CN104693296A - 抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白SiLNT1为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质。实验证明，本发明提供的抗逆相关蛋白SiLNT1能调控植物的抗逆性，可以用来提高植物的耐低氮性、抗盐性和抗旱性。

Description

抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、高盐和养分缺乏等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用。
本发明所提供的抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述抗逆相关蛋白的名称为SiLNT1，为如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有抗逆功能的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由237个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质SiLNT1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质SiLNT1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质SiLNT1的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述SiLNT1相关的生物材料。
本发明所提供的与所述SiLNT1相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，与所述SiLNT1相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
B1)编码所述SiLNT1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述与所述SiLNT1相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，B1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
a1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
a2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SiLNT1的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SiLNT1的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.1由714个核苷酸组成，SEQ ID No.1的核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiLNT1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiLNT1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiLNT1且具有SiLNT1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码SiLNT1的核酸分子的表达盒(SiLNT1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SiLNT1的DNA，该DNA不但可包括启动SiNF-YB8基因转录的启动子，还可包括终止SiLNT1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述SiLNT1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述与所述SiLNT1的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述与所述SiLNT1的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述与所述SiLNT1的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，SiLNT1的编码基因(即SEQ ID No.1的核苷酸)通过含有SiLNT1的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌GV3101中。所述重组载体为用SEQ ID No.1的核苷酸所示的DNA分子插入载体pBI121的BamHⅠ和SacI识别位点之间得到的重组载体pBI121-SiLNT1，pBI121-SiLNT1表达蛋白质SiLNT1。
上述与所述SiLNT1的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
上述与所述SiLNT1的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述植物逆境可为物理逆境和/或化学逆境。所述物理逆境可为干旱、热害、冷害、淹水、光辐射、机械损伤、电伤害或磁伤害；所述化学逆境可为养分缺乏、养分过剩、低pH、高pH、盐害、空气污染、农药污染或毒素；所述养分缺乏具体可为氮素缺乏。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述SiLNT1的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。
上述培育抗逆性转基因植物的方法中，所述SiLNT1的编码基因的编码序列是SEQID No.1的DNA分子。
在本发明的实施例中，所述SiLNT1的编码基因(即SEQ ID No.1的核苷酸)通过含有SiLNT1基因表达盒的SiLNT1基因重组表达载体导入所述受体植物中。
上述方法中，其中所述SiLNT1基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SiLNT1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述SiLNT1基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
上述方法中，所述SiLNT1的编码基因可为序列表中SEQ ID No.1的所示的DNA分子。
上述方法中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
上述方法中，所述植物逆境可为物理逆境和/或化学逆境。所述物理逆境可为干旱、热害、冷害、淹水、光辐射、机械损伤、电伤害或磁伤害；所述化学逆境可为养分缺乏、养分过剩、低pH、高pH、盐害、空气污染、农药污染或毒素；所述养分缺乏具体可为氮素缺乏。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiLNT1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述抗逆性具体可为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、两种或一种。所述耐低氮性具体可为苗期耐低氮。所述苗期耐低氮具体可体现为与受体植物相比，1)地上部分鲜重大于所述受体植株；2)总根长大于所述受体植株；3)地下部分鲜重大于所述受体植株。
实验证明，本发明的抗逆相关蛋白SiLNT1及其编码基因可以提高植物的耐低氮性、抗盐性和抗旱性。在低氮胁迫(总氮浓度为1mM)下，野生型植株、纯合转SiLNT1基因植株在表型上有显著差异，表现在拟南芥植株生长均受到一定抑制，纯合转SiLNT1基因拟南芥植株的主根长明显长于野生型拟南芥(图4)，侧根也比野生型拟南芥繁茂(图4)，低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的平均总根长是低氮野生型拟南芥总根长的1.5倍和1.4倍；拟南芥幼苗的地上部分鲜重和地下部分鲜重统计分析结果表明，低氮野生型拟南芥、低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的地上部分鲜重没有明显差异，而地下部分鲜重有显著性差异(图5中A和B)：低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的地下部分鲜重分别是低氮分别是低氮野生型拟南芥地下部分鲜重的3.0倍和2.8倍。说明SiLNT1或其相关生物材料可用于调控植物的抗逆性(如耐低氮性)。
附图说明
图1为SiLNT1基因在不同逆境胁迫下的转录水平表达模式。其中A为低氮处理的表达模式；B为100mM NaCl处理的表达模式；C为6％PEG6000处理的表达模式；D为100μM ABA处理的表达模式；E为100μM SA处理的表达模式；F为100μM GA处理的表达模式。
图2为SiLNT1基因在对照处理和低氮处理下的组织特异性表达分析。
图3为SiLNT1基因在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。其中A为GFP蛋白定位，B为SiLNT1蛋白定位。
图4为转SiLNT1基因植株的低氮胁迫表型鉴定。其中A为在MS固体培养基上培养10天的拟南芥幼苗的生长状态；B为在低氮培养基2上培养10天的拟南芥幼苗生长状态。
WT为野生型拟南芥；T3-4、T3-5：、两个T3代纯合转SiLNT1基因拟南芥株系。
图5为转SiLNT1基因植株在低氮胁迫下的根长及鲜重统计分析。其中A为植株地上部分鲜重的统计分析结果；B为植株地下部分鲜重的统计分析结果；C为植株总根长的统计分析结果。
WT为野生型拟南芥；T3-4、T3-5：、两个T3代纯合转SiLNT1基因拟南芥株系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)(KimH,Hyun Y,Park J,Park M,Kim M,Kim H,Lee M,Moon J,Lee I,Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。
下述实施例中的载体16318hGFP(Li ZY,Xu ZS,He GY,Yang GX,Chen M,LiLC,Ma YZ.(2012)Overexpression of soybean GmCBL1 enhances abiotic stresstolerance and promotes hypocotyl elongation in Arabidopsis.Biochem BiophysRes Commun，427:731-736.)。
下述实施例中的载体pBI121(Li ZY,Xu ZS,He GY,Yang GX,Chen M,Li LC,Ma YZ.(2012)Overexpression of soybean GmCBL1 enhances abiotic stresstolerance and promotes hypocotyl elongation in Arabidopsis.Biochem BiophysRes Commun，427:731-736.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的根癌农杆菌GV3101(高建强,梁华,赵军.植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展，中国农学通报，2010，2(16)：22-25)，公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的谷子具体为龙谷25，由中国农业科学院作物科学研究所刁现民研究员实验室提供，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。龙谷25在下文中简称谷子。
下述实施例中所用的培养基如下：
低氮培养基1：溶质及其浓度为：MSN粉0.78g/L，N+母液(0.05mol/L)1ml/L，K+母液(1.8767mol/L)10ml/L，盐酸硫胺素(维生素B1)1mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)1mg/L，甘氨酸1mg/L，烟酸1mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30.00g/L，植物凝胶2g/L；溶剂为蒸馏水；pH5.9。其中N+母液：溶质及其浓度为：1.36g/L NH4NO3，3.33g/LKNO3，溶剂为水，pH自然。K+母液：溶质及其浓度为139.908g/L KCl，溶剂为水，pH自然。
低氮培养基2：溶质及其浓度为NH4NO340mg/L，KCl 1400mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，KI 0.8mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，ⅣB烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；溶剂为蒸馏水；pH5.9。
实施例1、谷子抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的克隆
1、谷子抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的克隆
本发明的申请人从谷子中分离克隆出谷子抗逆相关蛋白SiLNT1的编码基因。具体方法如下：
1.1、样品处理及RNA提取
1.1.1、将在光照培养箱(光照培养箱条件设定为：温度22℃，湿度65％，光照周期16h/8h，光照强度40-60μmol/m2.s-1)低氮培养基1上生长10d的谷子幼苗取出并洗去营养土，取整株植株作为实验材料。用植物总RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取该谷子幼苗整株的RNA，得到低氮10d RNA。
按照上述方法，将10d分别替换为12d和14d，其它步骤均不变，分别得到低氮12d RNA和低氮14d RNA。
1.1.2、将在光照培养箱(光照培养箱条件设定为：温度22℃，湿度65％，光照周期16h/8h，光照强度40-60μmol/m2.s-1)MS培养基上生长10d的谷子幼苗取出并洗去营养土，取整株植株作为实验材料。用植物总RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取该谷子幼苗整株的RNA，得到MS 10d RNA。
按照上述方法，将10d分别替换为12d和14d，其它步骤均不变，分别得到MS 12dRNA和MS 14d RNA。
使用U1trospec 3000型紫外分光光度计(Amersham Biosciences)测定提取的RNA在260nm(OD260)和280nm(OD280)波长的吸光度值以确定RNA的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在1μg/μl以上，OD260/OD280的比值在1.8—2.0之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。
1.2、文库的构建及Solexa测序
提取到质量合格的RNA后，建立文库。将低氮10d RNA、低氮12d RNA和低氮14dRNA各取5μg等量混合，总共15μg用来构建低氮处理RNA测序库。同样，将MS 10dRNA、MS 12d RNA和MS 14d RNA各取5μg等量混合成15μg，用来构建正常(MS)处理RNA测序库。构建好的文库采用Illumina公司新一代高通量测序仪HiSeq 2000测序(北京华大基因研究中心)。比较低氮处理RNA测序库和MS处理RNA测序库间基因表达的差异，筛选出测序结果中对于低氮胁迫呈上调趋势的基因，将其中一个呈上调趋势的基因命名为SiLNT1基因。
SiLNT1基因全长为714bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的蛋白命名为SiLNT1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，由237个氨基酸残基组成。SiLNT1蛋白分子量为26.1kD，pI＝8.67。
实施例2、抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达模式和组织特异性分析
1、抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因在不同逆境胁迫下的转录水平表达模式
1.1、低氮诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将在MS培养基上培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，转移至低氮培养基1培养1d，提取谷子幼苗植株的总RNA，提取得到的RNA命名为低氮1d RNA。
按照上述方法，将1d分别替换为2d、5d和10d，其它步骤均不变，分别得到低氮2d RNA、低氮5d RNA和低氮10d RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中A)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因在低氮条件下，一直被诱导表达，SiLNT1基因的相对表达量在低氮诱导5d达到最大值，随后下降：SiLNT1基因在低氮诱导1d时的相对表达量为1.9，在低氮诱导2d时的相对表达量为3，在低氮诱导5d时的相对表达量为5.2，在低氮诱导10d时的相对表达量为2.3。
1.2、高盐诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将在MS培养基培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于100mM的氯化钠水溶液中，培养1h，提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为氯化钠处理1h RNA。
按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到氯化钠处理6h RNA、氯化钠处理12h RNA和氯化钠处理24h RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中B)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因在氯化钠模拟的高盐环境下，一直被诱导表达，SiLNT1基因的相对表达量在氯化钠模拟的高盐环境诱导6h达到最大值，随后下降：SiLNT1基因在氯化钠模拟的高盐环境诱导1h时的相对表达量为4，在氯化钠模拟的高盐环境诱导6h时的相对表达量为4.5，在氯化钠模拟的高盐环境诱导12h时的相对表达量为3.6，在氯化钠模拟的高盐环境诱导24h时的相对表达量为2.0。
1.3、干旱诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将在MS培养基培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于6％的PEG6000水溶液中，培养1h，提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为干旱处理1h RNA。
按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到干旱处理6h RNA、干旱处理12h RNA和干旱处理24h RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中C)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因在PEG6000模拟的干旱环境下，一直被诱导表达，SiLNT1基因的相对表达量在PEG6000模拟的干旱环境诱导24h达到最大值：SiLNT1基因在PEG6000模拟的干旱环境诱导1h时的相对表达量为1.4，在PEG6000模拟的干旱环境诱导6h时的相对表达量为1.7，在PEG6000模拟的干旱环境诱导12h时的相对表达量为1.75，在PEG6000模拟的干旱环境诱导24h时的相对表达量为2。
1.4、脱落酸诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将在MS培养基培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于100μM的ABA水溶液中，培养1h，提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为脱落酸处理1h RNA。
按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到脱落酸处理6h RNA、脱落酸处理12h RNA和脱落酸处理24h RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中D)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因的相对表达量在脱落酸诱导24h达到最大值：SiLNT1基因在脱落酸诱导1h时的相对表达量为0.95，在脱落酸诱导6h时的相对表达量为1.2，在脱落酸诱导12h时的相对表达量为1.3，在脱落酸诱导24h时的相对表达量为1.4。
1.5、水杨酸诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
将在MS培养基培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于100μM的SA水溶液中，培养1h，提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为水杨酸处理1h RNA。
按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到水杨酸处理6h RNA、水杨酸处理12h RNA和水杨酸处理24h RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中E)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因对于水杨酸处理的响应并不明显。
1.6、赤霉素诱导抗逆相关蛋白SiLNT1编码基因的表达
将在MS培养基培养3d的谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于100μM的GA水溶液中，培养1h，提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为赤霉素处理1h RNA。
按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h和24h，其它步骤均不变，分别得到赤霉素处理6h RNA、赤霉素处理12h RNA和赤霉素处理24h RNA。
提取在MS培养基培养3d的谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中F)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果表明，SiLNT1基因对于赤霉素处理的响应并不明显。
上述1.1-1.6的处理进行实时荧光定量的方法均相同。Real-time PCR反应使用Real Master Mix Plus(SYBR Green)试剂盒(天根生化科技有限公司)。Real-time PCR反应体系为：
扩增程序为：95℃15min；95℃10s，58℃20s，72℃20s，40个循环；72℃5min。
2、SiLNT1基因的组织特异性表达分析
用植物总RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取在低氮培养基1培养3天的谷子幼苗的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA(光照培养箱条件设定为：温度22℃，湿度65％，光照周期16h/8h，光照强度40-60μmol/m2.s-1)，分别得到低氮根组织的RNA、低氮茎组织的RNA和低氮叶片组织的RNA。
按照上述方法，将低氮培养基1替换为MS培养基，其它步骤均不变，分别得到MS根组织的RNA、MS茎组织的RNA和MS叶片组织的RNA。
对上述RNA中的SiLNT1编码基因的表达量进行定量分析(图1中D)，引物为5’-TCCTGAACACAAAGCAGCA-3’和5’-CTCGGGTGATAGTGGCGA-3’，内参为谷子Actin(Si001873m.g)，内参的引物为5′-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3′和5′-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3′)。结果如图2所示。
结果表明，SiLNT1在MS培养基培养的谷子根组织的相对表达量为5.0，在低氮培养基1培养的谷子根组织的相对表达量为8.2，在MS培养基培养的谷子茎组织的相对表达量为1.0，在低氮培养基1培养的谷子茎组织的相对表达量为1.0，在MS培养基培养的谷子叶片组织的相对表达量为2.0，在低氮培养基1培养的谷子叶片组织的相对表达量为2.2。表明SiLNT1基因主要在谷子的根部发挥功能。
实施例2、SiLNT1基因在野生型拟南芥原生质体中的亚细胞定位
将载体16318hGFP用BamH1单酶切，插入核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，保持载体16318hGFP的其它序列不变得到SiLNT1基因表达载体，其名称为16318hGFP-SiLNT1。16318hGFP-SiLNT1表达SEQ ID No.2所示的蛋白质SiLNT1。16318hGFP-SiLNT1中，SiLNT1基因的插入方向与GFP阅读框一致。
将重组表达质粒16318hGFP-SiLNT1通过瞬时转染法导入野生型拟南芥原生质体中，室温条件下培养过夜。
按照上述方法，将重组表达质粒16318hGFP-SiLNT1替换为空载体质粒(即质粒16318hGFP)，其它均相同。
使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察野生型拟南芥原生质体内的绿色荧光信号。实验结果表明GFP蛋白定位在细胞膜、细胞质、细胞核(图3中A)中，SiLNT1蛋白定位于细胞核及细胞膜上(图3中B)。
实施例3、转SiLNT1基因拟南芥植株的获得和抗逆性鉴定
1、表达载体pBI121-SiLNT1的构建
将载体pBI121用BamHI和SacI双酶切，插入核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，保持载体pBI121的其它序列不变得到SiLNT1基因表达载体，其名称为pBI121-SiLNT1。pBI121-SiLNT1表达SEQ ID No.2所示的蛋白质SiLNT1。pBI121-SiLNT1中，SiLNT1基因的插入方向与CaMV35S启动子方向一致。
2、转SiLNT1基因拟南芥植株的获得
将实施例3步骤1得到的质粒pBI121-SiLNT1转入根癌农杆菌GV3101，得到含有质粒pBI121-SiLNT1的重组农杆菌GV3101/pBI121-SiLNT1；将空载体质粒pBI121转入农杆菌GV3101，得到含有质粒pBI121的重组农杆菌GV3101/pBI121。
2.1、拟南芥的培养与侵染：将野生型拟南芥种子用灭菌水(含有10％(体积百分含量)次氯酸钠和10％(体积百分含量)吐温-20的水溶液)摇动消毒15min，在超净工作台中用灭菌水清洗上述消毒的种子至少5次。将清洗完的种子均匀播种在MS培养基上。MS平板于4℃春化3天，然后置于22℃光照培养箱培养一周。待小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养，保湿2-3天。拟南芥的生长对温度比较敏感，20-22℃为比较适宜的培养温度。当野生型拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花状态时，用重组农杆菌GV3101/pBI121-SiLNT1进行农杆菌侵染。将侵染过的拟南芥平放于托盘中，黑暗保湿培养24h，然后放于正常培养条件下培养。拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转化效率，收集转染植株的种子，得到T0代转pBI121-SiLNT1拟南芥种子。
2.2、阳性转SiLNT1基因拟南芥的鉴定：将2.1的T0代转pBI121-SiLNT1拟南芥种子，于37℃烘箱中烘干(6-8天)，然后4℃春化3天。将种子直接撒播在营养钵中，22℃保湿培养1周。待小苗长出4片真叶后，移植在营养土里。CTAB法提取T0代转pBI121-SiLNT1拟南芥植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以基因特异性引物LNT1F：ATGCTCCCTCCTCATCTCAC和LNT1R：GATCGCCACTATCACCCG进行PCR扩增，得到PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,含有目的条带(714bp)的初筛阳性T0代转pBI121-SiLNT1拟南芥植株即为T0阳性转SiLNT1基因拟南芥植株。野生型拟南芥进行上述鉴定实验无目的条带。
用上述方法鉴定T0阳性转SiLNT1基因拟南芥的后代，直至获得T3代纯合转SiLNT1基因拟南芥的种子。
3、转SiLNT1基因拟南芥的抗逆性鉴定
实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
将步骤2的野生型拟南芥(WT)、和两个T3代纯合转SiLNT1基因拟南芥株系(T3-4和T3-5)的种子播种到培养土中，分别在22℃，12h光照下MS固体培养基和低氮培养基2上培养，分别得到MS野生型拟南芥、MS T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥、MS T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥、低氮野生型拟南芥、低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥。
每个株系随机选取9株生长至15天的拟南芥植株，对各拟南芥植株的地上部分鲜重和地下部分鲜重进行统计分析，使用WinRHIZO根系扫描分析仪分析上述幼苗的主根长及总根长的差异。
结果表明(图4和图5)，MS野生型拟南芥、MS T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和MS T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥在表型上没有明显差异；低氮野生型拟南芥、低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥在表型上有显著差异，表现在拟南芥植株生长均受到一定抑制，两个低氮T3代纯合转SiLNT1基因拟南芥株系(T3-4和T3-5)植株的主根长明显长于野生型拟南芥(图4)，侧根也比野生型拟南芥繁茂(图4)，低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的总根长分别是低氮野生型拟南芥总根长的1.5倍和1.4倍；拟南芥幼苗的地上部分鲜重和地下部分鲜重统计分析结果表明，MS野生型拟南芥、MST3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和MS T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的地上部分鲜重和地下部分鲜重没有明显差异(图5中A和B)；低氮野生型拟南芥、低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的地上部分鲜重没有明显差异，而地下部分鲜重有显著性差异(图5中A和B)：低氮T3-4纯合转SiLNT1基因拟南芥和低氮T3-5纯合转SiLNT1基因拟南芥的地下部分鲜重分别是低氮野生型拟南芥地下部分鲜重的3.0倍和2.8倍。说明SiLNT1或其编码基因可用于调控植物的耐低氮性。

Claims (10)

1.抗逆相关蛋白SiLNT1在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆相关蛋白SiLNT1为a)或b)或c)：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。
2.与权利要求1所述抗逆相关蛋白SiLNT1相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
所述与权利要求1所述抗逆相关蛋白SiLNT1相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述抗逆相关蛋白SiLNT1的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述植物为陆生植物。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、两种或一种。
6.一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述抗逆相关蛋白的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述抗逆相关蛋白SiLNT1的编码基因的编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、两种或一种。
9.根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述受体植物为陆生植物。
10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述陆生植物为双子叶植物和/或单子叶植物。
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