AT1G47530   AT2G21710   AT3G 13960   AT4G 13560   AT5G10480   AT5G65930
  AT1G48270   AT2G21710   AT3G14110   AT4G 13560   AT5G12990   AT5G66055
  AT1G48270   AT2G22840   AT3G14110   AT4G 13560   AT5G16715   AT5G66055
  AT1G48270   AT2G22870   AT3G15030   AT4G15090   AT5G16715   AT5G66055
  AT1G48270   AT2G22870   AT3G15270   AT4G15090   AT5G16715   AT5G66570
  AT1G48380   AT2G22870   AT3G15270   AT4G15510   AT5G17710   AT5G66570
  AT1G49510   AT2G23430   AT3G16290   AT4G15560   AT5G17710   AT5G67030
  AT1G49510   AT2G23430   AT3G16290   AT4G15560   AT5G17710   AT5G67180
  AT1G49510   AT2G23430   AT3G16290   AT4G16110   AT5G18700   AT5G67260
  AT1G50250   AT2G23430   AT3G18110   AT4G16250   AT5G18700   AT5G67260
  AT1G50250   AT2G25660   AT3G18110   AT4G16250   AT5G18700   AT5G67260
  AT1G51190   AT2G25660   AT3G18110   AT4G16280   AT5G22290   AT5G67570
  AT1G52230   AT2G25660   AT3G18390   AT4G16280   AT5G22370   AT5G67570
  AT1G52890   AT2G25840   AT3G18390   AT4G16750   AT5G22370   AT5G67570
  AT1G53230   AT2G26760   AT3G18390   AT4G18480   AT5G22370
表I1中的基因涉及光合作用(Gene Ontology(GO)ID nr 15979)、光合作用的调节、光反应(GO ID nr 42548)、叶绿素生物合成(GO ID nr15995)、叶绿素代谢(GO ID nr 15994)、类胡萝卜素生物合成(GO ID nr16117)、对红光或远红光的反应(GO ID nr 9639)、光合作用、光收集(GO IDnr 9765)、光形态发生作用(GO ID nr 9640)、发育的调节(GO ID nr 50793)、种子发育(GO ID nr 48316)、发育(GO ID nr 7275)、细胞周期(GO ID nr7049)、细胞周期的调节(GO ID nr 51726)。
表I2：与Ler相比在hub1-1中上调的基因(SEQ ID NO：836到SEQ IDNO：961)
  AT1G09570   AT1G70140   AT2G25930   AT3G46550   AT4G32880   AT5G20520
  AT1G12840   AT1G70140   AT2G25930   AT3G54010   AT4G32880   AT5G20730
  AT1G12840   AT1G70710   AT2G26710   AT3G54010   AT4G34490   AT5G25810
  AT1G13180   AT1G70710   AT2G26890   AT3G54220   AT4G34490   AT5G25810
  AT1G13180   AT1G70940   AT2G34710   AT3G54920   AT4G36380   AT5G26751
  AT1G13980   AT1G72560   AT2G34710   AT3G54920   AT4G36380   AT5G39510
  AT1G13980   AT1G75080   AT2G34710   AT3G61460   AT4G39400   AT5G49720
  AT1G13980   AT1G75750   AT2G38120   AT4G02980   AT4G39400   AT5G49720
  AT1G17060   AT1G75750   AT2G46920   AT4G02980   AT4G39400   AT5G52240
  AT1G17060   AT1G75750   AT3G05840   AT4G 12420   AT4G40060   AT5G52240
  AT1G19350   AT1G75780   AT3G 13870   AT4G 12420   AT4G40060   AT5G53950
  AT1G19850   AT1G75780   AT3G 13870   AT4G18710   AT5G16490   AT5G53950
  AT1G36160   AT1G76420   AT3G15170   AT4G18710   AT5G16490   AT5G62310
  AT1G49040   AT2G06850   AT3G15170   AT4G18710   AT5G18580   AT5G62310
  AT1G49040   AT2G06850   AT3G15170   AT4G23640   AT5G18580   AT5G64630
  AT1G56010   AT2G18790   AT3G18730   AT4G23640   AT5G19280   AT5G66680
  AT1G56010   AT2G20370   AT3G23050   AT4G30610   AT5G20350   AT5G66680
  AT1G62360   AT2G20370   AT3G46550   AT4G32880   AT5G20350
表I2中的基因涉及细胞大小的调节(GO ID nr 8361)、纵轴规格(GOID nr 9942)、初生苗顶端分生组织规格(GO ID nr 10072)、细胞形态发生(GO ID nr 7148)、分生组织的组织(GO ID nr 9933、向重力性(GO ID nr9630)、对油菜素类固醇刺激的反应(GO ID nr 9741)。
表I3和I4显示了与HUB1过表达植物(HUB1 OE)相比在hub1-1中差别表达的基因列表：
表I3：与HUB OE相比在hub1-1中下调的基因(SEQ ID NO：962到SEQ ID NO：1023)
  AT1G07790   AT1G75600   AT2G46830   AT3G46030   AT5G10400   AT5G59870
  AT1G07790   AT2G21660   AT2G46830   AT3G46320   AT5G10400   AT5G60100
  AT1G09200   AT2G21660   AT3G09480   AT3G46320   AT5G12910   AT5G60100
  AT1G09200   AT2G28720   AT3G09480   AT3G46640   AT5G12910   AT5G61380
  AT1G22770   AT2G28720   AT3G20670   AT3G46640   AT5G22880   AT5G61380
  AT1G22770   AT2G37470   AT3G20670   AT3G54560   AT5G22880   AT5G65360
  AT1G28330   AT2G37470   AT3G27360   AT3G54560   AT5G24470   AT5G65360
  AT1G28330   AT2G40080   AT3G27360   AT5G02560   AT5G24470
  AT1G51060   AT2G40080   AT3G45980   AT5G02560   AT5G27670
  AT1G51060   AT2G46790   AT3G45980   AT5G09230   AT5G27670
  AT1G75600   AT2G46790   AT3G46030   AT5G09230   AT5G59870
表I3中的基因涉及染色质装配(GO ID nr 31497)、昼夜节律(GO IDnr 7623)。
表I4：与HUB OE相比在hub1-1中上调的基因(SEQ ID NO：1024到SEQ ID NO：1045)
  AT1G04550   AT1G56010   AT2G34710   AT4G08150   AT4G37650   AT5G53950
  AT1G13980   AT1G56010   AT3G54220   AT4G24220   AT5G53950   AT5G63090
  AT1G51190   AT2G34710
表I4中的基因涉及模式规格(GO ID nr 7389)、初生苗顶端分生组织规格(GO ID nr 10072)。
从这些数据，可以清楚地得出昼夜节律钟处于HUB1控制下的结论。
实施例23：HUB1的相互作用组
第一个实验：
HUB1在组蛋白H2B单泛素化中的角色提示HUB1是Bre1E3连接酶的功能同源物。为了鉴定HUB1相互作用蛋白质，已经利用了串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)技术，其允许在天然条件下快速纯化蛋白质复合体并且是基于目的蛋白质中TAP-标记的融合(Puig等，Methods.24(3)：218-29，2001)。
因为RING蛋白质在它们的C末端具有功能上重要的结构域，所以通过克隆HUB1的全长形式和点突变形式(HUB1pm，HUB1f1)制备N-末端融合物代替常规的C末端融合物。将拟南芥细胞培养物用两种构建体转化并在10升规模上培养，收获并通过TAP纯化(Van Leene等，Mol.CellProteomics 6，1226-38，2007)。蛋白质提取物在1-D SDS-PAGE凝胶上分离并从凝胶分离用于通过质谱法进行蛋白质鉴定(Laukens等，Proteomics.4，720-7，2004，Van Leene等，2007)。使用两个截断值，导致“证实的”和“待证实”的候选相互作用物列表(表I)。
表J：所有证实的和一组待证实的TAP鉴定的HUB1相互作用物证实的
Figure BDA0000046184160001011
Figure BDA0000046184160001021
在证实的数据集中，存在相互作用物TAP HUB1和HUB2，证明同源物之间二聚体的形成。此外，将乙酰基转移酶GCN5、RNA结合蛋白和KH结构域蛋白质鉴定为HUB1相互作用蛋白质。已知这些蛋白质多数位于细胞核或核仁中。HUB1的GFP构建体也已经定位于细胞核(Liu等，2007)。当HUB1pm用于TAP纯化时，不能将HUB2鉴定为相互作用蛋白质。这些数据提示功能RING结构域是HUB1和HUB2二聚化所需的。在TAP纯化实验中仅仅相互作用一次的一组蛋白质在表中被列为“待证实的”。
GCN5是涉及胁迫应答、防御、信号转导、转录、代谢、运输和花发育的组蛋白乙酰化酶，其中它影响两种关键的基因如WUSCHEL(WUS)和AGAMOUS(AG)。NOP56是酵母中核糖体生物发生中所需的。Myb是一种具有转录因子活性的DNA结合蛋白，涉及对脱落酸、茉莉酸和水杨酸刺激的应答。纤维蛋白2是一种RNA甲基转移酶和AtPRMT1a和AtPRMT1b的潜在底物，AtPRMT1a和AtPRMT1b是涉及其他翻译后修饰中的mH4K3的两种蛋白质甲基转移酶。也为SEUSS和spen样核酸结合蛋白显示了与HUB1的直接相互作用。通过酵母双杂交测定法测试了许多证实的和待证实的相互作用物来验证它们是否与HUB1直接相互作用。为HUB2、SEUSS和Spen样蛋白质显示了与HUB1的直接相互作用。其他证实的相互作用物可能需要用于与HUB1相互作用的中间蛋白质。
第二个实验：
不是使用最初的TAP标记，而是将Van Leene等(Trends in PlantScience 13，517-520，2008)开发的经优化的GS-TAP标记N-末端融合到多种引诱蛋白(见表J)。将构建体转化到拟南芥原生质体细胞中并且通过Western分析证实融合蛋白的表达。在5升规模的细胞培养物中产生了经标记的蛋白质，提取，并用Van Leene等(2008)等所述的串联亲和纯化方案纯化。将结合的复合体洗脱、沉淀并进行SDS-PAGE。提取考马斯染色的蛋白质带，胰蛋白酶消化并通过MALDI-TOF-TOF质谱法分析。
对于每个实验，已经进行了来自相同细胞培养物的两次独立的纯化(a&b)，并且在HUB1的情况下，已经进行了两次不同的纯化以便对于其相互作用网络有更强的支持。不同TAP纯化的结果在表J中列出。这些数据表明存在包含HUB1、HUB2、SL和KH的复合体。实际上，使用HUB1、HUB2和SL作为诱饵进行的所有TAP测定法都能够鉴定这三种蛋白质以及KH。此外，通过用两种不同TAP标记纯化加强了HUB1 TAP的结果。
表K：使用与GS-TAP标记融合通过TAP纯化检索的蛋白质列表。(a)和(b)代表独立的纯化，期望值是基于肽序列和蛋白质之间的同源性。
Figure BDA0000046184160001041
＊)具有不同的检索号的14种泛素
在涉及HUB1作为诱饵的两个TAP实验中，已经检索了它的同源物HUB2以及一种含有K同源性基序的蛋白质(重命名为KH)，它是一种未表征的分子，具有5个参与RNA结合的KH结构域。Spen-样(SL)是另一种未表征的蛋白质，其出现在一个实验的两次技术重复中以及在用最初的TAP标记进行的实验中。该蛋白质除了其C末端的SPOC结构域外也具有一个RNA结合结构域(RRM)。通过使用HUB2作为诱饵也得到了相当的结果。HUB1和HUB2的相互纯化提示形成了四聚体结构以控制组蛋白H2B单泛素化。已经在用HUB1进行的TAP实验的一次技术重复中检索到了K3K7。该蛋白质含有在RNA稳定化中发挥功能的五个三角状五肽重复区(pentatricopeptide repeats)(PPR)，因为相同的结构域存在于叶绿体RNA处理1(Crp1)(一种参与RNA处理的蛋白质)中。使用SL作为诱饵的TAP显示出其与HUB1、HUB2和KH结合的如何紧密。组合用HUB1、HUB2和SL(和下面的KH)作为诱饵的TAP实验数据，我们可以得出由HUB1-HUB2组成的所谓的组蛋白H2B单泛素化四聚体核心复合体含有至少两种额外的蛋白质：SL和KH。两种蛋白质具有RNA结合模块。该类型的蛋白质迄今还没有与组蛋白H2B单泛素化相关，然而，如下事实——该过程像其他外遗传标记一样，与DNA和新产生的mRNA紧密结合——提示这些蛋白质在组蛋白H2B单泛素化中具有关键作用，其中它们对RNA的亲和性可以导致在HUB1/HUB2复合体中掺入上游或反馈信息(例如来自小RNA分子)。UBC2允许减少泛素化复合体的其他基本组分像泛素，它们通过14个UBQ不同的检索号代表(由于它们之间的高同源性而不能区分)，和两种E1活化酶AtUBA1和AtUBA2。
第三个实验：
为了鉴定HUB1的直接相互作用物，进行酵母双杂交实验。对于所选蛋白质的每一种，构建AD和BD融合物，通过蛋白质印迹证实其表达。HUB2、截短的HUB1、SEUSS和KH菌株显示出通过菌落的蓝色染色所证实的自身活化活性，并且因此不被用作Y2H实验中的猎物以避免假阳性结果。结果在表K中总结：
表L：具有逐对相互作用的矩阵。++，强相互作用；+，轻微相互作用；-，无相互作用；已经在两个独立的实验中测试了不同的HUB1、HUB2和SEUSS形式中的相互作用。
  pDEST22/pDEST32   HUB1   HUB2无RING   SL
  HUB1   ++   ++   ++
  HUB1无RING   ++   ++   -
  HUB2   ++   ++   -
  HUB2无RING   -   -
  SL   ++   -   ++
  SEUSS   +   +   -
HUB1的全长和截短形式与全长HUB2在体内相互作用。RING结构域似乎影响HUB1相互作用组复合体的相互作用，其在HUB2的情况下最明显，在HUB2中，该结构域的缺失消除了HUB1和HUB2之间的相互作用。HUB1的最强相互作用是与SL。
为了测试SL的哪部分结合HUB1，产生了两种不同形式的该蛋白质。结果表明仅仅N-末端区而不是C末端部分与HUB1相互作用。SL也显示出二聚化活性并且该蛋白质的两个区域似乎都涉及。HUB1和HUB2的截短形式也显示出与SEUSS的轻微相互作用。此外，SEUSS显示出与自己的强相互作用，反映了同源二聚化。检测到SEUSS和LUG/RON2之间强相互作用，并且如在以前的研究中报告的，支持了该测定法的可靠性。HUB1和HUB2都没有显示出与存在于拟南芥基因组中的涉及组蛋白H2B单泛素化(UBC1，UBC2，UBC3)的E2缀合酶的可检测的相互作用，然而，可能的是，HUB1/HUB2二聚体或四聚体复合体对于与UBC多肽之一的相互作用是必要的。
实施例24：Spen-样突变植物的表型表征
Spen样蛋白质在序列的中间包含RNA识别基序(RRM)并且在C末端区包含“spen旁系同源和直向同源C末端”(SPOC)结构域；其是SplitEnds(Spen)蛋白质的典型组成。
拟南芥sl-1(SALK_025388)和sl-2(GABI_461F01)种子分别得自诺丁汉拟南芥原种中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre)和GABI-Kat。将纯合种子播种在Jiffy-7pellet(www.jiffypot.com)上，过夜春化并随后在生长室中如上述的长日照条件下生长。在开花(花序茎长度约0.5cm)时，通过将所有莲座叶在1％琼脂板上排列制备叶系列(n＝10)。将叶子照像并扫描以通过mageJ 1.41测量叶子面积。也在整个群体上对开花时叶子的数目打分(n＝25)。
在土壤上培养野生型(Col-0)、hub1-4(SALK_122512)(Fleury等，2007)和两个T-DNA株系(sl-1和sl-2)的25株植物用于表型分析。开花时间在sl-2的情况下轻微但不是显著的缩短，并且在hub1-4中高度改变。另一方面，sl-1显示出在开花时叶子数目的一致减少，而该发育转换的时间与Col-0之一相当(图22A和B)。培养每种基因型10株植物直到花茎约0.5mm长，然后分析它们的叶子大小，其是清楚指出莲座叶大小的一种度量。该分析的结果表明sl-1植物的几乎所有叶子(包括子叶)的面积显著小于野生型。相反，该减少在sl-2突变体中更轻微并且仅仅很少的叶子显著更小(图22C)。15株剩余的植物进一步生长以分析生殖结构。测量每种基因型的花茎直径并且在sl-1和sl-2中以及为hub1-4观察到显著减少。然而，在花器官的水平上，在sl等位基因中以及在野生型中没有观察到明显不同。这些指征提示不像FPA(其包含多个RRM结构域，与SL相反)，SL不可能涉及花发育，因为其已经通过不存在任何开花时间表型和花结构的改变显示(图22)。SL不显示出任何开花表型，但是通过它的突变体展示出的改变局限于生长。这在图22B中是明显的，其中尽管开花时间与野生型之一符合，但是sl-1产生的叶子比Col-0少1.3片。除了这之外，性状明显涉及生长样叶面积，并且花茎直径显著减小。sl-1和sl-2的花结构没有显示出改变并且长角果并且因此种子的产生在任何T-DNA株系中也没有改变。已经在以前的实施例中表明SL直接与HUB1相互作用，HUB1是涉及组蛋白H2B单泛素化的一种E3连接酶，其也在植物生长中有功能(Fleury等，2007)。根据这些数据，我们因此提出SL通过其对该外遗传标记的影响而作为植物生长调节物。

Claims (42)

1.相对于对照植物改进植物中生长特征的方法，包括调节植物中与中等强度组成型启动子有效连接的编码HUB1多肽的核酸的表达，其中所述HUB1多肽包含RING结构域。
2.根据权利要求1的方法，其中所述RING结构域是C3HC4型。
3.根据权利要求1或2的方法，其中通过在植物中引入并表达编码HUB1多肽的分离的核酸实现所述受调节的表达。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述编码HUB1多肽的核酸编码表A中所列的任一种蛋白质或者是这种核酸的一部分，或者是能够与这种核酸杂交的核酸。
5.根据权利要求1到4任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其中所述改进的生长特征包括相对于对照植物增加的萌发势、增加的早期活力和增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量的一种或多种。
7.根据权利要求1到6任一项的方法，其中所述改进的生长特征在非胁迫条件下得到。
8.根据权利要求1到6任一项的方法，其中所述改进的生长特征在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏条件下得到。
9.根据权利要求3到8任一项的方法，其中所述中等强度组成型启动子是HMGP启动子，更优选来自稻的HMGP启动子。
10.前面权利要求任一项的方法，其中所述编码HUB1多肽的核酸是植物来源，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。
11.通过前面权利要求任一项的方法可得到的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码HUB1多肽的重组核酸。
12.分离的多肽，其选自：
(i)编码如权利要求1或2定义的HUB1蛋白质的多肽序列，其在它的RING结构域中包含一个或多个突变，所述突变基本上阻止Zn结合位点中的辅因子结合，并且其中所述一个或多个突变降低自体多泛素化而不影响底物泛素化；
(ii)SEQ ID NO：28所代表的HUB1多肽序列；
(iii)多肽序列，其以优选性升序与SEQ ID NO：28代表的氨基酸序列有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性，并且包含RING结构域，所述RING结构域包含如(i)中定义的一个或多个突变；
(iv)上面(i)、(ii)或(iii)中给出的任一氨基酸序列的功能片段，条件是该功能片段包含RING结构域，所述RING结构域包含如(i)中定义的一个或多个突变。
13.分离的核酸，其选自：
(i)编码如权利要求12中(i)到(iv)中定义的HUB1多肽的分离的核酸分子；
(ii)能够在严格条件下与编码如权利要求12的(i)到(iv)中定义的HUB1多肽的分离的核酸的互补序列杂交的核酸；
(iii)如SEQ ID NO：49代表的分离的核酸。
14.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1、2或12中定义的HUB1多肽的核酸，或如权利要求13中定义的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种中等强度控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
15.根据权利要求14的构建体，其中所述中等强度控制序列之一是组成型启动子，优选HMGP启动子，最优选来自稻的HMGP启动子。
16.根据权利要求14或15的构建体在制备相对于对照植物具有增加的萌发势、增加的早期活力和增加的产量的一种或多种的植物的方法中的用途。
17.用根据权利要求14或15的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
18.产生相对于对照植物具有改进的生长特性，尤其增加的萌发势、增加的早期活力和/或增加的产量的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中引入并表达编码如权利要求1中定义的HUB1多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
19.来自编码权利要求1或2中定义的HUB1多肽的核酸的受调节表达的转基因植物，其相对于对照植物具有改进的生长特性，尤其增加的萌发势、增加的早期活力和/或增加的产量，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
20.根据权利要求11、17或19的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
21.根据权利要求20的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗生物量和/或种子。
22.来自根据权利要求20的植物和/或来自根据权利要求21的植物的可收获部分的产品。
23.编码HUB1多肽的核酸在相对于对照植物改进生长特性，尤其增加萌发势、增加早期活力和/或增加产量中的用途。
24.修饰植物中光调节的表型的方法，包括在植物中表达编码HUB1多肽的核酸。
25.权利要求24的方法，其中所述光调节的表型是如下一种或多种：
(a)修饰的昼夜节律钟；
(b)修饰的昼夜节律钟输出应答。
26.权利要求25的方法，其中所述修饰的昼夜节律钟输出应答是如下一种或多种：
(a)修饰的光合能力；
(b)发育基因的改变的表达；
(c)改变的植物发育。
27.根据权利要求26的方法，其中所述修饰的光合能力包括光合色素的修饰的浓度和/或修饰的质体结构。
28.权利要求26的方法，其中所述发育基因是表H中所列的一种或多种序列或其直向同源物。
29.权利要求26的方法，其中所述改变的植物发育包括改变的结构和/或改变的开花时间。
30.权利要求29的方法，其中所述改变的结构包括如下一种或多种：改变的下胚轴长度、改变的叶形态和改变的花形态。
31.根据权利要求25的方法，其中所述修饰的昼夜节律钟包括编码表G中所列的蛋白质或编码此类蛋白质的直向同源物的核酸的修饰的表达。
32.权利要求31的方法，其中所述基因是日间调节的。
33.同步基因的转录的方法，包括调节HUB1的表达。
34.权利要求33的方法，其中所述基因包括涉及光合作用、昼夜节律钟和/或发育的基因。
35.HUB1作为同步基因转录的转录调节物的用途。
36.权利要求35的用途，其中所述基因包括涉及光合作用、昼夜节律钟和/或发育的基因。
37.相对于对照植物修饰植物生长特征的方法，包括调节植物中编码选自表G到K任一个的蛋白质或编码所述蛋白质的直向同源物的核酸的表达，其中所述植物生长特征包括增加的产量和/或增加的胁迫抗性。
38.权利要求37的方法，其中所述表达是增加的表达。
39.权利要求37的方法，其中所述表达是减少的表达。
40.权利要求37的方法，其中所述修饰的生长特征包括增加的产量、增加的胁迫抗性和/或修饰的结构。
41.权利要求40的方法，其中所述增加的产量包括增加的生物量和/或增加的种子产量。
42.权利要求40的方法，其中所述增加的胁迫抗性是增加的干旱胁迫抗性、增加的盐胁迫抗性、营养缺乏条件下提高的生长的一种或多种。
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