CN104974235A - 磷吸收相关蛋白ZmPht1;5在调控植物磷吸收中的应用 - Google Patents

磷吸收相关蛋白ZmPht1;5在调控植物磷吸收中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了磷吸收相关蛋白ZmPht1；5在调控植物磷吸收中的应用。本发明所提供的磷吸收量相关蛋白ZmPht1；5为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与磷吸收量相关的蛋白质。实验证明，本发明提供的磷吸收量相关蛋白ZmPht1；5及其编码基因能增加植物的磷吸收量和生物量，提高了植物对低磷的耐受性。

Description

磷吸收相关蛋白ZmPht1;5在调控植物磷吸收中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中磷吸收相关蛋白ZmPht1；5在调控植物磷吸收中的应用。
背景技术
磷是植物生长发育必需的三大营养元素之一，不仅是核酸、磷脂、ATP等重要化合物分子的组成成分，而且还参与了包括光合作用、能量代谢、酶活调节、细胞信号传导等多种重要的生理生化过程。植物主要依靠根系从土壤溶液吸收有效磷(Pi)而获得磷素，由于土壤中磷的有效性低且扩散速率极慢，磷被认为是植物最难获得的营养元素之一，也是限制作物产量的一个重要因子。传统农业靠大量施肥来增强土壤的供磷能力并提高作物产量，然而也带来了一系列问题。首先，磷矿作为不可再生资源，在不断的开采利用中逐渐减少，并濒临枯竭；其次，作物对施入土壤的磷肥的利用效率低，只有15-25％，大部分在土壤中被固定，造成磷肥资源的巨大浪费；第三，影响土壤环境质量，同时引起水体的富营养化，对生态环境构成威胁。因此，克隆鉴定磷高效吸收利用相关基因，通过转基因培育磷高效作物品种，具有重要的经济和生态意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何增加植物磷吸收。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了磷吸收相关蛋白及其相关生物材料在调控植物磷吸收量、调控植物生物量和/或促进植物在低磷条件下对磷的吸收中的应用。
上述应用中，所述磷吸收相关蛋白的名称为ZmPht1；5，为如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物磷吸收相关的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由509个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质ZmPht1；5，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质ZmPht1；5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质ZmPht1；5的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述应用中，所述ZmPht1；5相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码所述ZmPht1；5的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
a2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述ZmPht1；5的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述ZmPht1；5的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.1由1530个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述调控植物磷吸收量可为增加植物磷吸收量。
上述调控植物生物量可为增加植物生物量。
本发明还提供了磷吸收相关蛋白及其相关生物材料在培育磷吸收量增加的、生物量增加的和/或耐低磷的植物中的应用。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmPht1；5的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmPht1；5的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmPht1；5且具有ZmPht1；5功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码ZmPht1；5的核酸分子的表达盒(ZmPht1；5基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmPht1；5的DNA，该DNA不但可包括启动ZmPht1；5基因转录的启动子，还可包括终止ZmPht1；5基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128
(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述ZmPht1；5基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，ZmPht1；5的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有ZmPht1；5的编码基因的表达盒构建重组载体。所述重组载体为用SEQID No.1所示的DNA分子替换pCAMBIA3301的Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ识别序列间的DNA片段得到的重组载体pCAMBIA3301-ZmPht1；5，pCAMBIA3301-ZmPht1；5表达SEQ ID No.2所示的ZmPht1；5蛋白。所述pCAMBIA3301-ZmPht1；5与pCAMBIA3301的差别仅在于将pCAMBIA3301的Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ识别序列间的DNA替换为SEQ ID No.1所示的DNA分子。
上文中，所述磷吸收量增加的植物可为转基因植物。所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmPht1；5基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述植物可为陆生植物，所述陆生植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉米。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括将所述磷吸收量相关蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的磷吸收量、生物量和/或耐低磷性高于所述受体植物。
上述培育转基因植物的方法中，所述磷吸收量相关蛋白的编码基因的编码序列是如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
a2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述ZmPht1；5的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述ZmPht1；5的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述培育转基因植物的方法中，所述植物可为陆生植物，所述陆生植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉米。
在本发明的实施例中，所述ZmPht1；5的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有ZmPht1；5基因表达盒的ZmPht1；5基因重组表达载体导入所述受体植物中。
上述培育转基因植物的方法中，其中所述ZmPht1；5基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述ZmPht1；5基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述ZmPht1；5基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmPht1；5基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述方法中，所述植物可为陆生植物，所述陆生植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉米。
为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码所述ZmPht1；5蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对。
本发明中，所述磷吸收量具体可为根的磷吸收量、茎的磷吸收量和/或植株总磷吸收量；所述生物量具体可为根干重、茎干重、总干重和/或总根长。
在本发明中，所述植物磷吸收量增加具体可为苗期磷吸收量增加。所述苗期磷吸收量增加具体可体现为与受体植物相比，a)根的磷吸收量大于所述受体植物；b)茎的磷吸收量大于所述受体植物；c)植株总磷吸收量大于所述受体植物；
在本发明中，所述植物生物量增加具体可为苗期生物量增加。所述苗期生物量增加具体可体现为与受体植物相比，d)根干重大于所述受体植物；e)茎干重大于所述受体植物；f)植物总干重大于所述受体植物；g)植物总根长大于所述受体植物。
实验证明，本发明所提供的磷吸收相关蛋白ZmPht1；5及其编码基因能增加植物的磷吸收量和生物量，并提高植物的耐低磷性。低磷(10μM)条件下生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2的根的磷吸收量相比于对照分别增加了15.2％和26.9％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2的茎的磷吸收量相比于对照分别增加了19.7％和29.9％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2的植株总磷吸收量相比于对照分别增加了19.6％和27.0％；低磷条件下生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的根干重相比于对照分别增加了45.0％和58.5％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的茎干重相比于对照分别增加了13.7％和28.7％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的总干重相比于对照分别增加了16.4％和27.7％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的总根长相比于对照分别增加了94.0％和39.5％。
附图说明
图1为T0代转35S：：ZmPht1；5玉米植株的PCR检测结果。
图2为Bar免疫试纸检测。其中A为Bar免疫试纸检测阴性结果，B为Bar免疫试纸检测阳性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCAMBIA3301为北京鼎国昌盛生物技术有限公司公司产品，产品目录号为MCV039。
下述实施例中的玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB(Armstrong C L,Green CE and Phillips R L.Development and availability of germplasm with high TypeII culture formation response.Maize Genetics Cooperation News Letter,1991,65:92-93)，公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
下述实施例中涉及的培养基如下：
N6E培养基：溶质及其浓度为：N6Salt 4g/L，N6Vitamin Stock(200×)5ml/L，2,4-D(0.4mg/ml)2mg/L，Myo-inositol 0.1g/L，Proline 2.76g/L，Sucrose 30g/L，Casein hydrolysate 0.1g/L，Gelrite 2.8g/L，Silver nitrate(17mg/ml)25μM/L；溶剂为去离子水；pH5.8。
高渗培养基：溶质及其浓度为：N6Salt 4g/L，N6Vitamin Stock(200×)5ml/L，2,4-D(0.4mg/ml)2mg/L，Myo-inositol 0.1g/L，Proline 0.69g/L，Sucrose 30g/L，Casein hydrolysate 0.1g/L，D-Sorbitol 36.4g/L，D-Mannitol 36.4g/L，Gelrite2.8g/L，Silver nitrate(17mg/ml)25μM/L；溶剂为去离子水；pH5.8。
选择培养基：溶质及其浓度为：N6Salt 4g/L，N6Vitamin Stock(200×)5ml/L，2,4-D(0.4mg/ml)2mg/L，Myo-inositol 0.1g/L，Sucrose 30g/L，Gelrite 2.8g/L，Silver nitrate(17mg/ml)25μM/L，Bialaphos(5mg/ml)2.5mg/L；溶剂为去离子水；pH5.8。
再生培养基I：溶质及其浓度为：Macro(200×)50ml/L，Micro(200×)1ml/L，Fe盐(200×)5ml/L，Vitamins(200×)5ml/L，Myo-inositol 0.1g/L，Sucrose 30g/L，Gelrite 3g/L，Bialaphos(5mg/ml)2.5mg/L；溶剂为去离子水；pH5.8。
再生培养基II：溶质及其浓度为：Macro(200×)50ml/L，Micro(200×)1ml/L，Fe盐(200×)5ml/L，Vitamins(200×)5ml/L，Myo-inositol 0.1g/L，Sucrose 30g/L，Gelrite 3g/L，6-BA(2mg/ml)0.5mg/L；溶剂为去离子水；pH5.8。
实施例1、利用磷吸收相关蛋白基因培育磷吸收量增加的转基因植物
本实施例提供了一个来源于玉米自交系B73的磷吸收相关蛋白基因，将其命名为ZmPht1；5基因。
制备序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子(即磷吸收相关蛋白ZmPht1；5基因,简称ZmPht1；5基因)，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQ ID No.2所示的蛋白质(即磷吸收相关蛋白ZmPht1；5，简称ZmPht1；5蛋白)。
一、重组载体的构建
将植物表达载体pCAMBIA3301的限制性核酸内切酶Bgl Ⅱ识别序列和限制性核酸内切酶EcoRⅤ识别序列间的DNA(植物表达载体pCAMBIA3301被限制性核酸内切酶Bgl Ⅱ和EcoRⅤ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为核苷酸序列是SEQ IDNo.1的DNA分子，保持植物表达载体pCAMBIA3301的其它序列不变得到ZmPht1；5基因表达载体，其名称为35S::ZmPht1；5。35S::ZmPht1；5表达SEQ ID No.2所示的ZmPht1；5蛋白。
二、用重组载体35S::ZmPht1；5转化玉米
本发明通过基因枪法导入玉米的幼胚从而获得转基因植株。具体的转基因方法如下：
实验室在转基因过程中所用受体为玉米自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。首先在田间种植玉米自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，然后在室内进行转化。采用基因枪法将35S::ZmPht1；5导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转35S::ZmPht1；5基因T0代植株，具体转基因方法如下：
(一)剥离幼胚
1、去除苞叶。切除玉米穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。
2、向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20)用来浸泡玉米穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转玉米穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。
3、把消毒过玉米穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1-2mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等。
4、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间,然后轻轻向上撬出幼胚,用小的手术刀尖轻轻托起幼胚,确保幼胚不受到任何的损伤,把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基,胚的密度大约是2×2cm(30个/皿)。
5、用封口膜封住培养皿，28度暗培养2-3天。
6、在N6E培养基28℃暗培养7-10天，幼胚出根状物，将根状物除去，继续暗培养，每14天继代一次。
7、幼胚长出的Ⅱ型愈伤组织可用于基因枪轰击转化。
(二)洗涤金粉
1、称取15mg金粉(0.6μm)，转到1.5ml无菌离心管中，该管内有10×的金粉量。
2、在超净台上，加入500μl冰冻的无水乙醇，轻轻弹起30s洗涤。
3、轻弹管壁，使管壁的液滴落到液面，所有金粉趋于稳定，冰上静止离心管30min。
4、3000g离心1min，移去浮于表面的乙醇。
5、加入1ml冰冻的无菌超纯水，通过管壁加入，轻轻击打沉淀，使其稍稍悬浮洗涤，然后静止5min，让金粉沉淀。
6、3000g离心1min，移去浮于表面的无菌超纯水。
7、重复5、6步骤2-3次。
8、加入500μl冰冻的无菌超纯水，在涡漩器上悬浮摇动，使金粉全部悬浮。
9、均分金粉，当离心管在涡漩器上摇动时，先用移液器吸25μl分到10个离心管内，然后从最后一个离心管反向逐个再次均分25μl金粉。每个离心管含有1.5mg金粉。将其-20℃储存。
(三)实验材料的准备
1、选取暗培养3天的幼胚，或毛状松软的Ⅱ型愈伤组织转移到高渗培养基中，集中培养基的中心放置，摆成约3cm的圆形，基因枪轰击前4h准备好。
2、将载体膜、铁丝网及圆形钢圈用70％酒精浸泡灭菌，可裂膜用时用异丙醇灭菌，蘸一下晾干即可。
3、事先保存的过表达载体质粒35S::ZmPht1；5，通过DNA的凝胶电泳估计质粒DNA的浓度，如果浓度较大，可适当稀释至50ng/μl。
(四)金粉包裹DNA
在轰击的当天，将洗涤好的金粉包裹DNA，包裹后的DNA一般在1-2h内使用完，效果较佳。每管1X金粉可以轰击8-10次。在无菌条件下操作以下步骤：
1、解冻离心管，在超净式工作台上加入构建好的载体质粒1μg。
2、手指适当涡漩，在工作台上轻击管壁，收集所有的液滴到底部。
3、轻弹管壁时，同时加入50μl的CaCl2溶液，同时利用枪头轻轻吸打悬浮液上下一次；然后在低速涡漩器上摇动，手指轻弹管壁时，同时加入20μl的亚精胺溶液后静止30s，再关闭管口，手指涡漩；将其放到涡漩器上摇动10min。
4、使离心管静止数分钟，然后2000g离心15s，用枪吸出表面溶液；在沉淀管内加入250ml冰冻的无水乙醇，用微量枪头吸打沉淀，然后摇动离心管，直至金粉完全以“粉状物”均匀地散在离心管溶液内。使离心管静止3-5min，直至沉淀，然后2000g离心15s，用枪吸出表面溶液。
5、在沉淀管内加入200ml冰冻的无水乙醇，尽量用微量枪头吸打沉淀，混合均匀。使离心管静止3-5min，直至沉淀，然后2000g离心15s，用枪吸出表面溶液。
6、重复步骤5两次。
7、最后在沉淀物内加入120-140μl的无水乙醇，混匀后即可加入到载玻片上。
(五)轰击受体材料
1、打开超净台，用70％乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部。
2、将用酒精浸泡的载体膜、铁丝网、用异丙醇浸泡一下可裂膜，放在滤纸上自然风干，圆形钢圈在70％酒精中浸泡后取出在酒精灯上烧干。
3、把灭好菌的载体膜装入圆形钢圈，在载体膜中心加上10μl用质粒DNA包裹好的微弹粒子，自然条件下晾干。
4、打开气瓶，调节压力至1500psi。
5、将可裂膜、铁丝网和载体膜安装进固定装置中。射击参数为：Gap distance:20min；微弹载体飞行距离：10mm；微弹飞行距离：7cm；压力：1100psi；真空度28inches Hg。
6、把准备好的Ⅱ型愈伤放在托盘上，将托盘插入倒数第二档。
7、打开基因枪的电源，打开真空泵，关闭基因枪的门，按下抽真空键(Vac)，当真空表读数达到28inches Hg时，将键置于保持(Hold)档。
8、按下射击键(Fire)直到射击结束，按下放气键，使真空表读数归零。
9、打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好。
10、轰击后的愈伤组织在高渗培养基上放置12-16h后，倒入继代培养基，28℃暗培养。
(六)选择稳定转化
1、在继代培养基上7-10天，转化细胞开始恢复，然后把轰击的愈伤组织转移到选择培养基上。
2、每隔2-3周，轰击愈伤转到选择培养基上。在轰击6-8周后，选择出现抗双丙胺膦愈伤组织。
3、在轰击6-8周后，转化的愈伤组织中能够观察到少数迅速生长出II型愈伤组织(质地松软，颜色新鲜)。大多数是没有生长、颜色变成褐色的幼胚。每一个生长出II型愈伤组织的幼胚被认为是单独的转化。
(七)转基因植株再生
1、将II型愈伤组织转移到在再生培养基I上培养3周；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。
2、然后转移到再生培养基II上培养至发芽，即为转基因植株；培养条件为：26℃，光照强度为10000LUX条件下培养。
3、一周内，体细胞愈伤长出幼苗和根，10天后可以转到培养瓶。培养瓶中促根壮苗。
4、待再生苗生长出3-4片叶时，将其移栽到温室，得到T0代转基因植株。
采用同样的方法，将质粒pCAMBIA3301导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得T0代转pCAMBIA3301玉米植株，作为空载体对照。
三、T0代转基因玉米植株的鉴定
(一)分子鉴定
提取步骤二获得的T0代转35S：：ZmPht1；5玉米植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以下述引物F和引物R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。其中引物F为：5'-ACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGA-3'；引物R为：5'-CCAGCCAGCCAAAGACCAGTT-3'。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,能得到875bp的目的条带的T0代转35S：：ZmPht1；5玉米植株即为阳性转35S：：ZmPht1；5玉米植株。
按照上述方法，将T0代转35S：：ZmPht1；5阳性玉米植株叶片的基因组DNA分别替换为水、质粒35S：：ZmPht1；5和T0代转35S：：ZmPht1；5阴性玉米植株叶片的基因组DNA，其他步骤均相同。结果表明(图1)，以水和T0代转pCAMBIA3301阴性玉米植株叶片的基因组DNA为模板进行PCR扩增后，无目的条带；而以质粒35S：：ZmPht1；5为模板进行PCR扩增有875bp的目的条带。
(二)Bar免疫检测试纸鉴定
(1)检测样品材料处理及准备
取步骤(一)分子鉴定为阳性T0代转35S：：ZmPht1；5玉米植株叶片0.1g，放入2ml离心管中，研磨。然后加入QuickStix Kit试剂盒(美国Envirologix公司产品)附赠蛋白提取液EB2500μl缓冲液，混匀。
(2)样本检测
使用前将Bar免疫检测试纸(美国Agdia公司产品，产品目录号为STX14200/0012)恢复至室温，将该检测试纸垂直插入2ml离心管中，样品端淹没入样品液的深度约为0.5cm，1min后取出放平阅读检测结果。
(3)结果判断
检测线及对照线一般可在1-2min内出现，检测标准为：在检测条上仅出现一条紫红色质控线为阴性结果(图2中A)；在检测条上出现两条紫红色条带，一条为紫红色检测线，一条为紫红色质控线，此为阳性结果(图2中B)。
凡能得到两条紫红色条带的转35S：：ZmPht1；5玉米植株即为阳性转35S：：ZmPht1；5玉米植株。
将鉴定为阳性T0代转35S：：ZmPht1；5阳性玉米植株分为两部分，一部分经过5代自交获得自交株系L-1；另一部分与玉米骨干自交系Z58回交3代，获得回交株系L-2。
四、转基因玉米植株的表型检测
1、实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
将步骤二的获得转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1的种子在低磷营养液(溶质及其浓度为：K2SO4750μmol/L，MgSO4·7H2O 650μmol/L，KH2PO410μmol/L，KCl 100μmol/L，Ca(NO3)2·4H2O 2000μmol/L，FeSO4·7H2O 100μmol/L，Na2EDTA 100μmol/L，MnSO4·H2O1μmol/L，ZnSO4·7H2O 1μmol/L，CuSO4·5H2O 0.1μmol/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.005μmol/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O，H3BO31μmol/L；溶剂为水)中水培20天，然后播种到培养土中。每个株系随机选取20株生长至20天的玉米，对自交株系L-1各玉米植株的总干重、根干重、茎干重、总根长、根的磷吸收量、茎的磷吸收量及整株的磷吸收量进行统计分析。所述玉米植株的总干重为玉米整个植株在烘箱中80℃烘干至恒重，放入干燥器内冷却后的质量。
其中采用钼锑抗吸光光度法测定磷吸收量，具体步骤如下：
1.1、磷标准曲线的制作
1)准确称取KH2PO4标准品0.0220g于100mL容量瓶中，用少量ddH2O溶解，然后用ddH2O定容至100mL，摇匀，配成50μg/ml磷标准溶液。
2)标准曲线的制作：分别准确吸取50μg/ml的磷标准溶液0、2、4、6、8、10ml加入到50ml的容量瓶中，加ddH2O至约30ml，再加空白试验定容后的消煮液5ml，调节溶液pH值至3，然后加钼锑抗试剂5ml，最后用ddH2O定容至50ml，摇匀，静置30分钟后于820nm波长进行比色。以KH2PO4浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制磷标准曲线。
1.2、测定磷吸收量
1)称取烘干剪碎的植物样品约0.5g，置于消煮管中，加入8ml浓硫酸轻轻摇匀。2)消煮管口放一小漏斗，放在300℃电炉上消煮30min。
3)当溶液至微沸并全部呈棕黑色时取下降温，小心滴加几滴H2O2，再放入消煮炉中继续消煮，如此反复，直至溶液呈无色或清亮时，取下，冷却。
4)用少量ddH2O冲洗漏斗，洗液流入消煮管中，将消煮液移入50ml容量瓶中，摇匀，冷却至室温。
5)加2滴硝基酚指示剂，然后滴加6M NaOH溶液直至溶液变为黄色。
6)滴加2M硫酸溶液，使黄色刚好褪去。
7)加钼锑抗试剂5ml，加ddH2O定容至50ml。
8)摇匀，静置30min后，820nm波长下比色，用空白消煮液与钼锑抗试剂反应液调零。
按照下述公式计算植物磷吸收量：
植物全磷含量(mg/g DW)＝OD820×(V/m)×(V2/V1)
OD820-----换算后待测液中磷的浓度(mg/L)
其中V为样品制备溶液的体积；m为样品干重(g)；V1为吸取反应所用体积；V2为反应液总体积。
2、按照上述方法，将转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1替换为转回交株系L-2，其他步骤均不变，分别得到转35S：：ZmPht1；5回交株系L-2的玉米植株的总干重、根干重、茎干重、总根长、根的磷吸收量、茎的磷吸收量及整株的磷吸收量的统计结果。
3、按照上述方法，将转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1替换为转基因阴性植株，其他步骤均不变，分别得到阴性对照的玉米植株的总干重、根干重、茎干重、总根长、根的磷吸收量、茎的磷吸收量及整株的磷吸收量的统计结果，作为对照。
实验结果见表1、表2和表3。
表1.自交株系L-1磷吸收量和干物重测定结果
表2.回交株系L-2磷吸收量和干物重测定结果
表3.自交株系L-1和回交株系L-2总根长测定结果
实验证明，本发明所提供的磷吸收相关蛋白ZmPht1；5及其编码基因能增加植物的磷吸收量。低磷条件下生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2的根的磷吸收量相比于对照分别增加了15.2％和26.9％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2茎的磷吸收量相比于对照分别增加了19.7％和29.9％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5的玉米自交株系L-1及回交株系L-2的植株总磷吸收量相比于对照分别增加了19.6％和27.0％；低磷条件下生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的根干重相比于对照分别增加了45.0％和58.5％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5-自交株系L-1和回交株系L-2中的茎干重相比于对照分别增加了13.7％和28.7％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5-自交株系L-1和回交株系L-2中的总干重相比于对照分别增加了16.4％和27.7％；生长至20天的转35S：：ZmPht1；5自交株系L-1和回交株系L-2中的总根长相比于对照分别增加了94.0％和39.5％。

Claims (10)

1.ZmPht1；5或所述ZmPht1；5相关的生物材料在X1)、X2)和/或X3)中的应用：
X1)调控植物磷吸收量；
X2)调控植物生物量；
X3)促进植物在低磷条件下对磷的吸收；
所述ZmPht1；5为a)或b)或c)：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与磷吸收相关的蛋白质；
所述ZmPht1；5相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码所述ZmPht1；5的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述生物量相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述生物量相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
3.权利要求1或2所述ZmPht1；5相关的生物材料或ZmPht1；5在培育磷吸收量增加、生物量增加和/或耐低磷的植物中的应用。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述磷吸收量为根的磷吸收量、茎的磷吸收量和/或植株总磷吸收量；所述生物量为根干重、茎干重、总干重和/或总根长。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为陆生植物；所述陆生植物为双子叶植物和/或单子叶植物。
6.一种培育转基因植物的方法，包括将权利要求1所述ZmPht1；5的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的磷吸收量、生物量和/或耐低磷性高于所述受体植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述ZmPht1；5的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述磷吸收量相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述磷吸收量相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述磷吸收量为根的磷吸收量、茎的磷吸收量和/或植株总磷吸收量；所述生物量为根干重、茎干重、总干重和/或总根长。
9.根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述受体植物为陆生植物。
10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述陆生植物为双子叶植物或单子叶植物。
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