TWI784486B

TWI784486B - 鑑別全兩性木瓜的檢驗套組及鑑別木瓜種苗７號及其後裔之全兩性木瓜的方法

Info

Publication number: TWI784486B
Application number: TW110113882A
Authority: TW
Inventors: 陳哲仁; 松村英生
Original assignee: 行政院農業委員會種苗改良繁殖場
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2022-11-21
Also published as: TW202242141A

Abstract

本發明提供一種鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，其係用以鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜，並用以檢測一木瓜樣本是否具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。鑑別全兩性木瓜的檢驗套組包含一第一引子組以及一第二引子組。第一引子組包含一如SEQ ID NO：2所示之正向引子及一如SEQ ID NO：3所示之反向引子。第二引子組包含一如SEQ ID NO：4所示之正向引子及一如SEQ ID NO：5所示之反向引子。本發明另提供一種利用上述檢驗套組鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法。

Description

鑑別全兩性木瓜的檢驗套組及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法

本發明是關於一種用於鑑別木瓜性別的分子標記、鑑別木瓜性別的檢驗套組及鑑別木瓜性別的方法，特別是關於一種用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記、鑑別全兩性木瓜的檢驗套組及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法。

木瓜(Carica papaya)，又稱番木瓜、石瓜、蓬生果等，為原產於熱帶美洲之軟木植果樹。木瓜富含胡蘿蔔素、維生素C、高量酵素及多種有益人體健康的成分，使其種植量在世界各地穩定增長。

木瓜的性別形式是栽培中最重要的特徵之一，其具有雄株、雌株、兩性株等三種基本樹型。其中，雌株只開雌花，需雄株或兩性株提供花粉以使果實正常發育；雄株一般只開雄花而不結果，多做為授粉樹之用；兩性株則開兩性花，其果實多為洋梨形或長形，並具有小果腔之特性，使兩性株木瓜具有較佳的經濟價值，並廣受木瓜栽培業者的歡迎。

為了種植與培育兩性株木瓜，在木瓜栽培過程中多以人力辨識並去除雌株，以獲得更高比例的兩性株。然而，木瓜從萌芽、生長至花器形成前，不同性別的植株在葉型、莖幹顏色、株型等各種外部型態皆大致相同，並無法單純以植株的外部型態進行區分，而須等到植株開花後根據其花型及花序始可辨認性別，如此一來不僅需將全數的木瓜幼苗栽種至成熟並開花，使其在苗木成本上居高不下，亦須付出大量的勞力支出，在經濟效益方面並不理想。再者，木瓜幼苗在不同環境培養下將影響其性狀表現，在環境溫度過高或低的情形下甚至會有退化、畸形的現象產生，致使以人力辨識去除雌株的準確度及效益仍有待商榷。

另外，在一般兩性株木瓜自交或相互雜交所產生的後代中，兩性株的數量約佔67%，木瓜栽培業者同樣必須一次密植2至3株木瓜幼苗，待定植3到4個月後形成花器，始能由花器構造確認其性別。因此，透過兩性株木瓜自交或相互雜交的方式，亦無法獲得100%之兩性株後代。

為了解決前述問題，與木瓜性別相關之分子標記遂蓬勃發展，以在木瓜幼苗尚無法以目視辨識性別的情形下鑑定其性別。然而，現行之與木瓜性別相關之分子標記仍難以大量地逐一鑑定木瓜性別，並鮮少實際應用於木瓜種苗生產。

為了達成種植與培育100%兩性株木瓜的訴求，行政院農業委員會種苗改良繁殖場進一步選育而得可獲得100%之兩性株後代之木瓜品種-木瓜種苗7號。然而，在將木瓜種苗7號之全兩性特性導入其它木瓜品種後，仍無法有效率地區別木瓜種苗7號的後裔中之兩性木瓜與全兩性木瓜，使其在後續應用中仍多有受限。

有鑑於此，如何發展一種鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，以有效地於木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值的全兩性木瓜植株，實為本領域之技術人員所共同努力的目標。

本發明之一態樣在於提供一種用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記，包含如SEQ ID NO：1所示之一核苷酸序列，其中如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列包含一單去氫抗壞血酸還原酶4(monodehydroascorbate reductase 4,MDAR4)之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因座。

本發明之另一態樣在於提供一種鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，其係用以鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜，包含一第一引子組以及一第二引子組。第一引子組包含一如SEQ ID NO：2所示之正向引子及一如SEQ ID NO：3所示之反向引子。第二引子組包含一如SEQ ID NO：4所示之正向引子及一如SEQ ID NO：5所示之反向引子。其中，所述之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組係用以檢測一木瓜樣本是否具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。

依據前述之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，可更包含一反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。

本發明之再一態樣在於提供一種鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，包含下述步驟。提供一木瓜樣本的一待測核酸樣本。提供一如前段所述之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組。進行一第一核酸增幅步驟，其係以所述之待測核酸樣本為模板並利用前述之第一引子組進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第一反應產物。進行一第二核酸增幅步驟，其係以所述之待測核酸樣本為模板並利用前述之第二引子組進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第二反應產物。進行一偵測步驟，其係偵測所述之第一反應產物是否具有一第一擴增子產物，並偵測所述之第二反應產物是否具有一第二擴增子產物。其中，當第一反應產物不具有第一擴增子產物且第二反應產物具有第二擴增子產物時，所述之木瓜樣本將被判斷為一全兩性木瓜樣本。

依據前述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中所述之第一擴增子產物的分子量可等於403bp，所述之第二擴增子產物的分子量可等於282bp。

依據前述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中前述之待測核酸樣本可為DNA或RNA。

依據前述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中當前述之待測核酸樣本為RNA時，鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法可更包含進行一反轉錄步驟，其係對前述之待測核酸樣本進行一反轉錄反應。

依據前述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中前述之偵測步驟可以膠體電泳系統進行。

依據前述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中前述之木瓜樣本可為木瓜種子、木瓜葉片或木瓜花器。

藉此，本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組以及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法透過檢測木瓜樣本中是否具有本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記，可快速且準確地於木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值之具有木瓜種苗7號之全兩性特性的全兩性木瓜植株，進而降低選種及日後栽種的人力成本，並具有相關市場的應用潛力。

100,200:鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法

110,120,130,140,150,210,220,230,240,250,260:步驟

第1圖係繪示本發明一實施方式之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法的步驟流程圖；第2圖係繪示本發明另一實施方式之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法的步驟流程圖；第3圖係繪示本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組用以進行聚合酶連鎖反應之一膠體電泳分析圖；以及第4圖係繪示本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組用以進行聚合酶連鎖反應之另一膠體電泳分析圖。

本發明提供一種鑑別全兩性木瓜的檢驗套組及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其係透過檢測木瓜樣本中是否具有本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記，可快速且準確地在木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值之具有木瓜種苗7號之全兩性特性的全兩性木瓜植株，並可進一步確保所鑑定而得之全兩性木瓜植株可透過主要生物學方法而獲得100%之兩性株後代。

本發明所述之木瓜可包含番木瓜(Carica papaya L.)之佛羅里達種、日昇種、種苗7號種或與種苗7號種雜交所得的後裔，或是前述之後裔再行與佛羅里達種、日昇種、種苗7號種等其他木瓜品種進行雜交育種而得的後裔。較佳地，本發明所述之全兩性木瓜為種苗7號種之木瓜或其後裔之全兩性木瓜。

本發明所述之木瓜性別是指雄性、雌性、兩性及全兩性。詳細而言，依據Storey在1941年及1953年提出的理論，木瓜植株的性別(雄株、雌株及兩性株)分別由 3個等位基因控制：M₁(雄性，顯性基因)、M₂(兩性，顯性基因)及m(雌性，隱性基因)，其中mm、mM₁和mM₂的基因型為雌性，而顯性等位基因(M₁M₁、M₁M₂與M₂M₂)組成的基因型皆具有致死性。通常兩性株自交所產生的後代其兩性株及雌性株的比例為2：1，而在兩性株與雌性株雜交所產生的後代中，兩性株與雌性株的比例則為1：1。再者，本發明所述之全兩性木瓜係指其自交所產生並可正常生長的後代植株皆為兩性株。

下述將更詳細討論本發明各實施方式。然而，此實施方式可為各種發明概念的應用，可被具體實行在各種不同的特定範圍內。特定的實施方式是僅以說明為目的，且不受限於揭露的範圍。

[本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記]

本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記包含如SEQ ID NO：1所示之一核苷酸序列，其中如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列包含一單去氫抗壞血酸還原酶4(monodehydroascorbate reductase 4，後續將以「MDAR4」代稱之以簡化說明)之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因座。MDAR4為植物參與抗壞血酸依賴性之過氧化氫(H₂O₂)清除途徑的酶之一，並與種子的發芽有關，並推論其在木瓜中也扮演類似的功能，而參與木瓜種子的發芽與生長。

詳細而言，本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記為包含SNP基因座之MDAR4的基因編碼序列(Coding sequence,CSD)，如表一所示，相較於木瓜細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)基因庫編號AC238599.1，本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記相較於正常之MDAR4的基因編碼序列包含3個插入缺失SNP位點，該插入缺失SNP位點將導致轉譯而得的胺基酸序列中的Val362丟失，並影響木瓜種子的發芽與生長。

因此，當木瓜樣本的X染色體包含如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列時，若該木瓜樣本不是兩性株且不具有正常之MDAR4的基因編碼序列，該木瓜樣本在其種子階段即無法正常發芽與生長。再者，當該木瓜樣本為一正常生長之全兩性株時，其自交所得的雌性株後代將會因為MDAR4基因的表達缺陷的情形而具有種子致死性，是以前述自交所得並可正常生長之後代將皆為具有木瓜種苗7號之全兩性特性的全兩性株後代(即為本發明所稱之全兩性木瓜植株)。由此可見，本發明之用於鑑別木瓜種苗 7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記可有效且準確地鑑別而得木瓜種苗7號之全兩性木瓜植株，並可進一步應用於挑選木瓜種苗7號之後裔中的全兩性木瓜植株，以有效地於木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值之具有木瓜種苗7號之全兩性特性的全兩性木瓜植株，並具有相關市場的應用潛力。

再者，本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記除包含如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列本身之外，亦可包含其衍生之產物且具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列者，例如PCR產物、HRM產物、RFLP產物、由上述序列轉錄的RNA或由上述序列轉譯而得的多肽等，且本發明並不以此為限。

另外，在本說明書中進一步將正常之MDAR4的基因編碼序列以「Gs等位基因」稱之，並將本發明之表達具有缺陷之MDAR4的基因編碼序列(即SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列)以「本發明之gs等位基因」稱之，以簡化相關說明。

[本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組]

本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組係用以鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜，並包含一第一引子組以及一第二引子組。第一引子組包含一如SEQ ID NO：2所示之正向引子及一如SEQ ID NO：3所示之反向引子。第二引子組包含一如SEQ ID NO：4所示之正向引子及一如SEQ ID NO：5所示之反向引子。

詳細而言，在本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組中，第一引子組與第二引子組是分別利用引子設計程式BatchPrimer3 v1.0設計而得，其中第一引子組的正向引子(如SEQ ID NO：2所示之正向引子)與反向引子(如SEQ ID NO：3所示之反向引子)係針對Gs等位基因設計而得，而第二引子組的正向引子(如SEQ ID NO：4所示之正向引子)與反向引子(如SEQ ID NO：5所示之反向引子)則係針對本發明之gs等位基因設計而得，且本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組係用以檢測一木瓜樣本是否具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。

具體來說，當使用本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組鑑定木瓜樣本時，由於木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜植株在MDAR4的基因編碼序列具有缺失，第一引子組的正向引子與反向引子將無法與木瓜樣本的待測核酸樣本結合而得到第一引子組的第一擴增子產物。反之，由於木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜植株包含如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列(即本發明之gs等位基因)，第二引子組的正向引子與反向引子將可和木瓜樣本的待測核酸樣本結合而得到第二引子組的第二擴增子產物，進而使本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組可快速且準確地於木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值的木瓜種苗7號之全兩性木瓜植株，並可進一步應用於挑選木瓜種苗7號之後裔中的全兩性木瓜植株，進而降低選種及日後栽種的人力成本，並具有相關市場的應用潛力。

另外，本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組可視需求而包含一反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑，但本發明並不以此為限。

[本發明之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法]

請參照第1圖，其係繪示本發明一實施方式之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法100的步驟流程圖。鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140以及步驟150。

步驟110為提供一木瓜樣本的一待測核酸樣本。詳細而言，木瓜樣本可為木瓜種子或木瓜葉片，亦可在其花器出現後以其做為木瓜樣本，但本發明並不以此為限。再者，待測核酸樣本可為DNA或RNA。

步驟120為提供一鑑別全兩性木瓜的檢驗套組。具體而言，鑑別全兩性木瓜的檢驗套組可為本發明之包含一第一引子組以及一第二引子組的鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，而其詳細內容請參前段所述，在此將不再贅述。

步驟130為進行一第一核酸增幅步驟，其係以所述之待測核酸樣本為模板並利用第一引子組而進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第一反應產物。

步驟140為進行一第二核酸增幅步驟，其係以所述之待測核酸樣本為模板並利用第二引子組進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第二反應產物。

步驟150為進行一偵測步驟，其係偵測所述之第一反應產物是否具有一第一擴增子產物，並偵測所述之第二反應產物是否具有一第二擴增子產物。詳細而言，偵測步驟係以膠體電泳系統進行，且第一擴增子產物的分子量等於403bp，第二擴增子產物的分子量等於282bp。具體而言，第一擴增子產物是對應Gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物，而第二擴增子產物則是對應gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物，是以本發明之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法100透過偵測第一反應產物是否具有第一擴增子產物以及偵測第二反應產物是否具有第二擴增子產物的方式，可快速且有效地鑑別木瓜樣本是否為木瓜種苗7號之全兩性木瓜植株，並可進一步應用於挑選木瓜種苗7號之後裔中的全兩性木瓜植株，進而降低選種及日後栽種的人力成本，並具有相關市場的應用潛力。

請參照第2圖，其係繪示本發明另一實施方式之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法200的步驟流程圖。鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法200包含步驟210、步驟220、步驟230、步驟240、步驟250以及步驟260，其中步驟210、步驟220、步驟240、步驟250以及步驟260與第1圖之步驟110、步驟120、步驟130、步驟140及步驟150相同，在此將不再贅述。

步驟230為進行一反轉錄步驟，其係對所述之待測核酸樣本進行一反轉錄反應。詳細而言，當所述之待測核酸樣本為RNA時，RNA將先進行反轉錄反應而獲得對應之cDNA，以進行後續的聚合酶連鎖反應。藉此，可使本發明之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法200的應用廣度進一步提升。

[試驗例]

一、木瓜樣本

本發明所使用之木瓜植株係於屏東種苗研究中心種植而得，其中木瓜植株的品種包含雄性之佛羅里達種，雌性之日陞種與佛羅里達種，正常兩性之日陞種和全兩性之種苗7號種，並以單一木瓜種子或木瓜葉片作為本發明之木瓜樣本，以取得對應之待測核酸樣本而進行後續實驗。

本試驗中所使用待測核酸樣本可分為DNA與RNA。當待測核酸樣本選用DNA時，單一木瓜種子或40mg的木瓜葉片組織將以TANBead^® Plant DNA Auto Kit(Taiwan Advanced Nanotech Inc,Taiwan)處理而提取總基因組DNA(Total genomic DNA)，而當測核酸樣本選用RNA時，單一木瓜種子或40mg的木瓜葉片將以TANBead^® Plant RNA Auto Kit(Taiwan Advanced Nanotech Inc,Taiwan)處理而提取總RNA，以進行後續實驗。另外，前述之單一木瓜種子係提取種仁的DNA或RNA，以增加試驗的準確率。

二、聚合酶連鎖反應

聚合酶連鎖反應是在生物體外複製特定DNA片段的核酸合成技術，是以待測核酸樣本須以DNA的形式呈現始可進行反應。因此，當本發明之待測核酸樣本選用RNA時，1μg的木瓜樣本總RNA將以Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche Life Science,Germany)處理，以從總RNA轉化而得第一鏈cDNA(1^st strand cDNA)以進行後續反應。

在聚合酶連鎖反應方面，10ng之從單一木瓜種子取得的總基因組DNA、50ng之從木瓜葉片取得的總基因組DNA或2ul之第一鏈cDNA將與1×PCR緩衝液、0.8單位的ProTaq聚合酶(Protech Technology Enterprise,Taiwan)、0.1mM的dNTP及0.2mM之本發明的第一引子組或第二引子組混合而形成總體積為20μl的PCR反應物，並將其置入聚合酶連鎖反應儀中進行反應，且聚合酶連鎖反應以下述條件進行：在95℃下反應3分鐘，然後在95℃下反應30秒，接著在55℃或60℃之退火溫度下反應30秒，而後在72℃的條件下反應1分鐘；前述反應將進行35個循環，最後在72℃的條件下反應3分鐘而結束反應，以得第一引子組對應之第一反應產物或第二引子組對應之第二反應產物。

接著，前述之第一反應產物或第二反應產物將分別以1.5%的瓊脂糖凝膠進行膠體電泳分離，以偵測第一反應產物是否具有第一擴增子產物，並偵測第二反應產物是否具有第二擴增子產物，其中第一擴增子產物對應Gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物，而第二擴增子產物則對應 gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物。另外，本試驗另以木瓜蛋白酶基因片段作為內部控制組，以確保本試驗之精確性。

請參照第3圖與第4圖，第3圖係繪示本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組用以進行聚合酶連鎖反應之一膠體電泳分析圖，第4圖係繪示本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組用以進行聚合酶連鎖反應之另一膠體電泳分析圖。

如第3圖所示，當以本發明之第一引子組對木瓜樣本的待測核酸樣本進行聚合酶連鎖反應後，雄性之佛羅里達種、雌性之日陞種、雌性之佛羅里達種與正常兩性之日陞種的第一反應產物均具有分子量等於403bp之Gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物，顯示其MDAR4的基因編碼序列並無變異。然而，由於全兩性之木瓜種苗7號在MDAR4的基因編碼序列包含3個插入缺失SNP位點，是以其並無法與第一引子組結合並得到第一引子組的擴增子產物。

再如第4圖所示，當以本發明之第二引子組對木瓜樣本的待測核酸樣本進行聚合酶連鎖反應後，全兩性之木瓜種苗7號的第二反應產物具有分子量等於282bp之gs等位基因的聚合酶連鎖反應擴增產物，而雄性之佛羅里達種、雌性之日陞種、雌性之佛羅里達種與正常兩性之日陞種則無，顯示本發明之第二引子組確實可有效偵測本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記，並可有效區別木瓜樣本是否為全兩性木瓜植株。

由上述結果可知，本發明之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組以及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法透過檢測木瓜樣本中是否具有本發明之用於鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的分子標記，可快速且準確地於木瓜品種選拔早期階段挑選具有較佳的經濟價值的木瓜種苗7號之全兩性木瓜植株，並可進一步應用於挑選木瓜種苗7號之後裔中的全兩性木瓜植株，進而降低選種及日後栽種的人力成本，並具有相關市場的應用潛力。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 行政院農業委員會種苗改良繁殖場

<120> 鑑別全兩性木瓜的檢驗套組及鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法

<130> CP-5188-TW

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 650

<212> DNA

<213> Carica papaya

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 進行PCR增幅Gs等位基因的引子(forward)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 進行PCR增幅Gs等位基因的引子(reverse)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 進行PCR增幅gs等位基因的引子(forward)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 進行PCR增幅gs等位基因的引子(reverse)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 5

100:鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法

110,120,130,140,150:步驟

Claims

一種鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，其係用以鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜，包含：一第一引子組，包含：一如SEQ ID NO：2所示之正向引子；及一如SEQ ID NO：3所示之反向引子；以及一第二引子組，包含：一如SEQ ID NO：4所示之正向引子；及一如SEQ ID NO：5所示之反向引子；其中，該鑑別全兩性木瓜的檢驗套組係用以檢測一木瓜樣本是否具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。
如請求項1所述之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組，更包含：一反轉錄聚合酶連鎖反應所需之試劑。
一種鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，包含：提供一木瓜樣本的一待測核酸樣本；提供一如請求項1所述之鑑別全兩性木瓜的檢驗套組；進行一第一核酸增幅步驟，其係以該待測核酸樣本為模板並利用該第一引子組進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第一反應產物；進行一第二核酸增幅步驟，其係以該待測核酸樣本為模板並利用該第二引子組進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一第二反應產物；以及進行一偵測步驟，其係偵測該第一反應產物是否具有一第一擴增子產物，並偵測該第二反應產物是否具有一第二擴增子產物；其中，當該第一反應產物不具有該第一擴增子產物且該第二反應產物具有該第二擴增子產物時，該木瓜樣本將被判斷為一全兩性木瓜樣本。
如請求項3所述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中該第一擴增子產物的分子量等於403bp，該第二擴增子產物的分子量等於282bp。
如請求項3所述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中該待測核酸樣本為DNA或RNA。
如請求項5所述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中當該待測核酸樣本為RNA時，該鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法更包含：進行一反轉錄步驟，其係對該待測核酸樣本進行一反轉錄反應。
如請求項3所述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中該偵測步驟係以膠體電泳系統進行。
如請求項3所述之鑑別木瓜種苗7號及其後裔之全兩性木瓜的方法，其中該木瓜樣本為木瓜種子、木瓜葉片或木瓜花器。