CN105061569A - 一种与植物抗逆性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

一种与植物抗逆性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物低氮耐性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用。本发明的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物低氮耐性相关的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明提供的蛋白具有提高植物低氮耐性、低钾耐性和低磷耐性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

一种与植物抗逆性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及一种与植物抗逆性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。
背景技术
氮是一种在植物生长和发育中需求量最大的矿质营养元素，植物干物质和植株全氮中的含氮量分别为1.5％-2％和16％。元素氮对作物生长起着非常重要的作用，它是植物体内氨基酸的组成部分、是构成蛋白质的成分，也是植物进行光合作用起决定作用的叶绿素的组成部分。
20世纪下半叶，为了提高作物的生产率，主要高产作物对氮肥和其它营养的需求大幅提升，导致了全球氮肥用量提高了十倍。然而植物对氮肥的吸收利用远小于其施用量的一半，大部分的氮肥由于N2和NH3等气体的挥发以及硝化反硝化脱氮、淋溶等被浪费。而且氮肥现今已成为作物生产所需的最主要成本，还会在较大程度上影响农民的收入。因此如何让植物能更高效的利用氮肥成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，将其命名为SiMYB107蛋白。
本发明提供的SiMYB107蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中，序列表中序列2所示的氨基酸序列由315个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagⅡ 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述SiMYB107蛋白相关的生物材料。
本发明提供的与上述SiMYB107蛋白相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码上述SiMYB107蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1所示的核苷酸序列由948个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiMYB107蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiMYB107蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiMYB107蛋白且具有上述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码SiMYB107蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达SiMYB107蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动SiMYB107基因转录的启动子，还可包括终止SiMYB107基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述SiMYB107基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，SiMYB107蛋白的编码基因(即序列表中序列1的核苷酸)通过含有SiMYB107蛋白的编码基因的表达盒的重组载体SiMYB107-pBI121导入农杆菌GV3101中。所述重组载体SiMYB107-pBI121为用序列表中序列1所示的DNA分子插入pBI121载体的两个BamHI酶切位点之间得到的重组载体SiMYB107-pBI121，重组载体SiMYB107-pBI121表达SiMYB107蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了上述SiMYB107蛋白或与上述SiMYB107蛋白相关的生物材料的用途。
本发明提供了上述SiMYB107蛋白或与上述SiMYB107蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
本发明还提供了上述SiMYB107蛋白或与上述SiMYB107蛋白相关的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆性为低氮耐性和/或低钾耐性和/或低磷耐性。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥(Columbia-0亚型)。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述SiMYB107蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物抗逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述SiMYB107蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述抗逆性为低氮耐性和/或低钾耐性和/或低磷耐性，所述低氮耐性和/或低钾耐性和/或低磷耐性具体可体现为在低氮胁迫和/或低钾胁迫和/或低磷胁迫下，与受体植物相比：(1)转基因植物比受体植物的鲜重高；(2)转基因植物比受体植物的根表面积大；(3)转基因植物比受体植物的根长长。
上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥(Columbia-0亚型)。
在本发明的实施例中，所述SiMYB107蛋白的编码基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过含有SiMYB107基因表达盒的重组载体SiMYB107-pBI121导入农杆菌GV3101中。所述重组载体SiMYB107-pBI121为用序列表中序列1所示的DNA分子插入pBI121载体的两个BamHI酶切位点之间得到的重组载体SiMYB107-pBI121，重组载体SiMYB107-pBI121表达SiMYB107蛋白。
上述方法中，所述SiMYB107基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SiMYB107基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。
所述SiMYB107基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiMYB107基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码上述SiMYB107蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种与植物低营养耐性相关的SiMYB107蛋白及其相关生物材料与应用。通过实验证明：将SiMYB107基因超表达于拟南芥中，得到的转SiMYB107拟南芥在低氮胁迫处理下，根长、鲜重、根表面积均高于野生型拟南芥，在低钾或低磷胁迫处理下，根长高于野生型拟南芥。说明SiMYB107蛋白具有调控植物抗逆性的功能，尤其是提高植物的低氮耐性、低钾耐性和低磷耐性，为培育具有抗逆性的转基因植物的研究奠定基础。
附图说明
图1为野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥正常条件下和低氮条件下生长情况。图1A为野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥正常条件下的生长情况；图1B为野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥在低氮条件(0.2mM)下生长情况。其中，左边4株为野生型拟南芥，右边8株为T3代转SiMYB107拟南芥株系。
图2为正常条件和低氮条件下野生型和转SiMYB107拟南芥的鲜重比较。其中，WT为野生型拟南芥，OE1和OE2均为T3代转SiMYB107拟南芥。
图3为正常条件和低氮条件下野生型和转SiMYB107拟南芥的根系表面积比较。其中，WT为野生型拟南芥，OE1和OE2均为T3代转SiMYB107拟南芥。
图4为0.2mM低氮处理下SiMYB107在不同时间段的相对表达量。
图5为正常条件和低氮条件下野生型和转SiMYB107拟南芥的根长比较。其中，WT为野生型拟南芥，OE1和OE2均为T3代转SiMYB107拟南芥。
图6为正常条件和低钾处理条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥生长情况和根长。图6A为正常条件和低钾处理条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥生长情况；图6B为正常条件和低钾条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥根长比较。其中，左边4株为野生拟南芥，右边8株为T3代转SiMYB107拟南芥株系。
图7为正常条件和低磷处理条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥生长情况和根长比较。图7A为正常条件和低磷处理条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥生长情况；图7B为正常条件和低磷条件下野生型拟南芥和转SiMYB107拟南芥根长比较。其中，左边4株为野生拟南芥，右边8株为T3代转SiMYB107拟南芥株系。
图8为SiMYB107的亚细胞定位。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的谷子H214在文献“GuanqingJia,XuehuiHuang,HuiZhi，Ahaplotypemapofgenomicvariationsandgenome-wideassociationstudiesofagronomictraitsinfoxtailmillet，2013”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)在文献“KimH,HyunY,ParkJ,ParkM,KimM,KimH,LeeM,MoonJ,LeeI,KimJ.AgeneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughFVEinArabidopsisthaliana.NatureGenetics.2004,36:167-171”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的pJIT16318-GFP载体在文献“Zhao-ShiXu,Lan-QinXia,MingChen,Xian-GuoCheng,Rui-YueZhang,Lian-ChengLi,Yun-XiangZhao,YanLu,Zhi-YongNi,LiLiu,Zhi-GangQiu,You-ZhiMa.IsolationandmolecularcharacterizationoftheTriticumaestivumL.ethylene-responsivefactor1(TaERF1)thatincreasesmultiplestresstolerance.PlantMolecularBiology.2007,65:719-732”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的pBI121载体是TaKaRa公司的产品。
下述实施例中的0.2mM的低氮培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在营养液中的浓度为：NH4NO30.069mM，KNO30.063mM，18.49mMKCl，KH2PO41.25mM，CaCl2·2H2O3.0mM，MgSO41.5mM，KI5μM，H3BO30.1mM，MnSO4·H2O0.13mM，ZnSO4·7H2O0.03mM，Na2MoO4·2H2O1μM，CuSO4·5H2O0.1μM，CoCl2·6H2O0.1μM，FeSO4·7H2O0.1mM，Na2-EDTA·2H2O0.1mM，VB11.48μM，VB62.43μM，烟酸4.06μM，甘氨酸26.64μM，肌醇0.55mM。
下述实施例中的1mM的低氮培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在营养液中的浓度为：NH4NO30.34mM，KNO30.31mM，18.49mMKCl，KH2PO41.25mM，CaCl2·2H2O3.0mM，MgSO41.5mM，KI5μM，H3BO30.1mM，MnSO4·H2O0.13mM，ZnSO4·7H2O0.03mM，Na2MoO4·2H2O1μM，CuSO4·5H2O0.1μM，CoCl2·6H2O0.1μM，FeSO4·7H2O0.1mM，Na2-EDTA·2H2O0.1mM，VB11.48μM，VB62.43μM，烟酸4.06μM，甘氨酸26.64μM，肌醇0.55mM。
下述实施例中的5mM的低氮培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在营养液中的浓度为：NH4NO31.72mM，KNO31.57mM，18.49mMKCl，KH2PO41.25mM，CaCl2·2H2O3.0mM，MgSO41.5mM，KI5μM，H3BO30.1mM，MnSO4·H2O0.13mM，ZnSO4·7H2O0.03mM，Na2MoO4·2H2O1μM，CuSO4·5H2O0.1μM，CoCl2·6H2O0.1μM，FeSO4·7H2O0.1mM，Na2-EDTA·2H2O0.1mM，VB11.48μM，VB62.43μM，烟酸4.06μM，甘氨酸26.64μM，肌醇0.55mM。
下述实施例中的50μM低磷培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在营养液中的浓度为：NH4NO320.62mM，KNO318.79mM，KH2PO450μM，1.2mMKCl，CaCl2·2H2O3.0mM，MgSO41.5mM，KI5μM，H3BO30.1mM，MnSO4·H2O0.13mM，ZnSO4·7H2O0.03mM，Na2MoO4·2H2O1μM，CuSO4·5H2O0.1μM，CoCl2·6H2O0.1μM，FeSO4·7H2O0.1mM，Na2-EDTA·2H2O0.1mM，VB11.48μM，VB62.43μM，烟酸4.06μM，甘氨酸26.64μM，肌醇0.55mM。
下述实施例中的10μM低钾培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，各溶质在营养液中的浓度为:NH4NO328.76mM，KNO310μM，(NH4)2HPO41.25mM，CaCl2·2H2O3.0mM，MgSO41.5mM，KI5μM，H3BO30.1mM，MnSO4·H2O0.13mM，ZnSO4·7H2O0.03mM，Na2MoO4·2H2O1μM，CuSO4·5H2O0.1μM，CoCl2·6H2O0.1μM，FeSO4·7H2O0.1mM，Na2-EDTA·2H2O0.1mM，VB11.48μM，VB62.43μM，烟酸4.06μM，甘氨酸26.64μM，肌醇0.55mM。
实施例1、SiMYB107基因的获得
1、植物材料的处理
用0.2mM低氮培养基处理幼苗时期的谷子品种H214的幼苗48h。
2、RNA提取
提取经低氮培养液处理后的谷子品种H214的总RNA，以获得的RNA为模板，进行反转录得到cDNA。
3、PCR扩增
以步骤2中获得的cDNA为模板，采用引物F和R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F:5′-ATGGGGAGGTCGCCGTGCT-3′(序列3)；
R:5′-TCATAGTGGCAAGCTGCTGCTCTCT-3′(序列4)。
对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到大小为948bp的DNA片段。将其与从天根生化科技有限公司中购买的pEasyBlunt载体连接，得到重组质粒，并将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为948bp的扩增产物，将其命名为SiMYB107基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，SiMYB107基因编码的SiMYB107蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
实施例2、SiMYB107蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析
为了定位SiMYB107蛋白在植物细胞内位置，对SiMYB107蛋白进行了亚细胞定位分析。具体步骤如下：
1、以谷子H214的总RNA反转录产物为模板，采用基因特异引物PCR扩增SiMYB107基因全长CDS区，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
F:5′-ATGGGGAGGTCGCCGTGCT-3′；
R:5′-TCATAGTGGCAAGCTGCTGCTCTCT-3′
2、将PCR扩增产物与pJIT16318-GFP载体连接，得到pJIT16318-SiMYB107-GFP融合表达载体。
3、通过PEG法将pJIT16318-SiMYB107-GFP融合表达载体转化谷子叶片原生质体，用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
结果如图8所示：从图中可以看出：表明GFP阴性对照在原生质体细胞中普遍表达，而SiMYB107蛋白主要定位在细胞核中。
实施例3、SiMYB107基因在低氮胁迫条件下的表达模式分析
为了研究SiMYB107基因在低氮胁迫条件下的表达情况，采用荧光定量技术对谷子H214幼苗的SiMYB107基因在低氮胁迫条件下的表达量情况进行了分析，具体步骤如下：
1、选取谷子H214幼苗并对其进行低氮胁迫处理，低氮处理的方法：将谷子种子栽至营养土中，两周后将幼苗移至0.2mM的低氮培养基进行低氮处理。
2、分别在低氮处理0h、1h、6h、12h、24h和48h时取幼苗的叶片，并分别提取总RNA，反转录获得cDNA。
3、以步骤2获得的cDNA为模板，分别采用SiMYB107-F和SiMYB107-R、Si001873m.g-F和Si001873m.g-R引物，通过Real-timePCR对SiMYB107基因进行表达量检测。
定量分析方法采用比较CT法(△△CT)，以Si001873m.g基因为内参，未经处理的样品作为参照因子。经Si001873m.g基因均一化处理后，通过2-△△CT法计算SiMYB107基因表达量变化差异，以处理样本相对于未处理样本的倍数表示。
SiMYB107基因特异引物序列为：
SiMYB107-F:5′-AACTGAACGCCGCTTCATC-3′；
SiMYB107-R:5′-GCTGCTCTCTGCTAGCATGTC-3′；
Si001873m.g内参基因特异引物序列为：
Si001873m.g-F:5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′；
Si001873m.g-R:5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′。
结果如图4所示：在低氮胁迫处理后，SiMYB107基因表达量呈上升趋势，并在胁迫处理24h后达到顶峰，表明SiMYB107基因的表达受低氮胁迫诱导。
实施例4、转SiMYB107基因拟南芥的获得及抗逆性分析
一、植物过表达载体的构建
1、植物材料的处理及cDNA的获得
用0.2mM低氮培养基处理幼苗时期的谷子品种H214的幼苗48h。提取经低氮培养液处理后的谷子品种H214的总RNA，以获得的RNA为模板，进行反转录得到cDNA。
2、PCR扩增
以步骤1中获得的cDNA为模板，采用引物F和R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F:5′-ATGGGGAGGTCGCCGTGCT-3′；
R:5′-TCATAGTGGCAAGCTGCTGCTCTCT-3′
反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到大小为948bp的DNA片段。
3、重组表达载体的获得
用BamHI酶对pBI121载体和上述步骤2得到的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到重组载体SiMYB107-pBI121。并将所述重组载体进行测序验证。
测序结果表明：重组载体SiMYB107-pBI121为将pBI121载体的两个BamHI位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的SiMYB107基因，且保持pBI121载体的其他序列不变得到的重组载体。SiMYB107基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
4、重组菌的获得
采用农杆菌转化法将上述获得的重组载体SiMYB107-pBI121转化农杆菌GV3101(博迈德，CC3201)，得到重组菌SiMYB107-pBI121/GV3101；采用农杆菌转化法将上述获得的pBI121空载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌pBI121/GV3101。将上述重组菌进行菌液PCR鉴定。
经PCR鉴定表明：重组菌SiMYB107-pBI121/GV3101含有大小为948bp的DNA片段(SiMYB107基因)；重组菌pBI121/GV3101不含有大小为948bp的DNA片段。
二、转SiMYB107拟南芥的获得
采用农杆菌花序侵染的方法将重组菌SiMYB107-pBI121/GV3101转化拟南芥，经含MS+50mg/Lkana抗生素培养基筛选，共筛选出3株T0代转SiMYB107基因植株。将筛选出的阳性植株移栽至营养土中在温室进行培养，繁殖出的每代种子都在含有MS+50mg/Lkana抗生素培养基上进行筛选，直至繁殖得到T3代转SiMYB107拟南芥株系(OE1-OE3)。
按照上述方法将重组菌pBI121/GV3101转化拟南芥，得到转空载体拟南芥株系。
对得到的T3代转SiMYB107拟南芥植株进行PCR检测。具体步骤如下：
分别以T3代转SiMYB107拟南芥植株、转空载体拟南芥植株和野生型拟南芥植株的基因组DNA为模板，采用F:5′-AACTGAACGCCGCTTCATC-3和R:5′-GCTGCTCTCTGCTAGCATGTC-3′引物进行PCR扩增。
结果表明：3个不同的T3代转SiMYB107拟南芥株系均扩增得到了大小为948bp的片段，而用同样的引物对转空载体拟南芥植株和野生型拟南芥植株进行PCR检测，未得到上述扩增片段。选取T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3代转SiMYB107拟南芥株系OE2用于下述功能验证试验。
三、转SiMYB107拟南芥的低氮耐性分析
分别将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的种子经过70％酒精处理3min，然后加1ml无菌水洗三次，每次1min；用0.5％-0.8％的次氯酸钠处理10min-15min，无菌水清洗三次，每次1min；4℃春化2-3天后，分别将种子移到0.2mM、1mM和5mM的低氮培养基中培养(温度22℃、相对湿度65％、光照周期16h/8h)一周。
1、根长
将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2在不同浓度的低氮培养基中培养一周后，分别取野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2各4棵。分别测量根长。
结果如图1和图5所示：从图中可以看出：T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的根长明显长于野生型拟南芥(WT)。
2、鲜重
将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2在不同浓度的低氮培养基中培养一周后，分别取野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2各4棵。分别测量鲜重。
结果图2所示：从图中可以看出：T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的鲜重明显高于野生型拟南芥。
3、根表面积
将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2在不同浓度的低氮培养基中培养一周后，分别取野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2各4棵。分别测量根表面积。
结果如图3所示：从图中可以看出：T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的根表面积明显大于野生型拟南芥。
四、转SiMYB107拟南芥的低钾耐性分析
分别将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的种子经过70％酒精处理3min，然后加1ml无菌水洗三次，每次1min；用0.5％-0.8％的次氯酸钠处理10min-15min，无菌水清洗三次，每次1min；4℃春化2-3天后，分别将种子移到10uM低钾培养基中培养(温度22℃、相对湿度65％、光照周期16h/8h)一周。
将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2在低钾培养基中培养一周后，分别取野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2各4棵。分别测量根长。
结果如图6所示：从图中可以看出：T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的根长明显长于野生型拟南芥。
五、转SiMYB107拟南芥的低磷耐性分析
分别将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的种子经过70％酒精处理3min，然后加1ml无菌水洗三次，每次1min；用0.5％-0.8％的次氯酸钠处理10min-15min，无菌水清洗三次，每次1min；4℃春化2-3天后，分别将种子移到50uM低磷培养基中培养(温度22℃、相对湿度65％、光照周期16h/8h)一周。
将野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2在不同浓度的低磷培养基中培养一周后，分别取野生型拟南芥、T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2各4棵。分别测量根长。
结果如图7所示：从图中可以看出：T3代转SiMYB107拟南芥株系OE1和T3转SiMYB107拟南芥株系OE2的根长明显长于野生型拟南芥。
通过上述实验说明SiMYB107蛋白具有调控植物抗逆性的功能，尤其是提高植物的低氮耐性、低钾耐性和低磷耐性的功能。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性和/或低钾耐性和/或低磷耐性。
6.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为低氮耐性和/或低钾耐性和/或低磷耐性。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.扩增编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106699856A (zh) * 2017-01-09 2017-05-24 中国农业科学院作物科学研究所 抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用
CN107434824A (zh) * 2016-05-25 2017-12-05 北京大学 OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用
CN108893487A (zh) * 2018-07-19 2018-11-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
CN109305997A (zh) * 2017-07-27 2019-02-05 中国农业大学 OsRL7.1蛋白在调控植物根发育中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7345217B2 (en) * 1998-09-22 2008-03-18 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7345217B2 (en) * 1998-09-22 2008-03-18 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, YH 等: "The MYB transcription factor superfamily of arabidopsis: Expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family", 《PLANT MOLECULAR BIOLOGY》 *
GENBANK: "PREDICTED: Setaria italics transcription factor MYB39 (LOC101758451)，mRNA", 《GENBANK》 *
MEHANATHAN MUTHAMILARASAN 等: "Identification and Molecular Characterization of MYB Transcription Factor Superfamily in C4 Model Plant Foxtail Millet (Setaria italica L.)", 《PLOS ONE》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107434824A (zh) * 2016-05-25 2017-12-05 北京大学 OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用
CN107434824B (zh) * 2016-05-25 2019-08-20 北京大学 OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用
CN106699856A (zh) * 2017-01-09 2017-05-24 中国农业科学院作物科学研究所 抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用
CN106699856B (zh) * 2017-01-09 2020-09-29 中国农业科学院作物科学研究所 抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用
CN109305997A (zh) * 2017-07-27 2019-02-05 中国农业大学 OsRL7.1蛋白在调控植物根发育中的应用
CN109305997B (zh) * 2017-07-27 2021-08-10 中国农业大学 OsRL7.1蛋白在调控植物根发育中的应用
CN108893487A (zh) * 2018-07-19 2018-11-27 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法

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