CN112251529A

CN112251529A - 与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112251529A
Application number: CN202011137379.2A
Authority: CN
Inventors: 赵钢军; 吴海滨; 罗剑宁; 龚浩; 李俊星; 郑晓明; 刘小茜
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112251529B

Abstract

本发明公开了与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记M4547，位于9号染色体44.96‑49.10Mb之间，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可利用其对丝瓜的育种后代进行苗期全雌性鉴定，其在苗期的检测准确率可达98.5％，省去了成株期雌性鉴定，节省成本、提高育种效率。同时省去制种过程中母本人工去雄的程序，大大提高了生产效率，同时避免了人工去雄不彻底、产生假杂种的情况，确保了杂交种的纯度，加速育种进程。本发明的鉴定方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。

Description

与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用。

背景技术

丝瓜是一种重要的多功能蔬菜。丝瓜果实富含维生素、氨基酸、微量元素和抗氧化物质，具有清热消暑、止血消炎的功效，是一种药食兼用的多功能蔬菜。近年来，随着人们对营养健康的重视，丝瓜的播种面积逐年增大，特别对于华南地区而言，丝瓜已成为广东、广西、海南、及港澳地区重要的日常消费蔬菜。

隐性全雌株在葫芦科杂交一代商品种生产中具有巨大的应用前景。利用全雌系制种的理想方案为：以优良全雌株作母本，雌雄同株的正常植株作父本，利用昆虫自然传粉辅助人工授粉生产杂交种；全雌株利用硝酸银诱雄自交留种。由于省去了母本人工去雄的程序，大大提高了生产效率，同时避免了人工去雄不彻底、产生假杂种的情况，确保了杂交种的纯度。目前在黄瓜、丝瓜、节瓜、苦瓜，利用雌性系(强雌系)制种已经在生产中大规模应用。但是雌性系仍然会产生少量雄花，生产中仍然需要人工去雄，无法避免人工去雄不彻底导致的混杂情况。全雌系没有雄花、全部是雌花，可以很好的解决以上问题。因此开发丝瓜全雌连锁分子标记，对于丝瓜生产具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记。

本发明的第二个目的在于提供上述Indel分子标记在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第三个目的在于提供扩增上述Indel分子标记的引物。

本发明的第四个目的在于提供上述引物在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第六个目的在于提供上述试剂盒在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第七个目的在于提供一种全雌丝瓜的鉴定方法。

本发明的第八个目的在于提供一种丝瓜辅助育种方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记，位于9号染色体的44.96-49.10Mb之间。

根据本发明第一个方面所述的与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述Indel分子标记在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种用于扩增本发明第一个方面所述Indel分子标记的引物。

根据本发明的第三个方面，所述引物序列如下所示：

M4547-F:5’-TGAAACTGCAATTAGATTCTGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

M4547-R:5’-TTGTCAAGCTCACCTTCCAC-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面所述引物在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含本发明第三个方面所述引物。

本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面所述试剂盒在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

本发明的第七个方面，提供一种全雌丝瓜的鉴定方法，包括如下步骤：

S1：以待检测丝瓜的基因组DNA为模板，使用本发明第三个方面所述引物进行PCR扩增；

S2：分析电泳结果，如果只含有如SEQ ID NO.1所示的条带，则该样品为全雌丝瓜。

本发明的第八个方面，提供一种丝瓜辅助育种方法，包括检测本发明第一个方面所述与全雌丝瓜相关的分子标记或者通过本发明第三个方面所述引物或本发明第五个方面所述试剂盒进行分子标记检测的步骤。

本发明的有益效果是：

本发明提供一种与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记M4547，可利用其对丝瓜的育种后代进行苗期全雌性鉴定，有效地将含有全雌性状的植株保留下来，淘汰非全雌性状植株，其在苗期的检测准确率可达98.5％，可用于鉴定或辅助鉴定丝瓜的全雌性状，省去了成株期雌性鉴定，节省成本、提高育种效率。同时省去制种过程中母本人工去雄的程序，大大提高了生产效率，同时避免了人工去雄不彻底、产生假杂种的情况，确保了杂交种的纯度，加速丝瓜育种进程。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为全雌系W207和雌雄异花同株系S304杂交所得F2代性状分离图。其中A为雌雄异花同株S304；B为全雌系突变体W207；A1为S304雌雄异花同株花序；A2为S304丝瓜果实；B1为全雌系突变花序；B2为全雌系突变花序的果实。

图2为丝瓜全雌BSA-Seq定位。

图3为雌雄同株亲本S304，F1和部分F2的Indel分子标记M4547检测。其中第1泳道为Marker，2-23泳道部分F2，其中2-9、11-14、16-20、22-23为雌雄同株系，10、15、21为全雌系，24为F1，25为雌雄同株亲本S304。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1筛选与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记

1、全雌系W207和雌雄异花同株系S304杂交，其中F1为雌雄异花同株，F2性状发生分离，具体情况见图1，其中雌雄异花同株有214株，全雌株有66株，经过卡方检验，雌雄同株异花株：全雌株分离比符合3：1孟德尔遗传定律(χ2＝0.23，P＝0.58)，说明丝瓜全雌性状由隐性单基因控制。

在F2群体中分别随机选取雌雄同株和全雌各50株，利用CTAB法提取DNA，分别等摩尔量混合成雌雄同株池和全雌池，利用TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(Illumina)对雌雄同株池和全雌池进行DNA建库，通过Illumina HiSeq2000测序。获得的原始数据利用自主开发的Perl脚本提取多态性SNP，并且计算SNP指数(SNP-index)。进一步计算两个池SNP-index的差值(即deltaSNP-index)并作图，最终确定目的基因位于9号染色体44.96-49.10Mb之间，具体见图2。

利用材料基因组序列差异，开发Indel标记，根据序列设计分子标记M4547的引物对，其其序列如下所示：

M4547-F:5’-TGAAACTGCAATTAGATTCTGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

M4547-R:5’-TTGTCAAGCTCACCTTCCAC-3’(SEQ ID NO.4)。

实施例2 Indel分子标记M4547在全雌丝瓜鉴定中的应用

1、提取丝瓜F2单株基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用M4547的引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为：

10×buffer：1μL

Mg²⁺：1μL(使用浓度25mM)

dNTP：1μL(使用浓度2.5mM)

M4547-F：0.5μL(使用浓度10μM)

M4547-R：0.5μL(使用浓度10μM)

DNA模板：1μL(使用浓度100ng/μL)

Tap酶：0.25μL，

ddH2O：4.75μL；

PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸25s，35次循环后，72℃保持2min。

PCR反应产物用1％的琼脂糖凝胶进行检测，结果如图3所示。

从图3可以看出，M4547引物对在全雌材料中，可以扩增出138bp条带，而在雌雄异花同株系S304中，扩增出294bp的条带，F1中扩增出138bp和294bp的条带。利用M4547引物对检测F2群体，发现全雌系98.5％(65/66)扩增出的条带为138bp(SEQ ID NO.1)，94.9％(203/214)雌雄同株系扩增出的片段为294bp(SEQ ID NO.2)，或者138bp和294bp。可见分子标记M4547在全雌系和雌雄异花同株系之间具有多态性，全雌系扩增出的条带为138bp；雌雄异花同株系扩增出的条带为294bp，或者138bp和294bp。

TGAAACTGCAATTAGATTCTGAGGAAAAAAAAGGCATTTGCAGGACATCAAAAAAGTAATTTTAACTAATCAAATATTATTCACGCTAATATCTCATATGGTCAAACAAGCTTTAAAGTGGAAGGTGAGCTTGACAAA(SEQ IDNO.1)

TGAAACTGCAATTAGATTCTGAGCGGAAACGGGGCATTTCAGAACATAAAAAACGTAGTTTTAACTAATCAAATATACATCATCTTCTGAACTTAAGAAGATGGCGTTCATAAACATTGCAGATTTGTCCCATTCATTAATGAAAATCAATCAAAATAGAATTATCAAACGTCGAGATATATCAACCAAACCCAACAAGAAATAACATTAAATTCAGAAAAATTCACTAGTATTCTTCACGCTAATATCTCATATGGTCAAAGAAGATTTAAAGTGGAAGGTGAGCTTGACAAA(SEQ ID NO.2)

因此，分子标记M4547可作为丝瓜全雌性状的分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定丝瓜的全雌性状。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaaactgca attagattct gaggaaaaaa aaggcatttg caggacatca aaaaagtaat 60

tttaactaat caaatattat tcacgctaat atctcatatg gtcaaacaag ctttaaagtg 120

gaaggtgagc ttgacaaa 138

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaaactgca attagattct gagcggaaac ggggcatttc agaacataaa aaacgtagtt 60

ttaactaatc aaatatacat catcttctga acttaagaag atggcgttca taaacattgc 120

agatttgtcc cattcattaa tgaaaatcaa tcaaaataga attatcaaac gtcgagatat 180

atcaaccaaa cccaacaaga aataacatta aattcagaaa aattcactag tattcttcac 240

gctaatatct catatggtca aagaagattt aaagtggaag gtgagcttga caaa 294

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaactgca attagattct gag 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgtcaagct caccttccac 20

Claims

1.与丝瓜全雌性状紧密连锁的Indel分子标记，位于9号染色体的44.96-49.10Mb之间。

2.根据权利要求1所述的Indel分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种引物，所述引物用于扩增权利要求1或2所述Indel分子标记。

4.根据权利要求3所述引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：

M4547-F:5’-TGAAACTGCAATTAGATTCTGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

M4547-R:5’-TTGTCAAGCTCACCTTCCAC-3’(SEQ ID NO.4)。

5.一种试剂盒，包含权利要求3或4所述的引物。

6.权利要求1或2所述的Indel分子标记在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

7.权利要求3或4所述的引物在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

8.权利要求5所述的试剂盒在全雌丝瓜鉴定和/或辅助育种中的应用。

9.一种全雌丝瓜的鉴定方法，包括如下步骤：

S1：以待检测丝瓜的基因组DNA为模板，使用权利要求3或4所述的引物进行PCR扩增；

10.一种丝瓜辅助育种方法，包括检测权利要求1或2所述与全雌丝瓜相关的分子标记或者通过权利要求3或4所述引物或权利要求5所述试剂盒进行分子标记检测的步骤。