CN104313020A - 与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记B36-SEQ137，其定位于黄瓜第6号染色体上，大小为137bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。可利用其对华南型全雌黄瓜的育种后代进行苗期全雌性检测，有效地将含有全雌性状的植株保留下来，淘汰非全雌性状植株，其在苗期的检测准确率可达97%以上。本发明不仅能够加快育种进程，降低育种成本，提高育种效率，还能够推进传统育种向分子育种的转变。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。

Description

与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记及其应用。

背景技术

黄瓜（Cucumis sativus L.）是世界上的主要蔬菜之一。目前我国主要栽培品种有华北型和华南型两大类型。华南型黄瓜新品种选育发展迅速，育成了一批新品种，在华南地区蔬菜生产中发挥了重要作用，并取得了显著的经济效益和社会效益。

黄瓜性别分化类型丰富多样，并与黄瓜产量直接相关。全雌黄瓜具有高产特性，因而在育种上具有较高的应用价值，并得到广泛的应用。

先前报道的关于全雌性状的分子标记主要集中在欧美类型小黄瓜，如美国鲜食全雌黄瓜Marketmore76F，欧洲温室类型的两个全雌黄瓜材料“戴多星”和9110Gt。到目前为止，仅从Marketmore76F中克隆到一个全雌基因CsACS1G。

目前，关于华南型黄瓜全雌基因以及分子标记的研究鲜有报道，而筛选到合适的与目标性状连锁的分子标记，有利于加速育种进程，提高育种效率。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记。

本发明的另一个目的在提供与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记在全雌黄瓜辅助选择育种中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记B36-SEQ137，其定位于黄瓜第6号染色体上，大小为137 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用于PCR扩增权利要求1或2所述indel分子标记B36-SEQ137的引物对。其序列如下所示：

Cs-gy-indel-F：5’- GATTCGAAGAAGAAAGGCG -3’（SEQ ID NO.2）；

Cs-gy-indel-R：5’- CATCGAACACATCCACTC-3’（SEQ ID NO.3）。

所述的与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记应用于全雌黄瓜辅助选择育种。

一种华南型全雌黄瓜的筛选方法，包括如下步骤：

（1）以待检黄瓜植株的基因组DNA为模板，使用权利要求4的引物对进行PCR扩增；

（2）对电泳产物进行电泳分析，如果产物中含有如SEQ ID NO.1所示的条带，则该样品为全雌黄瓜。

本发明的有益效果是：

本发明所提供一种与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记B36-SEQ137，可利用其对华南型全雌黄瓜的育种后代进行苗期全雌性检测，有效地将含有全雌性状的植株保留下来，淘汰非全雌性状植株，其在苗期的检测准确率可达97%以上。本发明不仅能够加快育种进程，降低育种成本，提高育种效率，还能够推进传统育种向分子育种的转变。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为华南型全雌黄瓜的表型图。

图2为华南型全雌黄瓜B36和华南型弱雌黄瓜S6中的indel分子标记序列比对。分别以B36和S6的DNA为模板，利用Cs-gy-indel-F和Cs-gy-indel-R引物进行PCR扩增，并将扩增产物测序，随后，将测序结果进行比对。比对结果显示全雌标记比弱雌标记长12 bp。

图3为‘早青4号’自交F1代中部分全雌性状个体的indel分子标记检测：“早”为‘早青4号’，1-35单株个体为自交F1代中具有全雌性状的个体。

图4为‘早青2号’自交F1代的indel分子标记检测：“早”为‘早青2号’，1-38单株个体为F1代，其中1-31为全雌表型，32-38为弱雌表型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 

筛选与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记：

（1）以华南型全雌黄瓜B36作为母本，华南型弱雌黄瓜S6作为父本，构建F2群体；

（2）采用CTAB法提取黄瓜亲本、F1代及F2代幼苗基因组DNA；

（3）以黄瓜基因组DNA为模板，使用引物Cs-gy-indel-F（5’-GATTCGAAGAAGAAAGGCG-3’）（SEQ ID NO.2）和Cs-gy-indel-R（5’- CATCGAACACATCCACTC-3’）（SEQ ID NO.3）对DNA模板进行PCR扩增，并进行电泳分析；

（4）对黄瓜F2个体表型（全雌或弱雌）与基因型进行比较分析；

（5）确定indel分子标记B36-SEQ137为华南型黄瓜全雌性状连锁标记，其核苷酸序列如下所示：

CATCGAACACATCCACTCCCACAACAATCCCCCGGCAACGGCTTCTCCGGCGGCGGTGGCAATTTCACCATCTCCTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTGCTTTCTCCTCCTCCACGCCTTTCTTCTTCGAATC（SEQ ID NO.1）

图2为华南型全雌黄瓜B36和华南型弱雌黄瓜S6中的indel分子标记序列比对，两者相差12 bp（CTCTTTCTCTTT）。

实施例2

indel分子标记B36-SEQ137在全雌黄瓜辅助选择育种中的应用

利用引物Cs-gy-indel-F和Cs-gy-indel-R对‘早青4号’黄瓜的自交F2代带有全雌表型的35个单株进行基因型检测：

（1）黄瓜幼苗DNA的提取

实验材料为‘早青4号’黄瓜的自交F2代带有全雌表型的35个单株。步骤如下：

①用液氮在2ml的eppendorf管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μl 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65 ℃水浴中温浴50min(每隔5min摇动一次)。

②静置至室温后在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清(约800μl)转移到新的2ml eppendorf管。

③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，静置3--5分钟,在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml eppendorf管中。

④加2/3体积340μl预冷的异丙醇，缓慢混匀(缓慢颠倒20次)，置于-20 ℃下培养30min。

⑤在4℃ 下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μl预冷的 70%乙醇洗涤DNA沉淀(两次)，微干。

⑥加入100μl无菌水溶解。

（2）PCR 扩增：

PCR体系（20μl）

DNA模板：5ng

引物正向：0.5μl

引物反向：0.5μl

dNTP：2.0μl（使用浓度2.0Mm）

Mg²⁺：1.2μl(使用浓度2.5mM)

10×PCR buffer：2.0μl

Taq酶：0.2μl

ddH₂0：补足20μl

PCR扩增程序：

94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。

（3）凝胶电泳

扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgNO₃银染15min；银染后用2%NaOH 、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃显色，显色后在灯箱上拍照分析。

（4）扩增结果

如图3所示，‘早青4号’黄瓜样本扩增出137 bp（SEQ ID NO.1）和125 bp两条条带，被检测的35个F2个体中有34个含有这两条条带或只含有SEQ ID NO.1条带，仅有第28号单株一株不含有SEQ ID NO.1条带，全雌标记有效率达97%以上。

35个单株继续种植至花期，观察花朵的雌雄类型，除28号单株有误外，其它单株的结果与PCR扩增结果相一致。

实施例3

采用实施例2的方法对‘早青2号’黄瓜的自交F2代进行检测，其中1-31为全雌表型，32-38为弱雌表型，检测结果为‘早青2号’黄瓜样本扩增出137 bp（SEQ ID NO.1）和125 bp两条条带，弱雌表型单株均不含SEQ ID NO.1条带，而全雌表型单株均扩增出SEQ ID NO.1条带，全雌标记有效率为100%。（见图4）。

35个单株继续种植至花期，观察花朵的雌雄类型，其结果与PCR扩增结果相一致。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  广东省农业科学院蔬菜研究所

 

<120>  与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记及其应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  137

<212>  DNA

<213>  Cucumis sativus L.

 

<400>  1

catcgaacac atccactccc acaacaatcc cccggcaacg gcttctccgg cggcggtggc       60

 

aatttcacca tctcctcttt ctctttctct ttctctttct ctgctttctc ctcctccacg      120

 

cctttcttct tcgaatc                                                     137

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gattcgaaga agaaaggcg                                                    19

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

catcgaacac atccactc                                                     18

Claims (6)

1.与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记B36-SEQ137，其定位于黄瓜第6号染色体上，大小为137 bp。

2.根据权利要求1所述的与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记B36-SEQ137，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.用于PCR扩增权利要求1或2所述indel分子标记B36-SEQ137的引物对。

4.根据权利要求3所示的用于PCR扩增indel分子标记B36-SEQ137的引物对，其序列如下所示：

Cs-gy-indel-F：5’- GATTCGAAGAAGAAAGGCG -3’（SEQ ID NO.2）；

Cs-gy-indel-R：5’- CATCGAACACATCCACTC-3’（SEQ ID NO.3）。

5.权利要求1或2所述的与华南型黄瓜全雌性状紧密连锁的indel分子标记应用于全雌黄瓜辅助选择育种。

6.华南型全雌黄瓜的筛选方法，包括如下步骤：

（1）以待检黄瓜植株的基因组DNA为模板，使用权利要求3或4的引物对进行PCR扩增；

（2）对电泳产物进行电泳分析，如果产物中含有如SEQ ID NO.1所示的条带，则该样品为全雌黄瓜。