CN102224247B - 具有改良的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于改良植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中ASPAT(天冬氨酸转氨酶)多肽的编码核酸的表达而改良植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有ASPAT多肽的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还提供了在实施本发明方法中有用的迄今未知的ASPAT编码核酸及包含此核酸的构建体。此外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过提高植物中MYB91样转录因子(MYB91)多肽的编码核酸序列的表达而提高多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有MYB91多肽的编码核酸序列提高的表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明此外涉及包含所述核酸序列的核酸序列、核酸构建体、载体和植物。另外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节植物中GASA(赤霉素刺激的拟南芥)的编码核酸的表达而改良多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有GASA的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。另外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于改良植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中AUX/IAA(生长素/吲哚乙酸)多肽的编码核酸的表达而改良植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有IAA多肽的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还提供了在实施本发明方法中有用的包含AUX/IAA编码核酸的构建体。

Description

具有改良的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于改良植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中ASPAT(天冬氨酸转氨酶(Asparatate转氨酶))多肽的编码核酸的表达而改良植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有ASPAT多肽的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还提供了在实施本发明方法中有用的迄今未知的ASPAT编码核酸及包含此核酸的构建体。
此外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过提高植物中MYB91样转录因子(MYB91)多肽的编码核酸序列的表达而改良多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有MYB91多肽的编码核酸序列提高的表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明此外涉及包含所述核酸序列的核酸序列、核酸构建体、载体和植物。
另外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节植物中GASA(赤霉素刺激的拟南芥)的编码核酸的表达而改良多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有GASA的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。
另外，本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于改良植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节植物中AUX/IAA(生长素/吲哚乙酸)多肽的编码核酸的表达而改良植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有IAA多肽的编码核酸受调节表达的植物，该植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状。本发明还提供 了在本发明方法中有用的包含AUX/IAA编码核酸的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有期望性状的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总导致期望性状从亲代植物传递下去。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入、胁迫耐受性和早期生长势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以有助于提高作物产量。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人和动物营养是重要的。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间和籽苗早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
植物生物量是饲料作物如苜蓿、青贮饲料和干草的产量。产量的许多代用物已经用于谷物作物。它们当中主要是对植物尺寸的估计。植物尺寸可以根据物种和发育阶段以多种方式测量，不过包括总植物干重、地 上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座叶直径、叶长度、根长度、根质量、分蘖数和叶数。许多物种维持在给定发育阶段上植物不同部分的尺寸之间的保守比率。这些异速增长关系用来从这些尺寸量值之一外推至另一种尺寸量值(例如Tittonell等，2005Agric Ecosys & Environ 105：213)。在发育早期的植物尺寸一般与发育中稍后的植物尺寸相关。具有较大叶面积的较大植物通常可以比较小的植物吸收更多光线和二氧化碳并且因而可能会在相同的时段期间获得更大重量(Fasoula和Tollenaar 2005 Maydica 50：39)。此外，这也是植物应当初始实现较大尺寸的微环境优势或遗传优势的潜在延续。存在针对植物尺寸和生长速率的强遗传组分(例如terSteege等，2005 Plant Physiology139：1078)，并且因而对于一系列不同遗传表型，在一种环境条件下的植物尺寸很可能关联于另一种环境条件下的尺寸(Hittalmani等，2003Theoretical Applied Genetics 107：679)。以这种方式，使用标准环境作为作物在田间于不同位置及时间所遭遇的多样且动态环境的代用物。
对于许多作物，另一个重要性状是早期生长势。改进早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种方面的重要目标。长根对于水栽稻中正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对良好出苗是重要的。将早期生长势改造到植物内的能力在农业中将是极重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
收获指数即种子产量对地上部分干重的比率在许多环境条件下是相对稳定的并且因而可以经常获得植物尺寸与谷物产量之间的强相关(例如Rebetzke等，2002 CropScience 42：739)。这些过程是内在联系的，因为谷物生物量的主要部分取决于植物叶和茎的现有和储备光合生产率(Gardener等，1985 Physiology of Crop Plants.Iowa StateUniversity Press，第68-73页)。因此，选择植物尺寸(甚至在发育的早期)已经用作未来潜在产能的指示物(例如Tittonell等，2005 Agric Ecosys & Environ 105：213)。当检验遗传差异对胁迫耐受性的影响时，使土壤属性、温度、水和养分有效性和光强度标准化的能力是温室或植物生长室环境与田间相比的固有优势。然而，产量因不良授粉所致的人为限制可能限制这些受控环境检验产量差异的用途，其中所述的不良授粉因缺少风和昆虫引起，或因成熟根或株冠生长的不足够空间引起。因此，在标准化条件下在生长室或温室测量发育早期的植物尺寸是提供潜在遗传产量优势指示的标准操作。
另一个重要性状是改良的非生物性胁迫耐受性。非生物性胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言平均产量降低超过50％(Wang等，Planta(2003)218：1-14)。非生物性胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改良植物的非生物性胁迫耐受性能力将在世界范围对农民是巨大的经济优势并且将允许在不利条件期间及在本来不可能栽培作物的陆地上栽培作物。
因而可以通过优化前述因素之一提高作物产量。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参数，这取决于用途。多种机制可以有助于提高种子产量，无论其形式为提高的种子尺寸或提高的种子数目。
提高植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
关于ASPAT多肽，现在已经发现可以通过调节植物中ASPAT(天冬氨酸转氨酶)的编码核酸的表达而改良植物中多种产量相关性状。
关于MYB91多肽，现在已经发现可以通过提高植物中MYB91样转录因子(MYB91)多肽的编码核酸序列的表达而改良多种植物产量相关性状。改良的产量相关性状包含以下一项或多项：提高的植物高度、提高的收获指数和提高的千粒重(TKW)。
关于GASA多肽，现在已经发现可以通过调节植物中GASA(赤霉素刺激的拟南芥)的编码核酸的表达而改良植物的多种生长特征。
关于AUX/IAA多肽，现在已经发现可以通过调节植物中AUX/IAA多肽的编码核酸的表达而改良植物的多种生长特征。
背景技术
1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
植物的生长、发育和产量生产能力受植物中碳和氮的代谢和N/C的比例影响，Lawlor 2002 Journal of Experimental Botany，第53卷，第370期，第773-787页。
天冬氨酸转氨酶(ASPAT酶)催化天冬氨酸和2-氧化戊二酸间的转氨基作用的可逆反应以使用吡哆醛5 -磷酸盐(PLP)作为基本辅因子在反应中产生谷氨酸和草酰乙酸，该反应可表示为：L-天冬氨酸和2-氧化戊二酸＝草酰乙酸+L-谷氨酸。
该酶在所有生物中的碳和氮代谢的代谢调节中起关键作用。在所有生物中，ASPAT酶在结构上和功能上是保守的。真核细胞中，该酶在碳和氮库亚细胞区室间的互换中发挥关键作用。
天冬氨酸转氨酶分类为转氨酶超家族的组I(Jensen和Gu，1996)。进而，天冬氨酸转氨酶分类入四个亚组。亚组la包括来自真细菌和真核细胞的ASPAT，同时亚组lb包含来自包括蓝细菌和古细菌的一些真细菌的酶。De La Torre等，2006 Plant J.2006，46(3)：414-25描述了ASPAT酶的新组。
植物中，鉴定了编码ASPAT多肽的基因，其靶向不同亚细胞区室并组装到线粒体、胞质溶胶、过氧化物酶体和叶绿体的功能性ASPAT同工 酶。
2.MYB91样转录因子(MYB91)
DNA结合蛋白是包含任一DNA结合结构域并因而具有对DNA的特异或普遍亲和性的蛋白质。DNA结合蛋白包括例如调节转录过程的转录因子、切割DNA分子的核酸酶和参与细胞核中DNA包装的组蛋白。
转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合亲和性并且能够激活和/或阻遏转录的蛋白质。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组编码至少1533种转录调节蛋白，占其预计基因总数的约5.9％(Riechmann等，(2000)Science 290：2105-2109)。稻转录因子数据库(DRTF)是籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)和粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)的已知和预测转录因子的集合，并且目前含有籼稻中的2,025种推定转录因子(TF)基因模型和粳稻中的2,384种推定转录因子基因模型，分布在63个家族中(Gao等，(2006)Bioinformatics 2006，22(10)：1286-7)。
这些家族之一是特征是具有高度保守的DNA结合结构域(MYB结构域)的转录因子的MYB结构域家族。最初在禽类成髓细胞性白血病病毒的癌基因(v-myb)中描述了MYB结构域(Klempnauer等，(1982)Cell 33，453-63)。许多脊椎动物含有与v-Myb、c-Myb、A-Myb和B-Myb相关的3种基因并且已经在昆虫、植物、真菌和粘菌中鉴定到其他的相似基因。所编码的蛋白质对于许多细胞类型中增殖和分化的控制是重要的。MYB蛋白含有50-53个氨基酸的保守序列的1至4个不完全同向重复序列，所述保守序列编码参与DNA结合的螺旋-转角-螺旋结构(Rosinski和Atchley(1998)J Mol Evol 46，74-83)。3个规律间隔的色氨酸残基(它们在三维螺旋-转角-螺旋结构中形成色氨酸簇)是MYB重复序列的特征。将c-Myb中的这三个重复序列称作R1、R2和R3；并且将来自其他MYB蛋白的重复序列根据它们与R1、R2或R3的相似性分类。由于在MYB结构域之外存在有限序列保守性，因而已经将MYB蛋白基于MYB编码区之外所鉴定到的保守基序聚类成亚组(Jiang等，(2004)Genome Biology 5，R46)。
AtMYB91属于R2R3-MYB基因家族(Li和Parish，Plant J.8，963-972，1995)，该基因家族是一个大的基因家族(具有拟南芥中已报道的126种基因)(Zimmerman等，Plant J.40，22-34，2004))。该组成员参与多种过程，包括次级代谢、细胞形态发生、分生组织形成的调节、花与种子发育、细胞周期、防御和胁迫应答、光和激素信号传导(Chen等，Cell Res.16，797-798，2006)。AtMYB91也命名为AS1不对称叶1，且与在叶细胞同一性，尤其是在背腹同一性中具有进化保守作用的金鱼草属(Antirrhinum)PHAN phantastica和玉米ROUGHSHEATH2(RS2)多肽密切相关(Sun等，(2002)Planta 214(5)：694-702)。拟南芥属中，AS1表达为叶基础细胞，在此其充当具有结构上无关的AS2蛋白质的异源二聚体来抑制KNOTTED 1样同源框(KNOX)基因的活性。
3.赤霉素刺激的拟南芥(Gibberellic Acid-Stimulated Arabidopsis，GASA)
GASA(赤霉素刺激的拟南芥)蛋白质是植物特异的且在多种生理期间表达。几种GASA样基因是激素应答的，在赤霉素缺乏的背景下应用外生赤霉素诱导要被表征的家族的第一成员番茄基因GAST1的表达(Shi等，Plant J.2，153-159，1992)。相关的番茄基因(RSI-1)与GAST1具有高序列同一性且在侧向根形成期间激活(Taylor和Scheuring，Mol.Gen.Genet.243，148-157，1994)。基于它们与番茄GAST1的相似性首次识别到来自拟南芥的GASA1和GASA4(Herzog等，Plant Mol.Biol.27，743-752，1995)。表达数据表明GASA1在花蕾和未成熟的长角果中积累，GASA2和GASA3在长角果和干种子中积累，且GASA4中生长的根和花蕾中积累。有报道GASA4在所有分生组织区表达(Aubert等，Plant Mol.Biol.36，871-883，1998)。
功能上，GASA蛋白没有很好表征。据报道GASA蛋白参与病原体应答和植物发育。与野生型相比，异位表达GEG(来自非洲菊(Gerbera hybrid)的GASA同源物)的植物显示出较短的具有降低的细胞长度的花 冠，表明了GEG作为细胞延长抑制剂的作用。拟南芥GASA4的过量表达产生具有提高的种子重的植物(Roxrud等，Plant Cell Physiol.48，471-483，2007)。然而，此外这些植物还具有随从花分生组织发育到正常不确定花序发育的再转换而偶发的分生组织同一性改变。此外，受调节的GASA4表达引起分枝的增加。拟南芥GASA4的过量表达还增加了对热胁迫的耐受性(Ko等，Plant Physiol.Biochem.45，722-728，2007)。
4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
AUX/IAA(生长素/吲哚乙酸)基因编码蛋白质家族，其表达由生长素严格调节。植物激素生长素参与多种过程如细胞分裂；细胞扩展和分化；胚、维管结构或其他组织的成型；主和侧根或芽分生组织的生长调节。AUX/IAA蛋白又通常以组织特异性方式表达。
AUX/IAA蛋白通常具有四个保守氨基酸序列基序(结构域I、II、III和IV)且具有和核定位信号序列。推定结构域I和II去稳定化蛋白质，且参与蛋白质-蛋白质相互作用：AUX/IAA蛋白可以形成同源二聚体且已知与ARF蛋白相关。AUX/IAA-ARF复合物可能参与生长素介导的基因表达。AUX/IAA蛋白是生长素应答因子(ARF)的负调节物，其调节生长素应答基因的表达。AUX/IAA蛋白与DNA-结合的ARF配偶体蛋白结合并抑制ARF活性。在生长素激活状态下，通过与生长素修饰的SCFTIR1复合物的相互作用可遍在AUX/IAA蛋白且随后由26S蛋白酶体作用将其降解。AUX/IAA蛋白的作用和活性的综述由Reed给出(Trends in PlantScience 6，420-425，2001)。最近Jain等，2006Funct Integr Genomics.2006年1月；6(1)：47-59报道了稻(Oryza sativa)中早期生长素应答Aux/IAA基因家族的结构和表达分析。
IAA14是AUX/IAA蛋白，其发挥侧根形成的转录阻抑物的作用。在IAA14中获得的功能突变阻断引发侧根发育的早期中柱鞘的分裂(Fukaki等，Plant J.29，153-168，2002)。
发明概述
1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
令人惊奇地，现已发现调节ASPAT多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改良产量相关性状的方法，其包括调节植物中ASPAT多肽的编码核酸的表达。
2.MYB91样转录因子(MYB91)
令人惊奇地，现已发现提高植物中如本文定义的MYB91样转录因子(MYB91)多肽的编码核酸序列的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括增加植物中如本文定义的MYB91样转录因子(MYB91)的编码核酸序列的表达。改良的产量相关性状包含以下一项或多项：提高的植物高度、提高的收获指数(HI)和提高的千粒重(TKW)。
3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
令人惊奇地，现已发现调节GASA多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状，尤其是提高的产量的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改良植物的产量相关性状的方法，其包括调节植物中GASA多肽的编码核酸的表达。
4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
令人惊奇地，现已发现调节AUX/IAA多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状，尤其是提高的产量的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改良植物的产量相关性状的方法，其包括调节植物中AUX/IAA多肽的编码核酸的表达，其中产量相关性状不包含提高的根生长。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接 起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是因分离而丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基被引入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 -表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，但是根据给予多肽的功能性约束条 件，可以是簇集的；插入通常是约1至10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸替换的例子
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比较，它们包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变的氨基酸残基。与衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包括用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内因祖先基因复制而起源的基因；直向同源物是来自不同生物的因物种形成而起源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
结构域
术语“结构域”指在进化相关性蛋白质的序列比对结果上的特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面很可能是必需的氨基酸。结构域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高程度保守而鉴定，故它们可以用作鉴定物来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区域。基序往往是结构域的高度保守部分，但是也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相 互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处在溶液中。杂交过程也可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补性核酸之一进行。杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)的互补性核酸之一进行。为使杂交发生，核酸分子通常被热变性或化学变性，以将双链解链成两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受诸条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，将低严格条件选择成在定义的离子强度和pH处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度在Tm以下20℃时，并且高严格条件是当所述温度在Tm以下10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离且依旧编码基本上相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在定义的离子强度和pH处的下述温度，其中50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在更高温度上特异性杂交。最大杂交速率从低于Tm约16℃直至32℃获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度而言，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均且对于大的探针而言，Tm下降约1℃/每％碱基错配。根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×Lc]-1-0.61×％
甲酰胺
2)DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：
对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)
对20-35个核苷酸而言：Tm＝22+1.46(ln)
a或者用于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于在30％-75％范围内的％GC是精确的。
c L＝双链体的碱基对长度。
d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。技术人员了解可以在杂交期间变更并且会维持或改变所述严格条件的多个参数。
除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗液的功能。为除去因非特异性杂交引起的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗液的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于所述杂交严格性进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。也可以选择严格性更高或更低的条件。技术人员了解可以在洗涤期间变更并且会维持或改变所述严格条件的多个参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：alaboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包括其中已经切除、替换、置换或添加所选内含子和/或外显子或其中已经缩短或加长内含子的核酸序列的变体。此类变体将是基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因位于相同染色体位置处的备选形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产 生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/调控序列/启动子
术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。前述术语包括从经典真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)衍生的转录调节序列和应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其他调节元件(即上游激活序列、改良子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括一个-35框序列和/或一个-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或改良核酸分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列节段表达的调节元件。因此，植物启动子不必须是植物来源的，但可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用本发明方法中待表达的并在本文中描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调节区如终止子或远离ORF存在的其他3’调节区的功能性或活性。还有可能所述启动子的活性因修饰其序列或它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换而提高。为了在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空间表达模式表达基因的合适启动子。
为鉴定功能性等同启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式 可以例如通过将此启动子有效连接至报道基因并分析该报道基因在植物的多种组织中的表达水平和模式进行分析。合适的熟知报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式可以随后与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平，或以每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1000转录物表达。通常，“中等强度启动子”意指驱动编码序列以低于强启动子水平，尤其是在一切情况下以低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平表达的启动子。
有效地连接
如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间的功能连接，从而该启动子序列能够启动该目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分期间但不是必需在全部期间，以及在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
遍在启动子
遍在启动子是在生物的全部组织或细胞中基本上有活性的。
发育调节型启动子
发育调节型启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有诱导的或提高的转录启动作用，或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁 迫条件时其激活，或是“病原体诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时其激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够偏好地启动某些器官或组织如叶、根、种子组织等中转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是这样的启动子，该启动子优势地在植物根中具有转录活性，在植物的任何其他部分中基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性的”。
根特异性启动子的例子列于下表2b中。
表2b：根特异性启动子的例子
种子特异性启动子是能够在种子组织中优势地具有转录活性的启动子，但无需排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉粒/胚特异性的。种子特异性启动子(胚乳/糊粉粒/胚)的实例在下面的表2c至表2f中显示。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，将其公开并入本文作为参考，就好像完整给出一样。
表2c：种子特异性启动子的实例
表2d：胚乳特异性启动子实例
表2e：胚乳特异性启动子实例：
基因来源 参考文献
稻OSH1 Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子实例：
如本文定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。
可以用于实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下面的表2g中显示。
表2g：绿色组织特异性启动子实例
基因 表达 参考文献
玉米正磷酸二激酶 叶特异性 Fukavama等，2001
玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Kausch等，2001
稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Liu等，2003
稻小亚基Rubisco 叶特异性 Nomura等，2000
稻β扩展蛋白EXBP9 根特异性 WO 2004/070039
木豆小亚基Rubisco 叶特异性 Panguluri等，2005
豌豆RBCS3A 叶特异性
组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中具有转录活性，基本上排除植物的任何其他组织，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。可以用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例示于下表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的实例
终止子
术语“终止子”包括作为转录单元端处DNA序列的调控序列，所述的DNA序列产生初级转录物的3’加工和多腺苷酸化及转录终止的信号。终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较次优选从任何其他真核基因衍生。
调节
就表达或基因表达而言，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比较，表达水平因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平可以提高或降低。原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，这引起植物产量提高和/或生长增加。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或某些基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述RNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。
用于提高基因或基因产物表达的方法在本领域内被充分报道并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录改良子或翻译改良子。可以引入在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般在上游)中引入充当启动子或改良子元件的分离的核酸，从而上调编码目的多肽的核酸表达。例如，可以在体内通过突变、缺失和/或替换而改变内源性启动子(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动 子以相对于本发明基因的恰当方向及距离引入植物细胞，从而控制该基因的表达。
若需要多肽表达，通常希望的是在多核苷酸编码区的3’端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的3’端序列可以从例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选从任何其他真核基因衍生。
内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列以提高细胞质中聚集的成熟信使的量。已经显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子提高了mRNA水平及蛋白质水平上的基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。此类内含子改良基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于总体信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中对“内源性”基因的称谓不仅指如植物中以其天然形式(即没有人类任何干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)被引入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达的相当大程度地度降低和/或内源基因表达的实质降低。分离的基因可以从生物分离或可以是人造的，例如通过化学合成法。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或“降低或基本消除表达”意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的下降。与对照植物相比较，所述降低或基本上消除以增加的优选顺序是至少10％、20％、 30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。降低表达的方法是本领域已知的且例如，技术人员能直接采用用于沉默的已知方法以便通过使用恰当的启动子实现内源基因在整株植物或其部分中表达的降低。
为了降低或基本消除植物中内源基因的表达，需要核酸序列的基本上连续的核苷酸的足够长度。为进行基因沉默，该长度可以短至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少核苷酸，或者该长度可以长至整个基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。基本上连续的核苷酸片段可以从编码目的蛋白的核酸(靶基因)或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸衍生。优选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法的前提。
用于降低或基本去除内源基因在植物中表达或用于降低蛋白质的水平和/或活性的多种方法的实例是本领域技术人员已知的。例如，技术人员能直接采用用于沉默的已知方法以便通过使用恰当的启动子实现内源基因在整株植物或其部分中表达的降低。
可以使用常规工具和技术完成表达的这种降低或基本消除。用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是在植物中引入并表达基因构建体，其中将核酸(在此情况下，从目的基因或从能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)克隆至所述基因构建体，(部分或完全地)作为被间隔序列(非编码性DNA)隔开的反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下，所述部分是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物 的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)的反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用降低或基本上消除内源基因的表达。在包含调控序列的表达载体中克隆该反向重复序列。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成所述反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自我互补性结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，该siRNA被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该RISC进一步切开所述mRNA转录物，从而相当大程度地降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050。
本发明方法的实施不取决于在植物中引入并表达将所述核酸作为反向重复序列克隆到其中的基因构建体，不过可以使用几种熟知“基因沉默”方法中任何一种或多种方法来实现相同效果。
用于降低内源基因表达的一种这样的方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由植物中与内源性靶基因实质相似的双链RNA序列(dsRNA)触发。这种dsRNA进一步被植物加工成约20个至约26个核苷酸的所谓短干扰RNA(siRNA)。所述siRNA被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其中所述RISC切割内源靶基因的mRNA转录物，从而相当大程度地将降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，所述双链RNA序列与靶基因对应。
RNA沉默方法的另一个例子涉及将核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)以有义方向引入植物。“有义方向”是指与自身mRNA转录物同源的DNA序列。因而将所述核酸序列的至少一个拷贝引入植物。这个额外核酸序列会降低内源基因表达，从而产生已知为共抑制作用的现象。将一个核酸序列的几个额外拷贝引 入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与触发共抑制作用之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个例子涉及使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选互补于待沉默的内源基因。这种互补性可以存在于基因的“编码区”中和/或其“非编码区”中。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”指分布在编码区侧翼的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5’和3’非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以互补于整个核酸序列(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)，不过也可以是仅对所述核酸序列的部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以互补于编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域。合适反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更小的核苷酸长度开始。本发明的反义核酸序列可以使用化学合成反应和酶连接反应，利用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在核苷酸或以多种方式修饰的核苷酸化学地合成，其中所述的修饰核苷酸设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间所形成的双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的例子是本领域熟知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和‘加帽’及用类似物(如肌苷)替换一个或多个天然存在核苷酸。对核苷酸的其他修饰作用是本领域熟知的。
反义核酸序列可以使用表达载体以生物学方式产生，其中一种核酸序列已经以反义方向亚克隆(即从插入的核酸转录出的RNA会对目的靶核酸 为反义方向)到所述表达载体中。优选地，植物中反义核酸序列的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论被引入植物中或原位(insitu)地产生)与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合以因而抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译做到这一点。杂交可以因形成稳定双链体的常规核苷酸互补性引起，或例如，在与DNA双链体结合的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内的特异性相互作用引起。反义核酸序列可以通过在特定组织部位转化或直接注射引入植物。备选地，反义核酸序列可以被修饰以靶向所选的细胞并且随后全身性施用。例如，对于全身性施用，可以修饰反义核酸序列，从而它们与表达在所选细胞表面上的受体或抗原特异性地结合，例如通过将所述反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体连接而做到这一点。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细胞。
根据又一个方面，反义核酸序列是α-端基异构核酸序列。α端基异构核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，在所述双链杂交体中与常见的b-单元相反，所述链彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与之具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化地切割编码多肽的mRNA转录物，因而相当大程度地降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有专一性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，与核酸序列 相对应的mRNA转录物可以用来从RNA分子的汇集物中选出具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶在植物中用于基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO 00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。
如果内源基因中存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸中存在突变，基因沉默也可能发生。所述降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。例如，该多肽可以与多种相互作用的蛋白质结合；一种或多种突变和/或截短作用因而可以产生仍能够结合相互作用的蛋白质(如受体蛋白)但不能展示正常功能的多肽(如信号传导配体)。
基因沉默的又一种方法是瞄准互补于基因调节区(例如启动子和/或改良子)的核酸序列以形成阻止靶细胞中基因转录的三重螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer DrugRes.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992；和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
技术人员会熟知其他方法，如使用针对内源多肽的抗体以抑制该多肽在植物中(in planta)的功能，或干扰涉及某多肽的信号传导途径。特别地，可以考虑人造分子可能用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰涉及所述靶多肽的信号传导途径。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低的活性的多肽。也可以使用此类天然变体，例如来进行同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。 它们主要发挥调节基因表达和/或mRNA翻译的功能。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶。它们从具有特征性折返结构的较长非编码性RNA由Dicer家族的双链特异性RNA酶加工得来。加工后，它们通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)的主要组分-Argonaute蛋白结合被掺入该复合体。miRNA充当RISC的特异性组分，因为它们与胞浆中的靶核酸(大多是mRNA)发生碱基配对。后续调节事件包括靶mRNA切割和摧毁和/或翻译抑制。miRNA过量表达的影响因此往往反映为靶基因的mRNA水平降低。
可以专门地遗传工程化一般21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)以负向地调节单个或多个目的基因的基因表达。选择植物的微RNA靶的决定因素是本领域熟知的。用于靶识别的经验参数已经被定义并可以用来辅助具体amiRNA的设计(Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，2006 Plant Cell.200618(5)：1121-33)。
为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，并使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选地，将来自任意的给定植物物种的核酸序列引入相同的物种。例如，将来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，不绝对要求待引入的核酸序列来自与待引入该核酸序列的植物相同的植物物种。只要内源靶基因与待引入的核酸之间存在实质同源性即可。
上文描述了用于降低或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的例子。例如，本领域技术人员将能够轻易调整用于沉默的前述方法，从而通过利用合适的启动子在完整植物中或其部分中实现内源基因表达的降低。
选择标记(基因)/报道基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中在所述细胞中表达该“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”以促进鉴定和/或选择用本发明核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够借助一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生物)的形成。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记的基因(如上文所述的基因)连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明方法中使用的序列的相同载体上，或在独立的载体上引入宿主细胞。已经用所引入核酸稳定转染的细胞可以通过选择加以鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。标记基因一旦不再需要可以从转基因细胞中除去或者切除。用于标记去除的技术是本领域公知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
因为一旦已经成功地引入所述标记基因，尤其是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，则这些核酸不再是转基因宿主细胞中需要的或是不想要的，故而，用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够移除或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是所谓共转化法。共转化法同时使用两种载体以转化，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记基因。大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。标记基因随后可以通过实施杂交从转化植物中移除。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用于随目的核酸一起转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源物杂交，或转化体用引起转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化。在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功发生，则转座子从宿主细胞的基因组跳出并丢失。在其他许多情况下，转座子跳到一个不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过实施杂交来消除。在微生物学中，开发了有可能或促进检测这类事件的技术。又一种有利方法依赖于所谓重组系统；所述方法的优势在于杂交消除作用可以用该重组系统实行。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。Cre1是移除位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合于loxP序列之间，一旦转化已经成功发生，则它因重组酶的表达被移除。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。位点特异性地整合本发明核酸序列至植物基因组是可能的。自然，这些方法也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”例如就核酸序列而言，意指包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用本发明 核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因调控序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
并不位于它们的天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，所述的修饰有可能采取例如替换、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp序列长度。当通过非天然、合成性(“人工”)方法(例如诱变处理)修饰天然存在表达盒时，该表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码如上文所定义在本发明方法中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合-变成转基因表达盒。合适的方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
为了本发明的目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中使用的核酸不处于它们在所述植物基因组中的天然基因座处，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而，如所提及，转基因还意指尽管本发明的或在本发明方法中使用的核酸处在植物基因组中它们的天然位置处，然而相对于天然序列而言，其序列已经被修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。转基因优选理解为意指本发明核酸在基因组中非天然基因座处表达，即所述核酸的同源表达或优选异源表达发生。在本文中提及优选的转基因植物。
转化
如本文中提及的术语“引入”或“转化”包括转移外源多核苷酸至宿主细胞中，无论转化所用的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器 官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且可完整植物以从中再生。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，它可以整合至宿主基因组中。所得的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法中的任意方法将目的基因引入合适的祖先细胞。描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和微量投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.GenGenet202：179-185)；DNA或RNA包被粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、用(非整合性)病毒感染等。包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是植物原位(in planta)转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的 熟知方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。在谷物转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。所述方法例如还由B.Jenes等，Techniques for Gene，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在PotrykusAnnu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后在合适培养基中培育它们。借助根癌农杆菌转化植物例如由 和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，从而产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，在：编 者C Koncz，N-HChua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复移除花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而同样可以在较晚的时间点获得转化的种子(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是改良真空渗入法，如“浸花”法。在拟南芥属植物真空浸润法的情况下，用农杆菌悬液在减低的压力下处理完整植物[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“浸花”法的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理过的农杆菌悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过生长在如上所述的选择条件下与非转基因种子区分开。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了借助花粉的转基因流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已经在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导向原质体系的位点特异性整合。已经对许多不同的植物物种描述质体转化法并且在Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basicresearch and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization ofplastid transformation technology)，Trends Biotechnol.21，20-28中给出综述。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中可以通过瞬时共整合的标记基因产生所述无标记质体转化体(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA活化标签技术(T-DNA activation tagging)
T-DNA活化标签技术(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及以如 此方式在目的基因的基因组区域内或基因的编码区上游或下游10kb处插入通常含有启动子(也可以是翻译改良子或内含子)的T-DNA，从而该启动子指导所靶向基因的表达。一般，目标基因的天然启动子对该基因表达的调节作用被破坏，并且该基因受新引入的启动子控制。该启动子一般嵌入T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感染，并且引起在所插入T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物表现显性表型，原因在于所引入启动子附近的基因受修饰的表达。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组中定向诱导的局部损伤法”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述核酸编码表达和/或活性改良的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以展示在强度或在位置或在时间方面改良的表达(例如，如果所述突变影响启动子)。这些突变变体可以展示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。TILLING联合了高密度诱变法与高通量筛选法。TILLING中一般所遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编辑，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和汇集个体DNA；(c)PCR扩增目的区域；(d)变性和复性以允许异双链体形成；(e)DHPLC，其中汇集物中异双链体的存在被检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)将突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145- 50)。
同源重组
同源重组允许在基因组中限定选择的位置处引入所选择的核酸。同源重组是在生物科学中例行用于低等生物如酵母或展叶剑叶藓属(Physcomitrella)苔藓的标准技术。已经对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)描述了用于植物中进行同源重组的方法，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间间隔有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接有助于对产量，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量(根和/或苗生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
早期生长势
“早期生长势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期期间，并且可以因提高的植物适应性所致，其中所述提高的植物适的原因是例如该植物更好地适应环境(即优化能量资源的用途和在苗与根之间的分配)。具有早期生长势的植物也显示提高的籽苗存活和更佳的作物建立，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往更好及更高的产量。因而，早期生长势可以通过测量多种因素如千粒重(Thousand Kernel Weight)、萌发百分数、出苗百分数、籽苗生长、籽苗高度、根长度、根和苗生物量和许多其他因素等确定。
提高/改盖/改良
术语“提高”、“改善”或“改良”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％、更优选25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
提高的种子产量自身可以表现为以下一个或多个指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子基础和/或每株植物和/或每平方米；b)提高的每株植物花数目；c)提高的(充实)种子数；d)提高的种子充实率(其表述为充实种子数与种子总数之间的比率)；e)提高的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)提高的千粒重(TKW)；和g)提高的第一圆锥花序数，这从计数的充实种子数及其总重量中外推出来。提高的TKW可以因增加的种子尺寸和/或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加引起。
种子产量的提高也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的提高自身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的提高。提高的种子产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
绿度指数
从植物的数字图像计算如本文中所用的“绿度指数”。对属于图像上植物目标的每个像素计算绿色值与红色值的比率(在编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，植物的绿度指数在开花前的最后成像中测量。相反，在干旱胁迫生长条件下，植物的绿度指数在干旱后的首次成像中测量。
植物
本文中所用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织、器官在内的植物部分，其中 每种前述对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族，尤其是单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油籽油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fylva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lcopersicon esculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、 鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、黑小麦属物种(Triticale sp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizania palustris、枣 属物种(Ziziphus spp.)及其他。
发明详述
令人惊讶地，现在已经发现调节植物中ASPAT多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中ASPAT多肽的编码核酸的表达和任选地选择具有改良的产量相关性状的植物。
又令人惊讶地，现在已经发现增加植物中如本文定义的MYB91多肽的编码核酸序列的表达产生相对于对照植物具有增加的产量相关性状的植物。根据又一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括增加植物中MYB91多肽的编码核酸序列的表达。
又令人惊讶地，现在已经发现调节植物中GASA多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状的植物。根据又一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中GASA多肽的编码核酸的表达。
又令人惊讶地，现在已经发现调节植物中AUX/IAA多肽的编码核酸的表达产生相对于对照植物具有改良的产量相关性状的植物。根据又一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中AUX/IAA多肽的编码核酸的表达且其中产量相关性状不包含增加的根生长。
关于ASPAT多肽，用于调节(优选增加)ASPAT多肽(ASPAT核酸)的编码核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达ASPAT多肽的编码核酸。优选ASPAT核酸和/或ASPAT多肽和/或ASPAT活性的增加的表达出现在一种或更多种亚细胞区室，该亚细胞区室以增加的优选顺序选择自植物细胞的胞质溶胶、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体和线粒 体。
例如可通过量表达编码胞质的同工型的ASPAT核酸来增加ASPAT核酸表达水平和/或ASPAT多肽和/或ASPAT活性的胞质水平。备选地，可通过去除特异的靶向基序的细胞器将天然在植物细胞的细胞器中表达的编码同工型的ASPAT核酸表达在胞质溶胶中。类似地可通过融合(fussing)编码此类细胞器的已知特异亚细胞靶向信号的特异酸氨基酸基序，将天然发现的胞质同工型表达在优选细胞器中。在优选植物细胞的细胞器中表达多肽的工具和技术是本领域已知的。
关于MYB91多肽，用于增加MYB91多肽的编码核酸序列在植物中的表达的优选方法是在植物中引入并表达MYB91多肽的编码核酸序列。
关于GASA多肽，用于调节(优选增加)GASA多肽的编码核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达GASA多肽的编码核酸。
关于AUX/IAA多肽，用于调节(优选增加)AUX/IAA多肽的编码核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达AUX/IAA多肽的编码核酸。
关于ASPAT多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的ASPAT多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及意指能够编码这种ASPAT多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“ASPAT核酸”或“ASPAT基因”。
关于MYB91多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的MYB91多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸序列”的谈及意指能够编码这种MYB91多肽的核酸序列。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸序列，下文也称作“MYB91核酸序列”或“MYB91基因”。
关于GASA多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的GASA多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的 核酸”的谈及意指能够编码这种GASA多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“GASA核酸”或“GASA基因”。
关于AUX/IAA多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质(或多肽)”的谈及意指如本文中定义的AUX/IAA多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及意指能够编码这种AUX/IAA多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“AUX/IAA核酸”或“AUX/IAA基因”。
如本文定义的“ASPAT多肽”指任意多肽，其包含转氨酶I和II类(Aminotran_1_2)结构域(Interpro登录号：IPR004839；pfam登录号：PF00155)、和任选地天冬氨酸转氨酶活性(EC.2.6.1.1)。
优选地，ASPAT多肽包含Aminotran_1_2结构域，其以增加的优选顺序与表D1、表D2和表D3中提供的任意Aminotran_1_2结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
优选地，ASPAT多肽包含基序，其与任意一个或多个个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(的序列同一性)：
(i)基序1(SEQ ID NO：207)：NPTG；
(ii)基序2(SEQ ID NO：208)：IVLLHACAHNPTGVDPT；
(iii)基序3(SEQ ID NO：209)：SRLLILCSPSNPTGSVY；
其中任意氨基酸可由保守氨基酸替换。
优选地，ASPAT多肽的同源物以增加的优选顺序与表A1的任意多肽的氨基酸，优选与表B1的系统发生的分类1(phylogenetic class 1)中的任意多肽、更优选与SEQ ID NO：2、甚至更优选与SEQ ID NO：8、最优选与SEQ ID NO：6具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的全局序列同一性(overall seqeunce identity)。此外ASPAT蛋白质的同源物优选包含如上文所述的Aminotran_1_2结构域。使用总体比对算法(global alignment algorithm)如程序GAP(GCGWisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并优选采用成熟蛋白质的序列(例如不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
备选地，在本发明方法中有用的ASPAT多肽具有氨基酸序列，其在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。
如本文定义的“MYB91多肽”指任意多肽，其包含(i)以增加的优选 顺序与如SEQID NO：269所示的InterPro登录号IPR014778的MYBDNA结合结构域至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)以增加的优选顺序与如SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号IPR014778的MYB DNA结合结构域至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)以增加的优选顺序与如SEQ ID NO：271所示的保守结构域至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，如本文定义的“MYB91多肽”指任意多肽序列，其与如SEQ ID NO：221所示的多肽以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，如本文定义的“MYB91多肽”指任意多肽序列，其与本文表A2给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，如本文定义的“MYB91多肽”指任意多肽序列，当其在构建MYB多肽的系统树(如图4中所绘制的一个系统树)中使用时，与多肽的MYB91组聚类，而不与任何其他组聚类。
如本文定义的“GASA多肽”指其天然形式中包含分泌信号、GASA结构域PF02704(Interpro IPR003854)和以下三个基序的多肽：
基序4(SEQ ID NO：277)、其包含4个保守Cys残基：
CXXCCXXCX
其中位置2的X可以是任意氨基酸，但优选N、K、M、G、L、I、Q中的一个；且其中位置3的X可以是任意氨基酸，但优选V、T、S、M、I、L、H、Y、K中的一个；且其中位置6的X可以是任意氨基酸， 但优选Q、A、N、D、L、V、R、H、S、G、K、E、T中的一个；且其中位置7的X可以是任意氨基酸，但优选R、T、A、D、K、E、Q、S、W、C中的一个；且其中位置9的X可以是任意氨基酸，但优选N、K、R、H、S、G、A、Q、L、D中的一个。
基序5(SEQ ID NO：278)：
CV(P/L)(P/K/Q/A/S/T)GXX(Q/G/A/S)
其中位置6的X可以是任意氨基酸，但优选T、P、S、Y、V、N、F、L中的一个；且其中位置7的X可以是任意氨基酸，但优选G、Y、F、S、A、L、V中的一个。
基序4和5彼此相邻或由一个氨基酸分开。
基序6(SEQ ID NO：279)：
CY(D/A/T/F/R/N)X(M/L/W/K)
其中位置4的X可以是任意氨基酸，但优选Q、R、S、D、E、N、T、H中的一个。
然而，如本发明中所用的术语GASA多肽不包含来自拟南芥(SEQ IDNO：295)的GASA4。
优选地，本发明方法中有用的GASA多肽包含一个或多个个以下基序：
基序7(SEQ ID NO：280)：
(S/L/Y/K/S/A)C(G/K/M/I/N/L)(L/M/I/V/T/S)CCXXC(N/G/A/K/R/H/S/D)
其中位置7的X可以是任意氨基酸，但优选E、H、G、K、A、Q、S、R、T、N、D、L、V中的一个；且其中位置8的X可以是任意氨基酸，但优选E、D、K、Q、S、R、A、T、C中的一个。
基序8(SEQ ID NO：281)：
CVP(T/S/P/A/K/Q)G(S/P/T)(G/Y/L/A/S/F)(S/A/G/Q)(T/S/P/N/D)(R/K/T/Y/L/Q/E)(D/S/H/R/E/N)X(C/I)
其中位置12的X可以是任意氨基酸，但优选E、H、T、A、S、L、V、K、M中的一个。
优选地，基序7之后紧跟基序8或由一个氨基酸与基序8分开。
基序9(SEQ ID NO：282)：
(P/R/K/T)CY(R/D/T/F/A)(D/Q/R/N/S/T/H/E)(M/K/W/L)(L/V/K/R/T/N/I)
优选地，基序8之后紧跟基序9或由一个氨基酸与基序9分开。
基序10(SEQ ID NO：283)：
(K/T)(R/P/V/A)C(L/N/M/I)(F/T)(Y/F/L)C(N/L/Q)(H/Y/K)CC(G/K/E/N/A/R)(W/R/K/T/S/A)C(Q/L/R)CV(P/L)(P/S/K/A)G(Y/T/V/N/F/L)(V/Y/F)G
基序11(SEQ ID NO：284)：
(N/H)K(G/D/E/Q/A)(C/E/T/S/F/A/V)(C/W)(S/P)CY(N/R)(N/D)(W/L/M)(K/T/E)(T/K/E/N)(Q/K)
基序12(SEQ ID NO：285)
(N/R)(G/C)(S/K)(H/Q/A/N/K/G)(K/T)(G/S/Q/A/K)(H/Y/F)(K/T/R/H)
备选地，GASA蛋白质的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：276所示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全局序列同一性，条件是同源物蛋白质包含如上文概述的保守基序。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package、Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并优选采用成熟蛋白质的序列(例如不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
优选地，多肽序列，当其在构建系统树(如图9中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含由SEQ ID NO：276(或SEQ ID NO：291或SEQ IDNO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。应注意来自拟南芥的GASA4(SEQ ID NO：275)不包括在如本发明定义的GASA蛋白质组中。
如本文中定义的“AUX/IAA多肽”指任意多肽，其包含AUX/IAA结构域(PFAM登录号PF02309，InterPro登录号IPR003311)。本文中定义的“AUX/IAA多肽”不包含SEQ ID NO：670：(K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L(IAA2基序)所示的基序。
本发明的AUX/IAA多肽具有与转录因子的AUX/IAA家族和其同源物相当的氨基酸结构和功能。
AUX/IAA结构域的结构和功能是本领域已知的。通常可在植物AUX/IAA转录因子中发现它们。植物起源的转录因子的AUX/IAA家族成员是本领域公知的。如在绿色植物界(viridiplantae)发现的AUX/IAA多肽的编译可在专用数据库中找到，如由Postdam(德国)大学维护并由Riano-Pacho等.BMC Bioinformatics 20078：47描述的所谓“植物转录数据库(PlnTFDB)”。
PlnTFDB数据库中，将AUX/IAA家族成员定义为具有AUX/IAA结构域的多肽(PFAM登录号：PF02309)且不含有Auxin_resp结构域(pfam登录号：PF06507)；Auxin_resp结构域通常在ARF多肽中发现且不出现在AUX/IAA多肽中。
在SEQ ID NO：432的氨基酸位置5-171间发现AUX/IAA结构域的实例。与SEQ IDNO：432中出现的结构域具有序列相似性的AUX/IAA结构域出现在表A4的多肽中。
在本发明的一个实施方案中，为实施本发明方法，提供了优选的AUX/IAA多肽，也指IAA14样多肽，其包含与由SEQ ID NO：738中的氨基酸1至220所示的AUX/IAA结构域的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、or 99％的序列同一性的AUX/IAA结构域(图13)。
优选地，IAA14样多肽包含至少一个、且以增加的优选顺序：2、3、4、5或所有6个以下基序：
基序13、，SEQ ID NO：739：
(K/R/E/D)(A/E/D)TEL(C/R)LG(L/I)(P/G)
基序14、，SEQ ID NO：740：
KRGF(S/A)ET
基序15、SEQ ID NO：741：
VGWPP(V/I)R
基序16、，SEQ ID NO：742：
GAPYLRK(V/I)DLXX(Y/F)
其中位置11的X可以是任意氨基酸，优选位置11的X可以是K、T、R、N、S，或Q中的一个，其中位置12的X可以是任意氨基酸，优选位置12的X可以是N、L、T、N、V、I，或C中的一个。
基序17，SEQ ID NO：743：
(S/N/G)(S/W/T)(E/D/G)(Y/F/H)(V/A/E)(P/L/V/I)(S/T/A)YEDKD(N/G)D(W/L)M(L/F)(V/I)GDVP
基序18，SEQ ID NO：744：
(S/T)C(K/R/Q)(R/K)(L/I)R(I/L)(M/I)K(G/S/E)(S/K/T)(E/D)(A/T)
优选基序15是：
VGWPPVR
基序16优选是：
GAPYLRK(V/I)DL(K/T/R/N)(M/L)Y
基序17优选是：
(S/N/G)(S/W/T)(E/D)YVP(S/T)YEDKDNDWM(L/F)VGDVP
基序18优选是：
(S/T)CK(R/K)(L/I)R(I/L)MK(G/S)(S/K/T)EA
优选地，本发明的AUX/IAA多肽以增加的优选顺序与AUX/IAA结构域的氨基酸，优选与表A4的任意多肽的AUX/IAA结构域，最优选与如位于氨基酸位置5至171间的氨基酸所示的SEQ ID NO：432的AUX/IAA结构域具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
优选地，IAA14样多肽序列，当其在构建系统树(如Remington等(PlantPhysiol.135，1738-1752，2004)中的图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含由SEQID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(见图15)。
备选地，AUX/IAA蛋白质的同源物以增加的优选顺序与由表4或表5的任意多肽的氨基酸，优选由SEQ ID NO：432或SEQ ID NO：738所示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全局序列同一性，条件是同源物蛋白质包含一个或多个个如上文概述的保守基序。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package、Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并优选采用成熟蛋白质的序列(例如不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
在优选实施方案中，多肽序列，当其在构建系统树(如Remington等(PlantPhysiol.135，1738-1752，2004)中的图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含由SEQID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(见图15)。
术语“结构域”和“基序”在本文的“定义”部分中定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等，(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编辑，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic AcidsResearch 30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服务器(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))上获得。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
关于MYB91多肽，本文表A2的多肽比对在图5中显示。此比对对鉴定如本文定义的MYB91多肽间的最保守结构域或基序有用。此结构域的实例是(i)如由SEQ ID NO：269和/或由SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域(在图5中由X’s标记)；(ii)InterPro登录号为IPR015495的MYB DNA转录椅子(在图2中也由X’s标记)。另一此类结构域是如SEQ ID NO：271所示的C端保守结构域，也在图5中由X’s标记。
用于比对序列以做比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等，(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并开展两个序列之间相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW序列多重比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中可用的方法之一确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(anapplication that generates similarity/identity matrices using protein or DNAsequences))。如本领域技术人员会显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定完整核酸或氨基酸序列范围或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，WatermanMS(1981)J. Mol.Biol 147(1)；195-7)。
关于MYB91多肽，本文实施例3的表B中描述了如SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽和表A2中所列的MYB91多肽之间的百分比同一性，其可以是低至52％的氨基酸序列同一性。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如使用BLAST，可以提高用于报告与数据库序列匹配的统计显著性阈值(称为“期望”值)以显示严格性更低的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
关于GASA多肽，例如可以由成熟的也就是没有分泌信号肽的蛋白质序列执行比对。用于鉴定信号肽的方法在本领域是公知的，例如见Bendtsen等，J.Mol.Biol.，340：783-795(2004)。
蛋白质亚细胞定位预测的任务是重要的并且得到充分研究。知晓蛋白质的定位有助于阐明其功能。用于蛋白质定位的实验方法的范围从免疫定位至使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸酶(GUS)对蛋白质加标签。虽然此类方法与计算性方法相比繁琐费累，然而它准确。最近在从序列数据计算性预测蛋白质定位方面取得长足进展。在瑞士生物信息研究所维护的ExPASy蛋白质组工具上可获得本领域技术人员熟知算法当中的例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP等。通过应用PSort算法到如SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽，获得预测到的核亚细部定位。
此外，ASPAT多肽通常具有天冬氨酸转氨酶，也称为天冬氨酸转移酶活性。测量天冬氨酸转氨酶活性的工具和技术在本领域是公知的。例如可按De la Torre等2006描述的由有活性缺陷的大肠杆菌菌株的互补作用，体外测定天冬氨酸转氨酶活性。备选地，可按照例如De la Torre等2006描述的执行天冬氨酸转移酶活性的生化测定。
此外，ASPAT多肽，当其按照实施例部分概述的本发明方法在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
GASA多肽，当其按照实施例部分概述的本发明方法在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的种子总重量和/或增加的饱满种子数、和/或增加的收获指数的植物。
此外，表达GASA多肽的转基因植物(至少以其天然形式)可具有改良的热胁迫耐受性(Ko等，2007)。用于测量植物对热胁迫的耐受性的工具和技术在本领域是公知的，例如参见Ko等2007中描述的方法。
此外，AUX/IAA多肽(至少以其天然形式)通常具有蛋白质结合活性：AUX/IAA多肽结合ARF(生长素应答因子)多肽。用于测量白质结合活性的工具和技术在本领域是公知的，包括例如蛋白质复合物免疫沉淀和酵母双杂交。用于测量AUX/IAA与ARF多肽结合的工具和技术在本领域是公知的，且包括例如酵母双杂交(见例如Fukaki等(Plant J.44，382-395，2005))。
通常本发明的AUX/IAA多肽包含EAR结构域(Ohata等；Plant Cell.200113(8)：1959-68)，其是公知的蛋白质结构域，该结构域通常将抑制活性赋予包含此类结构域的转录因子。本发明的AUX/IAA多肽优选具有转录抑制活性。
关于IAA14样多肽，它们(至少以其天然形式)通常与ARF7和ARF19蛋白质组合。用于测量白质此组合的工具和技术在本领域是公知的，且包括例如酵母双杂交分析(见例如Fukaki等(Plant J.44，382-395，2005))。更详细的描述由实施例部分提供。
此外，AUX/IAA多肽，当其按照实施例部分概述的本发明方法在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状的植物，该产量相关性状选自增加的收获指数、增加的根生物量、增加的绿色生物量和增加的种子产量。
此外，AUX/IAA多肽，当其按照实施例部分概述的本发明方法在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状如增加的种子饱满率和增加的收获指数的植物。
此外，IAA14样多肽，当其按照实施例部分概述的本发明方法在稻中表达时，产生具有增加的产量相关性状，尤其是增加的种子产量的植物。
另外，AUX/IAA多肽可显示出优选的亚细部定位，通常在细胞核、细胞质、叶绿体或线粒体中的一个或多个。蛋白质亚细胞定位预测的任务是重要的并且得到充分研究。知晓蛋白质的定位有助于阐明其功能。用于蛋白质定位的实验方法的范围从免疫定位至使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸酶(GUS)对蛋白质加标签。虽然此类方法与计算性方法相比繁琐费累，然而它准确。最近在从序列数据计算性预测蛋白质定位方面取得长足进展。在瑞士生物信息研究所维护的ExPASy蛋白质组工具上可获得本领域技术人员熟知算法当中的例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等。
关于ASPAT多肽，本发明通过用SEQ ID NO：1所示的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意ASPAT的编码核酸或ASPAT多肽实施。
编码ASPAT多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A1中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所示的ASPAT多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选 地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，第二BLAST因而将针对稻序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于MYB91多肽，本发明通过用SEQ ID NO：220所示的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：221的MYB91多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意编码MYB91多肽的核酸序列或MYB91多肽实施。
编码MYB91多肽的核酸序列的实例在本文实施例1的表A2中给出。此类核酸序列在实施本发明的方法中有用。在实施例1的表A2中给出的多肽序列是由SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：221，第二BLAST 因而将针对毛果杨(Populus trichocarpa)序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于GASA多肽，本发明通过用SEQ ID NO：275所示的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：276的多肽序列；且用编码SEQ ID NO：291的SEQ ID NO：361转化植物进行说明。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意GASA编码核酸或GASA多肽实施。在优选的实施方案中，编码GASA多肽的核酸，当其在植物中表达时，是异源核酸，该与内源GASA充分不同的异源核酸避免基因沉默。
编码GASA多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A3中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：276所示的GASA多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A3中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：275或SEQ ID NO：276，第二BLAST因而将针对番茄(Solanum lycopersicum)序列进行；查询序列是SEQ ID NO：361或SEQ ID NO：291，第二BLAST因而将针对白杨序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于AUX/IAA多肽，本发明通过用SEQ ID NO：431或SEQ IDNO：737所示的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ IDNO：432或SEQ ID NO：738的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的任意AUX/IAA的编码核酸或IAA14样多肽实施。
编码AUX/IAA多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A4和表A5中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例部分的表A4和表A5中给出的氨基酸序列是由SEQID NO：432或SEQ ID NO：738所示的AUX/IAA多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例部分的表A4和表A5中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：431或SEQ ID NO：432，第二BLAST因而将针对 拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评价。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间的特定长度范围内相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A1至A5中所给出任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。还在本发明方法中有用的是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A1至A5中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。还包括核酸变体，其中密码子使用被最优化或其中miRNA目标位点被去除。
在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸的部分、与编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸杂交的核酸、编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸的剪接变体、编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸的等位变体，和通过基因改组获得的编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组作用如本文中所述。
编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸不必须是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了用于改良植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A1至A5中给出的任一核酸序列的部分或编码实施例部分的表A1至A5中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。
核酸的部分可以例如通过对该核酸产生一个或多个缺失而制备。该部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生联合有几种活性的蛋白质。当融合至其他编码序列时，翻译后产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
关于ASPAT多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的ASPAT多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A1中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例部分的表A1中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A1中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分的长度是至少100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例部分的表A1中给出的任一核酸序列或具有编码在实施例部分的表A1中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。甚至更优选该部分是SEQ ID NO：1的核酸的部分，最优选该部分是SEQ ID NO：3的核酸。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，当该氨基酸序列在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。最优选部分编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸片段。
关于MYB91多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的 MYB91多肽，并且基本上具有如实施例1的表A2中所给出多肽序列相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A2中给出的任一核酸序列的部分，或是编码在实施例1的表A2中所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。优选地，该部分的长度是以增加的优选顺序至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050或更多个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例1的表A2中给出的任一核酸序列或具有编码在实施例1的表A2中所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列。优选地，该部分是编码多肽序列的核酸序列的部分，该多肽序列包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ IDNO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ ID NO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选地，该部分是编码多肽序列的核酸序列的部分，该多肽序列与SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽或与本文表A2给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选地，该部分是SEQ ID NO：220的核酸序列的部分。
关于GASA多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的GASA多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A3中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例部分的表A3中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A3中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分的长度是至 少200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多个连续核苷酸，该连续核苷酸是实施例部分的表A3中给出的任一核酸序列或是编码在实施例部分的表A3中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选该部分是SEQ ID NO：275的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，当该氨基酸序列在构建系统树(如图9中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQID NO：276(或SEQ ID NO：291或SEQID NO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于AUX/IAA多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的AUX/IAA多肽，并且基本上具有如实施例部分的表A4或表A5中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例部分的表A4或表A5中给出的任一核酸的部分，或是编码在实施例部分的表A4或表A5中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分的长度是至少100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多个连续核苷酸，该连续核苷酸是实施例部分的表A4或表A5中给出的任一核酸序列，或是编码在实施例部分的表A4或表A5中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选该部分是SEQ ID NO：431或SEQ ID NO：737的核酸的部分。优选地，该部分编码包含AUX/IAA结构域(PFAM登录号PF2309，InterPro登录号IPR003311)的氨基酸序列的片段。
如果是IAA14样多肽，优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，当该氨基酸序列在构建系统树(如Remington等(Plant Physiol.135，1738-1752，2004)中图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(又见图13)。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下， 优选在严格条件下与编码如本文中定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
根据本发明，提供了用于改良植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例部分的表A1至表5中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例部分的表A1至表5中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
关于ASPAT多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的ASPAT多肽，其基本上具有如实施例部分的表A1中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A1中给出的任一核酸的互补序列或与这些序列中任意序列的部分杂交，所述的部分如上文定义，或所述杂交序列能够与编码在实施例部分的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。甚至更优选地，该杂交序列能够与SEQ ID NO：1所示的核酸的互补序列或与其部分杂交。最优选地，该杂交序列是如SEQ ID NO：3所示的。
优选地，该杂交序列部分编码具有氨基酸序列的多肽，当该氨基酸序列是全长的并且在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。
关于MYB91多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的MYB91多肽，并且基本上具有如实施例1的表A2中所给出多肽序列相同的生物学活性。优选地，此杂交序列能够与在实施例1的表A2中给出的任一核酸序列或其互补序列杂交，或与任意这些序列的部分(如上文定义的部分)杂交，或其中该杂交序列能够与编码在实施例1的表A2中所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的核酸序列或其互补序 列杂交。优选地，该杂交序列能够与编码多肽序列的核酸序列杂交，该多肽序列包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ ID NO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选地，该杂交序列能够与编码多肽序列的核酸序列杂交，该多肽序列与SEQIDNO：221所示的MYB91多肽或与本文表A2给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选地，该杂交序列能够与SEQ ID NO：220所示的核酸序列或其部分杂交。
关于GASA多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GASA多肽，并且具有如实施例部分的表A3中所给出氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选地，此杂交序列能够与在实施例部分的表A3中给出的任一核酸的互补序列杂交，或与任意这些序列的部分(如上文定义的部分)杂交，或该杂交序列能够与编码在实施例部分的表A3中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选地，该杂交序列能够与SEQ ID NO：275所示的核酸的互补序列或其部分杂交。
优选地，该杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，当该氨基酸序列在构建系统树(如图9中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ IDNO：276(或SEQ ID NO：291或SEQID NO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于AUX/IAA多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的AUX/IAA多肽，并且具有如实施例部分的表A4或表A5中所给出氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选地，此杂交序列能够与在实施例部分的表A4或表A5中给出的任一核酸的互补序列杂交，或与任意这些序列的部分(如上文定义的部分)杂交，或该杂交序列能够与编码在实施例部分的表A4或表A5中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选，该杂交序列能够与SEQ ID NO：431或SEQ ID NO：737所示的核酸的互补序列或其部分杂交。
优选地，该杂交序列或其互补序列编码包含AUX/IAA结构域(PFAM登录号PF2309，InterPro登录号IPR003311)的氨基酸序列的多肽。
如果是IAA14样多肽，优选地，该杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，当该氨基酸序列是全长的并且在构建系统树(如Remington等(Plant Physiol.135，1738-1752，2004)中图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类(又见图15)。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
根据本发明，提供了用于改良植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A1至表5中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码实施例部分的表A1至表5中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
关于ASPAT多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1所示的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由该剪接变体编码的氨基酸序列在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。
关于MYB91多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：220所示的氨基酸序列的剪接变体或编码SEQ ID NO：221的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接变体。优选地，该剪接变体是编码多肽序列的核酸序列的剪接变体，该多肽序列包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ ID NO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选地，该剪接变体是编码多肽序列的核酸序列的剪接变体，该多肽序列与SEQ IDNO：221所示的MYB91多肽或与本文表A2给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选地，该剪接变体是SEQ ID NO：220的核酸序列，或编码SEQ ID NO：221所示的多肽序列的核酸序列的剪接变体。
关于GASA多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：275代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：276的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，该剪接变体编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如图93中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：276(或SEQ ID NO：291或SEQ ID NO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于AUX/IAA多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：431或SEQ IDNO：737所示的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：432或SEQ IDNO：738的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。
优选地，该剪接变体编码的氨基酸序列包含AUX/IAA结构域(PFAM登录号PF2309，InterPro登录号IPR003311)。
如果是IAA14样多肽，优选地，该剪接变体编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如Remington等(Plant Physiol.135，1738-1752，2004)中图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(又见图15)。
在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽或AUX/IAA多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
根据本发明，提供了用于改良植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例部分的表A1至表5中给出的任一核酸的等位变体或包括在植物中引入并表达编码实施例部分的表A1至表5中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
关于ASPAT多肽，在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO：2的ASPAT多肽和实施例部分的表A1中所述的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：1的等位变体或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由该等位变体编码的氨基酸序列在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。
关于MYB91多肽，在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO：221的MYB91多肽和实施例1的表A2中所述的任意多肽序列基本相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，该等位变体是多肽序列的等位变体，该多肽序列包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登 录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ ID NO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选地，该等位变体是编码多肽序列的等位变体，该多肽序列与SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽或与本文表A2给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选地，该等位变体是SEQ ID NO：220的等位变体或编码SEQ IDNO：221的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。
关于GASA多肽，在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO：226的GASA多肽和实施例部分的表A3中所述的任意氨基酸序列基本相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，该等位变体是SEQID NO：275的等位变体或编码SEQ ID NO：276的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，该等位变体编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如图9中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：276(或SEQ ID NO：291或SEQ ID NO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于AUX/IAA多肽，在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽具有与SEQ IDNO：432或SEQ ID NO：738的AUX/IAA多肽和实施例部分的表A4或表A5中所述的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。 优选地，该等位变体是SEQ ID NO：431或SEQ ID NO：737的等位变体，或编码SEQ ID NO：432或SEQ ID NO：738的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，该等位变体编码的氨基酸序列包含AUX/IAA结构域(PFAM登录号PF2309，InterPro登录号IPR003311)。如果是IAA14样，优选地，该等位变体编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如Remington等(Plant Physiol.135，1738-1752，2004)中图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(又见图15)。
基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
根据本发明，提供了用于改良植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达在实施例部分的表A1至表A5中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中引入并表达核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A1至表A5中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
关于ASPAT多肽，优选地，由通过基因改组所获得的变体核酸编码氨基酸序列，当在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，以增加的优选顺序与表B1中提供的系统发生的分类1、分类2、分类3和分类4中的任意多肽聚类。
关于MYB91多肽，优选地，由通过基因改组所获得的变体核酸序列编码多肽序列，该多肽序列包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺 序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ ID NO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。更优选地，通过基因改组所获得的该变体核酸序列编码多肽序列，该多肽序列与SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽或与本文表A1给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。最优选地，通过基因改组所获得的该核酸序列编码SEQ IDNO：221所示的多肽序列。
关于GASA多肽，优选地，由通过基因改组所获得的变体核酸编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如图9中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：276(或SEQ ID NO：291或SEQ IDNO：292)所示的氨基酸序列的GASA多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
如果是IAA14样，优选地，由通过基因改组所获得的变体核酸编码氨基酸序列，当该氨基酸序列在构建系统树(如Remington等(Plant Physiol.135，1738-1752，2004)中图1中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：738所示的氨基酸序列的IAA14样多肽组A聚类，而不与任何其他组聚类(又见图15)。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。
编码ASPAT多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码ASPAT多肽的核酸来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来禾本科(Poaceae)，最优选该核酸来自稻。
有利地，本发明还提供目前未知的ASPAT编码核酸和ASPAT多肽。
因此根据本发明的另一实施方案，提供了分离的核酸分子，其选自：
(i)任一SEQ ID NO：81、147、153、183和185所示的核酸；
(ii)由任一SEQ ID NO：81、147、153、183和185所示的核酸的互补序列；
(iii)编码由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的多肽的核酸，优选由遗传密码的简并性造成的，所述分离的核酸分子可衍生自由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的多肽序列且更优选相对于对照植物赋予改良的产量相关性状；
(iv)核酸，其与表A1的任意核酸序列以增加的优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性且更优选相对于对照植物赋予改良的产量相关性状；
(v)在严格杂交条件下与上述(i)至(iv)中的核酸分子杂交的核酸分子且优选相对于对照植物赋予改良的产量相关性状；
(vi)编码ASPAT多肽的核酸，其与由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列和表A1的任意其他氨基酸序列以增加的优选顺序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％的序列同一性且优选相对于对照植物赋予改良的产量相关性状。根据本发明的另一实施方案，还提供了分离的多肽，其选自：
(i)由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其与由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列和表A1的任意其他氨基酸序列以增加的优选顺序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性且优选相对于对照植物赋予改良的产量相关性状。
(iii)上文(i)或(ii)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
编码MYB91多肽的核酸序列可以衍生自任何天然或人工来源。该核酸序列可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。编码MYB91多肽的核酸序列来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自杨柳科(Salicaceae)，最优选该核酸序列来自毛果杨。
编码GASA多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码GASA多肽的核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自杨柳科，最优选该核酸来自番茄。备选地，GASA多肽的编码核酸来自杨柳科，优选来自杨属物种。
编码AUX/IAA多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码IAA14样多肽的核酸来自植物，还优选来自单子叶或双子叶植物，更优选来自禾本科或十字花科，最优选该核酸来自稻或来自拟南芥。
本发明方法的实施产生了具有改良的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生这样的植物，其相对于对照植物具有提高的产量，尤其是提高的种子产量。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本文中对改良的产量相关性状的谈及意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有提高的种子产量的植物。关于GASA多肽，应说明具有根据本发明方法编码GASA多肽的核酸的受调节表达的植物相对于对照植物在分枝属性上未显示显著改变。
以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物花序数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、花序长度/直径的提高、种子充实率(即充实种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。以稻为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每平方米植物数、每株植物的花序数、每个花序的小穗数、每个花序的花(小花)数目(其表述为充实种子数对原发花序数的比)、种子充实率(即充实种子数除以种子总数并乘以100)提高、千粒重提高及其他。
本发明提供了用于相对于对照植物而言提高植物的产量，尤其是种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的ASPAT多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的的核酸表达。
本发明还提供了用于相对于对照植物提高植物的产量相关性状的方 法，所述方法包括提高植物中编码如本文中定义的MYB91多肽的核酸序列表达。
由于本发明的转基因植物具有提高的产量和/或改良的产量相关性状，故这些植物有可能在其生活周期的相应阶段(在其生活周期的至少部分期间)相对于对照植物的生长速率表现出提高的生长速率。
提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整株植物。具有提高的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从干燥成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸因素如早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶段上或基本上在植物整个生活周期期间发生。在植物生活周期中早期期间提高的生长速率可以反映提高的(早期)生长势。生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物更晚地播种和/或更早地收获，而这本来是不可能的(可以随更早的开花时间获得相似效果；通常植物中延迟的开花不是期望的性状)。如果大幅提高生长速率，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，如果大幅提高生长速率，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许将转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线衍生多个参数而确定，此类参数可以 是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
根据本发明的一个优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有提高的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中调节编码如本文中定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的核酸表达。
与在相当条件下培育的对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，提高的产量产量相关性状均出现。植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％，优选小于25％、20％或15％、更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、和/或杀虫剂处理)的进步，栽培作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
与相当条件下培育的对照植物相比，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物改良的产量相关性状。因此，根 据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下培育的植物中改良产量相关性状的方法，所述方法包括增加植物中编码MYB91多肽的核酸序列表达。
特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。如Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物性胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知相互联系并可以通过相似的机制诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件下的植物(在非胁迫条件下培育)通常产量以增加的优选顺序为此类植物在给定环境下的平均产量的97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％。本领域技术人员清楚作物的平均产量。
相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码ASPAT多肽，或MYB91多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的核酸表达。
如本文中定义的术语“非生物性胁迫”意指以下任意一项或多项：水胁迫(因干旱或过量的水所致)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(因热、寒冷或 冰冻温度所致)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，所述非生物性胁迫是渗透胁迫，其选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，不过可以是由以下一种或多种盐：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等引起的任意胁迫。
相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在盐胁迫条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于提高盐胁迫条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码ASPAT多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的核酸的表达。术语盐胁迫不限于普通盐(NaCl)，不过可以是由以下一种或更多种盐：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等引起的任意胁迫。
非生物性环境胁迫的另一个例子是需要被所述植物同化用于生长和发育的一种或多种养分的可利用性降低。因为养分利用效率强烈影响植物产量和产品品质，故向田地倾注大量肥料以优化植物生长和产品品质。植物的生产量通常受3种主要养分磷、钾和氮限制，这3种养分中，氮通常是是植物生长的限速性元素。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。氮是活细胞中存在的许多重要化合物的组成成分，所述的重要化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素。1.5％至2％的植物干物质是氮，且大约16％的植物总蛋白是氮。因此，氮可利用性是作物植物生长和生产的主要限制性因素(Frink等，(1999)ProcNatl Acad Sci USA96(4)：1175-1180)，并且也对蛋白质积累和氨基酸组成产生重大影响。因此，在氮限制性条件下培育时具有改良的产量相关性状的植物是意义重大的。
相对于相当条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在养分缺乏条件下，尤其是在缺氮条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在养分缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括调节植物中编码ASPAT多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽 的核酸表达。养分缺乏可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼及其他元素缺少所致。
本发明方法的实施产生在养分可利用性降低，尤其是氮可利用性降低的条件下培育的植物，该植物相对于可比条件下培育的对照植物具有改良的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于提高在养分可利用性降低，尤其是氮可利用性降低的条件下培育的植物中产量相关性状的方法，该方法包括增加植物中编码MYB91多肽的核酸序列的表达。降低的养分可利用性可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等匮乏或过多所致。优选地，降低的养分可利用性是降低的氮可利用性。
本发明方法的实施赋予在非生物胁迫条件下植物相对于在可比条件下培养的对照植物而言具有改良的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了在非生物胁迫条件下培养的植物中改良产量相关性状的方法，该方法包括在植物中提高编码MYB91多肽的核酸序列的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一种或更多种：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
本发明包括通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)或其细胞。该植物或其部分包含编码如上文定义的与在植物中起作用的启动子有效连接的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸转基因。
本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码如本文定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
(a)编码如上文定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多 肽，或AUX/IAA多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸如上文定义。术语“调控序列”和“终止序列”如本文中定义。
关于MYB91多肽，优选地，构建体的调控序列之一是分离自植物基因组的组成型启动子。组成型启动子的例子是GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子，最优选如SEQ ID NO：272所示的GOS2序列。
植物用包含上述任意核酸的载体转化。技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。此目的序列有效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动所述核酸序列的表达，但优选该启动子具有植物起源。组成型启动子是在本方法中特别有用的。优选地，该组成型启动子也是中等强度遍在启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。关于ASPAT多肽，也在本发明方法中有用的是绿色组织特异性启动子。
关于MYB91多肽，有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来提高该核酸序列的表达。组成型启动子在本方法中特别有用，优选是分离自植物基因组的组成型启动子。植物组成型启动子以在一切情况下低于受35S CaMV启动子控制时所获得水平的水平驱动编码序列的表达。该组成型启动子的实例是如SEQ ID NO：272所示的GOS2启动子。
关于MYB91多肽，器官特异性启动子，例如用于优选在叶、茎、块茎、分生组织、种子中表达的启动子，在实施本发明方法中有用。发育调节型启动子和诱导型启动子也在实施本发明方法中有用。见本文“定义”部分对各种启动子类型的定义。
关于ASPAT多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：1代表的编码ASPAT多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码ASPAT多肽的核酸在受组成型启动子驱动时，或受绿色组织特异性启动子驱动时的表达。
组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选选自植物来源的启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是基本与SEQ ID NO：218相似的核酸序列所代表，最优选组成型启动子是如SEQ ID NO：218所示的。对组成型启动子其他例子见本文“定义”部分。
根据本发明的又一优选特征，编码ASPAT多肽的核酸与绿色组织特异性启动子有效连接。绿色组织特异性启动子优选是原叶绿素酸酯还原酶(PR)基因的启动子，更优选PR启动子来自稻，还优选PR启动子是由基本与SEQ ID NO：219相似的氨基酸序列所示的，最优选该启动子是如SEQ ID NO：219所示的。也可以用于实施本发明方法的其他绿色组织特异性启动子的例子在上文“定义”部分的表3中显示。
关于MYB91多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：220代表的编码MYB91多肽的核酸序列，本发明的应用也不限于编码MYB91多肽的核酸序列在受组成型启动子驱动时的表达。
关于GASA多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：275或SEQ ID NO：361代表的编码GASA多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码GASA多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选选自植物来源的启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是基本与SEQ ID NO：290相似的核酸序列所示的，最优选组成型启动子是如SEQ ID NO：290所示的。对组成型启动子其他例子见本文“定义”部分。
任选地，可以在被引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。 优选地，该构建体包含表达盒，该表达盒包含GOS2启动子和编码GASA多肽的核酸。
关于AUX/IAA多肽，应当明白本发明的应用不限于由SEQ ID NO：431或SEQ ID NO：737代表的编码AUX/IAA多肽的核酸，本发明的应用也不限于编码AUX/IAA多肽的核酸在受组成型启动子驱动时的表达。
组成型启动子优选是中等强度启动子，更优选选自植物来源的启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子。还优选组成型启动子是基本与SEQ ID NO：669相似的核酸序列所代表，最优选组成型启动子是如SEQ ID NO：669所示的。对组成型启动子其他例子见本文“定义”部分。
备选地，该组成型启动子优选是弱启动子，更优选选自植物来源的启动子，如高速泳动族蛋白(HMGP)启动子，更优选是来自稻的HMGP启动子。还优选组成型启动子是基本与SEQ ID NO：747相似的核酸序列所代表，最优选组成型启动子是如SEQ ID NO：747所示的。对组成型启动子其他例子见本文“定义”部分。
任选地，可以在被引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含表达盒，该表达盒包含基本分别与SEQ ID NO：669或与SEQ ID NO：747相似的GOS2或HMGP启动子和编码AUX/IAA多肽的核酸。
额外的调节元件可以包括转录改良子以及翻译改良子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和改良子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高细胞质中积累的成熟信使的量。(除启动子、改良子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质/或RNA稳定化元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易地获得。
本发明的基因构建体可以还包括对于特定细胞类型中维持和/或复制 所需要的复制起点序列。一个例子是当需要将基因构建体在细菌细胞中作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含选择标记基因。选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
已知当核酸序列稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将外来DNA整合至细胞基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记的基因(如上文所述的基因)连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸序列分子可以在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上引入宿主细胞。已经用所引入核酸序列稳定转染的细胞可以例如通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中引入并表达编码如上文所定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的任意核酸。
更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，该转基因植物具有改良的产量相关性状，尤其是提高的种子产量，该方法包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入并表达编码ASPAT多肽，或 MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文定义的ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的任意核酸。
该核酸可以直接地引入植物细胞或引入植物自身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸优选通过转化作用引入植物。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
该核酸可以直接地引入植物细胞或引入植物自身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸优选通过转化作用引入植物。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或 和Willmitzer的出版物中找到。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整植物。为了选择转化的植物，转化中获得的植物材料一般经历选择条件，从而转化植物可以与非转化植物区分开。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，并且在初始培育时间后，通过喷洒经受合适的选择。另一种可能性在于种子根据需要消毒后，在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，筛选所述转化植物的选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析就目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第 二世代(或T2)转化体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化接穗嫁接的转化根状茎)。
本发明明确地扩展至由本文中所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与如本发明方法中的亲本相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括含有编码如本文以上所定义ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言，宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界超家族，尤其是单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜籽、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。更优选地，该植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗。更优选地，该植物是禾谷植物。禾谷植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、黑麦、小黑麦属、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，其可收获部分包含编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的重组核酸。本 发明进一步涉及衍生自，优选直接衍生自此种植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。在本领域中充分报道了用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了例子。
如上文提及，用于调节编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸；然而，实施本方法的效果，即改良产量相关性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签技术、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。在定义部分中提供了对这些技术的描述。
本发明也包括编码如本文中所述ASPAT多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的核酸的用途，和这些ASPAT多肽、GASA多肽、AUX/IAA多肽的用途，用于改良植物中任意的前述产量相关性状。
本发明也包括编码如本文中所述MYB91多肽的核酸的用途，和这些MYB91多肽的用途，用于在正常生长条件、在非生物胁迫生长(有宣渗透胁迫生长条件)条件、和降低的养分可利用性的生长条件下，优选在降低的氮可利用性的条件下提高植物中任意的前述产量相关性状。
编码本文中所述ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸或ASPAT多肽、MYB91多肽、GASA多肽、AUX/IAA自身可以用于其中鉴定到DNA标记的育种程序中，其中该DNA标记可以遗传地与编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的基因连锁。该核酸/基因或ASPAT多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有改良的如上文所定义产量相关性状的植物。
编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA 多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而引入等位变异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“天然”来源的等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致提高的产量和/或产量相关性状的序列的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。
编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以开发具有所希望表型的品系。编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。该编码核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)MolecularCloning，ALaboratory Manual)可以用编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的编码核酸探测。所得的结合模式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)开展遗传分析以构建遗传图谱。此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有所定义遗传杂交的亲本和子代。标明了DNA多态性的分离并用来计算编码ASPAT多肽，或MYB91多肽，或GASA多肽，或AUX/IAA多肽的核酸在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中 描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。
该核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，该核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)GenomeRes.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)NucleicAcid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，这对作图法而言通常不是必需的。
关于ASPAT多肽，关于GASA多肽或AUX/IAA多肽，如前文所述，本发明方法产生了具有改良的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量改良性状、针对其他非 生物性胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
关于MYB91多肽，如前文所述，本发明方法产生了具有改良的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量提高性状、针对非生物性胁迫和生物胁迫的耐受性、对除草剂、杀虫剂的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
项
1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
1.相对于对照植物改良植物产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码ASPAT(天冬氨酸转氨酶)多肽的核酸的表达，该ASPAT多肽包含转氨酶类I和II(Aminotran_1_2)结构域(Interpro登录号：IPR004839；pfam登录号：PF00155)，和任选选择具有改良的产量相关性状的植物。
2.根据项1的方法，其中所述ASPAT多肽包含一个或多个以下基序，所述基序与任意一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(的同一性)：
(i)基序1：NPTG(SEQ ID NO：207)，
(ii)基序2：IVLLHACAHNPTGVDPT(SEQ ID NO：208)，
(iii)基序3：SRLLILC SPSNPTGSVY(SEQ ID NO：209)，
其中任意氨基酸残基可由保守氨基酸取代。
3.根据项1或2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入和表达编码ASPAT多肽的核酸实施。
4.根据项1至3中任一项的方法，其中所述编码ASPAT多肽的核酸编码表A中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
5.根据项1至4中任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据任一前述项的方法，其中所述改良的产量相关性状包括相对于对照植物而言提高的产量，优选提高的生物量和/或提高的种子产量。
7.根据项1至6中任一项的方法，其中所述改良的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
8.根据项1至6中任一项的方法，其中所述改良的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。
9.根据项3至8中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子，优选有效连接至GOS2启动子，最优选有效连接至来自稻的GOS2启动子。
10.根据项3至8中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至绿色组织特异性启动子，优选有效连接至PR启动子，最优选有效连接至来自稻的PR启动子。
11.根据项1至10中任一项的方法，其中所述编码ASPAT多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自禾本科(Poaceae)，更优选来自稻属(Oryza)，最优选来自稻。
12.根据项1至11中任一项的方法获得的植物或其包括种子的部分，其中所述的植物或其部分包含编码ASPAT多肽的重组核酸。
13.构建体，其包含：
(i)编码如项1或2中定义的ASPAT多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
14.根据项13的构建体，其中所述调控序列中的一个是组成型启动 子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
15.根据项13的构建体，其中所述调控序列中的一个是绿色组织特异性启动子，优选是PR启动子，最优选是来自稻的PR启动子。
16.根据项13至15的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，尤其是具有提高的生物量和/或提高的种子产量。
17.用根据项13至15的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
18.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的产量，尤其是提高的生物量和/或提高的种子产量，该方法包括：
(i)在植物中引入并表达编码如项1或2中定义的ASPAT多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
19.转基因植物，其相对于对照植物具有由编码如项1或2中所定义ASPAT多肽的核酸的受调节表达引起的提高产量，尤其是提高的生物量和/或提高的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
20.根据项11、17或18的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
21.根据项20的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗(shoot)生物量和/或种子。
22.产物，从根据项20的植物和/或从根据项21的植物的可收获部分衍生。
23.编码ASPAT多肽的核酸在相对于对照植物提高植物产量，尤其是提高植物种子产量和/或苗生物量中的用途。
24.分离核酸分子，其选自：
(a)由任一SEQ ID NO：81、147、153、183和185所示的核酸；
(b)由任一SEQ ID NO：81、147、153、183和185所示的核酸的互补序列；
(c)编码任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的多肽的核酸，其优选为遗传密码简并性的结果，所述分离的核酸衍生自任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的多肽序列并进一步优选赋予相对于对照植物改良的产量相关性状；
(d)核酸，其与表A1的任意核酸序列以增加的优选顺序具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并进一步优选赋予相对于对照植物改良的产量相关性状；
(e)核酸分子，其与(i)至(iv)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且优选赋予相对于对照植物改良的产量相关性状；
(f)编码ASPAT多肽的核酸，其与任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列和表A1中的任意其他氨基酸序列以增加的优选顺序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％的序列同一性，且优选赋予相对于对照植物改良的产量相关性状。
25.分离的多肽，其选自：
(i)由任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其与任一SEQ ID NO：82、148、154、184和186所示的氨基酸序列和表A中的任意其他氨基酸序列以增加的优选顺序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，且优选赋予相对于对照植物改良的产量相关性状。
(iii)上述(i)或(ii)给出的任意氨基酸序列的衍生物。
2.MYB91样转录因子(MYB91)
1.用于相对于对照植物改良植物中产量相关性状的方法，其包括提高植物中编码MYB91样转录因子(MYB91)多肽的核酸序列的表达，该MYB91多肽包含(i)与SEQ ID NO：269所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序(具有)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(ii)与SEQ ID NO：270所示的InterPro登录号为IPR014778的MYB DNA结合结构域以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性；和(iii)与SEQ IDNO：271所代表保守结构域以增加的优选顺序具有至少50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性，和任选地选择具有改良的产量相关性状的植物。
2.根据项1的方法，其中所述的MYB91多肽包含与SEQ ID NO：221所代表多肽以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
3.根据项1的方法，其中所述的MYB91多肽包含与本文表A2中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性。
4.根据项1的方法，其中所述MYB91多肽，当其在构建MYB结合结构域多肽的系统树(如图4中所绘制的一个系统树)中使用时，与多肽的MYB91组聚类，而不与任何其他组聚类。
5.根据任一前述项的方法，其中所述编码MYB91多肽的核酸序列是由表A2中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分，或能够与表A2中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其互补序列杂交的序列所代表。
6.根据任一前述项的方法，其中所述核酸序列编码表A2中给出的任意多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
7.根据任一前述项的方法，其中所述提高的表达由以下任一项或多项实现：T-DNA活化标签技术、TILLING或同源重组。
8.根据任一前述项的方法，其中所述提高的表达由在植物中引入并表达编码MYB91多肽的核酸序列实现。
9.根据任一前述项的方法，其中所述改良的产量相关性状是以下一项或多项：提高的植物高度、提高的收获指数(HI)、和/或提高的千粒重(TKW)。
10.根据任一前述项的方法，其中所述核酸序列有效连接至组成型启动子。
11.根据项10的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子，最优选由SEQ ID NO：272所示的GOS2启动子。
12.根据任一前述项的方法，其中所述编码MYB91多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，更优选杨柳科，最优选该核酸序列来自毛果杨。
13.根据任一前述项的方法获得的植物或其部分(包括种子)，或植物细胞，其中所述的植物，或其部分或细胞包含编码MYB91多肽的分离核酸转基因。
14.构建体，其包含：
(i)编码如项1-6中任一项定义的MYB91多肽的核酸序列；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
15.根据项14的构建体，其中所述调控序列是组成型启动子。
16.根据项15的构建体，其中所述组成型启动子是GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子，最优选由SEQ ID NO：272所示的GOS2启动子。
17.根据项14至16中任一项的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状，所述改良的产量相关性状是以下一项或多项：提高的植物高度、提高的收获指数(HI)、和/或提高的千粒重(TKW)。
18.用根据项14至16中任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
19.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有改良的产量相关性状，该方法包括：
(i)在植物、植物部分，或植物细胞中引入并表达编码如项1至6任一项中定义的MYB91多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞、植物部分或植物。
20.转基因植物，其相对于对照植物具有由编码如项1至6任一项中所定义MYB91多肽的分离核酸序列的提高表达引起的改良产量相关性状，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞或转基因植物部分。
21.根据项13、18或20的转基因植物，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或禾谷植物，如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、黑麦、小黑麦、高粱和燕麦，或衍生自所述转基因植物的转基因植物细胞。
22.根据项21的植物的可收获部分，其包含编码MYB91多肽的分离核酸序列，其中所述的可收获部分优选是种子。
23.产物，其衍生自根据项21的植物和/或从根据项22的植物的可收获部分。
24.根据项1至6中任一项定义的编码MYB91多肽的核酸序列在用于提高产量相关形状中的用途，所述改良的产量相关性状包含以下一项或多项：提高的植物高度、提高的收获指数(HI)、和/或提高的千粒重(TKW)。
3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
1.相对于对照植物改良产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码GASA多肽的核酸的表达，其中所述GASA多肽序列包含PfamPF02704结构域，条件是所述GASA蛋白不是由SEQ ID NO：295所示的GASA4。
2.根据项1的方法，其中所述GASA多肽包含一个或多个以下基序：
(a)基序4(SEQ ID NO：277)，
(b)基序5(SEQ ID NO：278)，
(c)基序6(SEQ ID NO：279)。
3.根据项1或2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入和表达编码GASA多肽的核酸实施。
4.根据项1至3中任一项的方法，其中所述编码GASA多肽的核酸编码表A3中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
5.根据项1至4中任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A3中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据任一前述项的方法，其中所述的改良的产量相关性状包括相对于对照植物而言提高的种子产量。
7.根据项1至6中任一项的方法，其中所述改良的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
8.根据项1至6中任一项的方法，其中所述改良的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。
9.根据项3至8中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子，优选至GOS2启动子，最优选至来自稻的GOS2启动子。
10.根据项1至9中任一项的方法，其中所述编码GASA多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物。
11.根据项1至10中任一项的方法获得的植物或其包括种子的部分，其中所述的植物或其部分包含编码GASA多肽的重组核酸。
12.构建体，其包含：
(i)编码如项1或2中定义的GASA多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
13.根据项12的构建体，其中所述调控序列中的一个是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
14.根据项12或13的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别具有提高的种子产量。
15.用根据项12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
16.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的产量，尤其是提高的种子产量，该方法包括：
(i)在植物中引入并表达编码如项1或2中定义的GASA多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
17.转基因植物，其相对于对照植物具有由编码如项1或2中所定义GASA多肽的核酸的受调节表达引起的提高产量，尤其是提高的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
18.根据项11、15或17的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、黑麦属、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
19.根据项18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
20.产物，从根据项18的植物和/或从根据项19的植物的可收获部分衍生。
21.编码GASA多肽的核酸在相对于对照植物提高植物产量，尤其是提高种子产量中的用途。
4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
1.相对于对照植物改良产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码AUX/IAA多肽的核酸的表达，该AUX/IAA多肽AUX/IAA结构域。
2.根据项1的方法，其中所述AUX/IAA结构域与AUX/IAA结构域的氨基酸，优选表A4的任意多肽的AUX/IAA结构域、最优选由位于氨基酸位置5至171间的氨基酸所示的SEQ IDNO：432的AUX/IAA结构域以增加的优选顺序具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、 41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
3.根据项1的方法，其中所述AUX/IAA多肽是IAA14样多肽，其包含一个或多个以下基序：
(i)基序13：SEQ ID NO：739，
(ii)基序14：SEQ ID NO：740，
(iii)基序15：SEQ ID NO：741，
(iv)基序16：SEQ ID NO：742，
(v)基序17：SEQ ID NO：743，
(vi)基序18：SEQ ID NO：744。
4.根据项1至3的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入和表达编码AUX/IAA多肽的核酸实施。
5.根据项1至4中任一项的方法，其中所述编码AUX/IAA多肽的核酸编码表A4或表A5中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
6.根据项1至5中任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A4或表A5中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
7.根据任一前述项的方法，其中所述的改良的产量相关性状包括相对于对照植物而言提高的产量，优选提高的生物量和/或提高的种子产量。
8.根据项1至7中任一项的方法，其中所述改良的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
9.根据项3至8中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子，优选至GOS2启动子，最优选至来自稻的GOS2启动子。
10.根据项1至9中任一项的方法，其中所述编码AUX/IAA多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。
11.根据项1至10中任一项的方法获得的植物或其包括种子的部分，其中所述的植物或其部分包含编码AUX/IAA多肽的重组核酸。
12.构建体，其包含：
(i)编码如项1或2中定义的AUX/IAA多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
13.根据项12的构建体，其中所述调控序列中的一个是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
14.根据项12或13的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，尤其是具有提高的生物量和/或提高的种子产量。
15.用根据项12或13的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
16.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的产量，尤其是提高的生物量和/或提高的种子产量，该方法包括：
(i)在植物中引入并表达编码如项1或2中定义的AUX/IAA多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
17.转基因植物，其相对于对照植物具有由编码如项1或2中所定义AUX/IAA多肽的核酸的受调节表达引起的提高产量，尤其是提高的生物量和/或提高的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
18.根据项11、15或17的转基因植物或来自其的转基因植物细胞， 其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、黑麦属、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
19.根据项18的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是苗生物量和/或种子。
20.产物，从根据项18的植物和/或从根据项21的植物的可收获部分衍生。
21.编码AUX/IAA多肽的核酸在相对于对照植物提高植物产量，尤其是提高种子产量和/或苗生物量中的用途。
附图简述
本发明现在将参考以下图进行描述，其中：
图1表示ASPAT多肽的多重对比。
图2表示ASPAT多肽的系统树。
图3表示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)或稻PR启动子的控制下增加ASPAT编码核酸在稻中的表达的双元载体。
图4表示来自拟南芥和其他植物的MYB DNA结合结构域多肽间的进化系统关系，基于氨基酸序列(根据Stracke等(2004)Current Opinion in Plant Biology 2001，4：447-456)。使用PHYLIP聚类MYB多肽，且使用MEME检测基序。用于实施本发明方法的多肽与MYB91聚类，圈出并用黑箭头标出。
图5显示来自表A2的MYB91多肽的ClustalW1.81序列多重比对。InterPro登录号IPR014778的两个MYB DNA结合结构域、InterPro登录号IPR015495的MYB转录因子和C端保守结构域，用共有序列下的X’s标出。
图6显示用于在对植物起作用的启动子控制下增加编码MYB91多肽的核酸序列在稻植物中的表达的双元载体。
图7表示具有以黑体显示的GASA结构域PF02704的SEQ ID NO：276的结构域结构。推定分泌信号肽(氨基酸1-24)具有下划线。
图8表示多种GASA蛋白的多重对比。基序4至12或其他基序可从此推导。
图9显示拟南芥GASA蛋白的系统树(Roxrud等.2007)。开始于ClustalW的多重比对(Thompson等，Nucleic Acids Res.22，4673-4680，1994)，使用PAUP v.4.0软件(http://www.paup.csit.fsu.edu)获得邻接系统树，和用具有1000个重抽样的bootstrap分析计算统计置信度。
图10表示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码GASA的核酸在稻中的表达的双元载体。
图11表示AUX/IAA多肽的多重对比。
图12表示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下增加编码AUX/IAA的核酸在稻中的表达的双元载体。
图13表示具有以黑体显示的AUX/IAA结构域和下划线的保守结构域的SEQ ID NO：738的结构域结构。
图14表示IAA14样蛋白序列的多重对比。
图15显示拟南芥IAA蛋白的系统树(Remington等，2004)。组A中的IAA14代表SEQID NO：738且IAA14样蛋白优选于此组A中聚类。
图16表示用于在稻HMGP启动子(pHMGP)控制下增加编码IAA14样的核酸在稻中的表达的双元载体。
实施例
本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是示意性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等(1994)， Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant MolecularBiology Labfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以略去低复杂性序列启动。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以提高E-值以显示严格性更低的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
1.1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
表A1提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A1：ASPAT多肽的例子：
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR，以TA开始)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用 BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列进行。在其他情况下，专用核酸序列数据库来自特定机构，如那些由Joint Genome Institute所有的，如筛选出的白杨基因组序列。
此外，登录专利数据库允许使用上述Blast算法鉴定其他核酸和多肽序列。
1.2.MYB91样转录因子(MYB91)
表A2提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A2：MYB91多肽序列和编码核酸序列的实例：
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR，以TA开始)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列进行。在其他情况下，专用核酸序列数据库由特定组织创建，如由Joint Genome Institute创建的。此外，登录专利数据库允许鉴定新的核酸和多肽序列。
1.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
表A3提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A3：GASA多肽序列的例子：
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列进行。
1.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
1.5.IAA14多肽
表A5提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A5：IAA14样多肽的例子：
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列进行。
实施例2：涉及用于本发明方法的多肽序列的序列的比对
2.1天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
使用渐进比对ClustalW 2.0算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施多肽序列比对，采用标准设置(慢比对(slow alignment)，相似矩阵：Gonnet(或Blosum 62(若比对多肽)，空位开口罚分是10，空位延伸罚分是0.2)。进行少许手工编辑以优化该比对。ASPAT多肽在图1中比对。
使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻接聚类算法构建ASPAT多肽的系统树(图2)。该多肽聚类于五个主要系统发生的分类，分类1、分类2、分类3、分类4和分类5。表B1显示了在这五个分类中发现的该多肽。分类5多肽被用作系统发生分析中的外组且不代表ASPAT多肽。因此分类5多肽不是本文所述本发明的部分。分类1和分类2中的多肽通常表达在胞质溶胶或叶绿体中。分类5对应De LaTorre等2006所定义的ASPAT多肽的新分类。分类4中多肽通常表达在线粒体中。
表B1：ASPAT多肽的系统发生的分类
使用渐进比对ClustalW 2.0算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)实施多肽序列比对，采用标准设置(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开口罚分是10，空位延伸罚分是0.2)。进行少许手工编辑以优化该比对。
2.2MYB91样转录因子(MYB91)
使用ClustalW 1.81算法实施来自表A2的所有MYB91多肽序列的序列多重比对。此比对结果见本申请图5。InterPro登录号为IPR014778的两个MYB DNA结合结构域、InterPro登录号为IPR015495的MYB转录因子、和C端保守结构域由共有序列下的X’s标出。
2.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序进行多肽序列的比对，其中所述AlignX程序基于流行的渐进比对Clustal W算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)， Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分是0.1并且所选的权重矩阵是Blosum 62(若比对多肽)。进行少许手工编辑以优化该比对。GASA多肽中的序列保守性基本上在该多肽的C端部分，N端部分通常在序列长度和组成方面有更多变化。该GASA多肽在图8中比对。
2.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序进行多肽序列的比对，其中所述AlignX程序基于用于渐进比对的Clustal W2.0算法(Thompson等(1997)Nucleic AcidsRes 25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)，采用标准设置实施比对：空位开口罚分是10，空位延伸罚分是0.2。进行少许手工编辑以优化该比对。比对该AUX/IAA多肽(图11)。
共有序列中示出高度保守的氨基酸残基。
2.5.IAA14多肽
使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序进行多肽序列的比对，其中所述AlignX程序基于流行的渐进比对Clustal W算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分是0.1并且所选的权重矩阵是Blosum 62(若比对多肽)。进行少许手工编辑以优化该比对。IAA14多肽之间的序列保守性基本上遍及该多肽的C端部分。该IAA14多肽在图14中比对。
实施例3：计算在实施本发明方法中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数
3.1天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMCBioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或 DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由LedionBitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。在分割线下半部分显示序列相似性，并且在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
还可以产生针对特定结构域局部比对的MATGAT表或关于特定结构域间的百分比同一性/相似性的数据。
3.2MYB91样转录因子(MYB91)
使用可在本领域内获得的方法中的一个方法MatGAT(矩阵全局比对工具(MatrixGlobal Alignment Tool))软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)，确定可以用于实施本发明的方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分比。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。
比较所用的参数有：
记分矩阵：Blosum 62
首个空位：12
延伸空位：2
多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的总体相似性和同一性的软件分析结果示于表C1。
与SEQ ID NO：221相比，可用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的百分比同一性可以为低至52％的氨基酸同一性。
表C1：表A的全长多肽序列范围的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
如比较该多肽的最保守区域，百分比氨基酸同一性可能显著提高。例如，如果将InterPro登录号为IPR015495由SEQ ID NO：268代表的MYB DNA转录因子的氨基酸序列、InterPro登录号为IPR014778由SEQ ID NO：269和/或270代表的MYB DNA结合结构域，或由SEQ IDNO：271代表的C端保守结构域与表A1多肽的各个对应结构域相比，百分比氨基酸同一性显著提高(以优选顺序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性)。
3.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
使用可在本领域内获得的方法中的一个方法MatGAT(矩阵全局比对工具(MatrixGlobal Alignment Tool))软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)，确定可以用于实施本发明的方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分比。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。
比较所用的参数有：
记分矩阵：Blosum 62
首个空位：12
延伸空位：2
多肽序列全长范围的总体相似性和同一性的软件分析结果示于表C2。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。
与SEQ ID NO：276相比，可用于实施本发明方法的GASA多肽序列之间的百分比同一性可以为低至22.2％的氨基酸同一性。
表C2：全长多肽序列范围的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1.TA5035_4679 42.0 35.5 27.6 35.0 29.9 35.9 52.1 33.0 28.2 35.9 64.3 36.6
2.TA5923_4679 52.1 48.0 34.2 35.6 32.0 33.3 47.1 31.1 28.1 33.3 40.8 36.1
3.Os05g0376800 40.8 55.9 28.8 26.7 28.4 27.6 38.6 23.2 26.6 27.6 34.2 23.9
4.Os04g0465300 37.1 47.1 40.1 24.2 33.1 37.4 28.8 30.6 35.1 37.4 29.5 33.0
5.Os10g0115550 42.7 49.6 42.1 35.0 30.7 33.3 34.6 23.7 29.4 32.5 36.8 30.5
6.AK105729 34.2 42.0 38.8 45.3 49.6 34.2 32.8 42.0 33.1 34.2 29.1 79.5
7.Os05g0432200 44.6 44.5 34.9 47.6 47.0 48.7 33.3 37.9 34.0 98.9 38.0 42.1
8.Os09g0414900 57.3 57.1 48.7 43.6 55.6 41.9 41.0 29.2 31.1 33.3 47.0 35.0
9.Os03g0607200 41.5 42.0 30.9 38.1 37.6 52.1 52.1 40.2 37.7 37.9 31.9 52.6
10.Os07g0592000 38.2 37.8 33.6 47.6 40.2 42.7 43.1 41.0 53.9 34.0 31.1 40.0
11.AK110640 43.5 44.5 34.9 47.6 46.2 48.7 98.9 41.0 52.1 43.1 38.0 42.1
12.Os06g0266800 73.8 46.2 38.2 36.2 44.4 30.8 44.6 53.0 40.4 36.3 43.5 35.4
13.Os03g0760800 43.0 46.2 31.6 46.7 44.4 79.5 59.1 41.0 64.9 51.0 59.1 40.9
14.scaff_205.30 41.2 43.7 38.2 49.5 39.3 47.9 46.1 47.9 52.9 53.9 46.1 37.3 55.9
15.scaff_II.04 35.6 45.4 37.5 53.3 42.7 49.6 60.4 42.7 48.5 46.1 59.4 37.6 56.4
16.scaff_II.2330 46.3 52.1 45.4 43.0 52.1 43.0 38.0 48.8 33.9 35.5 38.0 43.0 38.0
17.scaff_VI.397 60.0 622 49.3 48.6 49.6 45.3 43.0 54.7 43.0 41.2 42.0 59.0 48.0
18.scf_XVII.377 63.6 55.5 48.0 45.8 50.4 40.2 44.9 64.1 41.1 46.7 43.9 55.1 43.9
19.scaff_II.202 38.9 47.1 32.2 56.2 42.7 51.3 64.2 37.6 49.5 44.1 63.2 37.9 61.1
20.scaff_I.2410 44.8 41.2 30.3 40.0 42.7 47.9 53.3 38.5 53.2 48.0 52.2 47.1 57.0
21.scaff_I.1483 54.9 68.1 55.3 45.1 54.7 41.0 43.4 59.8 39.8 36.3 42.5 54.0 45.1
22.scaff_I.1926 18.4 26.1 30.6 26.1 22.4 22.4 22.0 23.3 21.2 20.0 21.6 18.0 19.2
23.scaff_XII.704 43.6 27.7 22.4 41.9 30.8 38.5 47.8 23.9 39.4 33.3 46.7 36.9 48.4
24.scaff_41.75 49.5 412 30.9 48.6 44.4 50.4 73.9 40.2 51.1 45.1 72.8 44.0 62.4
25.scaff_40.379 48.9 43.7 32.2 43.8 45.3 53.0 56.5 44.4 64.9 57.8 55.4 45.5 67.7
26.scaff_XV.507 39.8 39.5 28.3 48.6 37.6 41.9 55.9 36.8 42.6 44.1 54.8 38.7 52.7
27.scaff_II.203 43.6 29.4 24.3 36.2 32.5 38.5 54.3 28.2 40.4 34.3 53.3 41.7 47.3
28.scaff_II.2328 58.9 56.3 43.4 45.7 53.8 47.0 55.8 53.0 45.3 44.1 55.8 56.8 54.7
29.scaff_XIX.758 44.8 39.5 30.9 42.9 41.9 41.0 53.3 38.5 47.9 39.2 52.2 43.7 44.1
30.TA45751_4081 47.4 32.8 23.7 32.4 33.3 41.0 44.6 34.2 46.8 44.1 44.6 45.2 51.6
31.TA48119_4081 25.3 37.7 39.5 41.8 39.0 39.7 37.0 37.7 33.6 32.2 36.3 24.7 37.7
32.TA35962_4081 37.5 47.1 36.2 49.5 44.4 47.0 61.5 42.7 48.1 43.3 60.6 38.5 52.9
33.BI208422 65.4 50.4 40.8 40.0 46.2 36.8 43.5 48.7 40.4 43.1 43.5 63.1 46.2
34.BG128975 51.8 64.7 50.0 50.0 58.1 44.4 44.6 62.4 40.2 35.7 43.8 50.9 43.8
35.TA52374_4081 36.6 46.2 35.5 53.6 47.0 47.9 58.0 46.2 46.4 44.6 57.1 39.3 52.7
36.TA37180_4081 57.3 55.5 45.4 45.7 50.4 43.6 49.0 53.0 42.7 49.0 49.0 56.3 50.0
37.BE353147 39.2 44.5 37.5 59.0 36.8 49.6 59.8 40.2 47.1 41.2 58.8 37.3 52.9
38.TA56938_4081 62.5 60.5 46.7 49.5 47.9 41.9 48.1 60.7 42.3 49.0 47.1 55.8 50.0
39.BG130916 70.5 48.7 38.2 40.0 39.3 36.8 40.2 46.2 36.2 37.3 39.1 59.5 45.2
40.SEQ ID NO：276 51.8 68.1 50.7 48.2 52.1 44.4 45.6 58.1 44.7 42.1 44.7 50.0 45.6
41.TA41886_4081 37.9 45.4 34.9 59.0 35.9 52.1 58.3 38.5 45.6 39.8 58.3 37.9 56.3
42.TA36295_4081 46.6 45.4 35.5 49.5 47.0 41.0 53.4 41.9 47.6 45.6 52.4 41.7 55.3
43.TA56201_4081 50.0 44.5 36.2 47.6 41.9 41.0 43.6 47.0 44.7 45.1 43.6 43.6 51.1
44.AJ785329 52.6 31.9 24.3 26.7 29.1 23.9 30.4 34.2 26.6 28.4 30.4 47.6 30.1
45.CA725087 49.1 54.6 41.4 37.9 49.6 36.8 41.4 56.4 35.3 42.2 41.4 55.2 39.7
46.TA69823_4565 24.4 30.3 29.9 25.4 29.4 33.3 25.4 27.9 28.4 38.8 25.4 20.4 28.4
47.TA53297_4565 43.5 42.9 32.9 50.5 46.2 47.0 87.0 37.6 48.9 36.3 85.9 46.7 58.1
48.TA101332_4565 50.5 55.5 40.1 47.6 63.2 47.9 55.3 56.4 45.6 47.6 54.4 48.5 50.5
49.TA66036_4565 44.7 44.5 34.9 47.6 39.3 73.5 59.6 40.2 63.8 53.9 59.6 42.6 90.4
50.TA100367_4565 55.3 49.6 45.4 44.7 47.9 37.6 40.4 59.0 36.8 42.1 39.5 62.3 38.6
51.TA92393_4565 60.4 55.5 42.1 43.8 51.3 41.0 48.5 58.1 42.6 48.0 48.5 73.3 44.6
52.BM136027 43.6 45.4 34.2 47.6 40.2 72.6 58.5 40.2 62.8 55.9 58.5 42.6 89.4
53.CA705831 33.6 42.0 32.2 38.1 47.9 65.0 44.2 41.0 48.7 43.4 44.2 35.4 69.0
54.CA593033 29.7 38.3 31.6 35.2 41.4 60.2 40.6 36.7 44.5 40.6 40.6 28.1 61.7
55.CK153563 60.6 53.8 40.8 41.9 49.6 38.5 52.1 57.3 44.7 45.1 52.1 68.1 47.9
56.TA66038_4565 40.8 45.4 33.6 42.9 38.5 70.9 58.2 41.0 63.3 52.0 58.2 41.8 85.7
57.TA52915_4565 43.5 41.2 32.2 51.4 45.3 46.2 85.9 38.5 47.9 36.3 84.8 46.7 58.1
58.TA69821_4565 41.1 41.2 38.2 40.2 47.0 46.2 46.7 44.4 49.5 75.7 46.7 34.6 50.5
59.TA95153_4565 30.8 38.7 34.9 41.0 39.3 40.2 47.0 36.8 39.3 36.8 46.2 35.9 41.9
60.CD899399 39.8 44.5 32.9 42.9 38.5 73.5 57.1 40.2 62.2 52.9 57.1 39.8 88.8
61.TA77646_4565 61.6 57.1 43.4 44.8 51.3 38.5 50.5 59.0 41.4 50.0 50.5 70.7 48.5
62.TA51752_4565 29.5 39.5 37.5 34.9 34.9 42.6 44.2 38.8 38.8 35.7 43.4 31.0 38.0
63.Pop_GASA 49.4 43.7 32.2 42.9 43.6 48.7 53.3 42.7 58.5 52.0 52.2 47.2 60.2
64.Mt_GASA 36.6 43.7 36.8 50.9 47.9 45.3 50.0 42.7 50.0 44.6 49.1 36.6 48.2
65.At2g30810 57.5 61.3 45.4 50.9 55.6 45.3 43.4 60.7 39.6 45.3 42.5 51.9 46.2
66.At3g02885 62.9 58.0 46.1 46.7 54.7 44.4 54.6 57.3 47.4 48.0 53.6 59.8 50.5
67.At5g15230 57.5 53.8 40.8 43.4 52.1 42.7 44.3 55.6 42.5 43.4 43.4 54.7 43.4
68.At1g74670 62.4 60.5 45.4 45.7 49.6 40.2 52.5 57.3 41.6 49.0 51.5 58.4 44.6
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1.TA5035_4679 31.1 29.7 38.8 51.0 56.1 31.6 34.5 48.7 12.2 36.7 37.6 37.5 32.3
2.TA5923_4679 34.2 36.1 43.8 55.5 46.2 37.0 28.6 54.6 17.6 22.5 29.4 31.1 27.5
3.Os05g0376800 28.3 28.3 36.8 42.8 38.2 26.3 22.4 49.3 22.0 18.3 23.0 24.3 21.6
4.Os04g0465300 34.3 39.0 32.8 32.4 33.6 42.9 28.6 31.6 21.4 36.2 34.0 32.4 39.0
5.Os10g0115550 27.4 28.6 35.6 39.0 38.3 31.9 32.5 34.9 14.0 27.1 32.5 34.2 32.2
6.AK105729 39.3 36.0 31.0 32.5 32.5 41.5 40.2 30.6 16.3 30.5 41.0 47.0 33.9
7.Os05g0432200 34.3 49.0 28.9 34.0 34.6 53.1 38.0 32.7 18.0 43.0 59.8 41.3 48.4
8.Os09g0414900 32.5 29.9 38.8 45.3 52.1 29.1 29.1 48.7 16.3 20.3 30.8 33.3 25.4
9.Os03g0607200 37.1 35.6 25.8 27.1 28.2 37.8 38.3 29.3 14.5 31.6 35.1 47.9 33.3
10.Os07g0592000 39.3 33.0 29.3 30.8 33.6 35.0 35.0 27.0 14.6 24.5 31.1 42.7 31.7
11.AK110640 34.3 48.0 28.9 34.0 34.6 52.1 38.0 32.7 17.6 41.9 58.7 41.3 47.3
12.Os06g0266800 32.4 29.8 38.8 51.0 49.5 32.6 35.6 50.4 13.5 32.9 37.4 39.8 34.4
13.Os03g0760800 44.9 43.3 30.6 35.9 34.2 44.9 47.3 33.6 13.7 38.3 51.1 60.6 39.6
14.scaff_205.30 35.9 28.9 33.0 36.1 37.3 49.0 33.6 16.7 26.2 32.4 54.9 31.1
15.scaff_II.204 44.1 29.8 31.7 31.8 77.2 31.7 37.4 19.6 39.2 43.6 34.7 49.0
16.scaff_II.2330 38.0 37.2 39.7 40.5 28.9 24.8 41.3 17.1 23.8 30.6 30.6 25.4
17.scaff_VI.397 46.1 47.5 47.1 49.5 35.0 32.0 61.4 18.4 27.7 36.3 37.0 26.7
18.scf_XVII.377 53.3 48.6 45.5 60.7 33.6 29.9 54.0 13.5 25.0 34.6 38.9 33.3
19.scaff_II.202 45.1 85.1 32.2 47.0 43.0 33.3 33.6 18.0 46.9 47.4 36.1 53.1
20.scaff_I.2410 55.9 43.6 40.5 44.0 45.8 46.3 31.0 14.3 30.7 36.3 62.5 35.7
21.scaff_I.1483 46.0 48.7 52.1 64.6 62.8 44.2 45.1 15.5 24.6 33.6 36.3 30.7
22.scaff_I.1926 22.4 24.9 22.4 23.3 21.2 21.2 20.4 24.5 19.2 15.9 15.5 21.5
23.scaff_XII704 31.4 44.6 26.4 34.0 29.9 51.6 40.2 30.1 19.6 41.3 32.6 63.8
24.scaff_41.75 47.1 58.4 39.7 48.0 47.7 61.1 50.5 47.8 21.2 48.4 41.8 45.2
25.scaff_40.379 58.8 44.6 39.7 47.0 50.5 47.4 72.7 45.1 19.6 39.8 50.5 36.2
26.scaff_XV.507 37.3 61.4 38.8 40.0 43.0 67.4 49.5 40.7 23.7 67.7 57.0 46.2
27.scaff_II.203 33.3 55.4 30.6 37.0 30.8 56.8 39.1 34.5 18.0 67.6 57.1 40.9 52.7
28.scaff_II.2328 49.0 49.5 60.3 62.0 57.9 46.3 50.5 61.9 22.0 34.7 53.7 53.7 47.4
29.scaff_XIX.758 37.3 51.5 40.5 46.0 43.9 56.8 43.7 40.7 23.7 52.9 58.2 50.0 55.9
30.TA45751_4081 51.0 32.7 30.6 40.0 37.4 35.8 63.2 31.9 14.7 51.5 42.9 67.0 36.6
31.TA48119_4081 35.6 45.9 37.0 32.2 31.5 44.5 33.6 37.0 32.2 41.8 37.7 31.5 52.7
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33.BI208422 45.1 42.6 50.4 58.0 54.2 43.2 46.0 56.6 18.8 37.0 48.4 51.1 44.1
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40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
1.TA5035_4679 46.5 31.1 36.9 40.4 44.3 41.4 18.8 34.8 42.7 36.2 45.6 50.5 38.3
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22.scaff_I.1926 11.6 8.6 15.9 14.5 19.2 17.4 16.7 15.3 16.3 17.5 15.9 22.4 17.1
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24.scaff_41.75 35.4 30.5 43.2 46.9 56.5 34.5 32.5 48.0 42.6 30.2 36.3 37.5 36.8
25.scaff_40.379 44.2 40.6 43.6 57.6 39.1 40.7 27.4 54.1 40.4 25.6 71.9 36.6 34.0
26.scaff_XV.507 28.2 25.8 34.7 36.4 48.4 27.5 32.2 38.2 36.0 30.0 30.1 56.3 30.8
27.scaff_II.203 27.4 22.7 34.0 34.7 50.0 25.0 25.6 35.7 30.3 22.5 31.5 34.8 30.2
28.scaff_II.2328 33.3 27.3 56.7 38.8 38.9 35.2 29.2 38.8 55.9 27.9 38.9 35.7 52.8
29.scaff_XIX.758 25.7 21.1 37.2 32.7 42.4 24.8 27.4 33.7 34.3 24.0 36.0 42.9 33.0
30.TA45751_4081 40.7 37.5 37.2 49.0 32.6 33.3 23.9 49.0 35.4 22.5 57.3 26.8 29.2
31.TA48119_4081 22.0 20.2 23.3 27.5 32.2 26.4 29.9 27.5 25.3 26.0 22.6 43.0 27.4
32.TA35962_4081 29.4 26.2 33.3 35.5 48.1 30.6 37.6 37.4 36.5 34.1 34.6 40.2 36.1
33.BI208422 30.1 23.4 51.1 34.7 33.7 28.7 24.8 34.7 49.5 21.7 36.0 35.7 47.2
34.BG128975 28.9 25.3 50.0 30.4 36.6 33.3 25.6 30.4 50.0 25.6 27.7 33.6 49.6
35.TA52374_4081 32.8 30.2 37.5 38.3 43.8 32.5 34.2 40.9 43.8 33.3 35.7 40.7 39.1
36.TA37180_4081 31.4 24.8 51.0 34.3 37.5 30.6 25.6 33.3 49.5 24.0 35.4 36.6 49.1
37.BE353147 28.2 24.5 34.3 33.3 49.0 32.1 35.9 35.2 34.0 31.0 32.4 36.6 38.9
38.TA56938_4081 33.1 26.8 54.8 35.5 36.5 36.1 28.2 36.4 57.7 26.4 36.8 33.0 52.8
39.BG130916 28.3 24.2 47.9 33.7 33.7 27.8 23.1 32.7 44.0 23.3 36.0 27.7 43.4
40.SEQ ID NO：276 27.2 24.5 46.5 35.9 34.2 34.5 32.5 35.0 48.2 31.0 32.5 34.8 50.9
41.TA41886_4081 28.8 25.0 41.0 34.0 47.6 33.3 31.6 34.9 39.8 29.5 35.9 36.2 33.0
42.TA36295_4081 30.4 27.1 38.5 36.9 43.0 30.6 31.6 36.9 39.8 27.9 36.5 44.6 38.7
43.TA56201_4081 28.4 26.7 42.1 40.2 35.1 39.4 28.2 40.4 41.0 30.2 39.4 33.0 38.3
44.AJ785329 19.3 19.4 37.9 26.3 24.7 22.2 18.8 25.3 36.0 16.3 28.9 21.4 31.8
45.CA725087 32.2 29.2 68.1 30.5 29.7 25.8 23.3 30.5 78.4 21.4 31.4 27.1 39.0
46.TA69823_4565 19.3 19.6 17.8 21.4 18.3 46.8 18.7 20.6 19.3 22.3 19.8 19.2 21.8
47.TA53297_4565 30.7 27.1 41.7 42.9 97.8 30.8 34.2 44.9 40.6 33.3 31.5 36.8 34.9
48.TA101332_4565 32.8 28.6 47.6 36.8 40.8 40.2 30.8 37.7 50.5 32.6 36.9 33.6 49.5
49.TA66036_4565 65.5 58.6 37.1 79.6 43.2 40.2 31.1 83.7 35.3 26.7 53.2 35.7 34.9
50.TA100367_4565 30.9 27.8 57.9 35.3 30.7 33.6 27.4 34.5 65.8 27.1 32.5 27.8 49.6
51.TA92393_4565 33.3 26.8 84.2 38.7 39.8 33.3 30.8 37.5 94.1 26.4 38.8 33.9 50.9
52.BM136027 64.6 57.8 37.1 78.6 42.1 39.3 30.3 82.7 36.3 28.2 53.2 35.7 37.6
53.CA705831 81.3 35.3 65.8 31.6 31.0 25.4 68.4 33.9 24.0 45.1 26.9 31.3
54.CA593033 82.8 28.2 60.6 27.9 30.1 23.5 61.4 27.2 22.4 41.4 23.5 24.5
55.CK153563 40.7 32.8 41.6 37.2 32.4 28.2 41.6 87.9 26.4 40.4 31.3 50.0
56.TA66038_4565 71.7 65.6 50.0 42.9 39.3 27.7 94.9 38.2 28.2 52.0 32.2 34.9
57.TA52915_4565 43.4 38.3 52.1 51.0 30.8 34.2 44.9 40.6 32.6 31.5 36.3 35.8
58.TA69821_4565 44.2 40.6 42.1 49.5 39.3 28.8 38.2 33.3 27.7 37.6 27.8 34.2
59.TA95153_4565 41.0 38.3 35.9 38.5 48.7 39.3 28.6 29.9 76.7 31.6 31.4 26.5
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61.TA77646_4565 41.6 33.6 88.9 44.4 51.5 45.8 38.5 46.5 27.1 39.6 33.9 51.9
62.TA51752_4565 38.0 38.8 34.1 38.8 45.0 39.5 82.9 37.2 34.9 30.2 30.0 27.1
63.Pop_GASA 50.4 45.3 52.1 61.2 44.6 49.5 39.3 61.2 52.5 39.5 32.1 40.2
64.Mt_GASA 43.4 39.1 41.1 46.4 48.2 42.0 43.6 47.3 46.4 42.6 46.4 33.0
65.At2g30810 41.6 33.6 58.5 45.3 48.1 45.8 41.0 45.3 60.4 40.3 53.8 48.2
66.At3g02885 46.9 38.3 64.9 51.0 51.5 45.8 41.0 52.0 66.7 37.2 54.6 47.3 61.3
67.At5g15230 38.1 33.6 62.3 48.1 42.5 43.0 39.3 48.1 65.1 38.8 46.2 49.1 55.7
68.At1g74670 42.5 37.5 64.4 48.5 46.5 45.8 40.2 47.5 68.3 39.5 50.5 47.3 64.2
66 67 68
1.TA5035_4679 48.0 50.0 59.4
2.TA5923_4679 47.9 45.0 49.6
3.Os05g0376800 35.5 32.2 39.5
4.Os04g0465300 37.6 33.6 34.6
5.Os10g0115550 42.7 37.5 40.7
6.AK105729 33.9 31.7 34.2
7.Os05g0432200 39.2 31.1 37.6
8.Os09g0414900 47.0 41.9 47.0
9.Os03g0607200 34.0 30.3 27.9
10.Os07g0592000 38.8 27.9 33.3
11.AK110640 39.2 31.1 37.6
12.Os06g0266800 52.6 49.1 48.5
13.Os03g0760800 41.0 30.3 35.6
14.scaff_205.30 35.3 33.0 35.9
15.scaff_II.204 35.6 32.7 38.8
16.scaff_II.2330 45.5 36.4 40.5
17.scaff_VI.397 54.0 44.4 54.5
18.scf_XVII377 55.5 67.6 63.6
19.scaff_II.202 40.2 33.0 38.2
20.scaff_I.2410 35.1 31.1 31.7
21.scaff_I.1483 51.3 52.2 53.1
22.scaff_I.1926 15.9 14.7 14.7
23.scaff_XII.704 27.6 25.2 29.4
24.scaff_41.75 43.3 33.0 37.6
25.scaff_40.379 44.3 38.7 35.6
26.scaff_XV.507 37.0 30.8 38.2
27.scaff_II.203 32.0 25.5 30.7
28.scaff_II.2328 64.9 47.2 54.5
29.scaff_XIX.758 36.1 34.0 35.6
30.TA45751_4081 33.0 29.2 31.7
31.TA48119_4081 28.8 24.0 27.4
32.TA35962_4081 35.6 34.0 38.5
33.BI208422 57.7 45.3 54.5
34.BG128975 54.0 47.8 53.6
35.TA52374_4081 33.3 31.3 36.8
36.TA37180_4081 61.0 49.5 58.3
37.BE353147 34.6 31.8 34.3
38.TA56938_4081 55.1 63.2 64.4
39.BG130916 48.5 42.5 48.5
40.SEQIDNO：276 46.5 43.9 53.5
41.TA41886_4081 35.9 33.3 34.0
42.TA36295_4081 35.9 40.0 41.3
43.TA56201_4081 42.4 37.6 40.2
44.AJ785329 32.7 32.7 33.3
45.CA725087 45.3 42.7 42.4
46.TA69823_4565 21.8 17.8 21.3
47.TA53297_4565 41.2 35.8 32.7
48.TA101332_4565 51.9 41.5 45.6
49.TA66036_4565 41.0 30.3 35.6
50.TA1003674565 43.6 45.6 42.1
51.TA92393_4565 53.8 54.2 49.5
52.BM136027 42.0 31.2 35.6
53.CA705831 36.1 23.4 31.7
54.CA593033 29.9 21.0 27.5
55.CK153563 55.7 52.3 51.5
56.TA66038_4565 39.2 33.0 36.5
57.TA52915_4565 41.2 34.9 32.7
58.TA69821_4565 37.0 28.7 33.3
59.TA95153_4565 31.1 29.1 30.8
60.CD899399 41.7 33.0 35.6
61.TA77646_4565 58.6 54.2 53.5
62.TA51752_4565 28.7 28.7 26.4
63.Pop_GASA 38.4 33.0 38.2
64.Mt GASA 33.0 30.1 33.9
65.At2g30810 50.9 45.3 50.9
66.At3g02885 50.0 54.4
67.At5g15230 61.3 57.5
68.At1g74670 65.3 67.9
3.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
使用可在本领域内获得的方法中的一个方法MatGAT(矩阵全局比对工具(MatrixGlobal Alignment Tool))软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)，确定可以用于实施本发明的方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分比。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结 果排列成距离矩阵。
比较所用的参数有：
记分矩阵：Blosum 62
首个空位：12
延伸空位：2
3.5.IAA14多肽
使用可在本领域内获得的方法中的一个方法MatGAT(矩阵全局比对工具(MatrixGlobal Alignment Tool))软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)，确定可以用于实施本发明的方法的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分比。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。
比较所用的参数有：
记分矩阵：Blosum 62
首个空位：12
延伸空位：2
多肽序列全长范围的总体相似性和同一性的软件分析结果示于表C3。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。
与SEQ ID NO：738(拟南芥_AT4G14550.1)相比，可用于实施本发明方法的IAA14样多肽序列之间的百分比同一性可以为低至26.3％的氨基酸同一性，但通常高于35％。
表C3：全长多肽序列范围的总体相似性和同一性的MatGAT结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.拟南芥_AT4G14550.1#1 80.7 68.6 63.6 70.5 73.7 67.2 66.8 26.3 54.5 61.4 64.2
2.拟南芥_AT3G23050.1#1 84.8 86.4 63.3 68.1 70.2 63.9 63.5 24.7 55.8 60.2 64.3
3.拟南芥_AT3G23050.2#1 76.3 86.4 53.6 57.5 58.6 53.5 53.6 12.0 45.0 49.2 53.2
4.毛果杨_566151#1 72.2 72.9 61.4 85.6 66.9 63.3 57.3 21.3 56.6 57.8 54.5
5.毛果杨_720961#1 79.0 81.0 68.5 87.4 74.3 70.9 63.9 23.8 54.2 63.6 59.9
6.M.truncatula_TA20354_3880#1 81.4 79.8 69.1 75.8 83.5 72.3 64.4 26.3 55.8 61.2 63.9
7.番茄_TA40922_4081#1 76.3 77.4 66.9 70.4 78.2 83.1 60.5 24.6 55.3 59.4 62.5
8.拟南芥_AT1G04250.1#1 82.5 77.0 67.7 67.5 75.4 77.1 74.6 22.3 50.2 55.5 59.3
9.稻CB657009#1 27.2 26.3 15.2 23.1 25.4 26.7 25.8 26.6 23.8 24.1 25.4
10.稻TA41733_4530#1 64.6 66.8 55.2 71.1 67.9 66.8 63.9 59.9 23.8 55.7 54.2
11.M.truncatula_TA20951_3880#1 71.9 73.1 60.5 69.0 76.3 71.5 69.6 68.4 25.7 67.1 63.5
12.拟南芥_AT3G04730.1#1 75.8 77.8 66.5 67.9 75.8 78.8 77.1 74.6 27.5 64.6 73.5
13.番茄_TA48108_4081#1 69.7 67.9 63.3 62.1 68.5 72.0 69.5 71.2 29.8 56.0 66.8 71.6
14.M.truncatula_TA27011_3880#1 58.5 59.5 51.2 61.5 60.9 59.2 57.5 54.8 18.7 55.2 58.5 58.2
15.M.truncatula_TA22814_3880#1 71.0 72.2 60.0 65.7 72.2 74.3 71.4 71.4 25.7 59.6 70.4 71.4
16.毛果杨_643213#1 75.9 75.7 64.6 68.2 74.2 79.7 78.9 74.3 27.0 66.4 73.9 76.8
17.拟南芥_AT3G23030.1#1 51.8 48.1 47.6 44.0 48.8 50.8 49.2 52.8 25.3 44.0 47.8 48.7
18.拟南芥_AT4G14560.1#1 53.5 48.6 48.6 46.2 50.0 53.0 51.3 54.1 29.8 45.5 50.6 52.1
19.拟南芥_AT1G04240.1#1 54.8 53.5 53.3 46.9 53.6 54.7 53.0 55.0 26.5 47.7 53.8 54.2
20.番茄_TA38817_4081#1 54.8 52.7 52.4 46.2 51.2 49.2 51.3 52.0 23.7 44.8 50.2 50.4
21.番茄_TA43058_4081#1 55.3 53.1 53.3 48.4 55.6 53.8 51.3 56.8 23.0 47.3 53.4 55.1
22.毛果杨_726443#1 54.4 53.5 53.8 43.3 48.8 52.1 49.2 55.0 24.0 48.0 48.6 55.5
23.毛果杨_564913#1 57.9 52.7 51.4 48.7 51.6 54.7 53.4 59.8 23.2 51.6 51.4 53.8
24.毛果杨_831610#1 57.9 56.0 55.7 49.8 54.8 56.4 55.5 57.2 25.1 50.2 53.0 58.1
25.毛果杨_798526#1 56.6 55.1 54.8 48.4 54.8 57.6 55.9 57.6 23.6 49.1 53.8 57.6
26.M.truncatula_TA20557_3880#1 55.7 53.9 53.8 44.8 50.4 52.5 51.7 55.0 26.4 47.3 50.6 53.0
27.M.truncatula_TA20558_3880#1 55.3 49.8 49.0 46.9 53.6 51.7 53.8 54.1 26.3 48.0 50.6 55.9
28.毛果杨_823671#1 58.3 53.9 54.3 48.0 54.0 56.4 54.7 57.6 23.2 49.8 53.8 55.5
29.毛果杨_595419#1 57.0 55.1 55.7 47.3 53.6 55.9 54.7 55.9 23.4 48.4 52.6 53.8
30.M.truncatula_TA31746_3880#1 56.6 55.1 54.8 49.5 54.0 53.8 53.8 58.5 25.0 48.4 54.2 55.9
31.番茄_TA42190_4081#1 54.4 53.9 52.9 49.5 55.2 55.9 53.8 54.1 25.9 50.9 54.2 55.5
32.拟南芥_AT4G29080.1#1 53.1 54.4 44.9 57.7 55.1 54.4 50.8 52.1 19.3 57.7 58.0 53.8
33.M.truncatula_TA25400_3880#1 46.5 43.2 35.7 37.2 41.5 41.9 43.6 45.0 45.5 40.4 41.5 44.1
34.毛果杨_711734#1 47.0 49.6 41.0 51.0 48.1 48.7 48.1 48.1 17.8 51.3 53.3 48.7
35.毛果杨_584053#1 51.8 56.7 46.6 53.7 55.4 53.4 55.7 53.1 20.2 57.0 56.0 53.4
36.M.truncatula_TA230623880#1 46.4 50.1 41.5 50.4 47.6 46.1 47.0 48.4 17.9 51.6 50.7 47.8
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1.拟南芥_AT4G14550.1#1 58.5 49.3 62.5 63.2 40.6 42.3 41.8 41.8 42.7 43.5 45.6 45.5
2.拟南芥_AT3G23050.1#1 57.3 48.4 61.2 62.0 39.8 38.9 43.0 40.2 41.6 41.4 41.5 45.3
3.拟南芥_AT3G23050.2#1 46.1 41.9 50.4 50.2 35.0 35.3 37.9 34.6 36.5 38.3 36.0 39.7
4.毛果杨_566151#1 54.3 44.3 56.4 56.6 36.6 37.5 38.8 38.1 38.8 36.5 41.2 40.8
5.毛果杨_720961#1 58.3 46.9 60.8 61.2 38.8 39.9 43.8 42.0 44.2 40.3 42.7 43.5
6.M.truncatula_TA20354_3880#1 61.3 50.2 64.7 68.0 42.2 42.8 44.5 42.7 43.5 41.8 44.6 45.8
7.番茄_TA40922_4081#1 61.6 45.0 60.7 64.3 39.3 41.3 44.6 40.5 42.7 39.8 41.9 45.0
8.拟南芥_AT1G04250.1#1 58.6 44.3 58.8 59.3 43.3 42.8 45.9 41.5 45.5 41.6 46.1 45.4
9.稻CB657009#1 26.9 16.4 24.1 24.9 20.9 22.9 21.3 20.2 20.1 19.0 20.0 21.5
10.稻TA41733_4530#1 50.0 42.0 49.8 57.0 34.9 36.6 37.9 37.5 38.9 39.9 42.0 43.4
11.M.truncatula_TA20951_3880#1 57.6 47.2 61.2 64.7 37.9 39.9 43.5 39.1 43.5 39.9 40.9 45.5
12.拟南芥_AT3G04730.1#1 60.2 45.9 57.8 62.5 40.3 41.9 42.5 39.2 43.8 41.1 42.2 45.2
13.番茄_TA48108_4081#1 45.2 58.7 60.9 43.9 46.2 47.4 44.1 47.2 43.5 44.9 47.2
14.M.truncatula_TA27011_3880#1 52.8 57.5 55.5 30.1 32.0 34.7 31.9 33.7 32.2 33.0 32.3
15.M.truncatula_TA22814_3880#1 66.9 67.6 67.7 39.6 43.5 43.7 42.0 42.5 40.0 41.9 41.9
16.毛果杨_643213#1 70.0 64.5 78.0 40.1 43.5 41.8 40.4 40.6 41.3 44.4 45.6
17.拟南芥_AT3G23030.1#1 53.4 39.5 50.6 49.4 75.0 57.5 61.7 62.4 60.7 57.5 60.5
18.拟南芥_AT4G14560.1#1 56.7 41.1 50.6 52.3 85.1 60.2 60.5 59.7 59.8 57.2 59.0
19.拟南芥_AT1G04240.1#1 61.5 42.8 50.6 53.2 68.3 69.8 62.6 65.5 59.8 57.1 58.1
20.番茄_TA38817_4081#1 56.3 43.8 52.2 52.3 71.6 68.9 75.3 77.6 67.2 65.6 63.4
21.番茄_TA43058_4081#1 60.6 43.5 51.4 52.3 68.9 67.9 75.5 84.2 66.3 63.3 64.9
22.毛果杨_726443#1 59.1 41.5 50.6 52.3 69.8 66.7 73.4 80.2 77.0 83.7 68.3
23.毛果杨_564913#1 60.1 41.8 51.8 56.5 65.7 63.8 70.0 73.9 73.4 87.0 66.2
24.毛果杨_831610#1 62.0 42.8 51.8 57.4 69.2 68.2 73.3 74.4 76.5 79.5 74.4
25.毛果杨_798526#1 61.1 43.8 51.0 57.0 67.3 67.3 70.4 73.9 76.4 77.4 73.9 95.0
26.M.truncatula_TA20557_3880#1 57.2 42.1 50.6 54.9 75.8 74.7 75.1 75.3 74.5 80.7 73.4 77.4
27.M.truncatula_TA20558_3880#1 60.1 42.1 50.2 54.0 67.2 68.8 74.1 77.9 75.0 78.6 74.4 80.0
28.毛果杨_823671#1 62.0 44.8 52.2 56.5 63.5 63.1 71.9 75.4 74.9 75.9 73.9 80.3
29.毛果杨_595419#1 63.0 45.2 53.9 53.2 67.7 64.2 73.1 77.6 74.6 76.6 72.0 81.1
30.M.truncatula_TA31746_3880#1 61.1 42.1 52.7 56.1 63.2 65.7 71.1 70.6 72.1 72.5 71.5 82.8
31.番茄_TA42190_4081#1 58.7 44.1 51.4 55.3 68.6 71.4 75.7 72.6 74.0 75.0 67.6 76.4
32.拟南芥_AT4G29080.1#1 49.8 51.1 54.4 55.1 42.0 41.3 47.9 44.3 44.9 45.6 46.9 48.5
33.M.truncatula_TA25400_3880#1 49.5 33.4 42.4 45.1 44.8 50.0 42.3 41.6 39.8 39.6 40.6 41.5
34.毛果杨_711734#1 45.6 49.9 48.7 49.3 35.5 37.5 38.7 37.2 38.7 39.0 40.4 40.4
35.毛果杨_584053#1 50.2 51.8 53.7 53.7 39.4 41.0 42.7 42.0 43.3 44.0 44.6 44.0
36.M.truncatula_TA23062_3880#1 43.8 47.0 47.3 48.7 35.7 36.3 39.8 38.9 37.8 39.8 38.9 41.5
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
1.拟南芥_AT4G14550.1#1 43.1 42.9 44.0 43.2 41.7 44.4 42.4 43.0 36.1 38.4 43.3 36.5
2.拟南芥_AT3G23050.1#1 41.8 41.9 40.7 42.6 42.4 43.8 42.3 43.1 33.9 39.1 43.2 37.3
3.拟南芥_AT3G23050.2#1 36.6 37.4 35.0 37.4 37.3 38.2 36.6 35.7 25.0 31.7 35.1 31.5
4.毛果杨_566151#1 38.6 37.9 36.5 39.7 37.9 40.4 38.3 41.8 31.5 40.0 41.7 37.0
5.毛果杨_720961#1 43.5 42.3 41.1 44.8 42.7 43.5 42.3 43.3 34.8 39.5 43.6 36.6
6.M.truncatula_TA20354_3880#1 43.9 42.3 40.8 44.6 42.6 43.3 43.9 43.6 35.3 39.3 41.9 36.7
7.番茄_TA40922_4081#1 42.3 39.0 41.9 42.1 42.6 44.1 41.8 43.6 37.4 41.5 45.9 37.6
8.拟南芥_AT1G04250.1#1 44.6 40.8 43.2 45.9 42.4 44.0 42.4 42.6 35.9 37.4 41.2 36.4
9.稻CB657009#1 19.6 22.6 22.2 19.4 20.6 22.1 23.2 17.0 37.9 15.5 17.3 14.7
10.稻TA41733_4530#1 40.3 38.2 39.0 42.3 40.1 40.1 39.5 44.6 33.2 41.3 42.2 40.5
11.M.truncatula_TA20951_3880#1 43.9 40.7 39.5 44.1 43.3 42.9 45.5 48.0 34.9 42.4 45.0 40.9
12.拟南芥_AT3G04730.1#1 42.9 42.4 42.8 41.9 43.0 41.2 44.9 42.0 35.7 37.5 41.4 36.7
13.番茄_TA48108_4081#1 46.8 44.1 46.7 46.6 46.1 45.3 48.1 39.9 41.1 38.3 41.7 35.1
14.M.truncatula_TA27011_3880#1 33.0 33.7 33.3 33.9 33.8 35.3 35.0 33.7 26.6 31.1 33.1 30.4
15.M.truncatula_TA22814_3880#1 42.1 41.5 40.0 42.4 41.5 41.5 42.4 44.1 36.4 39.1 43.1 37.5
16.毛果杨_643213#1 44.4 44.0 45.0 43.0 42.0 44.3 43.0 43.6 38.1 40.7 43.7 38.0
17.拟南芥_AT3G23030.1#1 57.4 58.0 56.9 54.6 54.2 54.6 55.6 34.1 36.0 28.9 30.9 27.3
18.拟南芥_AT4G14560.1#1 56.8 58.1 58.3 57.6 57.2 55.9 58.1 33.4 36.6 30.9 33.6 29.1
19.拟南芥_AT1G04240.1#1 58.4 59.0 59.7 60.5 60.6 56.5 58.5 37.7 31.6 29.8 33.9 30.3
20.番茄_TA38817_4081#1 61.9 62.6 64.2 61.8 62.4 61.2 59.3 35.4 31.9 29.5 33.2 30.3
21.番茄_TA43058_4081#1 62.4 61.7 61.8 60.9 59.5 62.6 61.0 37.0 32.4 30.7 34.7 30.3
22.毛果杨_726443#1 66.3 69.4 64.9 65.4 62.6 61.8 60.1 38.4 30.5 32.3 36.2 30.3
23.毛果杨_564913#1 63.5 62.3 63.0 62.9 59.7 61.0 55.8 39.0 32.2 33.7 37.5 30.8
24.毛果杨_831610#1 92.0 62.8 66.8 69.1 67.3 70.0 65.2 38.7 31.8 34.1 37.0 33.4
25.毛果杨_798526#1 62.3 64.5 66.8 65.0 69.1 62.2 37.4 31.7 33.2 36.2 33.1
26.M.truncatula_TA20557_3880#1 74.9 69.4 60.9 61.0 58.8 59.0 36.7 33.2 27.8 32.9 29.7
27.M.truncatula_TA20558_3880#1 77.4 81.7 65.0 63.7 61.5 56.3 33.8 33.5 30.1 35.5 31.7
28.毛果杨_823671#1 80.8 72.9 75.4 89.2 63.8 57.8 38.0 31.9 33.2 36.2 32.6
29.毛果杨_595419#1 82.1 74.1 75.6 94.6 62.7 57.8 39.7 31.7 31.5 35.5 32.3
30.M.truncatula_TA31746_3880#1 82.8 73.0 73.5 76.5 77.5 60.1 38.8 31.6 33.5 38.4 34.8
31.番茄_TA42190_4081#1 73.9 76.2 75.3 73.9 73.6 71.6 37.7 32.1 30.9 38.1 29.1
32.拟南芥_AT4G29080.1#1 48.2 43.3 44.9 47.2 47.9 46.9 45.9 32.5 54.6 57.7 45.3
33.M.truncatula_TA25400_3880#1 42.2 44.9 44.1 41.9 40.8 40.2 44.3 36.7 30.7 36.2 28.0
34.毛果杨_711734#1 39.8 36.4 36.4 39.5 39.3 40.1 39.3 66.8 35.2 61.4 49.1
35.毛果杨_584053#1 44.6 43.0 42.0 46.3 45.0 46.9 46.3 69.4 39.1 69.1 47.3
36.M.truncatula_TA23062_3880#1 41.8 38.9 39.8 40.6 40.6 43.2 38.6 58.5 32.0 65.6 59.7
实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域
4.1天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的序列多重比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表D1、表D2和表D3中分别呈现如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示的多肽序列的InterPro扫描结果。
表D1、D2、D3：分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：6所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
表D1
表D2
表D3
4.2.MYB91样转录因子(MYB91)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表D4中呈现如SEQ ID NO：221所示的多肽序列的InterPro扫描结果。
表D4：如SEQ ID NO：221所示的多肽序列的InterPro扫描结果。
4.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的序列多重比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表D5中呈现如SEQ ID NO：2所示的多肽序列的InterPro扫描结果。
表D5：如SEQ ID NO：276所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
数据库 登录号 登录名称 氨基酸位置SEQ ID NO 2
InterPro IPR003854 赤霉素调节的蛋白质
HMMPfam PF02704 GASA 5-114
4.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
通过检索pfam数据库确定保守蛋白结构域在SEQ ID NO：432的出现。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的序列多重比对结果和隐匿马尔科夫模型的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。
在表D6中呈现如SEQ ID NO：432所示的查询序列的Pfam检索结果。
表D6：如SEQ ID NO：432所示的多肽序列的Pfam检索结果(主要登录号)
比对模型用途是所谓的“Is”。用于模型中的参数在表D7中给出。
表D7：HMM模型
Is模型：hmmbuild-F HMM_ls SEED hmmcalibrate--cpu 1--seed 0HMM_ls
4.5.IAA14多肽
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的序列多重比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表D8中呈现如SEQ ID NO：738所示的多肽序列的InterPro扫描结果。
表D8：如SEQ ID NO：738所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
数据库 登录号 登录名称 氨基酸坐标SEQ ID NO 738
InterPro IPR003311 AUX/IAA蛋白质
HMMPfam PF02309 AUX_IAA 1-220
InterPro IPR011525 Aux/IAA-ARF-二聚化
ProfileScan PS50962 IAA_ARF 111-211
InterPro NULL NULL
超家族 SSF54277 CAD&PB1结构域 106-209
实施例5：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑结构预测
5.1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
代表GRP的蛋白质序列用来查询TargetP 1.1。选择“植物”生物组，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
5.2.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定 性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
在表E1中呈现如SEQ ID NO：221所示的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果。选择“植物”生物组，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。预测具有24个氨基酸的分泌信号序列的如SEQ ID NO：221所示的多肽序列被分泌，。
表E1：如SEQ ID NO：221所示的多肽序列的TargetP 1.1分析
长度(AA) 114
叶绿体转运肽 0.022
线粒体转运肽 0.022
分泌途径信号肽 0.960
其他亚细胞靶向 0.023
预测的位置 S
可靠性级别 1
预测的转运肽长度 24
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM；
·PSORT(URL：psort.org)
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
5.3.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
·PSORT(URL：psort.org)
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
5.4.IAA14多肽
TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最 可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
在表E2中呈现如SEQ ID NO：738所示的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果。选择“植物”生物组，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。如SEQ ID NO：738所示的多肽序列的亚细胞定位有可能是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
表E2：如SEQ ID NO：738所示的多肽序列的TargetP 1.1分析。缩写：Len，长度；cTP，叶绿体转运肽；mTP，线粒体转运肽，SP，分泌途径信号肽，其他亚细胞靶向，Loc，预测定位；RC，可靠性类；TPlen，预测转运肽长度。
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
·PSORT(URL：psort.org)
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
PSORT分析预测核定位，其与来自文献(Fukaki等，2002)的数据一致。
实施例6：在实施本发明方法中有用的多肽序列的亚细胞定位预测
6.1.MYB91样转录因子(MYB91)
用于蛋白质定位的实验方法的范围从免疫定位至使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸酶(GUS)对蛋白质加标签。鉴定GRF多肽的亚细胞区室化的此类方法是本领域熟知的。
通过序列多重比对、随后通过目视检查在表A2的多肽序列中找到预测的核定位信号(NLS)。NLS是具有带正电荷的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列。
从序列数据进行蛋白质定位的计算预测。在本领域技术人员熟知的算法当中，例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM、TMpred等可在瑞士生物信息研究所维护的ExPASy蛋白质组工具处获得。
PSort算法预测如SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽如最高概率(0.088)的核亚细胞定位。此外，预测到两个推定NLS：
Found：pos：81(3)KK IAAEVPGRTA KRLGK
Found：pos：273(3)RR VELQLESERS CRRRE
实施例7：关于在实施本发明方法中有用的多肽序列的测定法
7.1.MYB91样转录因子(MYB91)
在本发明方法中有用的MYB91多肽(至少以它们的天然形式)一般，但并非必需具有转录调节活性和与其他蛋白质相互作用的能力。可以使用本领域熟知的技术(例如在Current Protocols in Molecular Biology，第1和2卷，Ausubel等(1994)，CurrentProtocols中)轻易地在体外或体内确定DNA结合活性和蛋白质-蛋白质相互作用。MYB91多肽包含两个MybDNA结合结构域(InterPro登录号IPR014778)。
7.2.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
表达GASA多肽的转基因植物(至少以其天然形式)可具有改良的热胁迫耐受性。由Ko等(2007)描述了热耐受性测定法：检测种子萌发中热胁迫测试反义，种子播种在水饱和过滤纸上。将它们保持在室温吸水18小时，转到50℃，且受3小时热处理。此后将其转到22℃。5天后确定子叶萌发。每一品系进行三次实验(每次30个种子)。为评估热胁迫耐受性测定法，种子在正常MS(Murashige & Skoog盐混合物)培养基中萌发。七天龄的籽苗暴露于50℃下2.5小时，且在返回正常生长条件后10天，评价存活的植物。每一品系进行三次实验(每次30个种子)。野生型植物用作对照。
7.3.IAA14多肽
据报道IAA14与ARF7和ARF19在酵母双杂交系统中相互作用(Fukaki等，2005)：从花cDNA库扩增编码拟南芥ARF5(氨基酸778-902)、ARF7(氨基酸1031-1164)和ARF19(氨基酸952-1086)的C端的cDNA片段，使用以下引物组：对于ARF5，5’-agaattcAATAGTAAAGGCTCATCATGGCAG-3’和5’-agtcgacGTTACATTTATGAAACAGAAGTCTTAAGATCG-3’；对于ARF7，5’-agtcgacaAGCTCAGACTCAGCGAATGCG-3’和5’-cagtcgacTCACCGGTTAAACGAAGTGGC-3’；对于ARF19，5’-gagaattcAATCAGACTCAACGAATGCG-3’和5’-agtcgacCTATCTGTTGAAAGAAGCTGCAGC-3’。
扩增全长IAA14可读框，使用两种引物，5’-cgaattcATGAACCTTAAGGAGACGGAGC-3’和5’-tgtcgacTCATGATCTGTTCTTGAACTTCTCC-3’。将PCR产品亚克隆到pCR-Blunt II TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并在通过EcoRI/SalI(IAA14，ARF5和ARF19)或SalI(ARF7)位点框内插入pAD-GAL4-2.1或pBD-GAL4Cam(Stratagene，CA，USA)之前测序。随后将构建体引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190细胞，且将转化体用于如前所述的β-半乳糖苷酶活性测定法(Kaiser等，Methods in Yeast Genetics：A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring HarborLaboratory Press，1994)。
实施例8：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
8.1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
使用定制的来自拟南芥籽苗或来自稻的cDNA文库(在pCMV Sport6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下使用50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。cDNA文库和使用的引物在表F1中给出。
表F1
引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”pASPAT。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：218)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将所得表达载体pGOS2::ASPAT(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
类似地，产生表达载体，其包含如下特征(表F2)：
表F2
8.2.MYB91样转录因子(MYB91)
除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：alaboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或在Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications(英国))出版的R.D.D.Croy的Plant MolecularBiology Labfax(1993)中描述。
使用来自不同发育阶段的番茄植物的RNA构建的cDNA库作为模板，通过PCR扩增编码如SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽序列的毛果杨核酸序列。包括用于Gateway重组的AttB位点的以下引物用于PCR扩增：
1)prm11884(SEQ ID NO：271，有义)：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGAAGGAGAGGCAGCGT-3’
2)prm11885(SEQ ID NO：272，反向，互补)：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACCTGATACAGCTGGACGTA-3’
使用Hifi Taq聚合酶在标准条件进行PCR。也使用标准方法扩增并纯化具有预期长度的PCR片段(包括attB位点)。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆(entryclone)”。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：220的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：53)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将用于组成型表达的所得表达载体pGOS2::ASPAT(图6)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
8.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
a)番茄GASA的克隆：
使用定制的番茄籽苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增本在本发明方法中使用的番茄核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下使用50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。使用的引物是prm10623(SEQID NO：286：有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggagaagacacttagctta-3’和prm10624(SEQ IDNO：287；反义，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatatatgattaagggcatttt-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”pGASA。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：275的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的 目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：290)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将所得表达载体pGOS2::GASA(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
b)白杨GASA克隆
使用定制的白杨籽苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增本在本发明方法中使用的白杨核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下使用50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。使用的引物是prm10625(SEQID NO：288：有义，起始密码子为粗体字)：5’-gggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaacaatgaagaagctcttctttgct-3’和prm10626(SEQ IDNO：289；反义，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacatgcacatcttgactgtct-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段，和如上文所述的其他克隆程序，包括使用稻启动子。
8.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
使用定制的稻籽苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增本在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下使用具有与SEQ ID NO：431的第一和最后20个核苷酸互补的引物组的50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。在PCR中使用的正向引物的序列由SEQ ID NO：667所代表且反向引物由SEQ ID NO：668所代表。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”p AUX/IAA。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：431的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：669)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将所得表达载体pGOS2::AUX/IAA(图12)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
8.5.IAA14多肽
使用定制的拟南芥籽苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增本在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下使用50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。使用的引物是：prm7273(SEQIDNO：745：有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaaccttaaggagacggag-3’和prm07274(SEQ ID NO：746；；反义，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcaatgcatattgtcctctttt-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”pIAA14样。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：737的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于弱组成型表达的稻HMGP启动子(SEQ ID NO：747)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，将所得表达载体pHMGP::IAA14样(图16)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
实施例9：植物转化
稻转化
使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。将粳稻栽培品种日本晴(Nipponbare)的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。无菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。该混悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸入此混悬液中15分钟。将所述愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中孵育3日。共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。在转移这种材料至再生培养基并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中于高湿度和短日照下培育。
对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留显示所述选择剂抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移栽后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米的转化用Ishida等(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方 法的改良形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源，不过也可以成功地使用其他基因型。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将来自每个胚的绿色苗转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
小麦转化
用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行小麦的转化。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化。将不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。与农杆菌孵育后，将所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后于再生培养基上体外培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但是可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将来自每个胚的绿色苗转移至生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
大豆转化
根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种适合通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。将大豆种子消毒用于体外播种。从7日龄的年幼籽苗切除下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和剩余的子叶以发育腋生结节。切下这些腋生结节并与含有表达载体的根癌农杆菌孵 育。在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养基。切下再生的苗并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
油菜籽/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄的年幼籽苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业品种Westar(AgricultureCanada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。将卡诺拉油菜种子表面消毒用于体外播种。从所述体外籽苗切下带有子叶的子叶柄外植体，并且通过将该叶柄外植体的切口端浸入细菌悬液用(含有表达载体的)农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗的长度是5-10mm时，切下这些苗并且转移至苗伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
苜蓿转化
使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(AgricultureCanada)或如Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。叶柄外植体与含有表达载体的根 癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。所述外植体在黑暗中于含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发体细胞胚。将生根的籽苗移植至花钵内并且在温室中培育。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
棉花转化
使用根癌农杆菌，根据US 5159135中所述的方法转化棉花。棉花种子在3％次氯酸钠溶液中作20分钟表面消毒并在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。随后将种子转移至含有50μg/m苯菌灵的SH培养基用于萌发。取下4至6日龄籽苗的下胚轴，切成0.5cm小片并置于0.8％琼脂上。农杆菌混悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择标记转化的过夜培养物稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有具维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等，Exp.CellRes.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL2以及杀死残留细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。单个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有精细蛭石中具SH培养基的管内，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的花钵。植物硬化并随后移至温室以 进一步培育。
实施例10：表型评价方法
10.1评价建立
产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并收获T1种子。T1子代以3∶1比例对所述转基因的存在/不存在分离的事件留下。对于这些事件中的每个事件，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1籽苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1籽苗(失效合子)。以随机位置并排生长转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并确保满足植物完全生长和发育的需要。
T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，但是每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
干旱筛选
在盆栽土壤中在正常条件下培育来自T2种子的植物直至它们接近齐穗期。随后将它们转移至灌溉减少的“干燥”区。将湿度探测器插入随机选择的花钵内，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。栽培的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
氮利用效率筛选
在盆栽土壤中在除营养液之外的正常条件下培育来自T2种子的稻植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常7至8倍之间更少的氮(N)含量的特定营养溶液浇灌所述花钵。培育的其余部分(植物成熟、种子收获) 与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
植物在由椰子纤维和argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在这两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。
10.2统计分析：F-检验
使用两因素ANOVA(变量分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。对于该F检验而言，真实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值指出了基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
因为实施了具有重叠事件的两个实验，故进行联合分析。这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且如果一致，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的可信度。所用的方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布(chisquare distribution)获得P-值。
10.3测量的参数
生物量相关的参数测量
植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点处所测量的面积。早期生长势是萌发后3周的植物(籽苗)地上部分面积。根生物量的增加表述为总根生物量的增加(测量为植物寿命期间所观察到的根最大生物量)；或表述为根/冠比增加(测量为根和苗的活跃生长期间根质量与苗质量之间的比例)。
早期生长势通过计数来自植物地上部分的与背景区别的像素总数确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表述的物理表面值。下述结果是针对萌发后3周的植物。
种子相关的参数测量值
将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将所述花序脱粒，并且收集和计数全部种子。使用吹气装置将充实粒与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。通过计数分离步骤后仍留下的充实粒的数目确定充实种子数。种子总产量通过称量从一株植物收获的全部充实粒测量。每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的壳数测量。千粒重(TKW)从计数的充实种子数及它们的总重量外推出来。本发明中的收获指数(HI)定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比率乘以系数106。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序数之间的比率。如本发明中定义的种子充实率是充实种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
实施例11：转基因植物的表型评价结果
11.1.天冬氨酸转氨酶(ASPAT)
下文(表G1)提供了为T2世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻GOS2启动子调控下的SEQ IDNO：1中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。在以下参数中观察到至少5％的提高：地上生物量(AreaMax)、出苗势、种子产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、充实率(fillrate)、和植物高度(HeightMax)(表G1)。
表G1用pGOS2::ASPAT转化的转基因植物表型
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
AreaMax 7.4
totalwgs eeds 11.8
nrfilledseed 9.3
fillrate 5.0
HeightMax 5.0
下文(表G2)提供了为T1世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻GOS2启动子调控下的SEQ IDNO：5中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。观察到植物高度(HeightMax)有至少5％的提高。
表G2.用ExprVect2转化的转基因植物的表型。
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
植物高度 5.2
下文(表G3)提供了为T1世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻PR启动子调控下的SEQ ID NO：5中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。在以下参数中观察到至少5％的提高：地上生物量(AreaMax)、出苗生长势(EmerVigor)、种子总产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、每个圆锥花序花数(flowerperpan)、第一圆锥花序数(firstpan)、总种子数(nrtotalseed)和植物高度(HeightMax)。
表G3用表达载体ExprVect3转化的转基因植物的表型
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
AreaMax 29.3
EmerVigor 49.8
totalwgseeds 31.2
nrfilledseed 32.0
flowerperpan 9.5
firstpan 15.8
nrtotalseed 26.8
HeightMax 11.6
下文(表G4)提供了为T2世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻PR启动子调控下的SEQ ID NO：5中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。在以下参数中观察到至少5％的提高：地上生物量(AreaMax)、出苗生长势(EmerVigor)、种子总产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、每个圆锥花序花数(flowerperpan)、第一圆锥花序数(firstpan)、种子总数(nrtotalseed)和植物高度(HeightMax)。
表G4用表达载体ExprVect3转化的转基因植物的表型
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
AreaMax 9.7
EmerVigor 17.8
totalwgseeds 24.4
nrfilledseed 23.3
fillrate 8.4
harvestindex 14.7
firstpan 10.8
nrtotalseed 14.9
HeightMax 5.3
下文(表G5)提供了为T1世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻PR启动子调控下的SEQ ID NO：3中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。在以下参数中观察到至少5％的提高：种子产量(totalwgseeds)、充实种子数(nrfilledseed)、收获指数(harvestindex)和种子充实率(fillrate)。
表G5用表达载体ExprVect1转化的转基因植物的表型
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
totalwgseeds 23.0
nrfilledseed 20.1
fillrate 9.9
harvestindex 13.8
下文(表G6)提供了为T1世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含在稻GOS2启动子调控下的SEQ IDNO：9中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。观察到充实种子数(nrfilledseed)和收获指数(harvestindex)至少有5％的提高。
表G6用表达载体ExprVect5转化的转基因植物的表型
参数 转基因植物相对于对照植物的提高％
fillrate 6.6
harvestindex 6.0
下文提供了非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果。观察到充实率和收获指数至少有5％的提高。
11.2.MYB91样转录因子(MYB91)
下文提供了在正常条件下生长的T1世代转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达在组成型启动子调控下的编码SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽的核酸序列。
在植物高度、收获指数(HI)和千粒重(TKW)方面有显著提高。
表G7：在组成型启动子调控下T1世代转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达编码SEQ ID NO：221所示的MYB91多肽的核酸序列。
性状 T2世代中4个事件中全局平均％提高
植物高度 3％
收获指数 8％
千粒重 6％
11.3.赤霉素刺激的拟南芥(GASA)
下文表G8中提供了在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达在中等强度组成型启动子调控下的番茄GASA核酸。
表G8：产量参数的全局提高(％)
参数 1st评价 2nd评价
开花时间 2.1 3.5
充实率 10.4 8.3
每个圆锥花序花数 4.8 14.7
与对照植物相比，开花时间缩短，而充实率和每个圆锥花序花数有超过5％的提高。
下文表G9中提供了在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达在中等强度组成型启动子调控下的白杨GASA核酸。
表G9：产量参数的全局提高(％)
参数 1st评价 2nd评价
种子总重量 13.3 13.7
收获指数 18.8 22.2
千粒重 4.2 2.9
11.4.生长素/吲哚乙酸基因(AUX/IAA)
下文提供了为T2世代，且在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达包含SEQ ID NO：431中最长可读框的核酸。关于转基因植物的世代的详述见前面的实施例。
下文(表G10)提供了在非胁迫条件下转基因稻植物的评价结果。在以下参数中观察到至少5％的提高：每株植物充实种子数(nrfilledseed)、收获指数(harvestindex)和种子产量(totalwgseeds)。
表G10
参量相关性状 与对照植物相比，转基因植物的百分比提高
totalwgseeds 12.0
harvestindex 8.3
nrfilledseed 11.2
11.5.IAA14多肽
下文(表G11)提供了在非胁迫条件下T2转基因稻植物的评价结果，该转基因稻植物表达SEQ ID NO：738的IAA14样核酸。
表G11表达SEQ ID NO：738的转基因稻植物的全局产量提高(％)
参数 全局提高
totalwgseeds 19.2
nrfilledseed 18.6
fillrate 18.8
harvestindex 21.1
HeightMax 5.5
GravityYMax 6.6
发现种子总重量、充实种子数、充实率(充实种子数除以总种子数，再乘以100)、收获指数、植物高度和重心(植物分枝的指示)有提高。对列于表G11中的各参数，p值是p＜0.05。

Claims (26)

1.相对于对照植物提高植物中的生物量和/或种子产量的方法，其包括在植物中引入和表达编码天冬氨酸转氨酶ASPAT多肽的核酸和任选选择具有提高的生物量和/或种子产量的植物，所述ASPAT多肽包含转氨酶类I和II结构域并且由SEQ ID NO:6表示，其中转氨酶类I和II结构域具有Interpro登录号IPR004839和pfam登录号PF00155，且其中所述核酸有效连接至PR启动子。
2.根据权利要求1的方法，其中所述ASPAT多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
3.根据权利要求1的方法，其中所述编码ASPAT多肽的核酸的序列为SEQ ID NO:5。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述提高的生物量和/或种子产量在非胁迫条件下获得。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述提高的生物量和/或种子产量在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。
6.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述PR启动子为来自稻的PR启动子。
7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述编码ASPAT多肽的核酸是植物来源的。
8.根据权利要求7的方法，其中所述植物为双子叶植物。
9.根据权利要求7的方法，其中所述植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
10.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1中定义的ASPAT多肽的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个调控序列，且其中所述调控序列之一是PR启动子；和任选地
(iii)转录终止序列。
11.根据权利要求10的构建体，其中所述PR启动子为来自稻的PR启动子。
12.根据权利要求10或11的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有提高的生物量和/或提高的种子产量。
13.制备相对于对照植物具有提高的生物量和/或提高的种子产量的植物的方法，其包括用根据权利要求10或11的构建体转化所述植物、或其植物细胞或部分。
14.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的生物量和/或提高的种子产量，该方法包括：
(i)在植物中引入并表达编码如权利要求1中定义的ASPAT多肽的核酸，且其中所述核酸有效连接至PR启动子；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
15.根据权利要求1-3、8-9、13和14中任一项的方法，其中所述植物是作物植物。
16.根据权利要求1-3、8-9、13和14中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
17.根据权利要求1-3、8-9、13和14中任一项的方法，其中所述植物是谷物。
18.根据权利要求1-3、8-9、13和14中任一项的方法，其中所述植物是黑麦属。
19.根据权利要求1-3、8-9、13和14中任一项的方法，其中所述植物是稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
20.编码如权利要求1所定义的ASPAT多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高种子产量、地上生物量、出苗生长势、每个圆锥花序花数、第一圆锥花序数和/或植物高度中的用途，其中所述核酸有效连接至PR启动子。
21.根据权利要求20的用途，其中所述提高种子产量是提高种子总产量、充实种子数和/或总种子数。
22.根据权利要求12、20和21中任一项的用途，其中所述植物是作物植物。
23.根据权利要求12、20和21中任一项的用途，其中所述植物是单子叶植物。
24.根据权利要求12、20和21中任一项的用途，其中所述植物是谷物。
25.根据权利要求12、20和21中任一项的用途，其中所述植物是黑麦属。
26.根据权利要求12、20和21中任一项的用途，其中所述植物是稻、玉米、小麦、大麦、谷子、裸麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍或燕麦。
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