CN101478869A - 用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统以及在检测和选择过程中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统，所述系统包括两个遗传控制元件的组合，分别是：以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)和以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，条件是所述第一遗传控制元件已经被人工插入进所述双子叶植物。上述系统使得双子叶植物的花的性别能够被控制和/或修饰。

Description

用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统以及在检测和选择过程中的应用

发明领域

本发明涉及植物品种的选择特别涉及植物性别类型(type sexuel)的选择。其涉及通过分析基因A的多态性进行植物性别的基因型检测，以及用于实施这种检测的手段和用于产生性别表型已经被修饰的植物的方法。

背景技术

生产杂交植物在农艺和农业中是非常令人感兴趣的。事实上，得益于称为杂种优势的现象，杂交植物与亲本双方的平均值相比，在很多性状上具有优势。这种优势可以用例如与其亲本相比更强的活力、更高的收获、对培养杂交株的环境更强的适应性以及杂交株的高度一致性来说明。这种杂种优势在亲本的遗传学差异很大时更为明显。

产生作为杂交株的未来亲本的纯并且稳定的植物品系是产生表达最大杂种优势的均一并且可再生的杂交品种的一个必要条件。因此需要产生纯并且稳定的植物品系，然后将这些品系进行杂交以获得杂交株。

产生纯植物品系涉及植物的自交以获得具有共同基因遗传物质、确定的整体预期生产性状、产量规律或疾病抗性的植物。

为了产生纯的植物品系，需要用允许自交的性别类型的植物，例如两性植物。

然而，许多双子叶植物，特别是葫芦科植物，可能是雌雄同体

雄性两性同体

全雌性

或两性(hermaphrodites)植物。

用于产生纯植物品系的第一种实施技术包括对植物进行化学处理从而获得具有自交能力的植物，例如两性植物。例如对于瓜类(甜瓜(cucumismelo))，喷洒乙烯合成抑制剂例如硝酸银或硫代硫酸银使得雌花中短暂出现雄蕊(Rudich et al.，1969；Risser et al.，1979)。通过此方式，将全雌性植物转变为两性植物以维持纯品系。

然而，用这种方法产生纯品系受限于化学试剂的高成本及其持续性和植物毒性作用。另外，对于从花期持续很长的植物产生杂交体来说这些试剂可能是无效的，因为在处理之后出现的新花可能不受所述化学处理影响。

因此需要能够控制双子叶植物花类型发育的系统，并获得具有确定花类型(type floral)的植物。

另外，从纯品系开始，需要进行很多步杂交育种以获得感兴趣的杂交株，并且在每一步杂交育种中，需要保留具有最有希望的表型的植物。

当在纯品系间进行育种时，必须能够选择实现育种的途径，从而避免会导致植物丧失所希望的杂种优势的植物自花授粉。

同样地，由于双子叶植物的性别类型多样性，必须分离同一植物的雄花和雌花以避免自花授粉。

第一种方法，特别是用于玉米的方法，包括使用机械装置以实现植物去雄。然而，这种方法非常昂贵，因为每一次杂交育种都需要对每一株需要避免自花授粉的植物去雄。

另一种方法包括对植物进行化学去雄，阻止可育花粉的形成。因此，在瓜类(甜瓜)中，用乙烯利(乙烯前体)处理雌雄同体植物导致雄花暂时消失。

这些用于引起暂时性雄性不育的化学试剂(称为去雄剂)有一些缺点，例如高成本或高毒性，如前面已经提到的。

因此可以看到上文描述的用于控制花类型的机械或化学方法非常昂贵，与此对应的是需要进行非常大量杂交以获得具有所期望特征并适于商业化的杂交植物。

为了有助于产生纯的杂交品系，因此需要能够控制对双子叶植物花类型发育的系统，从而获得具有确定花类型的植物。

另一种获得能够自花授粉并用于产生纯品系植物或获得不能自花授粉以产生杂交株植物的方法可以分别包括在一个物种中仅选择两性个体或仅选择雌性个体。然而，这种方法同样是非常昂贵的，因为其需要培养大量植物，直到可以确定其性别类型。另外，这种方法也是不确定的，因为确定花性别的机制特别依赖于环境因素。

因此也需要能够选择双子叶植物例如两性植物或雌性植物，而不需要对其进行培养的方法。

这种方法应当能够选择植物，特别是选择用于产生纯的或杂交品系的植物，如上文所述。

发明概述

本发明提供了能够控制双子叶植物花类型发育的系统。本发明人示出两个都具有至少两个等位基因的遗传控制元件(A/a)和(G/g)参与控制葫芦科(cucurbitacées)中的性别决定机制，其中(A)和(a)是第一遗传元件，(G)和(g)是第二遗传元件。

本发明人还示出在生理水平上，两个等位基因(A)和(a)通过一个新蛋白质的不同比率而彼此区别。

因此本发明的一个目的是提供用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统，所述系统包括两个遗传控制元件的组合，其分别为：

-以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)，其中：

-所述显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，所述核酸包括：

(i)在双子叶植物中发挥功能的调节多核苷酸(PA)，和

(ii)表达被所述调节多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质，

-所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因(A)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或

(ii)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，或

(iii)编码非活性ACCS蛋白质的核酸，或

(iv)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)和编码非活性ACCS蛋白质的核酸，和

-以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，其中：

-所述显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，所述核酸的表达引起雄性两性同体或雌雄同体植物的发育，和

-所述隐性等位基因(g)与所述显性等位基因(G)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或

(ii)在双子叶植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表达引起两性或全雌性植物的发育，

条件是所述第一遗传控制元件已经被人工插入进所述双子叶植物。

本发明一个进一步的目的是提供这种调节多核苷酸(PA)和(Pa)。

本发明还涉及用于产生转化植物的方法，所述植物性表型和各个部分特别是其种子已经被修饰。

本发明另一个目的是提供在下文中详细限定的ACCS蛋白质或所述蛋白的片段，以及针对ACCS蛋白质的抗体。

本发明还涉及在样品中检测所述等位基因(A)和(a)存在的方法。

发明详述

本发明人示出两个都具有至少两个等位基因的遗传控制元件(A/a)和(G/g)参与控制葫芦科中的性别决定机制，其中(A)和(a)是第一遗传元件，(G)和(g)是第二遗传元件。

本发明人证明了等位基因(A)控制植物的雄性两性同体性状，等位基因(G)控制植物的全雌性性状，如下表1所示。

表1

 

表型	基因型	花类型
			雌雄同体	AAGG或Aa GG	雄性和雌性
雄性两性同体	aaGG	雄性和两性
			两性	aagg	两性
全雌性	Aagg或Aagg	雌性

表1说明了双子叶植物的基因型和花的性别表型之间存在的关系。

本发明人还示出在生理水平上，两个等位基因(A)和(a)通过一个新蛋白质的不同浓度而彼此区别。

特别地，本发明人示出在生理水平上，在甜瓜中，两个等位基因(A)和(a)通过一个涉及乙烯代谢的ACCS类型的新蛋白质的不同浓度而不同。

同时，各种研究都示出葫芦科的花生物学中的基因编码涉及生物合成或乙烯调节途径的蛋白质(Kamachi et al.，1997；Kahana et al.，2000)。

本发明人示出，与具有等位基因(A)的植物相比，等位基因(a)在生理水平上通过植物中低ACCS蛋白质水平而区别于等位基因(A)。

从遗传学角度来说，本发明人示出了等位基因(A)通过在编码ACCS蛋白质的序列的启动子序列中的不同而区别于等位基因(a)。在发明人眼中，准确地说，对于等位基因(A)和(a)来说这个区别诱导了截然不同的蛋白质水平和截然不同的性别表型。

本发明人还在实施例1中示出等位基因(A)也通过ACCS蛋白质序列本身的不同而区别于等位基因(a)。事实上，等位基因(A)与编码ACCS蛋白质的序列中第57位的丙氨酸残基的存在相关，而等位基因(a)与同一序列中第57位的缬氨酸残基的存在相关。

本发明人还在实施例2中示出对于这两个等位基因来说在启动子区和蛋白质序列本身中的区别导致ACCS蛋白质截然不同的时间和空间表达。

不希望受限于任何特定理论，本发明人相信本发明的控制系统可推广至任何如上所述性别决定依赖于乙烯浓度的双子叶植物。

事实上，本发明人在实施例3中示出在不属于葫芦科的双子叶植物中表达等位基因(A)或等位基因(a)使得可能分别获得全雌性或两性表型。

最后，本发明人确定了等位基因(A)相对于等位基因(a)是显性的。

因此本发明的一个目的是提供用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统，所述系统包括两个遗传控制元件的组合，分别是：

-以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)，其中：

-所述显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，所述核酸包括：

(i)在双子叶植物中发挥功能的调节多核苷酸(PA)，和

(ii)表达被所述调节多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白，

-所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因(A)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或

(ii)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，或

(iii)编码非活性ACCS蛋白质的核酸，或

(iv)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)和编码非活性ACCS蛋白质的核酸，和

-以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，其中：

-所述显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，所述核酸的表达引起雄性两性同体或雌雄同体植物的发育，和

-所述隐性等位基因(g)与所述显性等位基因(G)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或

(ii)在双子叶植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表达引起两性或全雌性植物的发育，

条件是所述第一遗传控制元件已经被人工插入进所述双子叶植物。

本发明人鉴别的遗传控制系统使得双子叶植物的花的性别可以被控制和/或修饰，并因此与发明简介部分所描述的通常昂贵的机械控制系统或通常有毒的化学控制系统相比具有优势。

如本文所用，“等位基因”是指位于一对同源染色体上一个位点或基因座的基因的形式之一。基因的等位基因与同一遗传特征相关，但是它们可能决定不同的表型。

显性等位基因是一种等位基因，其表型表达水平比其同源等位基因(所谓隐性等位基因)的表型表达水平高得多。所述显性可以是完全显性或部分显性。

隐性等位基因是一种等位基因，其相应的表型仅当植物从其双亲中的每一个都得到相同等位基因时才会表达。相比，如果存在同源显性等位基因，所述隐性等位基因的表达被掩盖。

因此，上文限定的系统以各种状态的形式存在，每一种相应于一种表型。

当双子叶植物中存在的所述第一遗传控制元件(A/a)呈等位基因(A)的形式时，所述植物是雌雄同体或全雌性表型。

当植物中存在的所述第一遗传控制元件(A/a)呈等位基因(a)的形式时，所述植物是两性或雄性两性同体表型。

当双子叶植物中存在的所述第二遗传控制元件(G/g)呈等位基因(G)的形式时，所述植物是雌雄同体或雄性两性同体表型。

当植物中存在的所述第二遗传控制元件(G/a)呈等位基因(g)的形式时，所述植物是两性或全雌性表型。

等位基因和表型之间存在的关系总结于表1。

本说明书下面的部分说明了属于本发明控制系统的第一和第二遗传控制元件的各种或优选的实施方案。

遗传控制元件A/a，呈本发明系统的显性等位基因(A)形式

一般说来，在植物中以显性等位基因(A)形式存在的遗传控制元件A/a使得与当所述等位基因(A)不存在于所述植物中时观察到的量的水平相比可以获得更大量水平的ACCS蛋白质。

在下面的描述中，“高水平的ACCS蛋白质”相应于在基因组中含有显性等位基因(A)的植物中所测量的ACCS蛋白质的平均量水平，“低水平的ACCS蛋白质”相应于在基因组中不含有显性等位基因(A)的植物中观察到的ACCS蛋白质的平均量水平。

所述显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，所述核酸包括：

(i)在双子叶植物中发挥功能的调节多核苷酸(PA)，和

(ii)表达被所述调节多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码SEQID N°3所示的ACCS蛋白。

-功能性调节多核苷酸(PA)

本发明的功能性调节多核苷酸(PA)或启动子由能够使SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质在双子叶植物中表达的核酸组成。

例如，这种启动子包括SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。

因此，本发明的一个目的是提供一种遗传控制系统，其中调节多核苷酸(PA)包含SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

本发明一个进一步的目的是提供如上述限定的调节多核苷酸(PA)以及这种核酸的片段，其将在“本发明的核酸”部分中得到更为详细的描述。

本发明的功能性调节多核苷酸(PA)也可以由已知用于以组成型方式(组成性地)或以组织特异性方式指导编码ACCS蛋白质的核酸序列表达的启动子组成。

因此本发明的功能性调节多核苷酸(PA)可以选自组织特异性启动子例如得自如Theiβen et al.，2001所描述的“MADS盒(MADS box)”基因家族(A、B、C、D和E类)的启动子或任何其他同源异形基因启动子。

因此本发明的功能性调节多核苷酸(PA)可以选自：

-Kay et al.，1987所著文献描述的花椰菜花叶病毒35S启动子，或19S启动子或有利地双35S组成型启动子(pd35S)；

-Mc Elroy et al.，1991描述的包含在质粒pActl-F4中的水稻肌动蛋白启动子，其后跟随水稻肌动蛋白内含子(pAR-IAR)；

-PCT申请WO 90/02172或AXELOS et al.(1989)所著文献中描述的编码植物延伸因子的基因的组成型启动子EF-1α；

-基于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因启动子的转录激活元件和根瘤土壤杆菌甘露碱合酶基因启动子的三拷贝融合体的嵌合超级启动子PSP(NI et al.，1995)，和；

-向日葵泛素启动子(BINET et al.，1991)；

-玉米泛素1启动子(CHRISTENSEN et al.，1996)。

本发明的功能性调节多核苷酸(PA)也可以由诱导型启动子组成。

因此，本发明的一个目的是提供如上文限定的控制系统，其中所述调节多核苷酸(PA)对于诱导信号的作用敏感，并且优选地，其中所述调节多核苷酸(PA)是可诱导的转录或翻译激活多核苷酸。

当所述转录或翻译激活调节多核苷酸对于激活诱导信号直接或间接敏感时，其是本发明所限定的“可诱导激活”多核苷酸。

根据本发明，所述“可诱导激活”类型的调节多核苷酸是仅在存在外部信号时被激活的调节序列。这种外部信号可以是转录因子的结合，其中所述转录因子的结合可被激活诱导信号诱导，所述调节多核苷酸对于所述激活诱导信号直接或间接敏感。

当在宿主细胞中使用这种核酸构建体时，编码本发明的ACCS蛋白质的多核苷酸的表达可通过将所述被转化的宿主细胞与所述激活诱导信号接触而被诱导，其中所述激活调节多核苷酸对于所述激活诱导信号直接或间接敏感。

当期望在被转化的宿主细胞中缺乏编码ACCS蛋白质的多核苷酸的表达时，仅需要简单地消除或移除所述激活诱导信号的存在，其中所述转录或翻译激活调节多核苷酸对于所述激活诱导信号敏感。

根据本文上述实施方案中的定义，在调节多核苷酸领域特别是所述调节多核苷酸在植物中具有活性的调节多核苷酸领域的普通技术人员的一般技术知识的范围内限定所述构建体。

能够控制编码ACCS蛋白质的核酸的调节序列可以是可由特定代谢物诱导的调节序列，例如：

-糖皮质激素诱导性调节序列，例如AOYAMA et al.(1997)所述或例如McNELLYS et al.(1998)所述；

-乙醇诱导性调节序列，例如SALTER et al.(1998)所述或例如CADDICK et al.(1998)所述；

-四环素诱导性调节序列，例如CLONTECH公司销售的；

-可由病原性物质或由病原性物质产生的代谢物诱导的启动子序列；

-PR类型基因的水杨酸或BTH或aliette诱导性调节序列(Gorlach etal.，1996，Molina et al.，1998)；

-例如属于二苯甲酰肼家族的蜕皮素受体类型的双苯酰肼诱导性调节控序列(Martinez et al.，1999)(产品编号RH5992，ROHM & HAAS公司销售)。

-编码ACCS蛋白质的核酸

优选地，编码ACCS蛋白质的核酸从5′末端到3′末端至少包含：

(i)与SEQ ID N°1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列，

(ii)与SEQ ID N°1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列，和

(iii)与SEQ ID N°1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列。

遗传控制元件A/a，呈本发明系统的隐性等位基因(a)形式

一般说来，当存在于基因组中不具有显性等位基因(A)的植物中时，以隐性等位基因(a)形式存在的遗传控制元件(A/a)不能获得与当等位基因(A)存在时同样高的ACCS蛋白质水平。

因此，所述隐性等位基因(a)可以定义为相应于等位基因(A)的基因型的任何变化，所述基因型不能获得与等位基因(A)同样高的ACCS蛋白质水平。

所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因(A)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或

(ii)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，或

(iii)编码非活性ACCS蛋白质的核酸，或

(iv)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)和编码非活性ACCS蛋白质的核酸。

-非功能性调节多核苷酸(Pa)

本发明的非功能性调节多核苷酸(Pa)或启动子是这样的核酸：

(i)在宿主细胞中不允许SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质表达，或

(ii)与在调节多核苷酸(PA)的情况中观察到的水平相比，以低水平表达这个蛋白质，或

(iii)与在调节多核苷酸(PA)的情况中观察到的表达时期相比，使得ACCS蛋白质在植物生命周期中表达较短的时期。

有一个简单的方法对比几个本领域技术人员已知的启动子的表达水平，所述方法包括将一个可选择标记基因置于待测启动子的控制之下。可选择标记基因可以是例如本领域技术人员熟知的BASTA除草剂抗性基因。

另一种方法可以包括当编码ACCS蛋白质的序列处于各种启动子的控制之下时通过使用针对此蛋白质的抗体测定获得的该蛋白质水平，以及在标题为“本发明的多肽”的部分中描述的方法。

作为一个实施方案，非功能性调节多核苷酸(Pa)包含SEQ ID N°2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

因此，在本发明的控制系统中，非功能性调节多核苷酸(Pa)可以包含SEQ ID N°2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供上文限定的调节多核苷酸(Pa)本身。

本发明的另一个目的是提供包含序列SEQ ID N°2的核酸。这种核酸包含调节多核苷酸(Pa)和编码SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质的核酸。

非功能性多核苷酸(Pa)也可以由衍生自如上文限定的多核苷酸(PA)的任何多核苷酸组成，所述多核苷酸的核苷酸序列与调节多核苷酸的核苷酸序列相比包含一或多个核苷酸的插入、取代或缺失。

因此，本发明的另一个目的是提供包含一种核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸相比包含至少一个选自突变、插入或缺失的改变，含有所述改变的核酸当其控制ACCS蛋白质的表达时导致所述蛋白质与由序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的ACCS蛋白质的表达水平相比ACCS蛋白质表达降低。

本发明的另一个目的是提供如上文限定的控制系统，其中所述调节多核苷酸(Pa)对于诱导信号的作用敏感，并且优选地，其中所述调节多核苷酸(Pa)是可诱导转录或翻译阻抑多核苷酸。

如本文所用，“阻抑(répresseur)”调节多核苷酸是指组成性活性可以被外部信号阻断的调节序列。这种外部信号可以是缺乏被所述阻抑物调节多核苷酸识别的转录因子的结合。所述转录因子结合的缺乏可被阻抑物诱导信号的作用诱导，所述阻抑物调节多核苷酸对于所述阻抑物诱导信号敏感。

在此第一特定实施方案中，编码ACCS蛋白质的序列在所选择的宿主细胞中在缺乏所述阻抑物诱导信号的情况下组成型表达，其中所述阻抑物调节多核苷酸对于所述阻抑物诱导信号直接或间接敏感。

将宿主细胞与所述阻抑物诱导信号接触，通过对所述阻抑物调节多核苷酸的直接或间接作用，引起编码ACCS蛋白质的多核苷酸的表达被抑制和/或阻断。

为了获得本发明的包含阻抑物调节多核苷酸的DNA构建体，本领域技术人员会应用其在植物基因表达领域的普通技术知识。

用于产生应用这种类型的调节多核苷酸的转化植物的方法在标题为“用于产生本发明的转化植物的方法”部分中描述。

-编码非活性A CCS蛋白质的核酸

如本文所用，“编码非活性ACCS蛋白质的核酸”是指编码一种蛋白质的核酸，该蛋白质与SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质通过一或多个氨基酸的取代、缺失、或插入而不同并且不具有SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质的生物学活性。

-非活性ACCS蛋白质

如本文所用，“非活性ACCS蛋白质”是指与SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质通过一或多个氨基酸的取代、缺失、或插入而不同并且不具有SEQ IDN°3所示的ACCS蛋白质的生物学活性的蛋白质。

一般说来，非活性ACCS蛋白质是表达与雄性两性同体或两性表型相关的蛋白质。

例如，非活性ACCS蛋白质可以是不允许将S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)的蛋白质。

本发明人在实施例1中示出本发明的非活性ACCS蛋白质例如是SEQID N°3所示的ACCS蛋白质，其中第57位丙氨酸残基被缬氨酸残基取代。

遗传控制元件G/g，呈本发明系统的隐性等位基因(g)形式

一般说来，当存在于植物中时，以隐性等位基因(g)形式存在的遗传控制元件(G/g)导致两性或全雌性植物的发育。

本发明的核酸

如前所述，根据本发明，鉴定了第一遗传控制元件(A/a)的两个等位基因变体(A)和(a)。

本发明人鉴别了SEQ ID N°1的核酸是相应于处于基因(A/a)形式的第一遗传控制元件的显性等位基因(A)变体的核酸，而SEQ ID N°2的核酸是相应于隐性等位基因(a)变体的核酸。

在本发明的控制系统中，两种遗传控制元件中的至少一种已经被人工插入到植物中。

如上文所述，这种插入导致所述植物的花的性别改变，这正是本发明寻求的目的之一。

因此，序列SEQ ID N°1和SEQ ID N°2是本发明目的的一部分。

因此本发明的一个目的是提供一种核酸，所述核酸包含与选自SEQ IDN°1和SEQ ID N°2的核苷酸序列或SEQ ID N°1和SEQ ID N°2之一的片段具有至少95％核苷酸相同性的多核苷酸，条件是这种核酸具有如上文限定的等位基因(A)或等位基因(a)的功能性特性。

本发明一个进一步的目的是提供一种核酸，所述核酸的序列与如上文限定的核酸互补。

本发明另一个进一步的目的是提供一种核酸，所述核酸由与选自SEQID N°1和SEQ ID N°2所示序列或SEQ ID N°1和SEQ ID N°2之一的片段具有至少95％核苷酸相同性的多核苷酸组成，或者提供具有与其互补的序列的核酸，条件是这种核酸具有如上文限定的等位基因(A)或等位基因(a)的功能性特性。

本发明还涉及一种核酸，所述核酸包含SEQ ID N°1或SEQ ID N°2所示核酸的至少12个、优选至少15个、最优选至少20个连续核苷酸，应当理解这种核酸的定义包括如本说明书限定的本发明核酸的“片段”。

本发明也涉及包含SEQ ID N°1或2或由SEQ ID N°1或2组成的核酸。

本发明还涉及一种核酸，所述核酸包含SEQ ID N°1或SEQ ID N°2所示核酸的至少12个、优选至少15个、最优选至少20个连续核苷酸，应当理解这种核酸的定义包括如本说明书限定的本发明核酸的“片段”。

SEQ ID N°1限定的等位基因(A)从5′末端到3′末端分别包含：

a)非编码序列，包括位于第一个外显子上游的调节这个基因的转录和/或翻译的元件，从SEQ ID N°1的第1位核苷酸至第5906位核苷酸；

b)所谓“编码区”，包括基因(A/a)的三个外显子和两个内含子，这个编码区从SEQ ID N°1的第5907位核苷酸至第7915位核苷酸；

c)位于所述编码区下游的非编码区，从SEQ ID N°1的第7915位核苷酸至第13380位核苷酸。

SEQ ID N°1限定的等位基因(a)从5′末端到3′末端分别包括：

a)非编码序列，包括位于第一个外显子上游的调节这个基因的转录和/或翻译的元件，从SEQ ID N°2的第1位核苷酸至第3650位核苷酸；所述非编码序列与位于SEQ ID N°1所示的核酸的5′的非编码序列实质上不同，

b)所谓“编码区”，包括基因(A/a)的三个外显子和两个内含子，这个编码区从SEQ ID N°2的第3651位核苷酸至第5659位核苷酸，所述编码区与SEQ ID N°1所示的核酸的编码序列差别不大，并且编码SEQ ID N°3所示的同一个ACCS蛋白质，和

c)位于所述编码区下游的非编码区，从SEQ ID N°1的第5659位核苷酸至第11137位核苷酸，所述非编码区与位于SEQ ID N°1所示的核酸的3′的非编码区差别不大。

下表2详细示出了基因A/a的三个外显子和两个内含子的结构特征。所述基因(A/a)的等位基因(A)和(a)的外显子和内含子的结构特征非常相似，因此等位基因(A)和(a)的外显子确实编码SEQ ID N°3所示的同一个蛋白质。如上文已经描述的，相应于等位基因(A)和(a)的核苷酸序列之间的主要区别在于相应于这两个等位基因的上游调节序列。这两个序列因此具有由3个外显子和2个内含子组成的共同区域，和包括不同调节区域的非共同区域。

表2

基因A/a的外显子序列

本发明进一步涉及一种核酸，所述核酸包含基因A/a的外显子多核苷酸例如上文表1中所述的多核苷酸1至3的至少12个连续核苷酸，其包括在SEQ ID N°1和SEQ ID N°2所示的核酸中。

这种核酸编码ACCS蛋白质的至少一部分，并且可以引人注目地插入重组载体中，所述重组载体期望在宿主细胞中或用所述重组载体转化的植物中表达相应翻译产物以获得具有基因型(A)的植物。

这种核酸也可以用于合成核苷酸探针和引物，所述核苷酸探针和引物期望检测或扩增样品中基因(A/a)中存在的核苷酸序列。

如果需要，上文所述序列可以携带一或多个突变，优选诱导非活性ACCS蛋白质合成并修饰包含这种突变基因的植物的性别类型的一或多个突变。这些序列符合通常如上面所限定的编码非活性ACCS蛋白质的核酸的定义。

表3

基因(A/a)的内含子序列

本发明进一步涉及一种核酸，所述核酸包含基因(A/a)的内含子多核苷酸例如上文表2中所描述的多核苷酸1和2的至少12个连续核苷酸，其包括在SEQ ID N°1和SEQ ID N°2所示的核酸中。

这种核酸可以用作寡核苷酸探针或引物以在样品中检测至少一个拷贝的基因(A/a)的存在或扩增基因(A/a)中的确定靶序列。

这种核酸也可以用于扩增基因(A/a)中的确定靶序列或用有义方法或共抑制方法或用双链RNA(Wassenegger et al.1996；Kooter et al.1999)进行干扰而抑制该靶序列。这种核酸也可以用于确定基因(A/a)的功能性等位基因变体，其用于选择具有确定的性别类型的植物的方法。

应当注意在其共同区域(即上文描述的3个外显子和2个内含子)内，SEQ ID N°1和SEQ ID N°2具有高于95％的核苷酸相同性百分比，这个百分比事实上高于99％。

编码ACCS蛋白质的本发明的其他核酸

本发明一个进一步的目的是提供一种核酸，所述核酸包含与从SEQ IDN°1的核苷酸5907开始至核苷酸7915终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的多核苷酸，以及具有与其互补的序列的核酸。

本发明也涉及与从SEQ ID N°1的核苷酸5907开始至核苷酸7915终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的核酸，以及具有与其互补的序列的核酸。

本发明一个进一步的目的是提供一种核酸，所述核酸包含从SEQ IDN°1的核苷酸5907开始至核苷酸7915终止的核苷酸序列，或具有与其互补的序列的核酸。

本发明进一步涉及由从SEQ ID N°1的核苷酸5907开始至核苷酸7915终止的核苷酸序列组成的核酸，或具有与其互补的序列的核酸。

本发明另一个目的是提供一种核酸，所述核酸至少包含：

(i)与SEQ ID N°1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列，

(ii)与SEQ ID N°1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列，和

(iii)与SEQ ID N°1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％相同性的一段序列。

本发明一个进一步的目的是提供一种核酸，所述核酸从5′末端至3′末端包含：

(i)SEQ ID N°1的核苷酸5907至核苷酸6086的一段序列，

(ii)SEQ ID N°1的核苷酸6181至核苷酸6467的一段序列，和

(iii)SEQ ID N°1的核苷酸7046至核苷酸7915的一段序列。

编码ACCS蛋白质的核酸可以另外包含前导和终止序列，本领域技术人员常见所述序列。

基因(A/a)的转录和翻译产物以及本发明的多肽

因此本发明的另一个目的是提供包含氨基酸序列SEQ ID N°3(在本说明书中也称为“ACCS蛋白质”)的多肽，以及与SEQ ID N°3具有至少95％氨基酸相同性的多肽或其片段或变体。

本发明的ACCS蛋白质的片段包含SEQ ID N°3所示多肽的至少10、50、100、200、300、400、420、430、440或445个连续氨基酸。

本发明进一步涉及包含与SEQ ID N°3所示ACCS蛋白质序列具有至少95％氨基酸相同性的氨基酸序列的多肽。

有利地，本发明还包括与SEQ ID N°3所示多肽序列具有至少96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％氨基酸相同性的多肽，或SEQ ID N°3所示多肽的肽片段。

一般说来，本发明的多肽可以是分离的或纯化的形式。

本发明的多肽可以通过使用本领域技术人员熟知的方法进行的基因重组获得，所述方法例如AUSUBEL et al.(1989)所述方法。

本发明的多肽也可以通过使用常规化学合成方法在均质溶液中或在固相制备。

例如，本发明的多肽可以通过HOUBEN WEIL(1974)描述的均质溶液方法或通过MERRIFIELD(1965a；1965b)描述的固相合成方法制备。

优选地，本发明多肽的多肽变体依然能够被针对SEQ ID N°3所示多肽的抗体识别。

本发明的由基因(A/a)编码的多肽例如氨基酸SEQ ID N°3多肽或其变体或肽片段可特别用于制备期望检测样品中SEQ ID N°3所示多肽或其肽片段的存在和/或表达的抗体。

本发明一个进一步的目的是提供如上文限定的SEQ ID N°10所示多肽或这个序列的多肽片段。SEQ ID N°10所示多肽编码上文定义的“非活性”ACCS蛋白质，并且与SEQ ID N°3不同在于在第57位存在缬氨酸残基。

针对这些多肽的抗体不仅仅用于检测样品中由基因(A/a)编码的多肽或这种多肽的肽片段的存在，还用于例如在植物细胞中量化SEQ ID N°3或10所示多肽的合成，并从而用于确定所述植物的性别而无需培养所述植物。

如本文所用，“抗体”特别是指多克隆或单克隆抗体或片段(例如F(ab)’₂、F(ab)片段)或任何含有识别本发明的靶多肽或靶多肽片段的起始抗体的结构域的多肽。

单克隆抗体可以根据KOHLER and MILSTEIN(1975)描述的方法由杂交瘤制备。

本发明也涉及针对如上文描述的多肽或其片段或变体的抗体，例如在KOZBOR et al.(1983)描述的三瘤(trioma)方法和杂交瘤方法中产生的。

本发明进一步涉及单链抗体片段Fv(ScFv)，例如在专利USN°4,946,778或MARTINEAU et al.(1998)中所描述的。

本发明的抗体通常包括得自如RIDDER et al.(1995)所描述的噬菌体文库或如REINMANN et al.(1997)和LEGER et al.(1997)所描述的人源化抗体的抗体片段。本发明的抗体制备物可用于期望在样品中鉴别SEQ ID N°3所示多肽或其肽片段的存在和/或量的免疫检测。

本发明的抗体可以另外包含可检测标记(其性质是同位素或非同位素)，例如荧光标签，或可以使用本领域技术人员熟知的方法与分子例如生物素偶联。

因此，本发明一个进一步的目的是提供用于检测样品中本发明多肽的存在的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将测试样品与如上文所描述的抗体接触；

b)检测形成的抗原/抗体复合物。

本发明进一步涉及用于检测样品中本发明多肽的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

a)如上文限定的抗体；

b)如果需要，一或多种用于检测形成的抗原/抗体复合物所需要的试剂。

本发明另一个目的是提供如上文限定的核酸或核酸等位基因变体在用于获得花类型已经被修饰的植物的植物选择程序中的用途。

包含功能性调节多核苷酸(PA)的核酸

本发明的功能性调节多核苷酸(PA)或启动子包括允许SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质在双子叶植物中表达的核酸。

因此这种功能性调节多核苷酸(PA)当被人工导入植物中时，使得能够修饰所述植物的花的性别，并且特别使得可能获得不能自花授粉的雌性植物。

因此本发明的另一个目的是提供包含与从SEQ ID N°1的核苷酸1开始至核苷酸5906终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的多核苷酸的核酸，以及具有与其互补的序列的核酸。

本发明也涉及与从SEQ ID N°1的核苷酸1开始至核苷酸5906终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的核酸，以及具有互补序列的核酸。

因此本发明一个进一步的目的是提供包含从SEQ ID N°1的核苷酸1开始至核苷酸5906终止的核苷酸序列的核酸，或具有互补序列的核酸。

本发明进一步涉及由从SEQ ID N°1的核苷酸1开始至核苷酸5906终止的核苷酸序列组成的核酸，或具有互补序列的核酸。

本发明进一步涉及一种核酸，所述核酸包含如上文限定的调节多核苷酸的至少12个连续核苷酸。

这种核酸可以用作寡核苷酸探针或引物以在样品中检测至少一个拷贝的基因(A/a)的等位基因(A)的存在、以扩增基因(A/a)中的确定靶序列。这种核酸也可以用于寻找基因(A/a)的功能性变体等位基因，或用于选择具有确定性别类型的植物的方法。

应用如上文描述的核酸的检测方法描述于标题为“本发明的选择方法”的部分。

这种核酸也可用于使用反义或共抑制方法或使用双链RNA进行干扰(Wassenegger et al.1996；Kooter et al.1999)而抑制基因(A/a)中的确定靶序列。

包含非功能性调节多核苷酸Pa的核酸

本发明的非功能性调节多核苷酸(Pa)或启动子是一种核酸，所述核酸：

(i)在宿主细胞中不允许SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质表达，或

(ii)与用调节多核苷酸(PA)观察到的水平相比，允许这个蛋白质以非常低的水平表达，或

(iii)与用调节多核苷酸(PA)观察到的表达时期相比，使得ACCS蛋白质在植物生命周期中表达较短的时期。

因此这种非功能性调节多核苷酸(Pa)当被人工导入植物中时(例如当取代多核苷酸(A)时)，使得能够修饰这种植物的花的性别，并且特别使得可能获得能够自花授粉的两性植物。

因此本发明的一个目的是提供包含与从SEQ ID N°2的核苷酸1开始至核苷酸3650终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的多核苷酸的核酸，以及具有与其互补的序列的核酸。

本发明也涉及与从SEQ ID N°2的核苷酸1开始至核苷酸3650终止的核苷酸序列具有至少95％核苷酸相同性的核酸，以及具有与其互补的序列的核酸。

本发明一个进一步的目的是提供包含从SEQ ID N°2的核苷酸1开始至核苷酸3650终止的核苷酸序列的核酸，或具有与其互补的序列的核酸。

本发明进一步涉及由从SEQ ID N°2的核苷酸1开始至核苷酸3650终止的核苷酸序列组成的核酸，或具有与其互补的序列的核酸。

这种核酸可以用作寡核苷酸探针或引物以在样品中检测至少一个拷贝的基因(A/a)的等位基因(a)的存在，或扩增基因(A/a)中的确定靶序列。

本发明也涉及包含一或多个如上文限定的核酸的组合的核酸，例如在(PA)或(Pa)类型启动子控制之下的编码功能性ACCS蛋白质的核酸。

一般定义

根据本发明，可以使用本领域普通技术人员已知的任何常规分子生物学、微生物学和DNA重组方法。这些方法由例如SAMBROOK et al.(1989)、GLOVER(1985)、GAIT(1984)、HAMES and HIGGINS(1984)、BERBAL(1984)和AUSUBEL et al.(1994)描述。

优选地，本发明任何核酸和任何多肽以分离的或纯化的形式存在。

如本文所用，“分离的”是指从其原始环境(即其天然所处的环境)移出的生物材料。例如，在植物中天然存在的多核苷酸不是分离的。从相邻核酸分离出来的同一多核苷酸是分离的，其中所述多核苷酸在植物的基因组中天然插入在所述相邻核酸内。这种多核苷酸可被导入载体中和/或这种多核苷酸可掺入组合物中而保持分离的状态，因为所述载体或所述组合物不是其天然环境。

如本文所用，“纯化的”并不需要所述物质以排除其他化合物的绝对纯化的形式存在。其应当被解释为一个相对概念。

多核苷酸或多肽在粗材料或天然材料纯化至少一个数量级、优选至少2或3个数量级、优选至少4或5个数量级后即为纯化状态。

在本说明书中，“核苷酸序列”是指多核苷酸或核酸。“核苷酸序列”包括遗传物质本身并且不仅限于其序列的信息。

“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核苷酸序列”包括单链或双链形式的多于一个核苷酸的RNA、DNA、cDNA序列或RNA/DNA杂合序列。

如本文所用，“核苷酸”是指天然核苷酸(A，T，G，C)和包含至少一种修饰的修饰的核苷酸，例如(i)嘌呤类似物，(ii)嘧啶类似物，或(iii)糖类似物，这些修饰的核苷酸例如描述于PCT申请WO 95/04064。

在本发明中，当第一多核苷酸的每一个碱基与具有相反方向的第二多核苷酸的互补碱基配对时，所述第一多核苷酸被认为是与所述第二多核苷酸“互补的”。互补碱基是A和T(或A和U)，以及C和G。

根据本发明，与第二参考核酸具有至少95％相同性的第一核酸与这条第二参考多核苷酸具有至少95％、优选至少96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％核苷酸相同性，两条序列之间的相同性百分比如下文描述确定。

如本文所用，所述两条核酸序列之间的“相同性百分比”由通过对比窗对比两条最佳排列的序列确定。

在所述对比窗内的核苷酸序列部分因此与参考序列相比可以包含添加或缺失(例如缺口)(所述参考序列不包含这些添加或缺失)，从而获得所述两条序列之间的最佳排列。

所述相同性百分比通过确定在两条对比序列中观察到的相同核酸碱基的位置数目、之后用两个核酸碱基之间存在相同性的位置的数目除以对比窗内位置总数、最后用结果乘以一百得到两条序列的核苷酸相同性百分比来计算。

用于对比的最佳序列排列可以通过使用已知算法的计算机程序进行计算。

最优选地，所述序列相同性百分比使用CLUSTAL W软件(1.82版)确定，参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝＂full＂；(3)OUTPUT FORMAT＝＂aln w/numbers＂；(4)OUTPUT ORDER＝＂aligned＂；(5)COLOR ALIGNMENT＝＂no＂；(6)KTUP(word size)＝＂default＂；(7)WINDOW LENGTH＝＂default＂；(8)SCORE TYPE＝＂percent＂；(9)TOPDIAG＝＂default＂；(10)PAIRGAP＝＂default＂；(11)PHYLOGENETICTREE/TREE TYPE＝＂none＂；(12)MATRIX＝＂default＂；(13)GAP OPEN＝＂default＂；(14)END GAPS＝＂default＂；(15)GAP EXTENSION＝＂default＂；(16)GAP DISTANCES＝＂default＂；(17)TREE TYPE＝＂cladogram＂和(18)TREEGRAP DISTANCES＝＂hide＂

与本发明的核酸具有至少95％核苷酸相同性的核酸包括所述本发明核酸“变体”。

如本文所用，本发明的核酸“变体”是指与参考核酸相比，通过一或多个核苷酸的取代、添加或缺失而区别于所述参考核酸的核酸。本发明的核酸变体可以是天然来源的，例如天然存在于自然界的等位基因变体。这种变体核酸也可以是例如通过诱变方法获得的非天然核酸。

参考核酸和所述“变体”核酸之间的区别通常是很小的，因此所述参考核酸和所述变体核酸具有非常相似的核苷酸序列，在很多区域甚至是相同的。在变体核酸中发生的核苷酸突变可以是沉默突变，就是说不影响可能由此变体核酸编码的氨基酸序列的突变。

在变体核酸中的核苷酸改变也可能导致可能由此变体核酸编码的多肽序列中一或多个氨基酸的取代、添加或缺失。

最优选地，包含开放读框的本发明变体核酸编码保留与由参考核酸编码的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

最优选地，包含开放读框的本发明变体核酸编码仍旧能够被针对由参考核酸编码的多肽的抗体识别的多肽。

所述编码ACCS蛋白质的核酸“变体”包括导入到植物基因组中并与编码ACCS蛋白质的核酸具有至少95％核苷酸相同性的ACCS蛋白质直向同源基因的核酸。

如本文所用，本发明核酸的“片段”是指与参考核酸相比长度减少的核苷酸序列，所述核酸片段与参考核酸在其共有部分具有相同核苷酸序列。本发明的这些核酸片段具有参考核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸，其中本发明核酸的片段的最大核苷酸长度当然受限于参考核酸的最大核苷酸长度。

探针和引物

本发明的核酸特别是SEQ ID N°1和SEQ ID N°2、它们的至少12个核苷酸的片段、调节多核苷酸(PA)和(Pa)、以及具有互补序列的核酸都可用于检测样品中至少一个拷贝的基因(A/a)或其片段或等位基因变体的的核苷酸序列的存在。

特别地，衍生自SEQ ID N°1、特别是衍生自调节多核苷酸(PA)的上述探针和引物可用于检测双子叶植物中等位基因(A)的存在。

同样地，衍生自SEQ ID N°2、特别是衍生自非功能性调节多核苷酸(Pa)的上述探针和引物可用于检测双子叶植物中等位基因(a)的存在。

本发明也包括在高度严格杂交条件下与选自SEQ ID N°1和SEQ IDN°2的核酸或与调节多核苷酸(PA)或(Pa)杂交的核苷酸探针和引物。

因此本发明一个目的是提供用作探针或引物、特别是与如上文限定的核酸杂交的核酸。

下文所述的杂交条件用于杂交20个碱基长的核酸、探针或引物。

杂交程度和特异性依赖于各种参数，例如：

a)与探针或引物杂交的核酸制备物的纯度；

b)探针或引物的碱基组成，G-C碱基对具有比A-T或A-U碱基对更高的热稳定性；

c)探针或引物与核酸之间的同源碱基序列的长度；

d)离子强度：杂交水平随着离子强度和杂交时间的增加而提高；

e)保温温度；

f)与探针或引物杂交的核酸的浓度；

g)提高杂交严格性的变性剂例如促进氢键破坏的物质如甲酰胺或尿素的存在；

h)保温时间，杂交水平随保温时间提高；

i)体积排阻剂例如葡聚糖或硫酸葡聚糖的存在，所述体积排阻剂提高杂交水平，因为它们在制备物中提高探针或引物以及与其杂交的核酸的有效浓度。

限定严格性条件的参数依赖于成对链的50％分离的温度(Tm)。

对于包含多于360个碱基的序列，Tm由如下关系限定：

Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(阳离子浓度)-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数)(SAMBROOK et al.，(1989)，9.54-9.62页)。

对于长度小于30个碱基的序列，Tm由如下关系限定：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

在合适的严格性条件，即非特异性序列不会杂交的条件下，杂交温度大约在Tm之下5至30℃的范围内，优选低于Tm5至10℃。

如本文所用，本发明所述“高度严格杂交条件”是指杂交温度如低于Tm之下5℃的杂交条件。

上述杂交条件可以根据寻求杂交的核酸的长度和碱基组成或根据所选择的标记类型根据本领域技术人员已知方法进行调整。

合适的杂交条件可以例如根据从HAMES和HIGGINS(1985)或AUSUBEL et al.(1989)所著书籍中的教导进行调整。

作为示例，用于200个碱基长的核酸的杂交条件如下：

预杂交：

与用于杂交的条件相同

时间：1夜。

杂交：

5 x SSPE(0.9M NaCl，50mM磷酸钠pH7.7，5mM EDTA)

5 x Denhardt’s(0.2％ PVP，0.2％ Ficoll，0.2％ SAB)

100μg/ml鲑鱼精DNA

0.1％ SDS

时间：1夜。

漂洗：

2 x SSC，0.1％ SDS 10min 65℃

1 x SSC，0.1％ SDS 10min 65℃

0.5 x SSC，0.1％ SDS 10min 65℃

0.1 x SSC，0.1％ SDS 10min 65℃。

本发明的核苷酸探针和引物包含本发明核酸特别是SEQ ID N°1或SEQID N°2的核酸或与其互补的序列的、与选自SEQ ID N°1或2的序列具有95％核苷酸相同性的核酸或与其互补的序列的、或在高度严格杂交条件下与选自SEQ ID N°1或2的序列或与其互补的序列杂交的核酸的至少12个连续核苷酸。

优选地，本发明的核苷酸探针和引物的长度为本发明核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸。

或者，本发明的核苷酸探针或引物由长度为本发明核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸的片段组成和/或包含所述片段。

例如，SEQ ID N°7限定(相应于有义引物)的引物对和SEQ ID N°8限定(相应于反义引物)的引物对使得能够扩增SEQ ID N°1所示的核酸片段或SEQ ID N°2所示的核酸片段。

本发明的核苷酸探针或引物可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法制备，包括通过克隆并使用限制性酶或通过根据例如得自NARANGet al.(1979)或得自BROWN et al.(1979)的磷酸二酯方法、得自BEAUCAGEet al.(1980)的二乙基亚磷酰胺方法或在欧洲专利n°EP 0 707 592中描述的在固相支持物上的方法等方法直接化学合成制备。本发明的每一个核酸，包括上文描述的寡核苷酸探针和引物，如果需要，都可以通过掺入可检测分子(也就是说可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的可检测标记)进行标记。

例如，这些标记可以包括放射性同位素(³²P³H，³⁵S)、荧光分子(5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴)或配体例如生物素。

探针标记优选地通过将被标记的分子通过引物延伸或通过添加至5′或3′末端而插入多核苷酸中实现。

核酸片段非放射性标记的实例特别描述于法国专利n°FR 78 10 975或URDEA et al.(1988)或SANCHEZ PESCADOR et al.(1988)所写的文章中。

有利地，本发明的探针可以具有某些结构特征，所述结构特征使得可以由于其性质而扩增所述信号，例如URDEA et al；(1991)或在欧洲专利n°EP0 225 807(Chiron)中描述的探针。

本发明的寡核苷酸探针可以特别用于与编码ACCS蛋白质的任何核酸，特别是SEQ ID N°1或2所示核酸进行Southern类型的杂交，或当在样品中需要分析相应转录物的表达时用于RNA杂交。

本发明的探针也可以用于检测PCR扩增产物或用于检测任何错配。

本发明的核苷酸探针和引物可以固定在固相支持物上。本领域技术人员熟知这些固相支持物，包括微滴定平板的孔表面、聚苯乙烯薄片、磁珠、硝酸纤维素条或微颗粒例如乳胶颗粒。

因此，本发明一个进一步的目的是提供用作核苷酸探针或引物的核酸，所述探针或引物的特征在于包含如上文限定的核酸、特别是SEQ ID N°1和SEQ ID N°2所示的核酸的至少12个连续核苷酸。

本发明进一步涉及用作核苷酸探针或引物的核酸，所述探针或引物的特征在于包含为本发明的核酸、最优选地具有选自SEQ ID N°1和SEQ IDN°2的序列的核酸的至少12个连续核苷酸的多核苷酸。

如上文所述，这种核酸可以具有另外的特征，即其用可检测分子标记。

用作用于检测或扩增基因(A/a)的基因组序列、mRNA或cDNA的核苷酸探针或引物的核酸可以具有另外的特征，即其选自如下序列：

a)在高度严格杂交条件下与SEQ ID N°1或SEQ ID N°2所示核酸杂交的核苷酸序列；和

b)包含SEQ ID N°1或SEQ ID N°2所示核酸的至少12个连续核苷酸的序列。

本发明的载体、细胞和植物

在本发明的控制系统中，为了确保至少一个所述遗传控制元件被人工插入进双子叶植物，上文限定的核酸和调节多核苷酸应当被导入载体内，之后导入细胞内。

因此，本发明一个进一步的目的是提供包含如上文描述的调节多核苷酸(PA)和(Pa)、编码活性和非活性蛋白质ACCS的核酸、以及相应于等位基因(G)和(g)的核酸的载体、细胞和转化的植物，以及上文限定的引物。

载体

如上文限定的核酸(下文中称为“感兴趣的核酸”)可以被插入进合适的载体内。

如本文所用，“载体”是指可以是单链或双链的DNA或RNA环状或线状分子。

本发明的重组载体优选是表达载体，或更特别地是插入载体、转化载体或整合载体。

其可以特别地是细菌或病毒起源的载体。

在任何情况中，所述感兴趣的核酸被置于一或多个包含用于调控其在所考虑的植物中表达的信号的序列的控制之下，并且或者调控信号全部包含在所述感兴趣的核酸中(如在上文部分中描述的核酸构建体的情况)，或者它们中的一个、许多或全部调控信号包含在所述感兴趣的核酸已经被插入其中的接受载体(vecteur receveur)中。

本发明的重组载体有利地包含合适的转录起始和终止序列。

另外，本发明的重组载体可以包括宿主细胞中的一或多个功能性复制起点，其中期望所述重组载体在所述宿主细胞中表达，并且如果需要，所述重组载体包括作为用于选择的标记的核苷酸序列。

本发明的重组载体可以包括一或多个如本说明书上文限定的表达调节信号。

本发明优选的细菌载体包括例如载体pBR322(ATCC n°37 017)或载体例如pAA223-3(Pharmacia，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，United States)

也可以提及其他商业化载体例如载体pQE70、pQE60、pQE9(Quiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pMH16A、pMH18A、pMH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG(Stratagene)。

也可以是杆状病毒(Baculovirus)类型的载体例如用于转染衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞系(ATCC N°CRL 1711)细胞的载体pVL1392/1393(Pharmingen)。

优选地，并且为了本发明载体的主要应用(为了产生编码ACCS蛋白质的序列在植物中稳定和优选可诱导表达)，将会使用特别适于在植物细胞中表达感兴趣序列的载体，例如如下载体：

-载体pBIN19(BEVAN et al.)，由CLONTECH公司(Palo Alto，California，USA)销售；

-载体pBI 101(JEFFERSON，1987)，由CLONTECH公司销售；

-载体pBI 121(JEFFERSON，1987)，由CLONTECH公司销售；

-载体pEGFP；Yang et al.(1996)，由CLONTECH公司销售；

-载体pCAMBIA1302(HAJDUKIIEWICZ et al.，1994)

-衍生自Japan Tobacco(EP 672 752 and Ishida et al.，1996)描述的载体pSB12和pSB1的中间和超双元载体(vecteurs intermédiaires etsuperbinaires)。

例如，在本发明的控制系统中，呈等位基因(A)形式的基因(A/a)可以通过使用SEQ ID N°9所示的核酸被人工导入双子叶植物中，所述核酸从5′末端到3′末端包含：

-载体pEC2的部分序列，位于SEQ ID N°9的第1位核苷酸和第633位核苷酸之间，

-NotI限制位点的序列，位于SEQ ID N°9的第634位核苷酸和第641位核苷酸之间，

-包含呈等位基因(A)形式的基因(A/a)的核酸的序列，位于SEQ IDN°9的第642位核苷酸和第14020位核苷酸之间，

-NotI限制位点的序列，位于SEQ ID N°9的第14021位核苷酸和第14028位核苷酸之间，

-载体pEC2的部分序列，位于SEQ ID N°9的第14029位核苷酸和第16177位核苷酸之间。

因此，SEQ ID N°9包含通过使用载体的NotI限制位点线性化的载体pEC2，其中插入了包含呈等位基因(A)形式的基因(A/a)的核酸的序列。

细胞

将核酸导入细菌细胞最常用的方法可以在本发明的框架内使用，即通过将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合进行，所述融合通过电穿孔、通过用弹丸进行轰击、通过病毒载体介导的感染等等进行。细菌细胞经常用于扩增包含具有本发明核苷酸序列的构建体的质粒数。培养细菌并接下来使用本领域技术人员熟知的方法(参见已经提到的方法手册)分离质粒，所述方法包括可商购的质粒纯化试剂盒例如得自Pharmacia Biotech的EasyPrepl或得自Qiagen的QIAexpress Expression System。接下来对如此分离并纯化的质粒进行操作以产生其他将要用于转染植物细胞的质粒。

为了确保置于合适调节序列控制下的本发明的感兴趣核酸的表达，本说明书中限定的核酸或重组载体应当被导入宿主细胞中。将本发明的多核苷酸导入进宿主细胞中可以根据本领域技术人员熟知的方法体外进行。

本发明一个进一步的目的是提供用本发明的核酸或用如上文限定的重组载体转化的宿主细胞。

这种转化的宿主细胞的来源优选地是细菌、真菌或植物来源。

因此，可以特别使用衍生自各种大肠杆菌(Escherichia coli)菌株或根瘤土壤杆菌菌株的细菌细胞。

有利地，所述转化的宿主细胞是植物细胞或植物原生质体。

可以根据本发明的方法转化的细胞例如包括双子叶植物的细胞，优选属于葫芦科的双子叶植物的细胞，葫芦科的成员在下面标题为“本发明的植物”部分中详细描述。

通过对本发明的植物进行杂交育种获得的杂交植物也包括在本发明的范围内。

优选地，其是属于甜瓜物种的植物的细胞或原生质体。

本发明一个进一步的目的是提供感兴趣核酸在产生性别表型被修饰的转化植物中的用途。

本发明进一步涉及如在本说明书中限定的重组载体在产生性别表型被修饰的转化植物中的用途。

本发明也涉及用感兴趣核酸转化的宿主细胞在产生性别表型被修饰的转化植物中的用途。

本发明也涉及包含多个如上文限定的宿主细胞的转化植物。

本发明的转化的植物

本发明也涉及转化的植物多细胞生物体(un organisme multicellulairevégétal transformé)，其特征在于包含转化的宿主细胞或多个用至少一种上文限定的核酸或用包含这种核酸的重组载体转化的宿主细胞。

在寻求ACCS蛋白质过表达的情况中，所述转化的植物可以包含多个拷贝的编码ACCS蛋白质的核酸。当期望产生不能自花授粉的雌性花的植物时，特别寻求ACCS蛋白质的过表达。

因此本发明也涉及如上文限定的花都是雌性花或两性花的转化植物。

本发明的转化植物全部包含被人工插入进其基因组的至少一个选自核酸和上文限定的调节多核苷酸的元件。

通过对本发明的转化植物进行杂交育种获得的杂交植物也包括在本发明的范围内。

本发明也涉及如在本说明书中限定的转化植物的任何一部分，例如根，以及地上部分如茎、叶、花和特别是种子或果实。

本发明一个进一步的目的是提供由如上文限定的转化植物产生的种子(semence)或植物籽粒(graine de plante)。

典型地，这种转化的种子或籽粒包含一或多个在其基因组中包含一或多个拷贝的上文限定的第一和第二遗传控制元件的细胞，所述遗传控制元件被人工导入进所述双子叶植物使得能够任选地以受控及可诱导方式以大量水平或小量水平合成ACCS蛋白质。

在本发明的转化植物的一个优选实施方案中，ACCS蛋白质以受控方式表达，这涉及所述转化植物仅包含编码ACCS蛋白质的多核苷酸的一个功能性拷贝，所述一或多个拷贝被人工导入所述转化植物的细胞中，并且优选导入其基因组中，而在野生型植物中天然存在的编码ACCS的基因(A/a)的序列携带至少一个引起基因(A/a)缺陷表达的突变。

本发明的转化植物是双子叶植物，优选属于葫芦科，特别属于选自如下的属：

Abobra、Acanthosicyos、盒子草属(Actinostemma)、Alsomitra、Ampelosicyos、Anacaona、Apat3ingania、Apodanthera、Bambekea、冬瓜属(Benincasa)、三裂瓜属(Biswarea)、假贝母属(Bolbostemma)、Brandegea、bryonia、Calycophysum、Cayaponia、Cephalopentandra、Ceratosanthes、Chalema、Cionosicyos、西瓜属(Citrullus)、红瓜属(Coccinia)、Cogniauxia、Corallocarpus、Cremastopus、Ctenolepis、Cucumella、Cucumeropsis、甜瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、Cucurbitella、小雀瓜属(Cyclanthera)、Cyclantheropsis、Dactyliandra、Dendrosicyos、Dicoelospermum、Dieterlea、毒瓜属(Diplocyclos)、Doyerea、喷瓜属(Ecballium)、Echinocystis、Echinopepon、三棱瓜属(Edgaria)、Elateriopsis、Eureiandra、Fevillea、Gerrardanthus、锥形果属(Gomphogyne)、Gurania、Guraniopsis、金瓜属(Gymnopetalum)、绞股蓝属(Gynostemma)、Halosicyos、Hanburia、Helmontia、雪胆属(Hemsleya)、波棱瓜属(Herpetospermum)、油渣果属(Hodgsonia)、Ibervillea、藏瓜属(Indofevillea)、Kedrostis、葫芦属(Lagenaria)、Lemurosicyos、丝瓜属(Luffa)、Marah、Melancium、Melothria、Melothrianthus、Microsechium、苦瓜属(Momordica)、Muellerargia、帽儿瓜属(Mukia)、Myrmecosicyos、棒锤瓜属(Neoalsomitra)、Nothoalsomitra、Odosicyos、Oreosyce、Parasicyos、Penelopeia、Peponium、Peponopsis、Polyclathra、Posadaea、Praecitrullus、Pseudocyclanthera、Pseudosicydium、Psiguria、Pteropepon、Pterosicyos、Raphidiocystis、Ruthalicia、Rytidostylis、Schi3ocarpum、裂瓜属(Schi3opepon)、Sechiopsis、佛手瓜属(Sechium)、Selysia、Seyrigia、Sicana、Sicydium、Sicyos、Sicyosperma、Siolmatra、罗汉果属(Siraitia)、茅瓜属(Solena)、Tecunumania、Telfairia、赤瓟属(Thladiantha)、栝楼属(Trichosanthes)、Tricyclandra、Trochomeria、Trochomeriopsis、Tumamoca、Vaseyanthus、Wilbrandia、Xerosicyos、翅子瓜属(zanonia)、马瓞儿属(zehneria)、zombitsia或zygosicyos。

优选地，所述转化植物属于甜瓜属并属于甜瓜种。

本发明的检测方法

本发明人鉴别了花发育控制体系的事实使得可以开发非常简单的用于检测植物性别表型的方法，所述方法将在下文详细描述。

用于检测等位基因(A)或(a)存在的方法，所述方法包括如下步骤：

1)使如上文限定的一个核苷酸探针或多个核苷酸探针与待测样品接触；和

2)检测在探针和样品中存在的核酸之间最终形成的复合物。

用于检测等位基因(G)或(g)存在的方法，所述方法包括如下步骤：

1)使如上文限定的一个核苷酸探针或多个核苷酸探针与待测样品接触；和

2)检测在探针和样品中存在的核酸之间最终形成的复合物。

这两种检测方法使得可以选择表1中总结的植物的表型和基因型。

检测核酸和探针之间形成的复合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行，特别是通过使用标记的探针或引物进行，如在“本发明的探针和引物”部分中所述。

这些方法特别有利，因为它们使得无需培养双子叶植物以得知其性别表型。因此可以经济地从非常大量的植物样品中检测性别表型。

另外，这些方法使得能够选择晚表达表型特征，例如植物花性别表型在非常早的发育阶段(具有最早期叶的植物苗)出现。上文提到的应用使得可以节省相当多的时间和空间。

本发明人示出了(实施例1)等位基因(A)和等位基因(a)与单核苷酸多态性(SNP)相关。因此，SEQ ID n°1所示的等位基因(A)从第6074位至6077位包含一个序列AGCT，所述序列使得在SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质的第54位存在丙氨酸残基。SEQ ID n°2所示的等位基因(a)从第3817位至3820位包含一个序列AGTT，所述序列使得在ACCS蛋白质的第54位存在缬氨酸残基。

本发明人示出了在上文鉴别的两个序列中，只有在相应于等位基因(A)并且在第6076位具有胞嘧啶残基的SEQ ID n°1的第6074位至6077位的序列AGCT示出用于AluI酶的限制位点。因此使用本领域技术人员已知的所谓“分裂多态序列标记(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Markers，CAPS)”的消化方法可用于在植物中鉴别等位基因(A)或等位基因(a)的存在。

在此方法中，通过使用满足如下标准的一些特定引物进行PCR扩增步骤：

-所述引物对在SNP区侧翼，

-所述引物对使得能够扩增等位基因(A)和等位基因(a)，

-所述引物对使得能够在Alu I介导的酶消化之后观察到一些限制性片段，所述片段基于等位基因(A)或等位基因(a)是否被扩增而不同。

例如，这种引物对包括SEQ ID N°11和SEQ ID N°12。

在第二步中，将得自所述PCR的产物与限制酶Alu I在适于切割的条件下接触。

之后使用常规方法(例如基于其大小)对根据其核苷酸序列被酶消化或未消化的得自所述PCR的产物进行区分。

通过实施此方法，本领域技术人员可以容易地区别包含等位基因(A)的植物和包含等位基因(a)的植物，因为衍生自包含等位基因(A)的植物的PCR产物可以被限制酶在所述SNP水平消化。这些PCR产物可以容易地与衍生自包含等位基因(a)的植物的PCR产物(在所述SNP水平不被限制酶消化)区别。

因此本发明的另一个目的是提供用于检测等位基因(A)或(a)存在的方法，所述方法包括如下步骤：

-通过使用引物SEQ ID N°11和SEQ ID N°12PCR扩增待分析样品中的DNA，

-用限制酶Alu I消化得到的产物，和

-检测产生的限制性片段。

为了检测产生的限制性片段，本领域技术人员会进行电泳以例如根据其大小检测所述片段。

对于包含等位基因(A)的植物，获得4个限制性片段。它们的大小分别是327，197，137和116bp。

对于包含等位基因(a)的植物，获得3个限制性片段。它们的大小分别是524，137和116bp。

因此这种方法使得可以容易地检测植物的性别表型。

本发明的选择方法

上述检测方法可以在下文详细描述的选择方法中实施。

本发明的一个目的是提供用于选择属于葫芦科的属的植物的花类型的方法，特征在于其包括如下步骤：

a)在属于葫芦科的感兴趣的植物中例如通过使用如上文限定的核酸或针对ACCS蛋白质的抗体确定等位基因(A)和(a)的存在，和

b)对在基因组中包含等位基因(A)或等位基因(a)的植物进行阳性选择。

本发明一个进一步的目的是提供用于选择属于葫芦科的属的植物的花类型的方法，特征在于其包括如下步骤：

a)在属于葫芦科的感兴趣的植物中例如通过使用如上文限定的核酸确定等位基因(G)和(g)的存在，和

b)对在基因组中包含等位基因(G)或等位基因(g)的植物进行阳性选择。

确定等位基因(A)、(a)、(G)和(g)的存在可以有利地通过实施上述检测方法进行。

本领域技术人员可以通过参考说明基因型和表型之间的关系的表1容易地组合上文限定的选择方法，例如以获得仅具有雌性或两性表型的植物。

用于产生本发明的转化的植物的方法

本发明首先涉及用于产生转化植物的方法，所述方法的目的是将等位基因(A)插入不含有这个等位基因的植物中。

因此本发明的一个目的是提供用于产生属于葫芦科并包含雌性花的转化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步骤：

a)用核苷酸序列(NA)或包含这个核酸的重组载体转化在基因组内不包含等位基因(A)的感兴趣植物的至少一个植物细胞，

b)选择在步骤a)中获得的具有整合进基因组中的核酸(NA)的转化的细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物。

这类方法特别有用，因为其使得可以将等位基因(A)插入进植物基因组中，所述植物因此具有雌雄同体或全雌性表型。

本发明一个进一步的目的是提供用于转化植物的方法，所述方法的目的是从植物中移除等位基因(A)，或用等位基因(a)取代等位基因(A)以获得具有两性表型的植物。

因此本发明的一个目的是提供用于产生属于葫芦科并具有两性花的转化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步骤：

a)在植物中用等位基因(a)取代等位基因(A)，

b)选择在步骤a)中获得的等位基因(a)整合进基因组的转化的细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物，

d)对步骤c)中获得的植物进行杂交育种以获得不再含有等位基因(A)的植物。

在上述方法的第一个实施方案中，步骤a)由用如上文限定的“反义”类型的核酸转化在其基因组内包含等位基因(A)的植物并选择不再含有等位基因(A)的植物组成。

可以通过使用同源重组技术获得相同的结果，所述技术的目的是用使得不能获得相应于等位基因(A)的表型的具有受损结构的核酸取代核酸(NA)的全部或部分。

这种具有受损结构的核酸可以是调节多核苷酸(Pa)或编码改变的ACCS蛋白质的核酸。

因此本发明的一个目的是提供用于产生属于葫芦科并具有两性花的转化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步骤：

a)用调节多核苷酸(Pa)或用编码改变的ACCS蛋白质的核酸或包含这种核酸的重组载体转化包含等位基因(A)的感兴趣植物的至少一个植物细胞，

b)选择在步骤a)中获得的在基因组内整合了至少一个拷贝的调节多核苷酸(Pa)或编码改变的ACCS蛋白质的核酸的转化的细胞，

c)从在步骤b)中获得的的转化的细胞再生转化的植物，

d)对步骤c)中获得的植物进行杂交育种以获得不再含有等位基因(A)的植物。

这类方法特别有用，因为其使得可以获得不再含有任何等位基因(A)的植物，并且所述植物是雄性两性同体或两性类型。

本发明也涉及用于转化植物的方法，所述方法的目的是插入等位基因(G)。

因此本发明的一个目的是提供用于产生属于葫芦科并具有雌性花的转化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步骤：

a)用核苷酸序列(NG)或包含这个核酸的重组载体转化在其基因组内不包含等位基因(G)的感兴趣植物的至少一个植物细胞，

b)选择在步骤a)中获得的具有整合进基因组中的核酸(NG)的转化的细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物。

本发明也涉及用于转化植物的方法，所述方法的目的是用等位基因(g)取代等位基因(G)。

因此本发明的一个目的是提供用于产生属于葫芦科并具有两性花的转化植物的方法，所述方法的特征在于包括如下步骤：

a)在植物中用等位基因(g)取代等位基因(G)，

b)选择在步骤a)中获得的具有整合进基因组中的等位基因(g)的转化的细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物，

d)对步骤c)中获得的植物进行杂交育种以获得不再含有任何等位基因(G)的植物。

上述方法可以通过基于表1组合起来，以获得仅具有雌性或仅具有两性表型的植物，上文已经讨论过所述植物的工业用处。

为了简化用于产生仅具有雌性花或仅具有两性的转化植物的方法，可以在上文定义的方法中进行一个预先步骤：在所述步骤中进行植物中天然存在的基因(A/a)和(G/g)的突变，所述突变例如通过将转座子Mutator插入进具有野生型表型的植物群，之后在得到的具有基因型(aagg)的突变株中进行检测进行，所述检测例如使用实施例中描述的核苷酸探针或引物进行。

在这个优选的实施方案中，本发明的转化植物的特征在于其含有基因型(aagg)并仅具有两性花。

在用于产生如上文限定的转化植物的方法的一个实施方案中，当使用时，核苷酸(NA)包含可诱导激活调节多核苷酸(PA)。

因此本发明的一个目的也是提供用于产生植物种子的方法，所述种子当发育时产生具有雌性花的植物，所述方法包括如下步骤：

a)培养在其基因组中不包含如上限定的等位基因(A)的感兴趣的植物，所述植物用包含可诱导激活调节多核苷酸(PA)的核苷酸序列(NA)或用包含这个核酸的重组载体转化

在不存在诱导信号(所述可诱导激活调节多核苷酸对其敏感)的情况下，

b)将a)中限定的转化植物与所述可诱导激活信号(所述可诱导激活多核苷酸对其敏感)接触，

c)回收成熟种子，所述种子当发育时仅产生具有雌性花的植物。

在一个进一步的实施方案中，可诱导阻抑调节多核苷酸(Pa)用于取代植物中天然存在的调节多核苷酸，并且使得可以在预定时间降低ACCS蛋白质水平。

-用于产生仅具有雌性花的植物的优选的方法

最优选地，本发明涉及用于产生仅具有雌性花的植物的方法，所述方法的特征在于由如下组成：

-通过进行上述检测方法检测等位基因(A)、(a)、(G)和(g)，和

-通过进行如上文限定的选择方法或用于产生转化植物的方法获得包含至少一个拷贝的等位基因(A)并且不包含等位基因(G)的拷贝的植物。

通过上述方法获得的植物仅具有雌性花，并且因此从工业角度看特别感兴趣，因为它们不能自花授粉。这些植物因此可以用于选择方法以获得杂交植物。

用于产生仅具有两性花的植物的优选的方法

最优选地，本发明涉及用于产生仅具有两性花的植物的方法，所述方法的特征在于由如下组成：

-通过进行上述限定的检测方法检测等位基因(A)、(a)、(G)和(g)，和

-通过实施如上文限定的选择方法或用于产生转化植物的方法获得不包含等位基因(A)的拷贝并且不包含等位基因(G)的拷贝的植物。

通过上述方法获得的植物仅具有两性花，并且因此从工业角度看特别感兴趣，因为它们不能自花授粉。这些植物因此可以用于产生纯植物品系的方法。

用于转化本发明的植物的方法

用于将核酸导入植物细胞的最广泛应用的方法可以用于本发明中。

转化植物细胞可以使用各种方法实现，所述方法例如通过在将植物原生质体在存在二价阳离子(Ca⁺⁺)的情况下在聚乙二醇溶液中保温之后将上文提到的载体转移进所述植物原生质体、通过电穿孔(Fromm et al.1985)、使用基因枪、或通过胞质或核显微注射(Neuhaus et al，1987)进行。

可以用于本发明的用于转化植物细胞的一种方法包括用包含具有感兴趣序列的载体的细菌宿主细胞转染植物细胞。所述宿主细胞可以是根瘤土壤杆菌(An et al.1986)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)(Guerche et al.1987)。

优选地，转化植物细胞通过使用双元系统(Watson et al.，1994)进行的根瘤土壤杆菌的根癌诱导Ti染色体外环状质粒的T区转移实现。为此目的，制备两个载体。在其中一个载体中，通过缺失移除除了左右边界之外的DNA-T区，在所述左右边界之间插入基因标记以使得能够在植物细胞内进行选择。所述双元系统的第二个成员是辅助Ti质粒，其是不再含有任何DNA-T但是仍旧含有转化所述植物细胞所必需的入侵基因vir的修饰的质粒。这个质粒在土壤杆菌(Agrobacterium)内维持。

在一个优选的实施方案中，可以将Ishida et al.(1996)描述的方法用于转化双子叶植物。根据另一个方法，所述转化通过Finer et al.(1992)描述的方法使用基因枪用钨或金颗粒进行。

实施例

实施例1：鉴别单核苷酸多态性(SNP)

包含基因(A/a)区域的启动子的DNA片段(起始密码子上游2kb)的序列分析揭示了在5′调控区内和在内含子序列内的高水平多态性，而在蛋白质编码序列内仅鉴别出一个偶然突变(图1A)。核酸上的这个偶然突变导致ACCS蛋白质多肽序列在第57位的丙氨酸残基被缬氨酸残基取代(图1B)。通过使用用于推断氨基酸取代的方法(基于序列和物理性质同源性)，已经分析了在等位基因a中鉴别的偶然突变是否对于蛋白质功能有害。

SIFT软件(Ng PC and Henikoff S.，2001)确实推断Ala57Val取代对功能A具有高度有害作用。另外苹果和番茄中的ACC合酶的晶体结构分析(Capitani et al.，2002；Huai et al.，2001)确实提示这个氨基酸的关键性作用。

在鉴别了这个单核苷酸多态性(或SNP)之后，在30个瓜类种质收集物中对单元型和关联性分析揭示出这个SNP与性别表型完全相关。所有雌雄同体的查询对象在第57位都携带丙氨酸，而所有雄性两性同体的查询对象都携带缬氨酸。未发现例外情况，并且在此位置也没有任何其他类型的氨基酸改变。

最后，分析这个单核苷酸多态性以鉴别可以用于开发基于所谓“分裂多态序列标记”(CAPS)的消化方法的限制酶。已经证明了核苷酸C被核苷酸T取代导致在等位基因a中失去限制位点Alu I。

实施例2：遗传控制元件(A/a)的空间和时间表达

为了分析遗传控制元件A/a以等位基因A形式的表达，通过使用等位基因A特异性探针在基因型AA GG、aa GG、AA gg和aa gg的植物内，更特别地在雄性、雌性和两性植物花分生组织内进行原位杂交。在花分生组织A中，所述表达呈现局部高水平，并且杂交信号特别在雌雄同体、雄性两性同体、两性花和两性植物的雌性和两性花的心皮原基中检测到。参考对于黄瓜描述的各种花发育阶段(Bai et al.，2004)，在瓜类中显示基因(A/a)在花分生组织发育的早期阶段(在雄性花和雌性花之间可能出现形态学区别之前)表达。

在雄性花和两性中，在花药中检测不到表达。这些结果提示等位基因(A)在雌性花心皮中的表达抑制雄蕊发育。由于两性花中的隐性等位基因(a)与雌性花中的等位基因(A)具有相同表达谱，因此可以得出结论基因A的功能依赖于其组织表达特异性和合成的ACCS蛋白质的性质。

实施例3：在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的转基因

基因A/a和ACCS蛋白质在不属于葫芦科的植物中对花性别表型和花结构的可能作用已经通过用土壤杆菌转化拟南芥进行了研究。携带瓜类等位基因A或a的拟南芥(Arabidopsis)转基因植物在花结构和长角果水平具有表型(图2A和2B)。事实上拟南芥转化子的长角果比野生型拟南芥植物的长角果更短，并且拟南芥转化子的花结构受到高度影响。这些结果使得能够将瓜类基因(A/a)的用途扩展到不属于葫芦科的双子叶植物。

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<110>国立农业研究所-INRA

<120>用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统以及在检测和选择过程中的应用

<130>U144FR

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>13380

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>1

<210>2

<211>11137

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>2

<210>3

<211>445

<212>PRT

<213>Cucumis melo

<400>3

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>4

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>5

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>Cucumis melo

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<211>16177

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>7

<210>8

<211>445

<212>PRT

<213>Cucumis melo

<400>8

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>9

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>Cucumis melo

<400>10

Claims (27)

1.用于控制双子叶植物花类型发育的遗传系统，所述系统包括两个遗传控制元件的组合，其分别是：

-以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)，其中：

-所述显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，所述核酸包括：

(i)在双了叶植物中发挥功能的调节多核苷酸(PA)，和

(ii)表达被所述调节多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质，

-所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因(A)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NA)，或

(ii)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，或

(iii)编码非活性ACCS蛋白质的核酸，或

(iv)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，和编码非活性ACCS蛋白质的核酸，和

-以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，其中：

-所述显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，所述核酸的表达

引起雄性两性同体或雌雄同体植物的发育，和

-所述隐性等位基因(g)与所述显性等位基因(G)通过如下区别：

(i)在所述植物中不存在的核酸(NG)，或

(ii)在双子叶植物中存在核酸(Ng)，所述核酸表达引起两性或全雌性植物的发育，

条件是所述第一遗传控制元件已经被人工插入进所述双子叶植物。

2.权利要求1的系统，其特征在于所述遗传控制元件(A/a)是以与等位基因(a)相比是显性的等位基因(A)的形式存在的核酸，其中：

-所述等位基因(a)包含

(i)在双子叶植物中发挥功能的调节多核苷酸(PA)，和

(ii)被所述调节多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质，和

-所述等位基因(a)与所述等位基因(A)的区别在于其包含

(i)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)，或

(ii)编码非活性ACCS蛋白质的核酸，或

(iii)在双子叶植物中非功能性的调节多核苷酸(Pa)和编码非活性ACCS蛋白质的核酸。

3.权利要求1或2的系统，其特征在于编码ACCS蛋白质的核酸从5′末端至3′末端至少包含：

(iv)与序列SEQ ID N°1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％相同性的序列，

(v)与序列SEQ ID N°1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％相同性的序列，和

(vi)与序列SEQ ID N°1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％相同性的序列。

4.权利要求1-3任一项的系统，其特征在于所述调节多核苷酸(PA)包含序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。

5.权利要求1-4任一项的系统，其特征在于所述调节多核苷酸(Pa)包含序列SEQ ID N°2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

6.权利要求1-5任一项的系统，其特征在于所述调节多核苷酸(PA)和/或所述调节多核苷酸(Pa)对于诱导信号的作用敏感。

7.权利要求1-6任一项的系统，其特征在于所述调节多核苷酸(PA)是可诱导的转录或翻译激活多核苷酸。

8.权利要求1-7任一项的系统，其特征在于所述调节多核苷酸(Pa)是可诱导的转录或翻译阻抑多核苷酸。

9.一种核酸，从5′末端到3′末端至少包含：

(iv)与序列SEQ ID N°1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％相同性的序列，

(v)与序列SEQ ID N°1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％相同性的序列，和

(vi)与序列SEQ ID N°1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％相同性的序列。

10.呈等位基因(A)形式的序列SEQ ID N°1的核酸，例如如权利要求2中所限定的。

11.呈等位基因(a)形式的序列SEQ ID N°2的核酸，例如如权利要求2中所限定的。

12.一种核酸，包含序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。

13.一种包含核苷酸序列的核酸，与序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸对比，所述核苷酸序列包含选自取代、插入或缺失的改变，与由序列SEQ ID N°1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的ACCS蛋白质的表达相比，所述改变的核酸当控制序列SEQ ID N°3所示的ACCS蛋白质的表达时导致所述蛋白质的改变的表达。

14.权利要求13的核酸，包含序列SEQ ID N°2的核苷酸1至核苷酸3650的序列。

15.一种重组载体，包含如权利要求3至8任一项限定的核酸或权利要求9至14任一项的核酸。

16.一种宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求3至8任一项限定的核酸或用权利要求9至14任一项的核酸或用权利要求15的重组载体转化。

17.权利要求16的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是属于葫芦科(cucurbitaceae)优选属于甜瓜物种(cucumis melo)的植物细胞。

18.属于葫芦科的植物，所述植物用权利要求3至8任一项限定的核酸或权利要求9至14任一项的核酸或用权利要求15的重组载体转化。

19.权利要求18的转化的植物，其特征在于所述植物包含至少一个如权利要求1中限定的等位基因(A)。

20.转化的植物，所述植物包含多个权利要求16或17的宿主细胞。

21.一种核酸，所述核酸用作探针或引物，其与如权利要求3至8任一项限定的核酸或权利要求9至14任一项的核酸特异地杂交。

22.权利要求21的核酸，其与序列SEQ ID N°1或SEQ ID N°2所示的核酸或其互补序列核酸特异地杂交，其特征在于所述核酸分别选自SEQID N°7和SEQ ID N°8。

23.用于检测如权利要求1中限定的等位基因(A)或(a)的存在的方法，所述方法包括如下步骤：

1)使权利要求21的一个核苷酸探针或多个核苷酸探针与待测样品接触；

2)检测在所述探针和样品中存在的核酸之间可能形成的复合物。

24.用于检测等位基因(A)或(a)的存在的方法，所述方法包括如下步骤：

1)使用引物序列SEQ ID N°11和SEQ ID N°12通过PCR扩增待分析的样品中的DNA，

2)用限制酶AluI消化得到的产物，和

3)检测产生的限制性片段。

25.用于选择属于葫芦科的植物的花类型的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

a)在属于葫芦科的感兴趣的植物中确定如权利要求1所限定的等位基因(A)和(a)的存在，和

b)对在基因组中包含等位基因(A)或等位基因(a)的植物进行阳性选择。

26.用于产生属于葫芦科并包含雌花的转化植物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

a)用如权利要求1中限定的核苷酸序列(NA)或包含这个核酸的重组载体转化在基因组内不包含如权利要求1中限定的等位基因(A)的感兴趣的植物的至少一个植物细胞，

b)选择在步骤a)中获得的具有整合进基因组中的核酸(NA)的转化细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化细胞再生转化植物。

27.用于产生属于葫芦科并具有两性花的转化植物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

a)在植物中用如权利要求1中限定的等位基因(a)取代如权利要求1中限定的等位基因(A)，

b)选择在步骤a)中获得的具有整合进基因组中的等位基因(a)的转化细胞，

c)从在步骤b)中获得的转化细胞再生转化植物，

d)对步骤c)中获得的植物进行杂交育种以获得不再含有如权利要求1中限定的等位基因(A)的植物。

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