TWI635182B - 用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明有關於一種用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用。此分子標記包含複數個特定的單核酸多型性位點、基因體序列以及轉錄體序列。前述分子標記之至少一者與性別相關性狀基因之任一者可被定義對應關係，以建立相關性模式。當木瓜樣本之花器於早期發育時，可利用相關性模式評估其花器之分子標記，以鑑別此木瓜樣本之性別以及性別相關性狀。

Description

用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用

本發明是有關於一種分子標記及其應用，特別是有關於一種分子標記及其用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之方法及系統。

番木瓜(Carica papaya L.)俗稱木瓜，屬番木瓜科(Caricaceae)，番木瓜屬(Carica)植物。番木瓜一年四季都能結果其含豐富的營養價值，為熱帶地區的重要作物。番木瓜同時具有雌雄異株異花(dioecious)，分別是雌株(Female，F)、雄株(Male，M)及雌雄同株同花之兩性株(Hermaphrodite，H)。

一般而言，雄株不結果，不具經濟價值。雌株需人工授粉才能結果。兩性株可自花授粉，經濟價值高，因此商業栽培者較希望種植純兩性株。

番木瓜從生長至花蕾形成前，不論是葉型、莖幹顏色、株型等各種外部型態，都尚未發現與植株性別連鎖的外部特徵，無法利用外部型態判斷植株性別。農民為得到 較具商業價值的兩性株，須於每一植穴中種植2-3株番木瓜苗，等生長6-8個月待植株花蕾形成後，始能由花朵構造確認其性別，此時再選留一棵兩性株，其餘植株砍除，以達到全園生產長橢圓形的兩性果。然而這樣的栽培方式不僅造成番木瓜幼苗期的養分競爭與浪費，也造成栽培者大量的勞力支出，增加苗木費用與管理費用。此外，部分植穴可能因無栽植到兩性株而造成缺株情形，不易控制正常株距。

為了生產同一性別的番木瓜種苗，番木瓜種苗業者經常採行無性繁殖法，如利用組織培養、扦插、嫁接等技術。在這些方式中，組織培養繁殖之商業生產，其繁殖倍數高且所有植株均為兩性株是其優點，但是這種生產方式的技術門檻高，生產成本相對提高，致使組織培養苗的售價約為實生苗的7-15倍。嫁接苗因需要分別培養母穗及砧木，生產步驟多，需要較大的生產空間及加濕設備，且苗木生產速度較慢。至於扦插苗的繁殖倍率雖然較嫁接苗高，但是因為與組織培養苗同樣沒有種子根，部分農民認為其對逆境環境的忍受性較差而不喜種植。因此，對於多數農民而言，全兩性株的種子苗被認為是較具發展價值的種苗生產方式。

近年來，生物科技相關技術進展迅速，目前分子標記已證明在生物學上可以進行早期偵測，解決許多問題，具有極佳的應用價值。常見之分子標記檢測種類可例如簡單重複序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、簡單重複序列間多態性(Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR)、逢機擴增多型性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、擴增片段長度多型性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、限制性片段長度多型性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、特異性序列擴增區域(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)等。

舉例而言，在過去研究中，上述SSR可用於區別石斛蘭品種鑑定以及番木瓜之親源鑑定等。ISSR可應用於番木瓜以及茄子種內鑑定分析。RAPD、AFLP及RFLP可應用於區分番木瓜性別。SCAR則是由RAPD衍生而來，可作為區分番木瓜性別之分子標記。

目前發展出一些分子標記，在番木瓜幼苗株無法以目視辨識性別的情況下，可用於鑑別性別。然而，目前大多數的木瓜性別相關基因之分子標記，單一種分子標記僅供鑑別單一種性別，無法在同時鑑別三種性別。其次，木瓜幼株在不同環境培養下，花性會不穩定，尤其兩性株的花朵在不合適的環境或營養缺乏的情況下，甚至有退化、畸形的現象產生，影響性別相關性狀，這也會影響鑑別性別及性別相關性狀的準確率。

有鑑於此，亟需開發一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記，以改善習知分子標記的種種缺點。

因此，本發明之一態樣是在提供一種用於早期 鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記。

本發明之另一態樣係在提供一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其係由包含複數個單核苷酸多型性位點、基因體序列及轉錄體序列的分子標記與複數個性別相關基因建立相關性模式，藉此在木瓜樣本之花器發育早期，同時且準確鑑別其性別及性別相關性狀。

本發明之又一態樣係在提供一種提出一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的系統，其包含上述分子標記。

本發明之再一態樣係在提供一種重組載體，其包含上述之分子標記。

本發明又另一態樣係在提供一種轉形植物細胞，其包含上述之重組載體。

根據本發明之上述態樣，提出一種用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記，包含至少一序列選自於由SEQ ID NO：1~64以及與SEQ ID NO：1~51、53、55、57、59、61、63互補之序列所組成之一群組。

根據本發明之另一態樣，提出一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其係藉由包含複數個單核苷酸多型性位點、基因體序列及轉錄體序列的分子標記與複數個性別相關基因建立相關性模式，藉此在木瓜樣本之花器發育早期，同時且準確鑑別其性別及性別相關性狀。

在上述實施例中，建立相關性模式之步驟可包含但不限於由複數個木瓜之複數個花器獲得複數個核酸樣 本。接著，由前述核酸樣本獲得複數個分子標記，其中前述分子標記包括至少一序列選自於由SEQ ID NO：1~64以及與SEQ ID NO：1~51、53、55、57、59、61、63互補之序列所組成之一群組。之後，定義前述性別相關基因之任一者與前述分子標記之至少一者的對應關係，以建立相關性模式。

在上述實施例中，上述獲得核酸樣本之步驟中，上述花器之平均長度不超過0.2cm，且前述核酸樣本包含複數個基因體序列以及複數個轉錄體序列。

在上述實施例中，前述利用相關性模式鑑別木瓜樣本之性別以及複數個性別相關基因之步驟可包含但不限於由木瓜樣本之待測花器獲得待測核酸樣本，由該待測核酸樣本獲得複數個性別分型資料，將上述性別分型資料輸入上述相關性模式，以比對前述性別分型資料是否與上述分子標記之至少一者相符，並獲得分子標記之至少一者之對應關係之相關正確率。當前述性別分型資料之至少一者與上述分子標記之至少一者相符，且相關正確率為100%時，判斷此木瓜樣本具有對應關係之性別以及上述性別相關基因之至少一者。

依據本發明一實施例，上述木瓜以及木瓜樣本可包含但不限於番木瓜(Carica papaya L.)之佛羅里達種、日昇種、吉隆坡種、日昇13號種、日昇23號種、日昇與台農7號雜交種。

依據本發明一實施例，當上述第二性別分型資 料包含SEQ ID NO：1~16、18、20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64以及與SEQ ID NO：1~16、18、20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為二性。

依據本發明一實施例，當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62以及與SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為雄性。

依據本發明一實施例，當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60以及與SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為雌性。

依據本發明一實施例，上述該些性別相關性狀基因與複數個性別相關性狀相關，且該些性別相關性狀包含複數個花器型態及/或複數個果實形狀。

根據本發明之又一態樣，提出一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的系統，其包含上述早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的分子標記。

根據本發明之再一態樣係在提供一種重組載體，其包含上述之分子標記。

根據本發明又另一態樣係在提供一種轉形植物細胞，其包含上述之重組載體。

應用本發明之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用，其利用特定的分子標記與性別相關性狀基因之任一者建立相關性模式，可於木瓜花器早期發育時，鑑別此木瓜樣本之性別以及性別相關性狀，以有效、快速且準確獲得木瓜兩性株，並有助於減少不結實花及畸形花果的產生，進而多方應用，例如用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的系統、製得包含上述之分子標記重組載體以及含此重組載體的轉形植物細胞等。

100‧‧‧方法

120/130/140/150/160/170/180/190‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1〕係繪示根據本發明一實施例之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法之部分流程圖。

〔圖2A〕至〔圖2B〕係繪示根據本發明一實施例之Y^h染色體BAC 71E16分析CpSVP-LIKE於番木瓜不同性型表現之cDNA序列(圖2A)及內含子/外顯子在BAC位置(圖2B)的差異性。

〔圖3A〕至〔圖3B〕係繪示根據本發明一實施例之Y^h染色體BAC71E16分析CpSERK於番木瓜不同性型表現之cDNA序列(圖3A)及內含子/外顯子在BAC位置(圖3B)的差異性。

〔圖4A〕至〔圖4E〕係繪示根據本發明數個實施例以不同SNP基因型作為番木瓜性別及性別相關性狀基因之分子標記的HRM分析結果，其中圖10A為利用CpSVP-LIKE 88引子對的HRM分析結果，圖10B為利用CpSERK 30704引子對的HRM分析結果，圖10C為利用CpSERK 34072引子對的HRM分析結果，圖10D為利用CpSERK 34760引子對的HRM分析結果，圖10E為利用CpSERK 34787引子對的HRM分析結果，F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性。

〔圖5A〕至〔圖5B〕係繪示根據本發明數個實施例以不同SNP基因型作為番木瓜性別及性別相關性狀基因之分子標記之PCR-RFLP分析結果，其中F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性，左邊的M代表DNA標記(Marker)，H代表兩性木瓜株，FM代表佛羅里達種雄性木瓜株。

〔圖6〕係繪示根據本發明一實施例之番木瓜性別及性別相關性狀基因之分子標記的三性型基因連鎖圖及其表現模式，其中F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性。

承前所述，本發明提供一種用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀基因之分子標記及其應用，其係利用包含複數個特定的單核酸多型性位點、基因體序列及轉錄體序列的分子標記與性別相關性狀基因建立相關性模式，藉此於木瓜樣本之花器發育早期，同時且準確鑑別木瓜樣本之性別 及性別相關性狀。

申言之，本發明此處所稱之木瓜以及木瓜樣本，係指番木瓜(Carica papaya L.)，其品種並無特別限制，可包含但不限於番木瓜(Carica papaya L.)之佛羅里達種、日昇種、吉隆坡種、日昇13號種、日昇23號種、日昇與台農7號雜交種等。

本發明此處所稱之木瓜性別，係指雄性、雌性及兩性。依據Storey在1938年及1953年提出的理論，番木瓜性別(雄株、雌株及兩性株)分別由3個等位基因控制：M1(雄，顯性)、M2(兩性，顯性)及m(雌性，隱性)，而顯性等位基因(MM，MMh，MhMh)的所有組合都是胚致死。通常兩性株自交，後代發生兩性株及雌性株的比例為2：1，兩性株與雌性株雜交後代發生兩性株與雌性株的比例為1：1。

本發明此處所稱之性別相關性狀，係指其性別相關性狀基因表現及/或性狀表現與性別相關。在一例示中，上述性別相關性狀包含複數個花器型態及/或複數個果實形狀或與上述性狀相關的基因表現。

本發明此處所稱之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記，包括至少一序列選自於由1~64以及與SEQ ID NO：1~51、53、55、57、59、61、63互補之序列所組成之一群組。在一實施例中，上述分子標記包含上述序列本身、或者上述序列衍生之產物且含有上述序列者，例如PCR產物、HRM的產物、RFLP的產物、由上述序列轉 錄的RNA(或mRNA)、由上述序列轉譯的多肽等。

本發明此處所稱之早期發育，係指木瓜花器之平均長度不超過0.2cm。一般而言，平均長度不超過0.2cm之花器無法以目視辨識性別，但使用本發明的分子標記可以有效、快速且準確區分番木瓜性別以及性別相關性狀。

申言之，在一實施例中，上述分子標記可用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其係藉由分子標記與複數個性別相關基因建立相關性模式，以在木瓜樣本之花器發育早期，同時且準確鑑別其性別及性別相關性狀。在此實施例中，上述分子標記可包含複數個單核苷酸多型性位點、基因體序列、轉錄體序列及多肽的分子標記。

在一例示中，本發明此處所稱用於鑑別木瓜性別及性別相關性狀之單核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位點，係指與性別具有顯著相關性，並足資鑑別不同性別者的SNP位點。前述位點可以座落於性別相關性狀基因的外顯子(exon)或內含子(intron)，例如SEQ ID NO：17~51、53、55、57、59、61、63以及與SEQ ID NO：17~51、53、55、57、59、61、63互補之序列之至少一者。

上述用於鑑別木瓜性別及性別相關性狀之基因體序列係指與性別具有顯著相關性，且為性別相關性狀基因的外顯子及/或內含子的一部或全部，例如SEQ ID NO：17~50以及與SEQ ID NO：17~50互補之序列之至少一者。

上述用於鑑別木瓜性別及性別相關性狀之轉錄 體序列，係指對應於上述性別相關性狀基因所能轉錄出的所有RNA的總和，例如SEQ ID NO：51、53、55、57、59、61、63以及與SEQ ID NO：51、53、55、57、59、61、63互補之序列之至少一者。在其他例子中，上述用於鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記亦可包含由上述轉錄體序列所轉譯之所有多肽的總和，例如SEQ ID NO：52、54、56、58、60、62、64之至少一者。

請參閱表1，其係顯示根據本發明一實施例之部分的分子標記、引子對序列及其座落之性別相關性狀基因的比對表。

舉例而言，本發明適用的SNP分子標記可包含例如表1所列之SNP位點，包含CpSVP-LIKE基因內含子3第8511個核苷酸的SNP位點(SNP#88)、CpSERK基因內含子1第122453個核苷酸的SNP位點(SNP#30704)、CpSERK基因內含子7第119290、119295個核苷酸的SNP 位點(SNPs#34072a、34072b)、CpSERK基因外顯子9第118602個核苷酸的SNP位點(SNP#34760)以及CpSERK基因外顯子9第118575個核苷酸的SNP位點(SNP#34787)。

在一些實施例中，上述分子標記可以是探針、引子對、基因體序列或轉錄體序列，其長度並無特別限制，只要涵蓋上述SNP位點即可。然而在一些實施例中，當上述分子標記是探針或引子對時，其長度可例如15至30個鹼基對、或如表1所列、抑或更短或更長，藉此偵測上述SNP位點之至少一者，進而同時鑑別性別及性別相關性狀。

在其他實施例中，當上述分子標記是基因體序列或轉錄體序列本身時，其長度可例如200至400個鹼基對，以偵測上述SNP位點並偵測其上下游約200至400個鹼基對的序列，藉此提高偵測的準確性。

上述分子標記可應用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法。請參閱圖1，其係繪示根據本發明一實施例之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法100之部分流程圖。

在一實施例中，此方法100可如步驟120所示，首先由複數個木瓜之複數個花器獲得複數個核酸樣本，其中上述花器之平均長度不超過0.2cm，且此核酸樣本包含複數個基因體序列以及複數個轉錄體序列。接著，如步驟130所示，由核酸樣本獲得複數個分子標記，以建立基因體資料庫及轉錄體資料庫，其中分子標記包括至少一序列選自於由 SEQ ID NO：1~64以及與SEQ ID NO：1~51、53、55、57、59、61、63互補之序列所組成之一群組。之後，如步驟140所示，定義性別相關基因之任一者與分子標記之至少一者的對應關係，以建立相關性模式。

上述性別分型資料可包含單核苷酸多型性位點、基因體序列、轉錄體序列及多肽，其可利用例如高解析度熔解分析(High Resolution Melting，HRM)、PCR-RFLP及/或習知解析胺基酸序列的方式獲得。以HRM為例，HRM為近來DNA分子標記技術發展出之方式，藉由高分辨率的熔解曲線，以分辨序列中單一核苷酸差異。由於HRM具有精確、快速、方便以及低成本等優點，過去常用於基因序列性狀上差異性分析，例如桃樹品種間性狀差異性序列之品種差異性分析、番茄誘變育種特定基因之掃描分析以及羽扇豆遺傳連鎖圖譜分析等。在其他實施例中，本發明亦可使用其他習知方式，例如聚合酶鏈反應-限制性片段長度多型性(PCR-RFLP)分析法及/或其他習知方法，取得性別分型資料，且其結果亦可與前述HRM分析結果再核對。前述所述之建立基因體資料庫及轉錄體資料庫、HRM、PCR-RFLP及/或其他習知方法係參考習知方法建立，應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，此處不另贅述。

在一實施例中，本發明此處所稱之對應關係，係指利用習知商業統計軟體，將所得之性別分型資料進行相關性分析，以定義性別相關基因之任一者與分子標記之至少 一者的對應關係。

在建立相關性模式之後，在一例示中，上述利用相關性模式鑑別木瓜樣本之性別以及複數個性別相關基因之步驟150可包括由木瓜樣本之待測花器獲得待測核酸樣本，如步驟160所示。在一例示中，上述花器之平均長度不超過0.2cm，且前述核酸樣本亦包含複數個待測基因體序列以及複數個待測轉錄體序列。

然後，如步驟170所示，由待測核酸樣本獲得複數個性別分型資料，其中性別分型資料可包括例如複數個待測單核苷酸多型性位點、待測單核苷酸多型性位點對應的待測基因體序列以及待測基因體序列對應之待測轉錄體序列。上述性別分型資料利用例如HRM分析法、PCR-RFLP分析法及/或其他習知方法獲得，此處不另贅述。

接下來，如步驟180所示，將性別分型資料輸入上述相關性模式，以比對性別分型資料是否與分子標記之至少一者相符，並獲得分子標記之至少一者之對應關係之相關正確率。當性別分型資料之至少一者與分子標記之至少一者相符且相關正確率為100%時，判斷木瓜樣本具有對應關係之性別的一者以及性別相關基因之至少一者，如步驟190所示。

舉例而言，當待測核酸樣本利用HRM所得之性別分型資料，與上述相關性模式比對後，與分子標記中的SNP#88(T)相符，則判斷木瓜樣本為兩性株，且具有對應CpSVP-LIKE基因的內含子(intron)3。CpSVP-LIKE基因 在兩性株中具有(Alternative Splicing，AS)之多型性，詳見後述。

本發明之技術特徵之一，在於定義前述分子標記與性別相關性狀基因之間的對應關係，以建立相關性模式。值得留意的是，倘若使用上述以外之分子標記及/或上述以外的相關性模式鑑別木瓜株，無法預期能於花器早期發育時同時且準確鑑別出木瓜性別及特定的性別相關性狀。

在上述實施例中，前述利用相關性模式鑑別木瓜樣本之性別以及複數個性別相關基因之步驟可包含但不限於由木瓜樣本之待測花器獲得待測核酸樣本，由該待測核酸樣本獲得複數個性別分型資料，將該些性別分型資料輸入該相關性模式，以比對該些性別分型資料是否與該些分子標記之至少一者相符，並獲得該分子標記之該至少一者之該對應關係之相關正確率。當該些性別分型資料之該至少一者與該些分子標記之該至少一者相符，且相關正確率為100%時，判斷該木瓜樣本具有該對應關係之該些性別以及該些性別相關基因之至少一者。

依據Storey在1938年及1953年所提出番木瓜性別(雄株、雌株及兩性株)遺傳假說分別由3個等位基因控制：M1(雄)、M2(兩性)及m(雌性)，而顯性等位基因(MM，MMh，MhMh)的所有組合都是胚致死。通常兩性株自交，後代發生兩性株及雌性株的比例為2：1。兩性株與雌性株雜交，後代發生兩性株與雌性株的比例為1：1。

在此說明的是，本發明之分子標記不僅可同時 鑑別木瓜株的三種性別，亦可由轉錄體之選擇性剪接(AS)的多型性，判斷木瓜花器的性別相關性狀是否受影響而有退化、畸形的可能，藉此根據進行早期偵測的結果及早因應。

舉例而言，當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~16、18、20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64以及與SEQ ID NO：1~16、18、20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為二性。

當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62以及與SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為雄性。

當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60以及與SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之性別為雌性。

此外，上述分子標記更可多方應用，例如用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的系統、包含上述之分子標記重組載體以及含此重組載體的轉形植物細胞等。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與 潤飾。

實施例1. 建立番木瓜基因體資料庫及轉錄體資料庫

此實施例係由多個木瓜株建立番木瓜基因體資料庫(或稱基因體BAC庫)及轉錄體資料庫(或稱轉錄體BAC庫)。

首先，取番木瓜不同性別植株與花器，包含雌花4個、雄花4個及兩性花4個，共12個樣品，經萃取其基因體及轉錄體後，進行高通量定序(High-throughput Sequencing)，以獲得複數個基因體序列及轉錄體序列。

關於前述基因體資料庫及轉錄體資料庫係參考習知方法建立。簡言之，在NCBI上搜尋番木瓜細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)基因庫，以BAC序列為模板，將上述轉錄體所表現之基因序列組裝到模板上，並依據不同性別表現量之不同，選出15個番木瓜BAC(圖未繪示)。

實施例2. 番木瓜性別決定基因之篩選

在上述15個番木瓜BAC中，初步篩選出性別相關基因共117個，其中有27個基因可於二種性別株中表現，有28個基因可於三種性別株中表現，合計55個基因。

將上述所得55個性別相關基因進行核酸及胺基酸多重序列比對，其係利用市售統計分析軟體，例如excel比對，根據外顯子跳躍(Exon Jump)、內含子跳躍(Intron Jump)、胺基酸短少(AA Short)及胺基酸無改變(None AA Change)等胺基酸不同變化，篩選出RNA具有選擇性剪接(Alternative RNA splice)之性別相關基因。上述所得55個基因中，番木瓜BAC-71E16的基因中產生胺基酸變化者，如表2所示。

將上述選出之基因利用商業軟體，例如ClustalW2(網址為http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)以及基因核酸與胺基酸之多重序列比對後，依照基因表現序列區分為type_1(單一性別不表現，另二個性別之胺基酸表現序列有差異)、type_2(三個性別均表現，且胺基酸表現序列皆有差異)以及type_3(三個性別皆有表現，其中二個性別之胺基酸表現序列無差異)等三種區分方式，以由番木瓜BAC-71E16中篩選出RNA具有選擇性剪接(Alternative RNA splice)之性別相關基因。將選出之基因利用商業軟體，例如SMART(網址為http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.pl)，預測蛋白質功能域，其結果如表3所示。

表3

由表3比對結果可知，在由番木瓜BAC-71E16中，type_1基因有2個，type_2基因有1個，而type_3基因有1個。

實施例3. 番木瓜不同性別間CpSVP-LIKE及CpSERK之基因結構分析

此實施例利用SNP-HRM以及PCR-RFLP等方式，評估分子標記用於檢測並分析性別與性別性狀基因之相關性。

1. 利用SNP-HRM分子標記，檢測並分析性別與性別性狀基因之相關性

經由基因組資料分析性別相關之單核苷酸多態性(SNP)位置，利用Beacon Designer^TM軟體設計SNP-HRM分析引子，兩基因共設計5組引子。將64個已知性別之番木瓜樣品DNA(包含親本與子代)，進行SNP-HRM檢測，每一HRM反應試劑包含：Precision melt supermix(Bio-Rad)：6.34μl DDH₂O，10μl Precision melt supermix，0.4μl 10μM正向引子，0.4μl 10μM反向引子，3μl(1.5ng/μl)DNA樣品，總共15μl/孔，於96孔盤(BIOplastics)封膜(BIOplastics)，利用即時定量聚合酶鏈鎖反應儀(Bio-Rad GFX Connect)配合軟體 (Bio-Rad CFX Manager)Real-time Polymerase chain reaction(PCR)program。

上述PCR溫度程序設定條件如下：DNA雙股解離(Denaturation)：95℃進行2min。接著，進行39個循環的聚合酶鏈鎖反應，包括DNA雙股解離(Denaturation)：95℃ 10sec；以及引子配對黏合與單股DNA加長(Annealing and Elongation)：57℃ 30sec。上述PCR產物螢光解離曲線溫度程序之設定條件如下：DNA雙股解離(Denaturation)：95℃ 30sec，60℃ 1min；以及DNA雙股螢光偵測：65℃至90℃，每10秒增加0.2℃。

上述Real-time PCR結果利用軟體(Bio-Rad Precision Melt Analysis)進行叢集分析(cluster analysis)，並計算與番木瓜性別之相關正確率(correlection%)。將所得相關正確率達100%之SNP-HRM分子標記，於兩性親本與雄性親本雜交子代族群中選出96個番木瓜盲樣，計算SNP-HRM分析之性別數量，進行卡方分析了解子代族群SNP-HRM分子標記之性別性狀分離率是否符合理論值。

2. 利用PCR-RFLP分子標記，檢測並分析性別與性別性狀基因之相關性

依據SNP序列設計PCR-RFLP引子其PCR產物大小約200bp，PCR條件為：34μl DDH₂O，5μl DMSO(Dimethyl sulfoxide)，5μl 10xPC2 buffer (500mM Tris-HCl pH=9.1，160mM(NH₄)₂SO₄，35mM MgCl₂，1.5mg/ml BSA)，1μl 10mM dNTP，1μl 10mM正向引子，1μl 10mM反向引子，1μl Taq(2U/μl)，2μl DNA樣品，總共50μl。分裝於0.2ml eppendorf經聚合酶鏈鎖反應儀(BIOER-GenePro)PCR溫度程序設定：Denaturation：94℃ 40sec；35個循環反應：引子配對黏合(Annealing)：61℃ 40sec，單股DNA加長(Elongation)：72℃ 30sec。所得PCR產物用純化試劑組(Geneaid)，進行純化後，檢測PCR產物濃度。取400ng的PCR產物和酵素作用分析其中：MADS-BOX gene的PCR產物，以Nde I酵素配合buffer分析；SERK gene的PCR產物，以Ase I酵素配合buffer分析，均於37℃作用8小時，將酵素作用前與作用後之PCR產物，分別進行電泳分析並UV數位照相。

經上述HRM與PCR-RFLP篩選後，發現位於Y^h chromosome BAC 71E16距離約26000bp的短營養生長期(Short vegetative phase，CpSVP-LIKE)及體細胞胚胎發育受體激酶(Somatic Embryogenesis Receptor Kinase，CpSERK)，此二基因均與性別相關。其次，番木瓜(Carica papaya L.，Cp)CpSVP-LIKE基因與CpSERK基因與釀酒葡萄(Vitis vinifera，Vv)VvSVP及VvSERK之胺基酸序列比對後，分別可達72%及96%相似度(資料未顯示)。

請參閱圖2A及圖2B。圖2A至圖2B係繪示根據 本發明一實施例之Y^h染色體BAC 71E16分析CpSVP-LIKE於番木瓜不同性型表現之cDNA序列(圖2A)及內含子/外顯子在BAC位置(圖2B)的差異性。圖2A至圖2B之雙底線的數字代表BAC上的位置，F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性，圓型圖號代表起始密碼，三角型圖號代表終止密碼，方格代表外顯子，黑色方格代表無轉譯域，直條紋方格代表非特定域，方格E1/E2代表MADS-BOX域(GenBank序列編號：BAR64349.1，其胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示)，方格E3/E4/E5代表K-BOX域，橫線代表內插子。每種結構的右側標示其核酸、胺基酸數目。ORF代表開放閱讀框(open reading frame)，AA代表胺基酸(amino acid)，UTR代表非轉譯區(untranslated regions)，單底線數字為核酸數，結構下方標有primer位置，h代表HRM引子，dc代表PCR-RFLP引子，箭頭表示SNP位置。

圖2A結果指出，CpSVP-LIKE基因推測蛋白質序列長度而其推測蛋白質序列包含有K-BOX domain，含有6個內插子以及7個外顯子。該基因於番木瓜雌性0.2cm花苞不表現；雄性0.2cm花苞具有一種轉錄表現型推測轉譯長度167胺基酸(cDNA：4416bp；ORF：501bp)；而兩性0.2cm花苞則是3種轉錄表現型，兩性的三種推測轉譯長度分別為98個胺基酸(cDNA：839bp；ORF：294bp；4th intron alternative splicing)、167個胺基酸(cDNA：5093bp；ORF：501bp)以及203個胺基酸(cDNA：840 bp；ORF：609bp；2nd intron alternative splicing)。經由性別性狀SNP genotyping分析，發現位於intron 3第8511個核酸(MSY Y^h chromosome BAC 71E16為參考位置)SNP G(M)→T(H)具有性別性狀之相關性，而且僅有CpSVP-LIKE基因在兩性株中具有AS之多型性，確實具有性別相關性，如圖2A所示。因此，依據SNP位置設計SNP-HRM引子，及PCR-RFLP引子，分別命名為：SVP_HRM_88及SVP_RFLP_Nde I，如表1及SEQ ID NO：1~4所示。

請參閱圖3A及圖3B，其係繪示根據本發明一實施例之Y^h染色體BAC71E16分析CpSERK於番木瓜不同性型表現之cDNA序列(圖3A)及內含子/外顯子在BAC位置(圖3B)的差異性。

圖3A至圖3B之雙底線的數字代表BAC上的位置，F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性，圓型圖號代表起始密碼，三角型圖號代表終止密碼，方格代表外顯子，黑色方格代表無轉譯域，方格E1代表訊息胜肽(Signal peptide，SP域)，方格E2/E3/E4/E5代表富含亮胺酸重複序列(Leucine-rich repeats，或稱LRR域)，方格E7代表穿膜區(Transmembrane region，或稱TM域)(E7)，方格E9/E10/E11代表絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(Serine/Threonine protein kinases，或稱Kinase域)，橫線代表內插子。每種結構的右側標示其核酸、胺基酸數目。ORF代表開放閱讀框(open reading frame)，AA代表 胺基酸(amino acid)，UTR代表非轉譯區(untranslated regions)，單底線數字為核酸數，結構下方標有primer位置，h代表HRM引子，dc代表PCR-RFLP引子，箭頭表示SNP位置。

圖3A、圖3B、表3及表4之結果指出，CpSERK基因蛋白質序列包含有訊息胜肽(SP域)、富含亮胺酸重複序列(LRR域)、穿膜區(TM域)與絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(Kinase域)之C端域〔C-terminal(S_TKC-like)domain〕，含有10個內插子以及11個外顯子，而且番木瓜三種性別都不同：雌性593個胺基酸(cDNA：2183bp；ORF：1779bp)、雄性523個胺基酸(cDNA：1952bp；ORF：1569bp；10th intron alternative splicing)以及兩性628個胺基酸(cDNA：2467bp；ORF：1884bp)。經由性別性狀SNP genotyping分析，發現intron 1第122453個核酸的SNP若為A則為雌性，若為G則為雄性及兩性；intron 7第119295個核酸的SNP若為T則為雌性，若為G則為雄性及兩性；以及第119290個核酸的SNP若為A則為雌性及雄性，若為T則為兩性；Exon 9第118602個核酸的SNP若為C則為雌性，若為T則為雄性及兩性；以及第118575個核酸的SNP若為G則為雌性，若為A則為雄性及兩性。上述SNP均具有性別相關之變化，可用於鑑別木瓜性別。依據SNP位置分別設計SNP-HRM及PCR-RFLP引子對，依序命名為：SERK_HRM_30704、SERK_HRM_34072、SERK_HRM_34760、 SERK_HRM_34787、SERK_RFLP_Dde I與SERK_RFLP_Spe I，如表1及SEQ ID NO：1~16所示。

請參閱表4，其係繪示根據本發明一實施例之三性CpSERK與Y^h染色體BAC 71E16胺基酸序列之比對。

表4之結果指出，上述2個基因(CpSVP-LIKE及CpSERK)確實具有性別相關性。另外，上述2個基因(CpSVP-LIKE及CpSERK)僅有CpSVP-LIKE基因在兩性株中具有AS之多型性，如圖2A所示。

實施例4. 番木瓜性別分子標記檢測與遺傳分析

此實施例係利用上述分子標記，進行40個盲樣族群測試，以評估上述分子標記用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之相關正確率。

首先，在蛋白質編碼的基因組範圍進行性別性狀SNP genotyping分析，發現CpSVP-LIKE及CpSERK基因有性別相關的基因型SNP分佈，如圖2A至圖3B及表5所示。

其次，在CpSVP-LIKE基因中，SVP_HRM_88引子檢測結果發現三性之間具有明顯的DNA解離螢光曲線之差異(圖4A，CpSVP-LIKE 88引子對)，性別性狀遺傳分析結果發現24個親本與40個子代樣品測試，三性間SVP-HRM_88檢測之相關性達100%。再者，40個盲樣族群測試中，SVP_HRM_88引子檢測三性別之比值，經卡方檢測符合1：1：1理論值，如表5之結果所示。經由PCR-RFLP分析結果則發現SVP_RFLP_Nde I引子組針對不同性別進行PCR，雌性不會產生之PCR產物，而雄性與兩性的之PCR產物，經Nde I酵素處理後，該SNP可以區別雄性與兩性，如圖5A之結果所示。

在CpSERK基因中，SERK_HRM_34072、SERK_HRM_30704、SERK_HRM_34760以及SERK_HRM_34787四組引子對，檢測都能區別雌性，如圖4B至圖4E之結果所示。而SERK_HRM_34072則是發現三性之間具有明顯的DNA解離螢光曲線之差異，如圖4B之結果所示。該遺傳分析中親本與子代的 SERK_HRM_34072、SERK_HRM_34760與SERK_HRM_34787之分析結果發現，雌性與兩性的SNP-HRM檢測之相關性達100%，40個盲樣族群測試該三組檢測雌性與其他性別之比值，經卡方檢測符合1：2理論值，如表5之結果所示。而PCR-RFLP分析第119737核酸，利用SERK_RFLP_Spe I引子組針對不同性別進行PCR，其產物不同性別之間並無差異，而經Spe I酵素處理後，該SNP可以區別兩性與其他性別，如圖5B之結果所示。

上述實施例中，每組數據之樣本數至少為3個(n≧3)。

請參閱圖6，繪示根據本發明一實施例之番木瓜性別及性別相關性狀基因之分子標記的三性型基因連鎖圖及其表現模式，其中F代表雌性，M代表雄性，H代表兩性。舉例而言，當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60以及與SEQ ID NO：1~16、22、27、32、37、42、47、59~60互補之序列之至少一者但不含SEQ ID NO：51~58時，判斷木瓜樣本之花器型態及/或果實形狀為穩定的雌性型。當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62以及與SEQ ID NO：1~17、19、23~24、28~29、33~34、38~39、43~44、48、51~52、61~62互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之花器型態及/或果實形狀為穩定的雄性型。當上述第二性別分型資料包含SEQ ID NO：1~16、18、 20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64以及與SEQ ID NO：1~16、18、20~21、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、53~58、63~64互補之序列之至少一者時，判斷木瓜樣本之花器型態及/或果實形狀為不穩定的兩性型。

綜言之，由上述數個實施例證實，本發明之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記，確實可在木瓜樣本之花器發育早期，鑑別其性別及性別相關性狀，且經實驗證實，由此所得之鑑別結果確實能於早期同時且準確鑑別木瓜性別及性別相關性狀。

申言之，上述數個實施例證實，在基因組方面，CpSVP-LIKE在番木瓜具有X、Y^m與Y^h基因組上有著可以區分三性型之差異，且CpSVP-LIKE與CpSERK基因則是在X基因組緊密連鎖著相同雌性型之基因型變化。在轉錄體方面，該基因座上CpSVP-LIKE在兩性花器上的表現序列型可達三種，而雄性的表現序列只有一種，不僅可解釋該基因座在三性型X、Y^m與Y^h基因組的差異可能造成CpSVP-LIKE在不同性別表現上的差異，特別是兩性株CpSVP-LIKE表現序列之多型性與番木瓜兩性花器畸型變化的現象可能具有關聯性(如圖6之所示)。

其次，上述數個實施例亦證實，利用HRM分析盲樣基因體資料，SNP#34072、SNP#34760及SNP#34787可達到100%雌性相關；而利用PCR-RFLP分析盲樣CpSVP-LIKE基因之SNP#88及CpSERK基因之 SNP#34072均可區別三性及雌性別。另外，利用HRM分析盲樣轉錄體資料，CpSVP-LIKE基因在雌株無法表現，於雄性則是單一表現序列，而兩性基因表現具有選擇性RNA剪接(alternative RNA splicing)之三種表現序列；CpSERK基因表現序列在不同性別間之轉錄體序列亦具有差異性。由上述結果可判斷木瓜花器的性別與性別相關性狀是否受影響而有退化、畸形的可能，藉此根據進行早期偵測的結果及早因應。

再者，上述數個實施例更證實，本發明之上述分子標記可多方應用，例如用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的系統、包含上述之分子標記重組載體以及含此重組載體的轉形植物細胞等。

需補充的是，本發明雖以特定的品種、特定的分子標記、特定的性別相關性狀基因或特定的評估方式作為例示，說明本發明之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用，亦可使用其他的品種、其他的分子標記、其他的性別相關性狀基因或其他的評估方式進行。

由上述實施例可知，本發明之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記及其應用，其利用特定的分子標記與性別相關性狀基因之任一者建立相關性模式，可於木瓜花器早期發育時，鑑別此木瓜樣本之性別以及性別相 關性狀，藉此有效、快速且準確獲得木瓜兩性株，並有助於減少不結實花及畸形花果的產生。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (10)

1. 一種用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記，包含至少一序列選自於由SEQ ID NO：5~16、22~50、59~64之序列所組成之一群組。
2. 一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之系統，其包含如申請專利範圍第1項所述之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記。
3. 一種早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，包含：建立一相關性模式，包含：由複數個木瓜之複數個花器獲得複數個核酸樣本，其中該些花器之一平均長度不超過0.2cm，且該些核酸樣本包含複數個基因體序列以及複數個轉錄體序列；由該些核酸樣本獲得複數個分子標記，其中該些分子標記包括至少一序列選自於由SEQ ID NO：5~16、22~50、59~64之序列所組成之一群組；以及定義該些性別相關基因之任一者與該些分子標記之至少一者的一對應關係，以建立該相關性模式；以及利用該相關性模式鑑別一木瓜樣本之一性別以及複數個性別相關基因，包含：由該木瓜樣本之一待測花器獲得一待測核酸樣本，其中該些待測花器之一平均長度不超過0.2cm，且該待測核酸樣本包含一待測基因體序列以及一待測轉錄體序列； 由該待測核酸樣本獲得複數個性別分型資料，其中該些性別分型資料包括複數個待測單核苷酸多型性位點、該些待測單核苷酸多型性位點對應的該待測基因體序列以及該基因體序列對應之該待測轉錄體序列；將該些性別分型資料輸入該相關性模式，以比對該些性別分型資料是否與該些分子標記之至少一者相符，並獲得該分子標記之該至少一者之該對應關係之一相關正確率，且當該些性別分型資料之該至少一者與該些分子標記之該至少一者相符且該相關正確率為100%時，判斷該木瓜樣本具有該對應關係之該些性別的一者以及該些性別相關基因之至少一者。
4. 根據申請專利範圍第3項所述之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其中該些木瓜以及該木瓜樣本包含番木瓜(Carica papaya L.)之佛羅里達種、日昇種、吉隆坡種、日昇13號種、日昇23號種、日昇與台農7號雜交種。
5. 根據申請專利範圍第3項所述之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其中當該些第二性別分型資料包含SEQ ID NO：5~16、25~26、30~31、35~36、40~41、45~46、49~50、63~64之序列之至少一者時，判斷該木瓜樣本之該性別為兩性。
6. 根據申請專利範圍第3項所述之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其中當該些第二性別分型資料包含SEQ ID NO：5~16、23~24、28~29、33~34、 38~39、43~44、48、61~62之序列之至少一者時，判斷該木瓜樣本之該性別為雄性。
7. 根據申請專利範圍第3項所述之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其中當該些第二性別分型資料包含SEQ ID NO：5~16、22、27、32、37、42、47、59~60之序列之至少一者時，判斷該木瓜樣本之該性別為雌性。
8. 根據申請專利範圍第3項所述之早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀的方法，其中該些性別相關性狀基因與複數個性別相關性狀相關，且該些性別相關性狀包含複數個花器型態及/或複數個果實形狀。
9. 一種重組載體，其包含如申請專利範圍第1項所述之用於早期鑑別木瓜性別及性別相關性狀之分子標記。
10. 一種轉形植物細胞，包含如申請專利範圍第9項所述之重組載體。