CN107434824A - OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。本发明的OsTGA10蛋白,是如下a)或b)或c)的蛋白质:a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明:水稻ostga10突变体雄蕊成熟花粉数目降低,说明OsTGA10基因可以调控植物的育性,在农业生产中的育种、产种过程中获得雄性不育系,特别是具有创造人工可控制雄性不育以及创造转基因生物安全的受体材料上具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及OsTGA10蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。
背景技术
植物雄配子体花粉的形成包括小孢子的发生和雄配子的形成两个过程。小孢子的发生这一过程都在幼小的花药中进行,包括小孢子母细胞的形成,减数分裂过程以及四分体的分散过程。雄配子体即花粉粒是小孢子经过两次有丝分裂形成的,其中包含被称作雄配子的精细胞。在花粉发育的这一系列过程中涉及到众多相关基因,只有他们按照一定的时空顺序正常表达,才能保证可育花粉的形成。
我国的雄性不育研究和利用在国际上处于领先地位。近年来应用现代细胞生物学技术、遗传学和分子生物学手段对模式植物水稻和拟南芥的雄性不育过程做了深入的研究,取得了一些新的研究结果,如:拟南芥中的Ems1、CER1、AtGSL2基因和水稻UDT1、MSP1、GAMYB、UDPG、WDA1基因等,上述基因的突变直接导致了植株的育性降低,有的完全不育。Ems1编码一个受体激酶基因,该基因主要参与花粉母细胞、绒毡层的发育;UDT1基因是小孢子发育的关键基因,该基因主要作用于减数分裂时期,它对于绒毡层细胞的发育、小孢子母细胞的减数分裂以及中层的降解起作用;GAMYB基因对于小孢子母细胞紧贴绒毡层细胞吸收营养进而进行正常的减数分裂是必需的;WDA1基因对于水稻花粉壁蜡质层形成是必需的。对它们的研究加深了对植物雄性不育机理的理解。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质:
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中,序列2由523个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化,可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述c)中的蛋白质,所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的第二个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种:
A1)编码上述蛋白质的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述相关生物材料中,A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子;
2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码权利要求8所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交,且编码权利要求8所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
其中,序列1由1572个核苷酸组成,编码序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸,只要编码上述蛋白质且具有相同功能,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75%或75%以上同一性,可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
上述生物材料中,所述严格条件是在2×SSC,0.1%SDS的溶液中,在68℃下杂交并洗膜2次,每次5min,又于0.5×SSC,0.1%SDS的溶液中,在68℃下杂交并洗膜2次,每次15min;或,0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
本发明的第三个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在如下(1)-(6)中至少一种中的应用:
(1)调控植物育性;
(2)调控植物结实率;
(3)调控植物花粉发育;
(4)调控植物药室发育;
(5)培育育性降低或者培育不育的转基因植物;
(6)培育育性提高的转基因植物。
本发明的第四个目的是提供抑制上述蛋白质表达的物质的新用途。
本发明提供了抑制上述蛋白质表达的物质在培育育性降低或者培育不育的转基因植物中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种培育育性降低或者培育不育的植物的方法。
本发明提供的培育育性降低或者培育不育的植物的方法包括如下步骤:抑制出发植物中上述蛋白质表达,得到目的植物,所述目的植物的育性低于所述出发植物。
上述应用或上述方法中,所述植物为单子叶植物或双子叶植物;所述单子叶植物为水稻。
本发明利用T-DNA插入抑制了水稻体内OsTGA10基因表达,得到水稻ostga10突变体,通过实验证明:水稻ostga10突变体雄蕊成熟花粉数目降低,说明OsTGA10基因可以调控植物的育性,在农业生产中的育种、产种过程中获得雄性不育系,特别是具有创造人工可控制雄性不育以及创造转基因生物安全的受体材料上具有重要的应用前景。
附图说明
图1为OsTGA10的基因结构及T-DNA的插入位置示意图。
图2为突变体基因型鉴定示意图。
图3为突变体基因型鉴定电泳图。其中,#6/14/16为纯合体,#17为野生型,其余13株为杂合体。
图4为ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的形态图。
图5为ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的育性统计。
图6为ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的OsTGA10基因表达量检测。
图7为I-KI染色法观察ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊育性。图7B为野生型与ostga10结种后穗子比较(Bar=10cm);图7C为野生型体视镜下解剖的小花结构及花粉的I2-KI染色(Bar=500μm);图7D为ostga10的解剖小花和花粉的I2-KI染色(Bar=500μm)。
图8为ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊形态比较。图8A为野生型与ostga10突变体花外观形态比较(Bar=1mm);图8B为野生型的花药(Bar=200μm);图8C为ostga10的花药(Bar=200μm);图8D为扫描电镜下野生型的花药(Bar=200μm);图8E为扫描电镜下ostga10的花药(Bar=200μm)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、突变体水稻及OsTGA10基因的获得
一、突变体水稻及OsTGA10基因的获得
ostga10突变体购自韩国Postech水稻突变体库(ostga10突变体的种子编号或标号:2A-10206L(韩国)),是一个T-DNA插入突变体。经过测序表明:ostga10突变体T-DNA插入在某一候选基因的第5个内含子区域A(图1)。与野生型水稻(日本晴)相比,ostga10突变体为仅在某一候选基因的第5个内含子区域的位置发生T-DNA插入,其余序列与野生型水稻(日本晴)全部相同。将此结果重复验证,发现其他ostga10突变体也均都发生上述突变。将上述发生突变的候选基因命名为OsTGA10基因,其核苷酸序列如序列表中序列1,该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
二、突变体水稻基因型鉴定
1、PCR扩增
以野生型水稻(日本晴)植株和ostga10突变体水稻植株的基因组DNA为模板,分别采用2A-10206L-LP/2715-LB_BP和2A-10206L-LP/2A-10206L-RP引物进行PCR扩增,分别得到PCR扩增产物。野生型水稻(日本晴)植株和ostga10突变体水稻植株共17株,将其依次编号为#1-#17。引物序列如下:
2A-10206L-LP:ATTGATTTGGCAGGGAGAGA;
2A-10206L-RP:ACCCCCTGCACCATGTATAG;
2715-LB_BP:ACGTCCGCAATGTGTTATTAA。
PCR反应体系(50ul):2xKOD Mix 10ul、基因组DNA 2ul、10uM上游引物1ul、10uM下游引物1ul、KODase 1ul、ddH2O补足20ul。
PCR反应条件:95℃5’;94℃30”,58℃30”,68℃40”,24cycles;68℃10’。
2、向上述步骤1获得的PCR产物中加5ul(10X)loading buffer,用2%琼脂糖凝胶电泳方法鉴定PCR产物,鉴定方法如表1所示。
2A-10206L-LP/2715-LB_BP | 2A-10206L-LP/2A-10206L-RP | |
野生型 | 无条带 | 有条带 |
杂合ostga10突变体 | 有条带 | 有条带 |
纯合ostga10突变体 | 有条带 | 无条带 |
鉴定结果如图3所示,#6/14/16为纯合ostga10突变体,#17为野生型,其余13株为杂合ostga10突变体。
实施例2、突变体株系的表型鉴定
对实施例1中的经PCR鉴定的纯合ostga10突变体和野生型水稻植株的表型进行鉴定。具体步骤如下:
一、结实率检测
纯合ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)在营养生长阶段与野生型不存在差异,植株株高和分蘖数并没有变化(图4)。但在生殖生长阶段,野生型水稻植株每个小穗正常结实,结实率达90%;而纯合ostga10突变体的开花时间正常,但最终每个小穗的结实率极低,只有2%左右最终形成种子(图5)。
二、OsTGA10基因表达量检测
1、PCR扩增
对纯合ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)中OsTGA10的表达水平进行检测。具体步骤如下:分别以纯合ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的基因组DNA为模板,分别采用如下三对引物:OsTGA10-1-F/OsTGA10-1-R(P390-1,位于T-DNA插入位点前)、OsTGA10-2-F/OsTGA10-2-R(P390-2,横跨插入位点)、OsTGA10-1-F/OsTGA10-1-R(P390-3,位于插入位点后)进行PCR扩增,分别得到PCR扩增产物。引物序列如下:
OsTGA10-1-F:CGTCATCGTCTTCCTCTT;
OsTGA10-1-R:GGTCTGCCTTTGTTCTTG;
OsTGA10-2-F:GGTGTATCTACTGGTGAAC;
OsTGA10-2-R:GATGTAAGCCTTCTTCCTT;
OsTGA10-3-F:CTCTACCAGTCGCTCTCC;
OsTGA10-3-R:ATCTGGCCCATGTAGTTG。
2、OsTGA10基因表达量检测
检测结果如图6所示,从图6中可以看出,P390-1引物在纯合ostga10突变体中能够扩增出与野生型相当的扩增产物,P390-2和P390-3引物在纯合ostga10突变体中无扩增产物或极少扩增产物,说明T-DNA影响纯合ostga10突变体中的OsTGA10完整CDS的产生,因而无完整的OsTGA10蛋白。
三、雄蕊的染色观察
用I2-KI对纯合ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)花粉进行染色,并观察花粉形态。I-KI染色方法如下:1、配I2-KI染液:0.5g KI溶于1.25mL去离子水,加入0.25g碘片,再稀释至75mL,避光保存;2、取花粉期小花,在体视镜下解剖出花药,滴加I2-KI溶液,快速捣碎花药释花粉,显微镜下观察花粉并拍照。
染色结果如图7所示,从图7中可以看出,野生型水稻的成熟花粉由于充满淀粉和其它代谢物,容易被染成深色,花粉呈圆形;而ostga10突变体中88%花粉不能被染成深色,花粉形态不规则、干瘪、发育不正常,说明ostga10突变体的花粉发育受到影响。
四、雄蕊的扫描电镜观察
对纯合ostga10突变体(OsTGA10)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊进行扫描电镜观察。
结果如图8所示,从图8中可以看出,野生型花药的远轴侧药室体积较近轴侧偏大,4个药室都呈饱满的圆柱体状结构;ostga10突变体花药的远轴侧药室也是圆柱立体状,但并不像野生型饱满,近轴侧2个药室发育状态明显不如野生型,明显收缩,呈薄状组织结构,推测是药室发育停滞所导致。扫描电镜结果更清楚地说明ostga10突变体具有不正常发育的近轴侧药室,从而导致花粉育性下降。
Claims (6)
1.蛋白质,是如下a)或b)或c)的蛋白质:
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料,为下述A1)至A12)中的任一种:
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料,其特征在于:A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子;
2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码权利要求8所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交,且编码权利要求8所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在如下(1)-(6)中至少一种中的应用:
(1)调控植物育性;
(2)调控植物结实率;
(3)调控植物花粉发育;
(4)调控植物药室发育;
(5)培育育性降低或者培育不育的转基因植物;
(6)培育育性提高的转基因植物。
5.抑制权利要求1所述的蛋白质表达的物质在培育育性降低或者培育不育的转基因植物中的应用。
6.一种培育育性降低或者培育不育的植物的方法,包括如下步骤:抑制出发植物中权利要求1所述的蛋白质表达,得到目的植物,所述目的植物的育性低于所述出发植物。
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CN107434824B (zh) | 2019-08-20 |
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