CN105218650B - 一种与植物抗逆性相关蛋白Prp1及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物抗逆性相关蛋白Prp1及其编码基因与应用。本发明所提供的植物抗盐性相关蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验表明：在盐胁迫下，转Prp1基因植株的叶绿素含量和萎蔫率都要明显高于对照植株，导电率明显低于对照植株。说明本发明提供的Prp1基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的抗盐性，对培育抗盐植物新品种，特别是培育抗盐水稻具有重要的理论及实际意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白Prp1及其编码基因与应用。
背景技术
植物转录因子在植物逆境胁迫应答过程中起着重要作用，它们能够激活植物抗逆相关基因的表达和不同功能蛋白的合成，引起各种生理生化反应。据报道小麦转录因子TaBTF3、TabZIP60、TaMBF1、TaWRKYs、TaMYBs和TaNACs参与小麦非生物胁迫相关的应答反应，能够显著提高小麦在不同胁迫条件下的抗逆性，因而从小麦基因中中筛选出和抗逆相关的小麦转录因子，为作物抗逆新品种的培育奠定基础。
自然环境中的干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。当前，通过基因工程育种获得具有耐逆性的作物品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗逆基因的筛选与功能发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，将其命名为Prp1蛋白。
本发明提供的Prp1蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列由214个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述Prp1蛋白相关的生物材料。
本发明提供的与上述Prp1蛋白相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码上述Prp1蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的第256-900位脱氧核糖核苷酸所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Prp1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的Prp1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Prp1蛋白且具有上述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码Prp1蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达Prp1蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动Prp1基因转录的启动子，还可包括终止Prp1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述Prp1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了上述Prp1蛋白或与上述Prp1蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了上述Prp1蛋白或与上述Prp1蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。
本发明还提供了上述Prp1蛋白或与上述Prp1蛋白相关的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述Prp1蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物抗逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述Prp1蛋白的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第256-900位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。
上述方法中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
所述抗盐胁迫具体为抗NaCl胁迫，所述NaCl浓度具体为150mM，体现为在150mMNaCl胁迫的条件下：转基因植物的含水量高于受体植物、转基因植物的萎蔫度低于受体植物、转基因植物的叶绿素含量高于受体植物、转基因植物的电导率升高速率低于受体植物。
上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述单子叶植物具体可为水稻。
在本发明的一个实施例中，Prp1蛋白的编码基因通过含有Prp1蛋白的编码基因的表达盒的重组载体Prp1-pCUbi1390导入农杆菌AGL1中。所述重组载体Prp1-pCUbi1390为将序列表中序列1自5’端第256-900位所示的DNA片段插入pCambia1390载体的Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ酶切位点间，且将序列表中序列5所示的启动子插入到pCambia1390载体的Hind III和KpnⅠ酶切位点间，且保持pCambia1390载体的其他序列不变得到的载体。重组载体Prp1-pCUbi1390表达Prp1蛋白。
上述方法中，所述Prp1基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述Prp1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述Prp1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码上述Prp1蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
通过实验证明：将本发明的Prp1蛋白的编码基因导入野生型水稻日本晴中得到的转Prp1水稻植株，在盐胁迫处理后的萎蔫率和叶绿素含量明显高于野生型植株、导电率明显低于野生型植株。说明本发明提供的Prp1蛋白与其编码基因能够显著提高水稻的抗盐性，对培育抗逆水稻新品种，特别是培育抗盐水稻具有重要的理论及实际意义。
附图说明
图1为T0代转Prp1水稻植株的分子鉴定。图1a为T0代转Prp1水稻植株的PCR检测，其中，P为过表达载体Prp1-pCUbi1390，NT为对照植株(T0代转空载体植株)；1-5为5个T0代转Prp1水稻株系。图1b为5个T0代转Prp1水稻株系的RT-PCR表达分析，其中，Actin1为内参基因，NT为对照植株(T0代转空载体植株)，1-5为5个T0代转Prp1水稻株系。
图2为T0代转Prp1水稻植株在抗盐性实验中的生长状况。图2a为盐处理前，T0代转Prp1水稻植株的生长状况；图2b为盐处理15天后，T0代转Prp1水稻植株的生长状况。其中，Prp1和Prp2均为T0代转Prp1水稻株系，CK为T0代转空载体植株。
图3为盐处理后T0代转Prp1水稻植株和T0代转空载体植株的萎蔫率统计结果。其中，Prp1和Prp2均为T0代转Prp1水稻株系，CK为T0代转空载体植株。
图4为盐处理后T0代转Prp1水稻植株和T0代转空载体植株的叶绿素含量测定结果。其中，Prp1和Prp2均为T0代转Prp1水稻株系，CK为T0代转空载体植株。
图5为盐处理后T0代转Prp1水稻植株和T0代转空载体植株的电导率含量测定结果。其中，Prp1和Prp2均为T0代转Prp1水稻株系，CK为T0代转空载体植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小麦品种中国春购买于中国农业科学院作物科学研究所种子销售部。
下述实施例中的水稻品种日本晴购买于中国农业科学院作物科学研究所种子销售部。
下述实施例中的Yoshida营养液的配方如表1所示。其中，A-F为配制1L母液所需要的药品量。配制水稻水培营养液时，配制4L营养液各加入5mL A-E母液，加入20mL F母液，最后加入水定容至4L。
表1、Yoshida营养液的配方
实施例1、Prp1基因的克隆
1、cDNA的获得
提取小麦(中国春)的RNA，反转录获得cDNA。
2、PCR扩增
以步骤1获得的cDNA为模板，采用Prp1FW和Prp1RV引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
Prp1FW：5’-GGTACCCACAAACCCTCACCACTCACCTAC-3’(序列3)；
Prp1RV：5’-ACTAGTGTAGCACTGTGGTAGATGAG-3’(序列4)。
PCR扩增反应条件为预变性94℃3min；94℃1min，52℃1min，72℃1min；5个循环；94℃1min，62℃1min，72℃1min；25个循环，最后72℃5min。
3、Prp1基因的获得
将步骤2得到的PCR扩增产物克隆到pEASY simple blunt载体(购自全式金公司)得到重组表达载体，将其命名为pEASY-Prp1重组表达载体，并对其进行测序。
测序结果表明：上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，将其命名为Prp1基因，其中，自5’端第256-900位为ORF，编码由214个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为Prp1，该蛋白的氨基酸序列为序列2。
实施例2、转Prp1基因水稻的获得及其抗盐性分析
一、转Prp1基因水稻的获得
1、Prp1-pCUbi1390过表达载体的构建
以pCambia1390载体(pCambia1390公司)为骨架载体，在骨架载体的Bgl Ⅱ和SpeⅠ酶切位点间插入序列表中序列1自5’端第256-900位所示的DNA片段，在骨架载体的HindIII和Kpn Ⅰ酶切位点间插入序列表中序列5所示的启动子，得到Prp1-pCUbi1390过表达载体，并对其进行测序。
测序结果表明：Prp1-pCUbi1390过表达载体为将序列表中序列1自5’端第256-900位所示的DNA片段插入pCambia1390载体的Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ酶切位点间，且将序列表中序列5所示的启动子插入到pCambia1390载体的Hind III和Kpn Ⅰ酶切位点间，且保持pCambia1390载体的其他序列不变得到的载体。
2、L1-Prp1-pCUbi1390重组菌的获得
将上述步骤1获得的Prp1-pCUbi1390转化农杆菌菌株AGL1(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)，得到重组菌，并对其进行菌落PCR及酶切鉴定(PCR鉴定的引物FP:GTCGAGGAGAGCGACAAGAT和RP:GCCGTCCTTGTCCTCGTAG)，将含有大小为456bp的目的条带的重组菌命名为L1-Prp1-pCUbi1390。
将pCUbi1390载体转化农杆菌菌株AGL1，得到重组菌L1-pCUbi1390。
3、转Prp1基因水稻的获得
(1)愈伤组织的制备
将大约200粒野生型水稻种子(日本晴)置于50ml离心管中，先用70％酒精灭菌30s，倒出酒精加入45ml次氯酸钠原液(加两滴吐温-20)摇动灭菌40min(冰上操作)，于超净台中用无菌水冲洗6-8次，放置于4℃冰箱中2-3天，然后用10％的次氯酸钠灭菌10min，无菌水冲洗6-8次。将消毒的种子放置于愈伤组织诱导培养基(MS基本培养基+5mg/L 2,4-D+0.4g/L CH(水解酐酪素)+植物凝胶phytagel 3.6g/L)上，25℃暗培养，随时拔掉长出的芽。每两周继代一次，观察胚的愈伤诱导情况，一个月后诱导出具有一定形态结构的愈伤组织。
(2)转化
1)在解剖镜下挑选继代约5-10天的胚性愈伤组织作为转化受体材料。
2)收集上述步骤2获得的L1-Prp1-pCUbi1390重组菌体，将其重悬于液体共培养培养基(在YEP液体培养基的基础上添加终浓度为100mg/L AS(乙酰丁香酮)，调PH5.2得到的液体培养基)中，28℃，200rpm震荡培养1-2小时；调整OD值至1.0，得到农杆菌菌液。
3)将上述步骤(1)获得的愈伤组织浸泡于上述步骤2)获得的农杆菌菌液，0.5×105Pa负压处理5min，然后进行菌液浸泡，处理30min。
4)台式真空泵抽干菌液，将步骤3)处理得到的愈伤组织在无菌滤纸上吸干，转移到铺有一层灭菌滤纸的固体共培养培养基(在MS基本培养基的基础上添加5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2-4D)、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.5g/L酸水解酪蛋白(CH)、40mg/L乙酰丁香酮(AS)、3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.2灭菌得到的固体培养基)上，19℃暗培养2-3天。
5)将步骤4)培养得到的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef(头胞噻呐霉素)的无菌水漂洗，然后将愈伤组织放到灭菌的滤纸上。
6)将步骤5)得到的用无菌滤纸吸干的愈伤组织转移到选择培养基(在MS基本培养基的基础上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH(水解酐酪素)、250mg/L Cef(头胞噻呐霉素)、50mg/L HPT和3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上，25℃暗培养，每两周转至相同的选择培养基上继代一次。
7)经步骤6)3次继代培养后，将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基(在MS基本培养基的基础上，添加1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1g/L CH(水解酐酪素)、250mg/L Cef(头胞噻呐霉素)、50mg/L HPT和3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上，25℃、16h、2000Lx光照培养，两周左右新鲜的愈伤组织上开始有绿色芽点出现，在相同的培养条件下，在分化培养基上每15天继代一次，两次继代后，长出小苗，转移到生根培养基(在MS基本培养基基础上添加3g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)在25℃、16h、2000Lx光照培养下生根培养。
8)待生根培养长出完整小苗，将小苗转入到壮苗培养基(1/2MS基本培养基的添加3g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上培养两周获得到幼苗。
9)将步骤8)壮苗培养基上的幼苗，炼苗一周，在清水中将培养基漂洗干净，先移栽到温室，再移栽到大田中得到T0代转Prp1水稻株系(Prp1-Prp10)。
按照上述同样的方法，以L1-pCUbi1390替代L1-Prp1-pCUbi1390，获得T0代转空载体植株。
4、T0代转Prp1水稻株系的分子鉴定
提取步骤3获得的T0代转Prp1水稻株系(Prp1-Prp10)和野生型水稻(日本晴)的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以正向引物(P1：5’-AGCGACAAGATGCC-3’)和反向引物(P2：5’-CCTGCTTCACCACCACAG-3’)进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。以质粒pCUbi1390作为对照。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环；72℃延伸5min。
将PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳得到大小为221bp的片段即为PCR检测阳性的转Prp1水稻植株，部分电泳图结果如图1A所示。从图中可以看出：PCR鉴定获得阳性的T0代转Prp1水稻，而野生型水稻植株中没有大小为221bp的片段。图1A中，1-5为部分T0代转Prp1水稻株系的PCR产物；P代表Prp1-pCUbi1390；NT为对照植株(转空载体植株)。
5、转Prp1水稻植株的RT-PCR表达分析
1)采用TRIZOL(Invitroge，USA)一步法分别提取步骤4鉴定阳性的T0代转Prp1水稻和T0代转空载体植株叶片的总RNA，取2μg总RNA，采用SuperScriptTM first-strandsynthesis system(Invitrogen，USA)反转录获得cDNA。
2)以步骤1)获得的T0代转Prp1水稻和T0代转空载体植株的cDNA为模板，采用正向引物(P1:5’-AGCGACAAGATGCC-3’)和反向引物(P2：5’-CCTGCTTCACCACCACAG-3’)进行PCR扩增，并以actin为内参基因，内参基因的引物序列为：LP actin-F:5’-GATACTCCCTCACAACAACCGC-3’和LP actin-R:5’-TGACCATCAGGCATCTCATAGC-3’，分别得到PCR扩增产物。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环；72℃延伸5min。
3)将步骤2)得到的PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳得到221bp的片段即为Prp1基因。
结果如图1B所示：泳道1为T0代转空载体植株(NT)，泳道2-6为T0代转Prp1水稻，结果表明Prp1基因在水稻中得到了表达，T0代转Prp1水稻构建成功。选取T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2用于下述抗盐性分析。
二、转Prp1水稻植株的抗盐性分析
1、盐胁迫处理
1)幼苗萌发
将T0代转空载体植株、野生型水稻(日本晴)、T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2的种子置于42℃保存一周以打破休眠，于室温将种子在水中浸泡3天，随后将其置于37℃萌发一天。每个株系取40株生长一致的幼苗放入96孔板(减掉底部)中。37℃黑暗条件下浸泡在水中培养一天以促进根部生长，之后转移至育秧盘中[24℃(13h)/20℃(11h)]继续培养。5天后，将水换成Yoshida营养液继续培养。
2)胁迫处理
将T0代转空载体植株、野生型水稻(日本晴)、T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2的幼苗进行盐胁迫处理，具体步骤如下：将Yoshida营养液换成盐胁迫营养液(含有150mM NaCl的MS营养液(购自Sigma M5524)，胁迫15天后复水，复水照片如图2所示。取样进行相关生理指标(具体指标：萎蔫度、叶绿素含量、电导率)的测定，测定方法具体见文献“王晶英，敖红，张杰，等.植物生理生化实验技术与原理[M],哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.”。
2、生理指标的测定结果
(1)萎蔫度的检测结果
萎蔫度的检测结果如图3所示：从图中可以看出：在盐胁迫处理后，T0代转空载体植株(CK)的相对含水量在高盐过程中下降较快，而T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2则保持相对较高的含水量。
叶绿素含量的检测结果如图4所示：在盐胁迫处理后，T0代转空载体植株(CK)的叶绿素含量在高盐胁迫后下降较快，而T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2则保持相对较高的叶绿素含量。
电导率(电解质渗透率)的检测结果如图5所示：从图中可以看出：在盐胁迫处理后，T0代转空载体植株(CK)的电导率急速升高，说明叶片受损伤严重，而T0代转Prp1水稻株系Prp-1和T0代转Prp1水稻株系Prp-2的电导率则缓慢升高，损伤相对较轻。
野生型水稻的萎蔫度、叶绿素含量和电导率的检测结果和T0代转空载体植株均无显著差异。
以上各指标的变化说明转Prp1水稻株系提高了水稻的抗逆性，尤其是抗盐性。
Claims (8)
1.蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为序列表中序列1的第256-900位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆性为抗盐性。
5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用；所述抗逆性为抗盐性。
6.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述抗逆性为抗盐性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1的第256-900位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
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