BR112017026015B1 - Métodos para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose e método para introgredir um alelo qtl associado com a resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho - Google Patents
Métodos para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose e método para introgredir um alelo qtl associado com a resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho Download PDFInfo
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Abstract
método para identificar e/ou selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, e método para introgredir um alelo qtl associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho. trata-se de composições e métodos úteis na identificação e/ou seleção de plantas de milho que têm resistência à podridão de colmo causada por antracnose que são fornecidos no presente documento. a resistência pode ser recém-conferida ou aprimorada em relação a uma planta de controle. os métodos usam marcadores de milho no cromossomo 10 para identificar, selecionar e/ou construir plantas resistentes. as plantas de milho geradas pelos métodos também são fornecidas.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido Provisório no U.S. 62/170.276, depositado em 3 de junho de 2015, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento em sua totalidade, a título de referência.
[0002] O campo é relacionado à reprodução de planta e métodos para identificar e selecionar plantas com resistência à podridão de colmo causada por antracnose.
[0003] A cópia oficial da listagem de sequência é submetida eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo nomeado 20160516_BB2531_SequenceListing_ST25 criado em 18 de maio de 2016, tem um tamanho de 6 quilobytes e é depositada concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequência contida nesse documento formatado em ASCII é parte do relatório descritivo e está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0004] A podridão de colmo causada por antracnose (ASR) causada pelo patógeno fúngico Colletotrichum graminicola(Ces.) Wils, (Cg) é uma das doenças de podridão de colmo principais em milho (Zea mays L.). ASR é uma preocupação principal devido à redução significativa em rendimento, peso de grão e qualidade. As perdas de rendimento ocorrem a partir de morte de planta prematura que interrompe o enchimento do grão e da quebra e acamamento de colmo que fazem com que as espigas sejam perdidas no campo. ASR ocorre em todas as áreas de crescimento de milho e pode resultar em 10 a 20% de perdas.
[0005] Os fazendeiros podem combater a infecção por fungos, como antracnose, através do uso de fungicidas, mas os mesmos têm efeitos colaterais ambientais e necessitam de monitoramento de campos e técnicas de diagnóstico para determinar qual fungo causa a infecção para que o fungicida correto possa ser usado. O uso de linhagens de milho que portam fontes genéticas ou transgênicas de resistência é mais prático se os genes responsáveis pela resistência puderem ser incorporados em germoplasma de rendimento alto de elite sem reduzir o rendimento. As fontes genéticas de resistência a Cg foram descritas (White, et al. (1979) Annu. Corn Sorghum Res. Conf. Proc. 34:1 a 15; Carson. 1981. Sources of inheritance of resistance to anthracnose stalk rot of corn. Tese de Ph.D., University of Illinois, Urbana-Champaign; Badu-Apraku et al., (1987) Phytopathology 77:957 a 959; Toman et al. 1993. Phytopathology, 83:981 a 986; Cowen, N et al. (1991) Maize Genetics Conference Abstracts 33; Jung, et al., 1994. Theoretical and Applied Genetics, 89:413 a 418). Entretanto, a introgressão de resistência pode ser altamente complexa.
[0006] A seleção através do uso de marcadores moleculares associados ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose permite as seleções com base somente na composição genética da progênie. Como resultado, a reprodução de planta pode ocorrer mais rapidamente, gerando, assim, plantas de milho comercialmente aceitáveis com um nível mais alto de podridão de colmo causada por antracnose. Há múltiplos QTL que controlam resistência à podridão de colmo causada por antracnose (por exemplo, rcgl e rcglb no cromossomo 4 (documento no WO2008157432 e documento no WO2006107931)), com cada um tendo um efeito diferente no traço. Desse modo, é desejável fornecer composições e métodos para identificar e selecionar plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose recém-conferida ou aprimorada. Essas plantas podem ser usadas em programas de reprodução para gerar híbridos de alto rendimento que são resistentes à podridão de colmo causada por antracnose.
[0007] As composições e os métodos úteis na identificação e seleção de plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos no presente documento. Os métodos usam marcadores para identificar e/ou selecionar plantas resistentes ou para identificar e/ou contrasselecionar plantas suscetíveis. As plantas de milho que têm resistência recém- conferida ou aprimorada à podridão de colmo causada por antracnose em relação a plantas de controle também são fornecidas no presente documento.
[0008] Em uma modalidade, os métodos para identificar e/ou selecionar plantas de milho que têm resistência à podridão de colmo causada por antracnose são apresentadas. Nesses métodos, o DNA de uma planta de milho é analisado pela presença de um alelo QTL no cromossomo 10 que é associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose, em que o dito QTL compreende: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35; e uma planta de milho é identificada e/ou selecionada como tendo resistência à podridão de colmo causada por antracnose se o dito alelo QTL é detectado. A planta de milho selecionada pode ser cruzada com uma segunda planta de milho a fim de obter uma planta de progênie que tem o alelo QTL. A resistência à podridão de colmo causada por antracnose pode ser recém-conferida ou aprimorada em relação a uma planta de controle que não tem o alelo QTL favorável. O alelo QTL pode ser adicionalmente refinado para um intervalo cromossômico definido por e incluindo marcadores C00429-801 e PHM824 ou ainda adicionalmente um intervalo cromossômico definido por e incluindo marcadores SYN17244 e sbd_INBREDA_48 ou ainda adicionalmente um intervalo cromossômico definido por e incluindo marcadores sbd_INBREDA_093 e sbd_INBREDA_109. A etapa de análise pode ser realizada isolando- se ácidos nucleicos e detectando-se um ou mais alelos marcadores ligados a e associados ao alelo QTL.
[0009] Em outra modalidade, métodos para identificar e/ou selecionar plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos, nos quais um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a qualquer um dentre: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35, são detectados em uma planta de milho, e uma planta de milho que tem o um ou mais alelos marcadores é selecionada. O um ou mais alelos marcadores podem ser ligados por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, ou 0,1 cM ou menos em um mapa genético com base em meiose única. A planta de milho selecionada pode ser cruzada com uma segunda planta de milho para obter uma planta de progênie que tem um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a qualquer um dentre: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35.
[0010] Em outra modalidade, métodos para identificar e/ou selecionar plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos, nos quais um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a um haplótipo que compreende: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35, são detectados em uma planta de milho, e uma planta de milho que tem o um ou mais alelos marcadores é selecionada. O um ou mais alelos marcadores podem ser ligados ao haplótipo por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, ou 0,1 cM ou menos em um mapa genético com base em meiose única. A planta de milho selecionada pode ser cruzada com uma segunda planta de milho para obter uma planta de progênie que tem um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a um haplótipo que compreende: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35.
[0011] Em outra modalidade, métodos para identificar e/ou selecionar plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos, nos quais um haplótipo que compreende: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35, é detectado em uma planta de milho, e uma planta de milho que tem o um ou mais alelos marcadores é selecionada. Uma planta de milho selecionada pode ser cruzada com uma segunda planta de milho para obter uma planta de progênie que tem o haplótipo que compreende: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd INBREDA 33 e um "G" em sbd INBREDA 35.
[0012] Em outra modalidade, os métodos para introgressar um alelo QTL associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose são apresentados no presente documento. Nesses métodos, uma população de plantas de milho é triada com um ou mais marcadores para determinar se qualquer uma das plantas de milho tem um alelo QTL associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose, e pelo menos uma planta de milho que tem o alelo QTL associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose é selecionada a partir da população. O alelo QTL compreende um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35. O um ou mais marcadores usados para triagem podem estar localizados em 5 cM, 2 cM ou 1 cM (em um mapa genético com base em meiose única) de qualquer um dentre um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33 e um "G" em sbd_INBREDA_35.
[0013] As plantas de milho identificadas e/ou selecionadas com o uso de qualquer um dos métodos apresentados acima também são fornecidas.
[0014] A revelação pode ser mais completamente entendida a partir da descrição detalhada a seguir e da Listagem de Sequência que forma uma parte deste pedido.
[0015] As descrições de sequência e a Listagem de Sequência anexa ao presente documento cumprem com as regras aplicáveis às revelações de sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos nos pedidos de patente conforme estabelecido no título 37 do C.F.R. §1.821 a 1.825. A Listagem de Sequência contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido em conformidade com os padrões IUPAC IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13:3021 a 3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (2):345 a 373 (1984), os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Os símbolos e o formato usados para dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras estabelecidas no título 37 do C.F.R. §1.822. SEQ ID NO:1 é a sequência de referência para o marcador C00429801. SEQ ID NO:2 é a sequência de referência para o marcador SYN17615. SEQ ID NO:3 é a sequência de referência para o marcador PZE- 110006361. SEQ ID NO:4 é a sequência de referência para o marcador PHM824-17. SEQ ID NO:5 é a sequência de referência para o marcador SYN17244. SEQ ID NO:6 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_4. SEQ ID NO:7 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_9. SEQ ID NO:8 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_13. SEQ ID NO:9 é a sequência de referência para o marcador sbd INBREDA 24. SEQ ID NO:10 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_25. SEQ ID NO:11 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_32. SEQ ID NO:12 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_33. SEQ ID NO:13 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_35. SEQ ID NO:14 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_48. SEQ ID NO:15 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_093. SEQ ID NO:16 é a sequência de referência para o marcador sbd_INBREDA_109.
[0016] Os loci de marcador de milho que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos no presente documento. A detecção desses loci ou loci ligados adicionais pode ser usada na seleção auxiliada por marcador como parte de um programa de cultivo de milho para produzir plantas de milho que têm resistência à podridão de colmo causada por antracnose.
[0017] As definições a seguir são fornecidas como um auxílio para entender a presente revelação.
[0018] Deve ser entendido que a revelação não é limitada às modalidades particulares, que podem, obviamente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito apenas de descrever modalidades particulares, e não é destinada a ser limitante. Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, os termos no singular e as formas singulares "um", "uma" e "a/o", por exemplo, incluem referentes no plural, a menos que o conteúdo dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "planta", "a planta” ou "uma planta” também inclui uma pluralidade de plantas; também, dependendo do contexto, o uso do termo "planta" também pode incluir progênie geneticamente similar ou idêntica daquela planta; o uso do termo "um ácido nucleico" inclui opcionalmente, como uma matéria prática, muitas cópias daquela molécula de ácido nucleico; de modo similar, o termo "sonda" opcionalmente (e tipicamente) abrange muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.
[0019] A menos que indicado de outro modo, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'. As faixas numéricas declaradas no relatório descritivo são inclusivas dos números que definem a faixa e incluem cada número inteiro ou qualquer fração de número não inteiro dentro da faixa definida. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a revelação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados para testar a matéria declarada na presente revelação, os materiais e métodos preferidos são descritos no presente documento. Na descrição e reivindicação da matéria da presente revelação, a terminologia a seguir será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.
[0020] O termo "alelo" se refere a uma dentre duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um locus específico.
[0021] “Frequência de alelo" se refere à frequência (proporção ou porcentagem) na qual um alelo está presente em um locus em um indivíduo, dentro de uma linhagem, ou dentro de uma população de linhagens. Por exemplo, para um alelo "A", os indivíduos diploides de genótipo "AA", "Aa" ou "aa" têm frequências de alelo de 1,0, 0,5 ou 0,0, respectivamente. Uma pessoa pode estimar a frequência de alelo dentro de uma linhagem obtendo-se a média das frequências de alelo de uma amostra de indivíduos daquela linhagem. De modo similar, uma pessoa pode calcular a frequência de alelo dentro de uma população de linhagens obtendo-se a média das frequências de alelo de linhagens que constituem a população. Para uma população com um número finito de indivíduos ou linhagens, uma frequência de alelo pode ser expressa como uma contagem de indivíduos ou linhagens (ou qualquer outro agrupamento especificado) que contêm o alelo.
[0022] Um "amplicon" é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido amplificando-se um ácido nucleico modelo por qualquer método de amplificação disponível (por exemplo, PCR, LCR, transcrição ou semelhantes).
[0023] O termo "amplificar" no contexto de amplificação de ácido nucleico é qualquer processo pelo qual cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma forma transcrita do mesmo) são produzidas. Os métodos de amplificação típicos incluem vários métodos de replicação com base em polimerase, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), métodos mediados por ligase, como a reação em cadeia da ligase (LCR), e métodos de amplificação com base em RNA polimerase (por exemplo, por transcrição).
[0024] O termo "montar" se aplica a BACs e suas propensões a se unirem para formar trechos contíguos de DNA. Um BAC "se monta" a um contig com base no alinhamento de sequência, se o BAC for sequenciado, ou por meio do alinhamento de sua digital de BAC às digitais de outros BACs. As montagens públicas podem ser encontradas com o uso de Maize Genome Browser, que está publicamente disponível na internet.
[0025] Um alelo é "associado a" um traço quando é parte ou é ligado a uma sequência ou alelo de DNA que afeta a expressão do traço. A presença do alelo é um indicador de como o traço será expresso.
[0026] Um "BAC", ou cromossomo artificial bacteriano, é um vetor de clonagem derivado do fator F de ocorrência natural de Escherichia coli, que é, em si, um elemento de DNA que pode existir como um plasmídeo circular ou pode ser integrado ao cromossomo bacteriano. BACs podem aceitar insertos grandes de sequência de DNA. Em milho, vários BACs que contêm, cada um, um inserto grande de DNA genômico de milho de linhagem congênita de milho B73, foram montados em contigs (fragmentos genéticos contíguos em sobreposição, ou "DNA contíguo"), e essa montagem está disponível publicamente na internet.
[0027] Uma digital de BAC é um meio para analisar a similaridade entre diversas amostras de DNA com base na presença ou ausência de sítios de restrição específicos (sítios de restrição como sequências de nucleotídeos reconhecidas por enzimas que cortam ou "restringem" o DNA). Duas ou mais amostras de BAC são digeridas com o mesmo conjunto de enzimas de restrição e os tamanhos dos fragmentos formados são comparados, normalmente com o uso de separação de gel.
[0028] “Retrocruzamento” se refere ao processo pelo qual a progênie híbrida é repetidamente cruzada a um dos parentes. Em um esquema de retrocruzamento, o parente "doador" se refere à planta parental com o gene/genes, locus/loci ou fenótipo específico desejado a ser introgressado. O parente "recipiente" (usado uma ou mais vezes) ou parente "recorrente" (usado duas ou mais vezes) se refere à planta parental na qual o gene ou locus é introgressado. Por exemplo, consultar Ragot, M. et al. (1995) Marker-assisted backcrossing: a practical example, em Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Volume 72, páginas 45 a 56, e Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, páginas 41 a 43. O cruzamento inicial dá origem à geração de F1; o termo "BC1" se refere, então, ao segundo uso do parente recorrente, "BC2" se refere ao terceiro uso do parente recorrente, e assim por diante.
[0029] Um centimorgan ("cM") é uma unidade de medida de frequência de recombinação. Um cM é igual a uma chance de 1% de que um marcador em um locus genético será separado de um marcador em um segundo locus devido ao cruzamento por uma geração única.
[0030] Conforme usado no presente documento, o termo "intervalo cromossômico" designa uma amplitude linear contígua de DNA genômico que reside in planta em um cromossomo único. Os elementos genéticos ou genes localizados em um intervalo cromossômico único são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados dentro de um intervalo cromossômico único são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética, por exemplo, menor ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menor ou igual a 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um intervalo cromossômico único sofrem recombinação a uma frequência menor ou igual a 20% ou 10%.
[0031] Um "cromossomo" é uma peça única de DNA enovelado que contém muitos genes que atuam e se movem como uma unidade durante a divisão celular e pode ser, portanto, dita como ligada. Também pode ser denominado "grupo de ligação".
[0032] A expressão "estreitamente ligado", no presente pedido, significa que a recombinação entre dois loci ligados ocorre com uma frequência igual ou menor que cerca de 10% (isto é, são separados em um mapa genético por não mais do que 10 cM). De outro modo, os loci estreitamente ligados cossegregam pelo menos 90% do tempo. Os loci marcadores são especialmente úteis em relação à matéria da presente revelação quando os mesmos demonstram uma probabilidade significativa de cossegregação (ligação) com um traço desejado (por exemplo, resistência à podridão de colmo causada por antracnose). Os loci estreitamente ligados, como um locus marcador e a segundo locus podem exibir uma frequência de recombinação de inter-locus de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 7% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferidas, os loci relevantes exibem uma recombinação com uma frequência de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. Dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e em tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorre a uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) também são ditos como "próximos" entre si. Em alguns casos, dois marcadores diferentes podem ter as mesmas coordenadas de mapa genético. Naquele caso, os dois marcadores estão em tal proximidade estreita entre si que a recombinação ocorre entre os mesmos com tal frequência baixa que é não detectável.
[0033] O termo "complemento" se refere a uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma dada sequência de nucleotídeos, isto é, as sequências são relacionadas pelas regras de pareamento de base de Watson-Crick.
[0034] O termo “DNA contíguo" se refere a um trecho ininterrupto de DNA genômico representado sobrepondo-se parcialmente peças ou contigs.
[0035] Quando em referência à relação entre dois elementos genéticos, como um elemento genético que contribui para a resistência à podridão de colmo causada por antracnose e um marcador proximal, a ligação de fase de "acoplamento" indica o estado em que o alelo "favorável" no locus de resistência à podridão de colmo causada por antracnose é fisicamente associado no mesmo filamento de cromossomo que o alelo "favorável" do respectivo locus de marcador ligado. Em fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados juntos por progênie que herda aquele filamento de cromossomo.
[0036] O termo "cruzado" ou "cruzar" se refere a um cruzamento sexual e que envolveu a fusão de duas gametas haploides por meio de polinização para produzir progênie diploide (por exemplo, células, sementes ou plantas). O termo abrange tanto a polinização de uma planta por outra quanto o autocruzamento (ou autopolinização, por exemplo, quando o pólen e o óvulo são da mesma planta).
[0037] Uma planta denominada no presente documento como "diploide" tem dois conjuntos (genomas) de cromossomos.
[0038] Uma planta denominada no presente documento como “haploide duplicado" é desenvolvida duplicando-se o conjunto haploide de cromossomos (isto é, metade do número normal de cromossomos). Uma planta haploide duplicada tem dois conjuntos idênticos de cromossomos, e todos os loci são considerados homozigóticos.
[0039] Uma “linhagem de elite" é qualquer linhagem resultante de reprodução e seleção por desempenho agronômico superior.
[0040] Uma "cepa de milho exótica" ou um “germoplasma de milho exótica" é uma cepa derivada de uma planta de milho que não pertence a uma linhagem de milho de elite disponível ou cepa de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou cepas de germoplasma, um germoplasma exótico não é estreitamente relacionado por descendência ao germoplasma de elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem de elite de milho conhecida, mas é selecionado em vez disso para introduzir elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de reprodução.
[0041] Um "alelo favorável" é o alelo em um locus particular (um marcador, um QTL, etc.) que confere, ou contribui para um fenótipo agronomicamente desejável, por exemplo, resistência à podridão de colmo causada por antracnose, e que permite a identificação de plantas com aquele fenótipo agronomicamente desejável. Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável.
[0042] "Fragmento" é destinado a significar uma porção de uma sequência de nucleotídeos. Fragmentos podem ser usados como sondas de hibridização ou iniciadores de PCR com o uso de métodos revelados no presente documento.
[0043] Um "mapa genético" é uma descrição de relações de ligação genética dentre loci em um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) em uma dada espécie, geralmente representada em uma forma diagramática ou tabular. Para cada mapa genético, distâncias entre loci são medidas pelo quão frequentemente seus alelos aparecem juntos em uma população (suas frequências de recombinação). Os alelos podem ser detectados com o uso de marcadores de DNA ou proteína, ou fenótipos observáveis. Um mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores usados e do potencial polimórfico de cada marcador entre populações diferentes. As distâncias genéticas entre loci podem diferir de um mapa genético para outro. Entretanto, as informações podem ser correlacionadas de um mapa para outro com o uso de marcadores comuns. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode usar posições de marcador comuns para identificar posições de marcadores e outros loci de interesse em tal mapa genético individual. A ordem de loci não deve mudar entre mapas, embora haja frequentemente mudanças pequenas em ordens de marcador devido a, por exemplo, marcadores que detectam loci duplicados alternados em populações diferentes, diferenças em abordagens estatísticas usadas para ordenar os marcadores, mutação inovadora ou erro de laboratório.
[0044] Uma "localização de mapa genético" é uma localização em um mapa genético em relação a marcadores genéticos circundantes no mesmo grupo de ligação em que um marcador especificado pode ser encontrado dentro de uma dada espécie.
[0045] “Mapeamento genético" é o processo para definir as relações de ligação de loci através do uso de marcadores genéticos, populações que segregam os marcadores e princípios genéticos padrões de frequência de recombinação.
[0046] "Marcadores genéticos" são ácidos nucleicos que são polimórficos em uma população e em que os alelos da mesma podem ser detectados e distinguidos por um ou mais métodos analíticos, por exemplo, RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR e semelhantes. O termo também se refere a sequências de ácidos nucleicos complementares às sequências genômicas, como ácidos nucleicos usados como sondas. Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por métodos bem estabelecidos na técnica. Os mesmos incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos de sequência com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozima, detecção de polimorfismos de polinucleotídeo por hibridização específica de alelo (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma de planta, detecção de replicação de sequência autossustentada, detecção de repetições de sequência simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs). Os métodos bem estabelecidos também são conhecidos pela detecção de etiquetas de sequência expressas (ESTs) e marcadores SSR derivados de sequências EST e DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD).
[0047] "Frequência de recombinação genética” é a frequência de um cruzamento por evento (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou traços que seguem a meiose.
[0048] "Genoma" se refere ao DNA total, ou ao conjunto inteiro de genes, portado por um cromossomo ou conjunto de cromossomos.
[0049] O termo "genótipo" é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos. Genótipo é definido pelo alelo (ou alelos) de um ou mais loci conhecidos que o indivíduo herdou de seus parentes. O termo genótipo pode ser usado para se referir a uma constituição genética de indivíduo em um locus único, em múltiplos loci ou, mais geralmente, o termo genótipo pode ser usado para se referir a uma constituição genética do indivíduo para todos os genes em seu genoma.
[0050] "Germoplasma" se refere ao material genético de ou proveniente de um indivíduo (por exemplo, uma planta), um grupo de indivíduos (por exemplo, uma linhagem, variedade ou família de planta) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultura, ou mais geralmente, todos os indivíduos dentro de uma espécie ou para diversas espécies (por exemplo, coleção de germoplasma de milho ou coleção de germoplasma andino). O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode ser separado do organismo ou célula. Em geral, o germoplasma fornece material genético com uma constituição molecular específica que fornece uma base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultura celular. Conforme usado no presente documento, germoplasma inclui células, semente ou tecidos a partir dos quais as plantas novas podem ser cultivadas, ou partes de planta, como folhas, caules, pólen ou células, que podem ser cultivados em uma planta total.
[0051] Uma planta denominada "haploide" tem um conjunto único (genoma) de cromossomos.
[0052] Um "haplótipo" é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de loci genéticos, isto é, uma combinação de alelos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um haplótipo são física e geneticamente ligados, isto é, no mesmo segmento de cromossomo.
[0053] O termo “heterogeneidade" é usado para indicar que indivíduos dentro do grupo diferem em genótipo em um ou mais loci específicos.
[0054] A resposta heterótica de material, ou "heterose", pode ser definida por desempenho que excede a média dos parentes (ou parente superior) quando cruzados com outros grupos dissimilares ou não relacionados.
[0055] Um "grupo heterótico" compreende um conjunto de genótipos que têm desempenho satisfatório quando cruzado com genótipos de um grupo heterótico diferente (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, páginas 463 a 564. Em G.F. Sprague e J.W. Dudley (ed.) Corn and corn improvement). As linhagens congênitas são classificadas em grupos heteróticos e são adicionalmente subdivididas em famílias dentro de um grupo heterótico, com base em diversos critérios como descendência, associações com base em marcador molecular e desempenho em combinações híbridas (Smith et al. (1990) Theor. Appl. Gen. 80:833 a 840). Os dois grupos heteróticos mais amplamente usados nos Estados Unidos são denominados "Iowa Stiff Stalk Synthetic" (também denominados no presente documento como "colmo rígido") e "Lancaster" ou "Lancaster Sure Crop" (algumas vezes denominado como NSS, ou Colmo não Rígido).
[0056] Alguns grupos heteróticos possuem os traços necessários para ser um parente feminino, e outros, traços para um parente masculino. Por exemplo, em milho, os resultados de rendimento de congênitos públicos liberados a partir de uma população chamada BSSS (população Iowa Stiff Stalk Synthetic) resultou nesses congênitos e seus derivados se tornando o grupamento feminino no Cinturão do Milho central. Os congênitos BSSS foram cruzados com outros congênitos, por exemplo, SD 105 e Maiz Amargo, e esse grupo geral de materiais se tornou conhecido como Stiff Stalk Synthetics (SSS) mesmo que nem todos os congênitos sejam derivados da população BSSS original (Mikel e Dudley (2006) Crop Sci: 46:1193 a 1205). Por padrão, todos os outros congênitos que se combinam bem com os congênitos SSS foram atribuídos ao grupamento masculino, o qual pela ausência de um nome mais satisfatório foi designado NSS, isto é, Colmo Não Rígido. Esse grupo inclui diversos grupos heteróticos principais como Lancaster Surecrop, Iodent e Leaming Corn.
[0057] Um indivíduo é "heterozigótico" se mais de um tipo de alelo está presente em um dado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia de cada um de dois alelos diferentes).
[0058] O termo "homogeneidade" indica que membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos.
[0059] Um indivíduo é "homozigótico" se o indivíduo tem apenas um tipo de alelo em um dado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada um dos dois cromossomos homólogos).
[0060] O termo “híbrido" se refere à progênie obtida entre o cruzamento de pelo menos dois parentes geneticamente dissimilares.
[0061] "Hibridização” ou “hibridização de ácido nucleico" se refere ao pareamento de cepas de RNA e DNA complementares, assim como ao pareamento de filamentos únicos de DNA complementares.
[0062] O termo "hibridizar" significar formar pares de base entre regiões complementares de filamentos de ácido nucleico.
[0063] Um “mapa genético IBM" pode se referir a qualquer um dos mapas a seguir: IBM, IBM2, vizinhos IBM2, IBM2 FPC0507, vizinhos IBM2 2004, vizinhos IBM2 2005, quadro de vizinhos IBM2 2005, vizinhos IBM2 2008, quadro de vizinhos IBM2 2008 ou a última versão no sítio da web maizeGDB. Os mapas genéticos IBM têm base em uma população B73 x Mo17 no qual a progênie do cruzamento inicial foi aleatoriamente correspondida para múltiplas gerações antes de construir linhagens congênitas recombinantes para mapeamento. As versões mais recentes refletem a adição de loci mapeados de BAC e genéticos assim como refinamento de mapa aprimorado devido à incorporação de informações obtidas a partir de outros mapas genéticos ou mapas físicos, data limpa, ou ao uso de algoritmos novos.
[0064] O termo "congênito" se refere a uma linhagem que foi reproduzida para homogeneidade genética.
[0065] O termo “indel" se refere a uma inserção ou deleção, em que uma linhagem pode ser denominada como tendo um nucleotídeo inserido ou peça de DNA em relação a uma segunda linhagem, ou a segunda linhagem pode ser denominada como tendo um nucleotídeo deletado ou peça de DNA em relação à primeira linhagem.
[0066] O termo "introgressão" se refere à transmissão de um alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgressão de um alelo desejado em um locus especificado pode ser transmitido a pelo menos uma progênie por meio de um cruzamento sexual entre dois parentes da mesma espécie, em que pelo menos um dos parentes tem o alelo desejado em seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por recombinação entre dois genomas de doador, por exemplo, em um protoplasto fundido, em que pelo menos um dentre os protoplastos doadores tem o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, detectado por um marcador que é associado a um fenótipo, em um QTL, um transgene, ou semelhantes. Em qualquer caso, a descendência que compreende o alelo desejado pode ser repetidamente retrocruzada com uma linhagem que tem um fundo genético desejado e selecionado pelo alelo desejado, para resultar no alelo se tornando fixo em um fundo genético selecionado.
[0067] O processo de "introgressão" é frequentemente denominado "retrocruzamento" quando o processo é repetido duas ou mais vezes.
[0068] Uma "linhagem" ou "cepa" é um grupo de indivíduos de antecedentes idênticos que são geralmente congênitos até certo ponto e que são geralmente homozigóticos e homogêneos na maioria dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). Uma "sublinhagem" se refere a um subconjunto congênito de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos congênitos de modo similar descendentes do mesmo progenitor.
[0069] Conforme usado no presente documento, o termo "ligação" é usado para descrever o grau com o qual um locus marcador é associado a outro locus marcador ou algum outro locus. A relação de ligação entre um marcador molecular e um locus que afeta um fenótipo é dada como uma “probabilidade" ou “probabilidade ajustada". A ligação pode ser expressa como uma faixa ou limite desejado. Por exemplo, em algumas modalidades, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores são separados por menos de 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa (ou cM) de um mapa de meiose único (um mapa genético com base em uma população que foi submetida a um ciclo de meiose, como, por exemplo, um F2; os mapas IBM2 consistem em meioses múltiplas). Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma faixa limitada de ligação, por exemplo, entre 10 e 20 cM, entre 10 e 30 cM, ou entre 10 e 40 cM. Quanto mais estritamente o marcador é ligado a um segundo locus, o marcador se torna um indicador mais satisfatório para o segundo locus. Desse modo, “loci estreitamente ligados”, como um locus marcador e um segundo locus, podem exibir uma frequência de recombinação de inter-locus de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 7% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos, e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferidas, os loci relevantes exibem uma recombinação com uma frequência de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. Dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e em tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorre a uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos) também são ditos como "em proximidade" entre si. Visto que um cM é a distância entre dois marcadores que mostram uma frequência de recombinação de 1%, qualquer marcador é estreitamente ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que está em proximidade estreita, por exemplo, em ou menos de 10 cM de distância. Dois marcadores estreitamente ligados no mesmo cromossomo podem ser posicionados 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos entre si.
[0070] O termo "desequilíbrio de ligação" se refere a uma segregação não aleatória de loci ou traços genéticos (ou ambos). Em qualquer caso, o desequilíbrio de ligação implica que os loci relevantes estão dentro de proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo para que segreguem juntos com uma frequência maior do que aleatória (isto é, não aleatória). Os marcadores que mostram o desequilíbrio de ligação são considerados ligados. Os loci ligados cossegregam mais do que 50% do tempo, por exemplo, a partir de cerca de 51% a cerca de 100% do tempo. Em outras palavras, dois marcadores que cossegregam têm uma frequência de recombinação menor que 50% (e por definição, são separados por menos de 50 cM no mesmo grupo de ligação). Conforme usado no presente documento, ligação pode ser entre dois marcadores, ou alternativamente entre um marcador e um locus que afeta um fenótipo. Um locus marcador pode ser "associado a" (ligado a) um traço. O grau de ligação de um locus marcador e um locus que afeta um traço fenotípico é medido, por exemplo, como uma probabilidade estatística de cossegregação daquele marcador molecular com o fenótipo (por exemplo, uma estatística F ou escore LOD).
[0071] O desequilíbrio de ligação é mais comumente avaliado com o uso da medida r2, a qual é calculada com o uso da fórmula descrita por Hill, W.G. e Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:226 a 231(1968). Quando r2 = 1, LD completo existe entre os dois loci marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por recombinação e têm a mesma frequência de alelo. O valor de r2 será dependente da população usada. Os valores para r2 acima de 1/3 indicam LD suficientemente forte para ser útil para mapeamento (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)). Então, os alelos estão em desequilíbrio de ligação quando valores de r2 entre loci marcadores em par são maiores ou iguais a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0.
[0072] Conforme usado no presente documento, “equilíbrio de ligação" descreve uma situação em que dois marcadores segregam independentemente, isto é, selecionam entre progênie aleatoriamente. Os marcadores que mostram equilíbrio de ligação são considerados não ligados (se residem ou não no mesmo cromossomo).
[0073] Um "locus" é uma posição em um cromossomo, por exemplo em que um nucleotídeo, gene, sequência, ou marcador está localizado.
[0074] O "logaritmo de valor de chances (LOD)" ou "escore de LOD" (Risch, Science 255:803 a 804 (1992)) é usado em mapeamento de intervalo genético para descrever o grau de ligação entre dois marcadores de loci. Um escore de LOD de três entre dois marcadores indica que a ligação é 1.000 vezes mais provável do que nenhuma ligação, enquanto um escore de LOD de dois indica que a ligação é 100 vezes mais provável que nenhuma ligação. Os escores de LOD maiores ou iguais a dois podem ser usados para detectar a ligação. Os escores de LOD também podem ser usados para mostrar a força de associação entre loci marcadores e traços quantitativos em mapeamento de “loci de traço quantitativo”. Nesse caso, o tamanho de escore de LOD é dependente da proximidade do locus marcador com o locus que afeta o traço quantitativo, assim como o tamanho do efeito de traço quantitativo.
[0075] "Milho" se refere a uma planta de Zea mays L. ssp. mays e também é conhecida como "milho".
[0076] O termo "planta de milho" inclui plantas de milho inteiras, células de planta de milho, protoplasto de planta de milho, célula de planta de milho ou cultura de tecido de milho a partir da qual as plantas de milho podem ser regeneradas, calos de planta de milho, touceiras de planta de milho e células de planta de milho que são intactas plantas de milho ou partes de plantas de milho, como sementes de milho, espigas de milho, flores de milho, cotiledôneas de milho, folhas de milho, caules de milho, brotos de milho, raízes de milho, pontas de raiz de milho e semelhantes.
[0077] Um "marcador" é um meio para encontrar uma posição em um mapa genético ou físico, ou outras ligações dentre marcadores e loci de traço (loci que afetam traços). A posição que o marcador detecta pode ser conhecida por meio de detecção de alelos polimórficos e seu mapeamento genético, ou por hibridização, correspondência de sequência ou amplificação de uma sequência que foi fisicamente mapeada. Um marcador pode ser um marcador de DNA (detecta polimorfismos de DNA), uma proteína (detecta variação em um polipeptídeo codificado), ou um fenótipo simplesmente herdado (como o fenótipo ‘ceroso’). Um marcador de DNA pode ser desenvolvido a partir da sequência de nucleotídeos genômico ou a partir de sequências de nucleotídeos expressas (por exemplo, a partir de um RNA emendado ou um cDNA). Dependendo da tecnologia de marcador de DNA, o marcador consistirá em iniciadores complementares que flanqueiam o locus e/ou sondas complementares que hibridizam para alelos polimórficos no locus. Um marcador de DNA, ou um marcador genético, também pode ser usado para descrever o gene, sequência de DNA ou nucleotídeo no cromossomo em si (em vez dos componentes usados para detectar o gene ou a sequência de DNA) e é frequentemente usado quando o marcador de DNA é associado a um traço particular em genética humana (por exemplo, um marcador para câncer de mama). O termo locus marcador é o locus (gene, sequência ou nucleotídeo) que o marcador detecta.
[0078] Os marcadores que detectam polimorfismos genéticos entre membros de uma população são bem estabelecidos na técnica. Os marcadores podem ser definidos pelo tipo de polimorfismo que os mesmos detectam e também pela tecnologia de marcador usada para detectar o polimorfismo. Os tipos de marcador incluem, mas sem limitação, por exemplo, a detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozima, DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD), polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs), detecção de repetições de sequência simples (SSRs), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma de planta, detecção de replicação de sequência autossustentada ou detecção de polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs). SNPs podem ser detectados, por exemplo, por meio de sequenciamento de DNA, métodos de amplificação específicos de sequência com base em PCR, detecção de polimorfismos de polinucleotídeo por hibridização específica de alelo (ASH), hibridização específica de alelo dinâmica (DASH), baliza molecular, hibridização de microarranjo, ensaios de ligase de oligonucleotídeo, endonucleases Flap, endonucleases 5’, extensão de iniciador, polimorfismo de conformação de filamento simples (SSCP) ou eletroforese de gel de gradiente de temperatura (TGGE). O sequenciamento de DNA, como a tecnologia de pirossequenciamento, tem a vantagem de poder detectar uma série de alelos de SNP ligados que constituem um haplótipo. Os haplótipos tendem a ser mais informativos (detectar um nível mais alto de polimorfismo) do que SNPs.
[0079] A “alelo marcador", alternativamente um "alelo de um locus marcador", pode se referir a uma dentre uma pluralidade de sequências de nucleotídeos polimórficas encontradas em um locus marcador em uma população.
[0080] "Seleção auxiliada por marcador" (de MAS) é um processo pelo qual plantas individuais são selecionadas com base em genótipos marcadores.
[0081] "Contrasseleção auxiliada por marcador" é um processo pelo qual os genótipos marcadores são usados para identificar plantas que não serão selecionadas, o que permite que as mesmas sejam removidas de um programa de reprodução ou plantação.
[0082] Um "haplótipo marcador" se refere a uma combinação de alelos em um locus marcador.
[0083] Um "locus marcador" é uma localização de cromossomo específica no genoma de uma espécie em que um marcador específico pode ser encontrado. Um locus marcador pode ser usado para rastrear a presença de um segundo locus ligado, por exemplo, um que afeta a expressão de um traço fenotípico. Por exemplo, um locus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em um locus geneticamente ou fisicamente ligado.
[0084] Uma "sonda de marcador" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador, através da hibridização de ácido nucleico. As sondas de marcador que compreendem 30 ou mais nucleotídeos contíguos do locus marcador ("todo ou uma porção" da sequência de locus marcador) podem ser usadas para hibridização de ácido nucleico. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda de marcador se refere a uma sonda de qualquer tipo que pode distinguir (isto é, genótipo) o alelo particular que está presente em um locus marcador.
[0085] O termo "marcador molecular" pode ser usado para se referir a um marcador genético, conforme definido acima, ou um produto codificado do mesmo (por exemplo, uma proteína) usado como um ponto de referência durante a identificação de um locus ligado. Um marcador pode ser derivado de sequências de nucleotídeos genômico ou de sequências de nucleotídeos expressas (por exemplo, a partir de um RNA emendado, um cDNA, etc.), ou a partir de um polipeptídeo codificado. O termo também se refere a sequências de ácidos nucleicos complementares ou que flanqueiam as sequências de marcador, como ácidos nucleicos usados como sondas ou pares de iniciadores com capacidade para amplificar a sequência de marcador. Uma "sonda de marcador molecular" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda de marcador se refere a uma sonda de qualquer tipo que pode distinguir (isto é, genótipo) o alelo particular que está presente em um locus marcador. Os ácidos nucleicos são "complementares" quando os mesmos hibridizam especificamente em solução, por exemplo, de acordo com as regras de pareamento de base de Watson-Crick. Alguns dos marcadores descritos no presente documento também são denominados marcadores de hibridização quando localizados em uma região indel, como a região não colinear descrita no presente documento. Isso é devido ao fato de que a região de inserção é, por definição, um polimorfismo vis a vis uma planta sem a inserção. Desse modo, o marcador precisa indicar apenas se a região indel está presente ou ausente. Qualquer tecnologia de detecção de marcador adequada pode ser usada para identificar tal marcador de hibridização, por exemplo, tecnologia SNP é usada nos exemplos fornecidos no presente documento.
[0086] Um alelo se correlaciona "negativamente" a um traço quando é ligado ao mesmo e quando a presença do alelo é um indicador de que um traço ou forma de traço desejado não ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.
[0087] "Sequência de nucleotídeos", "polinucleotídeo", “sequência de ácidos nucleicos", e “fragmento de ácido nucleico" são usados de modo intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que tem filamento simples ou filamento duplo, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintético, não natural ou alterado. Um "nucleotídeo" é uma unidade monomérica a partir da qual polímeros de DNA ou RNA são construídos, e consistem em uma base de purina ou pirimidina, uma pentose, e um grupo ácido fosfórico. Os nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma 5'-monofosfato) são denominados por sua designação de letra única conforme a seguir: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato, "G" para guanilato ou deoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para deoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina, e "N" para qualquer nucleotídeo.
[0088] O termo "fenótipo", “traço fenotípico" ou "traço" pode se referir à expressão observável de um gene ou série de genes. O fenótipo pode ser observável ao olho nu, ou por quaisquer outros meios de avaliação conhecidos na técnica, por exemplo, pesagem, contagem, medição (comprimento, largura, ângulos, etc.), microscopia, análise bioquímica, ou um ensaio eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um gene único ou locus genético, isto é, um “traço de gene único" ou um “traço simplesmente herdado". Na ausência de níveis grandes de variação ambiental, os traços de gene único podem segregar em uma população para gerar uma distribuição "qualitativa" ou "discreta", isto é, o fenótipo é abrangido por classes discretas. Em outros casos, um fenótipo é o resultado de diversos genes e pode ser considerado como um “traço multigênico" ou um “traço complexo". Os traços multigênicos segregam em uma população para gerar uma distribuição "quantitativa" ou "contínua", isto é, o fenótipo não pode ser separado em classes discretas. Tanto o gene simples quanto os traços multigênicos podem ser afetados pelo ambiente nos quais são expressos, mas traços multigênicos tendem a ter um componente ambiental maior.
[0089] Um “mapa físico" do genoma é um mapa que mostra a ordem linear de marcos identificáveis (incluindo genes, marcadores, etc.) no DNA de cromossomo. Entretanto, em contraste aos mapas genéticos, as distâncias entre marcos são absolutas (por exemplo, medidas em pares de base ou isoladas e sobrepondo fragmentos genéticos contíguos) e não com base em recombinação genética (que pode variar em populações diferentes).
[0090] Uma "planta" pode ser uma planta inteira, qualquer parte da mesma, ou uma célula ou a cultura de tecido derivada de uma planta. Desse modo, o termo “planta” pode se referir a qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos de planta, sementes, células de planta, e/ou progênie da mesma. Uma célula de planta é uma célula de uma planta, tomada de uma planta, ou derivada através de cultura a partir de uma célula tomada de uma planta.
[0091] Uma planta de milho "derivada de um congênito na população Stiff Stalk Synthetic" pode ser uma híbrida.
[0092] Um "polimorfismo" é uma variação no DNA entre dois ou mais indivíduos dentro de uma população. Um polimorfismo tem preferencialmente uma frequência de pelo menos 1% em uma população. Um polimorfismo útil pode incluir um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), uma repetição de sequência simples (SSR), ou um polimorfismo de inserção/deleção, também denominado no presente documento "indel".
[0093] Um alelo se correlaciona "positivamente" a um traço quando é ligado ao mesmo e quando a presença do alelo é um indicador de que o traço ou forma de traço desejado ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.
[0094] O "valor de probabilidade" ou "valor p" é a probabilidade estatística de que a combinação particular de um fenótipo e a presença ou ausência de um marcador de alelo particular é aleatório. Desse modo, quanto mais baixo o escore de probabilidade, maior a probabilidade de um locus e um fenótipo serem associados. O escore de probabilidade pode ser afetado pela proximidade do primeiro locus (normalmente um marcador de locus) e o locus que afeta o fenótipo, mais a magnitude do efeito fenotípico (a mudança em fenótipo causada por uma substituição de alelo). Em alguns aspectos, o escore de probabilidade é considerado "significativo" ou "não significativo". Em algumas modalidades, um escore de probabilidade de 0,05 (p=0,05, ou uma probabilidade de 5%) de sortimento aleatório é considerado uma indicação significativa de associação. Entretanto, uma probabilidade aceitável pode ser qualquer probabilidade menor que 50% (p=0,5). Por exemplo, uma probabilidade significativa pode ser menor que 0,25, menor que 0,20, menor que 0,15, menor que 0,1, menor que 0,05, menor que 0,01 ou menor que 0,001.
[0095] Um "marcador de produção" ou "marcador SNP de produção" é um marcador que foi desenvolvido com propósitos de produtividade alta. Os marcadores SNP de produção são desenvolvidos para detectar polimorfismos específicos e são projetados para uso com uma variedade de químicas e plataformas. Os nomes de marcador usados aqui começam com um prefixo PHM para denotar ‘Pioneer Hi-Bred Marker', seguido por um número que é específico para a sequência a partir da qual foi designado, seguido por um "." ou um "-" e então um sufixo que é específico para o polimorfismo de DNA. Uma versão de marcador também pode seguir (A, B, C etc.) que denota a versão do marcador designada àquele polimorfismo específico.
[0096] O termo "progênie" se refere à descendência gerada a partir de um cruzamento.
[0097] Uma "planta de progênie" é uma planta gerada a partir de um cruzamento entre duas plantas.
[0098] O termo “locus de traço quantitativo" ou "QTL" se refere a uma região de DNA que é associada à expressão diferencial de um traço fenotípico quantitativo em pelo menos um fundo genético, por exemplo, em pelo menos uma população de reprodução. A região do QTL abrange ou é estreitamente ligado ao gene ou genes que afetam o traço em questão.
[0099] Uma “sequência de referência" ou uma “sequência de consenso" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequência. A sequência de referência para um marcador de PHM é obtida sequenciando-se várias linhagens no locus, alinhando-se as sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequência (por exemplo, Sequencher), e obtendo-se, então, a sequência de nucleotídeos mais comum do alinhamento. Os polimorfismos encontrados dentre as sequências individuais são anotados na sequência de consenso. Uma sequência de referência não é normalmente uma cópia exata de qualquer sequência de DNA individual, mas representa um amálgama de sequências disponíveis e é útil para projetar iniciadores e sondas para polimorfismos da sequência.
[0100] Em ligação de fase de "repulsão", o alelo "favorável" no locus de interesse é fisicamente ligado a um alelo "não favorável" no marcador de locus proximal, e os dois alelos "favoráveis" não são herdados juntos (isto é, os dois loci estão "fora de fase" entre si).
[0101] Conforme usado no presente documento, "resistência à podridão de colmo causada por antracnose" se refere à resistência ou tolerância aprimorada a um patógeno fúngico que causa podridão de colmo causada por antracnose quando comparada a uma planta de controle. Efeitos podem variar de um aumento leve em tolerância aos efeitos do patógeno fúngico (por exemplo, inibição parcial) até a resistência total, de modo que a planta seja não afetada pela presença do patógeno fúngico. Um nível aumentado de resistência contra um patógeno fúngico particular ou contra um espectro mais amplo de patógenos fúngicos constitui uma resistência fúngica "aprimorada" ou melhorada. As modalidades da revelação aprimorarão ou melhorarão a resistência ao patógeno fúngico que causa podridão de colmo causada por antracnose, de modo que a resistência da planta a um patógeno fúngico ou patógenos aumente. O termo "aprimorar" se refere a melhorar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, crescer e semelhantes. Desse modo, plantas descritas no presente documento como resistentes à podridão de colmo causada por antracnose também podem ser descritas como resistentes à infecção por Colletotrichum graminicola ou como tendo ‘resistência aprimorada' à infecção por Colletotrichum graminicola.
[0102] Um "teste de cruzamento superior" é um teste realizado cruzando-se cada indivíduo (por exemplo, uma seleção, linhagem congênita, clone ou indivíduo de progênie) com o mesmo parente de pólen ou "testador", normalmente uma linhagem homozigótica.
[0103] A expressão "sob condições restritivas" se refere a condições sob as quais uma sonda ou polinucleotídeo hibridizará para uma sequência de ácidos nucleicos específica, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente para nenhuma outra sequência. As condições restritivas são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As sequências mais longas hibridizarão especificamente em temperaturas mais altas. Geralmente, as condições restritivas são selecionadas para estarem cerca de 5 a 10 °C mais baixos do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma pH de força iônica definido. A Tm é a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração de ácido nucleico) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a sequência-alvo em equilíbrio (visto que as sequências-alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). As condições restritivas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições restritivas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes o fundo, preferencialmente 10 vezes a hibridização de fundo. As condições de hibridização restritivas exemplificativas são frequentemente: 50% de formamida, 5x SSC, e 1% de SDS, incubação a 42 °C, ou, 5x SSC, 1% de SDS, incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2x SSC, e 0,1% de SDS a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação restritiva baixa, embora as temperaturas de dissociação possam variar entre cerca de 32 °C e 48 °C, dependendo do comprimento de iniciador. As linhagens de orientação para determinar os parâmetros de hibridização são fornecidas em várias referências.
[0104] Um “alelo não favorável" de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo de planta não favorável, fornecendo, portanto, o benefício de identificar plantas que podem ser removidas a partir de um programa de reprodução ou plantio.
[0105] O termo "rendimento" se refere à produtividade por área de unidade de um produto de planta particular de valor comercial. Por exemplo, o rendimento de milho é comumente medido em alqueires de semente por acre ou toneladas métricas de semente por hectare por temporada. O rendimento é afetado tanto por fatores genéticos quanto ambientais. "Agronomia", “traços agronômicos", e "desempenho agronômico" se referem aos traços (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribui para o rendimento ao longo do curso da temporada de cultivo. Os traços agronômicos individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência ou tolerância à doença, resistência a herbicida, ramificação, florescimento, conjunto de semente, tamanho de semente, densidade de semente, resistência, capacidade para ser debulhado e semelhantes. O rendimento é, portanto, a culminação final de todos os traços agronômicos.
[0106] Os alinhamentos de sequência e os cálculos de identidade de porcentagem podem ser determinados com o uso de uma variedade de métodos de comparação projetados para detectar as sequências homólogas que incluem, mas sem limitação, o programa MEGALIGN® do pacote de programas de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI). A menos que declarado de outro modo, o alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente documento foi realizado com o uso do método CLUSTAL V de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 a 153 (1989)) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Os parâmetros para alinhamentos em pares e cálculo de identidade de porcentagem de sequências de proteína com o uso do método CLUSTAL V são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências, com o uso do programa CLUSTAL V, é possível obter valores de “porcentagem de identidade" e "divergência" visualizando-se a tabela de “distâncias de sequência" no mesmo programa; a menos que declarado de outro modo, as identidades de porcentagem e divergências fornecidas e reivindicadas no presente documento foram calculadas dessa maneira.
[0107] O DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usados no presente documento são bem conhecidos na arte e são descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (mais adiante no presente documento "Sambrook").
[0108] Foi reconhecido por algum tempo que os loci genéticos específicos que se correlacionam com fenótipos particulares, como resistência à podridão de colmo causada por antracnose, podem ser mapeados em um genoma do organismo. O reprodutor de planta pode usar vantajosamente os marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados detectando-se alelos marcadores que mostram uma probabilidade estatisticamente significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestado como desequilíbrio de ligação. Identificando-se um marcador molecular ou agrupamentos de marcadores moleculares que cossegregam com um traço de interesse, o reprodutor pode selecionar rapidamente um fenótipo desejado selecionando-se o alelo marcador molecular apropriado (um processo chamado seleção auxiliada por marcador, ou MAS).
[0109] Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica está disponível para detectar marcadores moleculares ou agrupamentos de marcadores moleculares que cossegregam com um traço de interesse, como a traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose. A ideia básica subjacente a esses métodos é a detecção de marcadores, para a qual os genótipos alternativos (ou alelos) têm fenótipos médios significativamente diferentes. Desse modo, uma pessoa faz uma comparação dentre loci marcadores da magnitude da diferença dentre genótipos alternativos (ou alelos) ou o nível de significância daquela diferença. Os genes de traço são inferidos como localizados mais próximos ao marcador (ou marcadores) que têm a maior diferença genotípica associada. Dois tais métodos usados para detectar os loci de traço de interesse são: 1) Análise de associação com base em população (isto é, mapeamento de associação) e 2) Análise de ligação tradicional.
[0110] Entender a extensão e os padrões de desequilíbrio de ligação (LD) no genoma é um pré-requisito para desenvolver abordagens de associação eficazes para identificar e mapear loci de traço quantitativo (QTL). O desequilíbrio de ligação (LD) se refere à associação não aleatória de alelos em uma coleção de indivíduos. Quando LD é observado dentre alelos em loci ligados, o mesmo é medido à medida que LD decai através de uma região específica de um cromossomo. A extensão do LD é um reflexo do histórico recombinatório daquela região. A taxa média de decaimento de LD em um genoma pode auxiliar a prever o número e a densidade de marcadores que são necessários para submeter um estudo de associação em genoma e fornecer uma estimativa da resolução que pode ser esperada.
[0111] Associação ou mapeamento de LD objetiva identificar associações genótipo-fenótipo significativas. O mesmo foi explorado como uma ferramenta poderosa para mapeamento preciso em cruzamento de espécies como seres humanos (Corder et al. (1994) "Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late- onset Alzheimer-disease", Nat Genet 7:180 a 184; Hastbacka et al. (1992) "Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in Finland" Nat Genet 2:204 a 211; Kerem et al. (1989) "Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis", Science 245:1073 a 1080) e milho (Remington et al., (2001) "Structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maize genome", Proc Natl Acad Sci USA 98:11479 a 11484; Thornsberry et al. (2001) "Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time", Nat Genet 28:286 a 289; revisado por Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants", Annu Rev Plant Biol. 54:357 a 374), em que a recombinação entre heterozigotos é frequente e resulta em um decaimento rápido de LD. Em cruzamentos cossanguíneos, a espécie em que a recombinação entre genótipos homozigóticos não é geneticamente detectável, a extensão de LD é maior (isto é, blocos maiores de marcadores ligados são herdados juntos) e isso aprimora dramaticamente a potência de detecção de mapeamento de associação (Wall e Pritchard (2003) "Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome", Nat Rev Genet 4:587 a 597).
[0112] O histórico recombinatório e de mutação de uma população é uma função do hábito de acasalamento, assim como o tamanho eficaz e a idade de uma população. Os tamanhos de população grandes oferecem possibilidades aprimoradas para detectar recombinação, enquanto as populações mais velhas são geralmente associadas a níveis mais altos de polimorfismo, ambos os quais contribuem para taxas aceleradas de modo observável de decaimento de LD. Por outro lado, os tamanhos de população eficazes, por exemplo, aqueles que experimentaram um efeito de gargalo recente, tendem a mostrar uma taxa mais lenta de decaimento de LD, o que resulta em conservação de haplótipo mais extensiva (Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants", Annu Rev Plant Biol. 54:357 a 374).
[0113] As linhagens de reprodução de elite fornecer um ponto inicial valioso para análises de associação. As análises de associação usam escores fenotípicos quantitativos (por exemplo, tolerância à doença classificada de um a nove para cada linhagem de milho) na análise (conforme oposto à observação apenas em distribuições de frequência de alelo tolerante versus resistente em tipos de distribuição de alelo intergrupo de análise). A disponibilidade de dados de desempenho fenotípico detalhados coletados por programas de reprodução ao longo dos múltiplos anos e ambientes para um número grande de linhagens de elite fornece um conjunto de dados valioso para análises de mapeamento de associação de marcador genético. Isso cria o caminho para integração contínua entre pesquisa e aplicação e toma vantagem dos conjuntos de dados historicamente acumulados. Entretanto, um entendimento da relação entre polimorfismo e recombinação é útil no desenvolvimento de estratégias apropriadas para extrair de modo eficaz o máximo de informações desses recursos.
[0114] Esse tipo de análise de associação não gera nem necessita de quaisquer dados de mapa, mas é independente de posição de mapa. Essa análise compara o escore fenotípico das plantas com os genótipos nos vários loci. Subsequentemente, qualquer mapa de milho adequado (por exemplo, um mapa compósito) pode ser opcionalmente usado para auxiliar na distribuição observada dos marcadores QTL identificados e/ou agrupamento de marcador QTL com o uso de localizações de mapa anteriormente determinadas dos marcadores.
[0115] Os mesmos princípios são subjacentes à análise de ligação tradicional; entretanto, LD é gerado criando-se uma população a partir de um número pequeno de fundadores. Os fundadores são selecionados para maximizar o nível de polimorfismo dentro da população construída, e sítios polimórficos são avaliados por seu nível de cossegregação com um dado fenótipo. Vários métodos estatísticos foram usados para identificar associações de traço de marcador significativas. Um tal método é uma abordagem de mapeamento de intervalo (Lander e Botstein, Genetics 121:185 a 199 (1989), no qual cada uma das muitas posições ao longo de um mapa genético (dizer em intervalos de 1 cM) é testada para a probabilidade de um gene controlar um traço de interesse ser localizado naquela posição. Os dados de genótipo/fenótipo são usados para calcular para cada posição de teste um escore de LOD (log de razão de probabilidade). Quando o escore de LOD excede um valor de limiar, há evidência significativa para a localização de um gene que controla o traço de interesse naquela posição no mapa genético (que estará entre dois loci marcadores particulares).
[0116] Os loci de marcador de milho que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose, conforme determinado por análise de ligação tradicional e por genoma análise de associação de genoma total, são fornecidos no presente documento. A detecção de loci ou loci ligados adicionais pode ser usada em programas de reprodução de milho auxiliados por marcador para produzir plantas que têm resistência à podridão de colmo causada por antracnose.
[0117] As atividades em programas de reprodução de milho auxiliados por marcador podem incluir, mas sem limitação: selecionar dentre populações de reprodução novas para identificar qual população tem a frequência mais alta de sequências de ácidos nucleicos favoráveis com base no genótipo histórico e associações de traço agronômico, selecionar sequências de ácidos nucleicos favoráveis dentre progênie em populações de reprodução, selecionar dentre linhagens parentais com base na previsão de desempenho de progênie, e avançar linhagens em atividades de melhora de germoplasma com base na presença de sequências de ácidos nucleicos favoráveis.
[0118] Um QTL no cromossomo 10 foi identificado como associado ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose com o uso de mapeamento de ligação tradicional (Exemplo 1). O QTL está localizado no cromossomo 10 em uma região definida por e que inclui C00429-801 e PHM824, um subintervalo do qual é definido e inclui SYN17244 e sbd_INBREDA_48, um subintervalo que é definido por e inclui os marcadores sbd_INBREDA_093 e sbd_INBREDA_109.
[0119] Os intervalos cromossômicos que se correlacionam com o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose são fornecidos. Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica está disponível para identificar valores cromossômicos. Os limites de tais intervalos cromossômicos tendem a abranger marcadores que serão ligados ao gene (ou genes) que controla o traço de interesse. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é extraído de modo que qualquer marcador que reside naquele intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem os limites do intervalo) possam ser usados como um marcador para o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose. As Tabelas 1 e 2 identificam marcadores na região de 10 QTL de cromossomo que demonstraram no presente documento se associar ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose e que são ligados a um gene (ou genes) que controla a resistência à podridão de colmo causada por antracnose. As sequências de referência para cada um dos marcadores são representadas por SEQ ID NOs:1-16.
[0120] Cada intervalo compreende pelo menos um QTL, e adicionalmente, pode compreender certamente mais de um QTL. A proximidade estreita de múltiplos QTL no mesmo intervalo pode obscurecer a correlação de um marcador particular com um QTL particular, visto que um marcador pode demonstrar a ligação a mais de um QTL. Ao contrário, por exemplo, se dois marcadores em proximidade estreita mostram cossegregação com o traço fenotípico desejado, é algumas vezes obscuro se cada um desses marcadores identifica o mesmo QTL ou dois QTL diferentes. Independentemente, o conhecimento de quantos QTL estão em um intervalo particular não é necessário para fazer ou praticar o que é apresentado na presente revelação.
[0121] O intervalo de cromossomo 10 pode abranger qualquer um dos marcadores identificados no presente documento como associados ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose incluindo: C00429-801, SYN17615, PZE-110006361, PHM824-17, SYN17244, sbd_INBREDA_4, sbd_INBREDA_9, sbd_INBREDA_13, sbd_INBREDA_24, sbd_INBREDA_25, sbd_INBREDA_32, sbd_INBREDA_33, sbd_INBREDA_35, sbd_INBREDA_48, sbd_INBREDA_093, e sbd_INBREDA_109. O intervalo de cromossomo 10, por exemplo, pode ser definido por marcadores C00429-801 e PHM824-17, um subintervalo adicional do qual pode ser definido por marcadores SYN17244 e sbd_INBREDA_48, um subintervalo adicional do qual pode ser definido por marcadores sbd_INBREDA_093 e sbd_INBREDA_109. Qualquer marcador localizado nesses intervalos pode encontrar uso como um marcador para resistência à podridão de colmo causada por antracnose e pode ser usado no contexto dos métodos apresentados no presente documento para identificar e/ou selecionar as plantas de milho que têm resistência à podridão de colmo causada por antracnose, recém-conferidas ou aprimoradas em comparação a uma planta de controle.
[0122] Os intervalos cromossômicos também podem ser definidos por marcadores que são ligados (mostram desequilíbrio de ligação com) a QTL marcador, e r2 é uma medida comum de desequilíbrio de ligação (LD) no contexto de estudos de associação. Se o valor r2 de LD entre um locus marcador de cromossomo 10 em um intervalo de interesse e outro locus marcador de cromossomo 10 em proximidade estreita for maior que 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)), os loci estão em desequilíbrio de ligação entre si.
[0123] Uma medição comum de ligação é a frequência com a qual os traços cossegregam. Isso pode ser expresso como uma porcentagem de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). O cM é uma unidade de medida de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a uma chance de 1% que um traço em um locus genético será separado a partir de um traço em outro locus devido ao cruzamento por uma geração única (o que significa que os traços segregam juntos 99% do tempo). Devido ao fato de a distância cromossômica ser aproximadamente proporcional à frequência de cruzamento por eventos entre traços, há uma distância física aproximada que se correlaciona com a frequência de recombinação.
[0124] Os loci marcadores são traços em si e podem ser avaliados de acordo com a análise de ligação padrão rastreando-se os loci marcadores durante a segregação. Desse modo, um cM é igual a uma chance de 1% que um locus marcador será separado de outro locus, devido ao cruzamento por uma geração única.
[0125] Quanto mais próximo um marcador estiver de um gene que controla um traço de interesse, o mais eficaz e vantajoso que um marcador estiver como um indicador para o traço desejado. Os loci estreitamente ligados exibem uma frequência de cruzamento de inter-locus de cerca de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 7% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos, e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferidas, os loci relevantes (por exemplo, um locus marcador e um locus alvo) exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. Desse modo, os loci têm diferença de cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos. Por outro lado, dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e em tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorre a uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos) são ditos como "próximos" entre si.
[0126] Embora os alelos marcadores particulares possam cossegregar com o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose, é importante notar que o locus marcador não seja necessariamente responsável pela expressão do fenótipo resistente à podridão de colmo causada por antracnose. Por exemplo, não é uma necessidade que a sequência de polinucleotídeo de marcador seja parte de um gene que é responsável pelo fenótipo resistente à podridão de colmo causada por antracnose (por exemplo, é parte do quadro de leitura aberta de gene). A associação entre um marcador de alelo específico e o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose é devido à fase de ligação de “acoplamento" original entre o alelo marcador e o alelo na linhagem de milho ancestral a partir da qual o alelo originou. Eventualmente, com recombinação repetida, o cruzamento ao longo dos eventos entre o marcador e o locus genético pode mudar essa orientação. Por essa razão, o alelo marcador favorável pode mudar dependendo da fase de ligação que existe no parente que tem resistência à podridão de colmo causada por antracnose que é usada para criar populações em segregação. Isso não muda o fato de que o marcador pode ser usado para monitorar a segregação do fenótipo. Apenas muda qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população de segregação.
[0127] Os métodos apresentados no presente documento incluem detectar a presença de um ou mais alelos marcadores associados à resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho e identificar, então, e/ou selecionar plantas de milho que têm alelos favoráveis naqueles loci marcadores. Os marcadores listados nas Tabelas 1 e 2 foram identificados no presente documento como associados ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose e, então, podem ser usados para prever a resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho. Qualquer marcador dentro de 50 cM, 40 cM, 30 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM (com base em um mapa genético com base em meiose única) de qualquer um dentre os marcadores nas Tabelas 1 e 2 também podem ser usados para prever a resistência à podridão de colmo causada por antracnose em uma planta de milho.
[0128] Os marcadores moleculares podem ser usados em uma variedade de aplicações de reprodução de planta (por exemplo, consultar Staub et al. (1996) Hortscience 31: 729 a 741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter. 1: 3 a 8). Uma das áreas principais de interesse é para criar a eficácia de retrocruzamento e genes de introgressão com o uso de seleção auxiliada por marcador (MAS). Um marcador molecular que demonstra ligação com um locus que afeta um traço fenotípico desejado fornece uma ferramenta útil para a seleção do traço em uma população de planta. Isso é particularmente verdadeiro quando o fenótipo é difícil de ensaiar. Visto que os ensaios de marcador de DNA são menos trabalhosos e tomam menos espaço físico do que a fenotipagem de campo, as populações muito maiores podem ser ensaiadas, o que aumenta as chances de encontrar um recombinante com o segmento-alvo da linhagem doadora movido para a linhagem recipiente. Quanto mais próxima a ligação, mais útil o marcador, visto que a recombinação é menos propensa a ocorrer entre o marcador e o gene que causa o traço, o que pode resultar em falsos positivos. Ter marcadores de flanqueamento diminui as chances que a seleção falsa positiva ocorrerá visto que um evento de recombinação dupla seria necessário. A situação ideal é ter um marcador no gene em si, para que a recombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Tal marcador é chamado “marcador perfeito”.
[0129] Quando um gene é introgressado por MAS, não apenas o gene é introduzido, com também as regiões de flanqueamento (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780 a 1790). Isso é denominado "arraste de ligação". No caso em que a planta doadora é altamente não relacionada à planta recipiente, essas regiões de flanqueio portam genes adicionais que podem codificar traços agronomicamente indesejáveis. Esse "arraste de ligação" também pode resultar em rendimento reduzido ou outras características agronômicas negativas até mesmo após múltiplos ciclos de retrocruzamento na linhagem de milho de elite. Isso também é denominado algumas vezes como "arraste de rendimento". O tamanho da região de flanqueamento pode ser diminuída por retrocruzamento adicional, embora isso não seja sempre bem sucedido, visto que reprodutores não têm controle sobre o tamanho da região ou os pontos de interrupção de recombinação (Young et al. (1998) Genetics 120:579 a 585). Em reprodução clássica, é normalmente apenas por chance que as recombinações são selecionadas que contribuem para uma redução no tamanho do segmento doador (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257 a 264). Mesmo após 20 retrocruzamentos em retrocruzamentos desse tipo, uma pessoa pode esperar encontrar uma peça dimensionável do cromossomo doador ainda ligado ao gene selecionado. Com marcadores, entretanto, é possível selecionar aqueles indivíduos raros que experimentaram recombinação próxima do gene de interesse. Em 150 plantas de retrocruzamento, há uma chance de 95% de que pelo menos uma planta terá experimentado um cruzamento dentro de 1 cM do gene, com base em uma distância de mapa de meiose única. Os marcadores permitirão a identificação não equivocada desses indivíduos. Com um retrocruzamento adicional de 300 plantas, haveria uma chance de 95% de um cruzamento dentro de uma distância de mapa de meiose única de 1 cM do outro lado do gene, gerando um segmento em torno do gene-alvo de menos de 2 cM com base em uma distância de mapa de meiose única. Isso pode ser cumprido em duas gerações com marcadores, em que seria necessário em média 100 gerações sem marcadores (Consultar Tanksley et al., supra). Quando a localização exata de um gene é conhecida, os marcadores de flanqueamento que circundam o gene podem ser utilizados para selecionar as recombinações em tamanhos de população diferentes. Por exemplo, em tamanhos de população menores, recombinações podem ser esperadas distantes do gene, para que mais marcadores de flanqueamento distais sejam direcionados para detectar a recombinação. A disponibilidade de mapas de ligação integrados do genoma de milho que contém densidades crescentes de marcadores de milho públicos facilitou o mapeamento genético de milho e MAS. Consultar, por exemplo os mapas de Vizinhos IBM2, os quais estão disponíveis online no sítio da web MaizeGDB.
[0130] Os componentes-chave para a implantação de MAS são: (i) Definir a população dentro da qual a associação marcador-traço será determinada, a qual pode ser uma população de segregação, ou uma população aleatória ou estruturada; (ii) monitorar a segregação ou associação de marcadores polimórficos em relação ao traço, e determinar a ligação ou associação com o uso de métodos estatísticos; (iii) definir um conjunto de marcadores desejáveis com base nos resultados da análise estatística, e (iv) o uso e/ou extrapolação dessas informações para o conjunto atual de germoplasma de reprodução para possibilitar que as decisões de seleção com base em marcador sejam feitas. Os marcadores descritos nessa revelação, assim como outros tipos de marcador, como SSRs e FLPs, podem ser usados em protocolos de seleção auxiliados por marcador.
[0131] SSRs podem ser definidos como execuções relativamente curtas de DNA repetidas em tandem com comprimentos de 6 bp ou menos (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463 a 6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1 a 6) Polimorfismos surgem devido à variação no número de unidades de repetição, provavelmente causados por deslize durante replicação de DNA (Levinson e Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203 a 221). A variação em comprimento de repetição pode ser detectada projetando-se iniciadores de PCR para as regiões de flanqueamento não repetitivas conservadas (Weber e May (1989) Am J Hum Genet. 44:388 a 396). SSRs são altamente adequados para mapeamento e MAS visto que são multialélicos, codominantes, reproduzíveis e amenizáveis à automatização de produtividade alta (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. Em: Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic press. páginas 75 a 135).
[0132] Vários tipos de marcadores de SSR podem ser gerados, e perfis de SSR podem ser obtidos por eletroforese de gel dos produtos de amplificação. O escore de genótipo de marcador tem base no tamanho do fragmento amplificado. Um serviço de SSR para milho é disponível ao público em uma base contratual por DNA Landmarks in Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.
[0133] Vários tipos de marcadores de FLP também podem ser gerados. Mais comumente, os iniciadores de amplificação são usados para gerar polimorfismos de comprimento de fragmento. Tais marcadores de FLP são similares de muitas maneiras aos marcadores de SSR, exceto pela região amplificada pelos iniciadores não ser tipicamente uma região altamente repetitiva. Adicionalmente, a região amplificada, ou amplicon, terá variabilidade suficiente dentre germoplasma, frequentemente devido a inserções ou deleções, de modo que os fragmentos gerados pelos iniciadores de amplificação possam ser distinguidos dentre indivíduos polimórficos, e tais indels são conhecidos por ocorrer frequentemente em milho (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539 a 547; Rafalski (2002b), supra).
[0134] Os marcadores de SNP detectam substituições de nucleotídeo de par de base único. Dentre todos os tipos de marcador molecular, SNPs são os mais abundantes, tendo, desse modo, o potencial para fornecer a resolução de mapa genético mais alta (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539 a 547). SNPs podem ser ensaiados em um nível ainda mais alto de produtividade do que SSRs, de uma maneira chamada “produtividade ultra alta”, visto que não necessitam de quantidades grandes de DNA e a automatização do ensaio pode ser direta. SNPs também têm a promessa de serem sistemas de custo relativamente baixo. Esses três fatores juntos tornam SNPs altamente atrativos para uso em MAS. Os diversos métodos estão disponíveis para genotipagem de SNP, incluindo, mas sem limitação, hibridização, extensão de iniciador, ligação de oligonucleotídeo, clivagem de nuclease, minissequenciamento e esferas codificadas. Tais métodos foram revisados em: Gut (2001) Hum Mutat 17 páginas 475 a 492; Shi (2001) Clin Chem 47, páginas 164 a 172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, páginas 95 a 100; e Bhattramakki e Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. Em: R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Uma faixa ampla de tecnologias comercialmente disponíveis utilizam esses e outros métodos para interrogar SNPs que incluem Masscode.TM. (Qiagen), INVADER®. (Third Wave Technologies) e Invader PLUS®, SNAPSHOT®. (Applied Biosystems), TAQMAN®. (Applied Biosystems) e BEADARRAYS®. (Illumina).
[0135] Vários SNPs juntos dentro de uma sequência, ou através de sequências ligadas, podem ser usados para descrever um haplótipo para qualquer genótipo particular (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 páginas Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329 a 333). Os haplótipos podem ser mais informativos do que SNPs únicos e podem ser mais descritivos de qualquer genótipo particular. Por exemplo, um SNP único pode ser alelo “T” para uma linhagem ou variedade específica com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, mas o alelo “T” também pode ocorrer na população de reprodução de milho utilizada para parentes recorrentes. Nesse caso, um haplótipo, por exemplo, uma combinação de alelos em marcadores de SNP ligados, pode ser mais informativo. Uma vez que um haplótipo único for visto atribuído a uma região cromossômica doadora, aquele haplótipo pode ser usado naquela população ou qualquer subconjunto do mesmo para determinar se um indivíduo tem um gene particular. Consultar, por exemplo, o documento no WO2003054229. Com o uso de plataformas de detecção de marcador de produtividade alta automatizadas conhecidos por aqueles de habilidade comum, na técnica torna esse processo altamente eficiente e eficaz.
[0136] Muitos dos marcadores de PHM apresentados no presente documento podem ser prontamente usados como marcadores de FLP para selecionar os loci de gene no cromossomo 10, devido à presença de inserções/polimorfismos de deleção. Os iniciadores para os marcadores de PHM também podem ser usados para converter esses marcadores em SNP ou outros marcadores estruturalmente similares ou funcionalmente equivalentes (SSRs, CAPs, indels, etc.), nas mesmas regiões. Uma abordagem muito produtiva para a conversão de SNP é descrita por Rafalski (2002a) Current opinion in plant biology 5 (2): 94 a 100 e também Rafalski (2002b) Plant Science 162: 329 a 333. Com o uso de PCR, os iniciadores são usados para amplificar segmentos de DNA a partir de indivíduos (preferencialmente congênitos) que representam a diversidade da população de interesse. Os produtos de PCR são sequenciados diretamente em uma ou ambas as direções. As sequências resultantes são alinhadas e polimorfismos são identificados. Os polimorfismos não são limitados a polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mas também incluem indels, CAPS, SSRs e VNTRs (número variável de repetições em tandem). Especificamente em relação às informações de mapa satisfatórias descritas no presente documento, uma pessoa pode usar prontamente as informações fornecidas no presente documento para obter SNPs polimórficos adicionais (e outros marcadores) na região amplificada pelos iniciadores listados nessa revelação. Os marcadores dentro da região de mapa descrita podem ser hibridizados para BACs ou outras bibliotecas genômicas, ou eletronicamente alinhadas com sequências de genoma, para encontrar sequências novas na mesma localização aproximada como os marcadores descritos.
[0137] Além de SSRs, FLPs e SNPs, conforme descrito acima, outros tipos de marcadores moleculares também são amplamente usados, incluindo, mas sem limitação, etiquetas de sequência expressas (ESTs), marcadores de SSR derivados de sequências de EST, DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD), e outros marcadores à base de ácido nucleico.
[0138] Os perfis de isozima e características morfológicas ligadas também podem ser, em alguns casos, indiretamente usadas como marcadores. Mesmo que não detectem diretamente as diferenças de DNA, os mesmos são frequentemente influenciados por diferenças genéticas específicas. Entretanto, os marcadores que detectam a variação de DNA são muito mais numerosos e polimórficos do que os marcadores de isozima ou morfológicos (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3 a 8).
[0139] Os alinhamentos de sequência ou contigs também podem ser usados para encontrar sequências a montante ou a jusante dos marcadores específicos listados no presente documento. Essas sequências novas, próximas aos marcadores descritos no presente documento, são, então, usadas para constatar e desenvolver marcadores funcionalmente equivalentes. Por exemplo, os mapas físicos e/ou genéticos diferentes são alinhados para localizar marcadores equivalentes não descritos dentro dessa revelação, mas que estão dentro das regiões similares. Esses mapas podem estar dentro da espécie de milho, ou até mesmo através de outra espécie que foi genética ou fisicamente alinhada com milho, como arroz, trigo, cevada ou sorgo.
[0140] Em geral, MAS usa marcadores polimórficos que foram identificados como tendo uma propensão significativa de cossegregação com um traço como o traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose. Presume-se que marcadores se mapeiam próximos a um gene ou genes que fornecem à planta seu fenótipo resistente à podridão de colmo causada por antracnose, e são considerados indicadores para o traço desejado, ou marcadores. As plantas são testadas pela presença de um alelo desejado no marcador, e se espera que plantas que contêm um genótipo desejado em um ou mais loci transfiram o genótipo desejado, juntamente com um fenótipo desejado, à sua progênie. Desse modo, as plantas com resistência à podridão de colmo causada por antracnose podem ser selecionadas detectando-se um ou mais alelos marcadores, e além disso, as plantas de progênie derivadas daquelas plantas também podem ser selecionadas. Então, uma planta que contém um genótipo desejado em uma dada região cromossômica (isto é, um genótipo associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose) é obtida e, então, cruzada com outra planta. A progênie de tal cruzamento seria, então, avaliada com o uso de modo genotípico de um ou mais marcadores e as plantas de progênie com o mesmo genótipo em uma dada região cromossômica seriam, então, selecionadas como tendo resistência à podridão de colmo causada por antracnose.
[0141] Os marcadores foram identificados a partir de mapeamento de ligação como sendo associados ao traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose. As sequências de referência para os marcadores são representadas por SEQ ID NOs:1 a 16. As posições de SNP são identificadas dentro das sequências de marcador.
[0142] Os SNPs podem ser usados sozinhos ou em combinação (isto é, um haplótipo de SNP) para selecionar um alelo QTL favorável associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose. Por exemplo, um haplótipo de SNP no QTL de cromossomo 10 revelado no presente documento pode compreender: um "T" em sbd_INBREDA_4, um "C" em sbd_INBREDA_9, um "T" em sbd_INBREDA_13, um "T" em sbd_INBREDA_24, um "T" em sbd_INBREDA_25, um "C" em sbd_INBREDA_32, um "A" em sbd_INBREDA_33, um "G" em sbd_INBREDA_35, um "A" em sbd_INBREDA_093, um "G" em sbd_INBREDA_109 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0143] O artesão versado na técnica esperaria que poderiam haver sítios polimórficos adicionais em loci marcadores em e em torno dos marcadores de cromossomo 10 identificados no presente documento, em que um ou mais sítios polimórficos sites estão em desequilíbrio de ligação (LD) com um alelo em um ou mais dos sítios polimórficos no haplótipo e podem ser usados, desse modo, em um programa de seleção auxiliado por marcador para introgressar um alelo QTL de interesse. Dois alelos particulares em sítios polimórficos diferentes são ditos como em LD se a presença do alelo em um dos sítios tende a prever a presença do alelo no outro sítio no mesmo cromossomo (Stevens, Mol. Diag. 4:309 a 317 (1999)). Os loci marcadores podem ser localizados dentro de 5 cM, 2 cM, ou 1 cM (em um mapa genético com base em meiose única) do traço de resistência à podridão de colmo causada por antracnose QTL.
[0144] O artesão versado na técnica entenderia que a frequência alélica (e, então, a frequência de haplótipo) pode diferir de um grupamento de germoplasma para outro. Os grupamentos de germoplasma variam devido a diferenças de maturidade, agrupamentos heteróticos, distribuição geográfica, etc. Como resultado, SNPs e outros polimorfismos podem não ser informativos em alguns grupamentos de germoplasma.
[0145] As plantas de milho identificadas e/ou selecionadas por qualquer um dos métodos descritos acima também são de interesse.
[0146] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a matéria reivindicada. É entendido que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são apenas com propósitos ilustrativos, e pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da revelação ou do escopo das reivindicações anexas.
[0147] Uma população de mapeamento de DH derivada de F1 para resistência à podridão de colmo causada por antracnose (ASR) foi criada a partir de um cruzamento entre INBRED A e INBRED B a fim de identificar QTL que são associados à resistência à ASR. INBRED A é resistente à ASR em contraste a INBRED B. A população de mapeamento resultante exibiu graus variáveis de resistência.
[0148] A população de F1DH foi analisada com o uso de ILLUMINA® SNP Genotyping (arranjo 768 para o grupo heterótico NSS). A população foi plantada no campo em três replicatas em uma localização no Brasil, e fenotipada para ANTROT, ANTINODES, e ANTGR75. O fenótipo ANTINODES representa o número de internódios que são infectados pelo patógeno e incluem o internódio que foi inoculado. Os escores para ANTINODES estão na faixa de 1 a 5 com um 1 correspondente à resistência e um 5 correspondente à suscetibilidade. O fenótipo ANTGR75 representa o número de internódios que são infectados em > 75%. Os escores para ANTGR75 estão na faixa de 1 a 5 com um 1 correspondente à resistência e um 5 correspondente à suscetibilidade. ANTSUM é a soma dos fenótipos ANTINODES e ANTGR75, e a faixa de ANTSUM é de 1 (Resistente) a 10 (Suscetível).
[0149] A variação de SNP foi usada para gerar haplótipos específicos através de congênitos em cada locus. Esses dados foram usados para identificar associações entre alelos e resistência à podridão de colmo causada por antracnose no nível de genoma. Escores de resistência e informações genotípicas foram usadas para mapeamento de intervalo de QTL em MaxQtl e o pacote R qtl. Um QTL para resistência à podridão de colmo causada por antracnose foi identificado no Cromossomo 10 entre 10 a 90 cM em um mapa genético com base em meiose única proprietário.
[0150] A progênie da população de F1DH foi enviada a uma estação de reprodução Norte Americana para determinar a eficácia da resistência fornecida por INBRED A em relação a raças do fungo Colletotrichum graminicola que origina na América do Norte. O efeito foi medido, e a progênie resistente teve escore de 4,5 pontos de modo mais satisfatório em comparação à progênie que foi suscetível. O escore em si dos parentes usados para criar essa população de F1DH foi 1,52 e 9,88 para INBRED A e INBRED B, respectivamente.
[0151] O efeito foi medido na América do Norte cruzando-se as linhagens de F1DH com um testador, fenotipadas em 2011, cruzadas com um testador, INBRED E, para determinar o efeito da resistência em um híbrido. Embora não tão forte quanto o efeito visto nos congênitos em si, uma melhora de escore de 1,5 pontos das linhagens de F1DH/TC com a região de cromossomo 10 de INBRED A foi observada.
[0152] As populações derivadas de BC2 foram desenvolvidas em diversos fundos suscetíveis, incluindo PH1M6A congênito (documento no U.S. 8.884.128) e PH1KYM (documento no US 8.692.093), isto é, os mesmos foram usados como parentes recorrentes. As seções diferentes do locus de resistência entre 10 e 90 cM (no mapa PHB, um mapa genético proprietário com base em meiose única) de INBRED A foram selecionadas por seleção auxiliada por marcador. As plantas individuais da progênie de BC2 dessas populações foram inoculadas com Colletotrichum graminicola e fenotipadas. Os dados genotípicos foram gerados com o uso de marcadores TAQMAN® selecionados para heterozigosidade entre parentes dos respectivos cruzamentos na região de interesse no Cromossomo 10, Os fenótipos, ANTINODES e ANTGR75, foram usados para avaliar a resposta à infecção com Colletotrichum graminicola, e os genótipos foram analisados com a análise de dados TIBCO SPOTFIRE® e ferramenta de visualização, o qual emprega uma metodologia Kruskal-Wallis para determinar o valor p e definir a associação entre fenótipo e genótipo. Um valor p de 1,00E-030 foi obtido para o marcador C002DC9-001 localizado em C10 em 32,9 cM no mapa genético com base em meiose única proprietário, que representa uma associação forte entre genótipo e fenótipo. A região de QTL foi adicionalmente refinada a uma região de cromossomo 10 a partir de 13,3 a 39,7 cM (mapa genético com base em meiose única).
[0153] Para refinar adicionalmente a região de interesse em C10, 24 marcadores do ensaio ILLUMINA® SNP Genotyping 50k-plex, que foram identificados como polimórficos entre a linhagem doadora resistente INBRED A e as linhagens parentais recorrentes suscetíveis, PH1M6A e INBRED D, foram convertidos em marcadores de KASPar (o método é conhecido por uma pessoa de habilidade comum na técnica). O teste dos parentes da população e teste subsequente de um painel pequeno de linhagens de BC2 recombinantes dentro da região de 10 a 40 cM identificou quatro marcadores que refinaram adicionalmente a área de QTL para 18 a 40 cM (isto é, a região foi delimitada por marcadores C00429-801 e PHM824-17). Os marcadores usados para genotipagem e os valores p das associações marcador- traço são exibidos na Tabela 1. Tabela 1: Marcadores que têm a associação mais significativa ao fenótipo em cada uma das duas populações
[0154] Populações de BC3S2 foram geradas com o uso de 8 linhagens de elite Norte Americanas suscetíveis como parentes recorrentes. As seções diferentes do locus resistente de INBRED A, com ênfase na região entre 18 e 44 cM (mapa de PHI), foram selecionados por seleção auxiliada por marcador.
[0155] Duas das populações de BC3S2, com PH1M6A e PH17JT (documento no US 8.481.823) como os parentes recorrentes, foram usados para mapear finamente a região de QTL adicionalmente. Aproximadamente 1.300 plantas de progênie a partir de ambas as populações foram plantadas no campo, inoculadas com C. graminicola, e fenotipadas para ANTINODES e ANTGR75.
[0156] Para determinar se a região de QTL derivada de INBRED A teve um efeito consistente através de um painel de fundos genéticos suscetíveis diferentes, linhagens de BC3S2 a partir de cada um dos parentes recorrentes mencionados acima, que foram homozigóticos para o doador de INBRED A ou o parente recorrente na região de cromossomo 10 de interesse, foram plantadas como fileiras únicas, com duas replicações. As plantas foram inoculadas e fenotipadas para ANTINODES e ANTGR75.
[0157] Os marcadores na região de cromossomo 10 de 17 a 44 cM no mapa genético com base em meiose única internamente derivado foram usados para genotipar tanto as populações de BC3S2 em segregação grandes quanto as linhagens de BC3S2 fixadas com os fundos parentais recorrentes diferentes.
[0158] Para as populações de mapeamento grandes, as associações entre fenótipos e genótipos foram analisadas com o uso da ferramenta de análise de dados e visualização TIBCO SPOTFIRE®. Dois marcadores C01964-1 e C01957-1 foram identificados como mostrando uma associação forte a ANTINODES e ANTGR75. (Valores P de 1,33E- 62 e 4,80E-62, respectivamente)
[0159] Para a população com PH1M6A como o parente recorrente, o escore de ANTSUM médio para indivíduos com o alelo INBRED A foi 2,6. Os heterozigotos tiveram um escore de 3,0 e indivíduos com o haplótipo PH1M6A tiveram um escore de 6,2. Para a população com PH17JT como o parente recorrente, o escore de ANTSUM médio para indivíduos com o alelo INBRED A foi 3,4. Os heterozigotos tiveram um escore de 3,5 e indivíduos com o haplótipo PH17JT tiveram um escore de 5,3.
[0160] O fato de que os indivíduos heterozigóticos têm um nível similar de resistência em relação aos indivíduos homozigóticos para o alelo de INBRED A indica que o QTL derivado de INBRED A tem um efeito dominante. Uma melhora de escore de ANTSUM de 1,9 (fundo de PH17JT) para 3,6 (PH1M6A) pontos é um efeito principal.
[0161] O número de Linhagens Quase Isogênicas (NILs) de BC3S2 fixadas para oito fundos parentais recorrentes diferentes esteve na faixa de 4 a 23 linhagens por fundo. A melhora de escore de ANTSUM para os NILs com o fundo de INBRED A versus os NILs com o fundo parental recorrente esteve na faixa de uma diferença de escore de 1,1 a uma diferença de escore de 3,9, dependendo do fundo parental recorrente.
[0162] Os dados de sequência de captura exoma derivados de quatro pares de INBRED A x volumes de NIL recorrente (Parentes recorrentes: PH1M1Y (documento no U.S. 8.604.313), INBRED C, INBRED D, e PH17JT) foi utilizado para identificar SNPs polimórficos adicionais na região de C10:18 a 40 cM. Para cada fundo parente recorrente, há um "volume com" e um "volume " a região de interesse. SNPs que foram polimórficos na região de cromossomo 10 de interesse entre o volume positivo INBRED A e todos os quatro volumes parentes recorrentes foram identificados. Um subconjunto de SNPs foi escolhido para desenvolver marcadores de KASPar com o uso de sequência de flanqueamento de SNP para desenvolver iniciadores. Os marcadores de KASPar foram ensaiados com INBRED A e os parentes recorrentes. Os marcadores que foram diagnosticados entre parentes foram, então, triados contra recombinantes da população de BC3S2, PH1M6A<4[INBRED A]. Com esses marcadores adicionais (Consultar Tabela 2) a região abrange uma região flanqueada de 1Mb por SYN17244 e sbd_INBREDA_48. Os alelos marcadores de INBRED A na Tabela 2, assim como alelos marcadores em desequilíbrio de ligação com os alelos marcadores de INBRED A na Tabela 2 podem ser usados para identificar e selecionara s plantas de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose aumentada. Os marcadores de KASPAR foram desenvolvidos, delimitando adicionalmente a região para um intervalo definido por e incluindo sbd_INBREDA_093 e sbd_INBREDA_109. A associação entre o traço e o marcador sbd_INBREDA_093 teve um valor p de 1,93 E-051, enquanto a associação entre o traço e o marcador sbd_INBREDA_109 teve um valor p de 7,82 E-049. Tabela 2: Alelos marcadores para seleção auxiliada por marcador
[0163] A região de Inbred A foi introgressada para linhagens de milho de maturidade média (Norte Americana) conforme descrito no Exemplo 5. As plantas resultantes foram, então, cruzadas por teste com uma linhagem de testador congênito, e os híbridos foram fenotipados. A Tabela 3 mostra os efeitos de ANTSUM médios para os fundos diferentes. A presença da região Inbred A resultou em um aumento em resistência em todos os casos. Tabela 3: Efeitos ANTSUM médios em fundos diferentes
*PH18D4 é revelado no documento no US 8.759.636 *PH1V5T é revelado no documento no US 8.907.160
Claims (4)
1. Método para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a. analisar o DNA de uma planta de milho pela presença de um alelo QTL no cromossomo 10 que é associado à resistência à podridão de colmo causada por antracnose, em que a dita análise compreende isolar ácidos nucleicos e detectar um ou mais alelos marcadores ligados a e associados ao dito alelo QTL, e em que o dito alelo QTL compreende: i. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 6, ii. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 7, iii. um "T” na posição 51 da SEQ ID NO: 8, iv. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 9, v. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 10, vi. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 11, vii. um "A" na posição 51 da SEQ ID NO: 12, e viii. um "G" na posição 51 da SEQ ID NO: 13; e b. selecionar a dita planta de milho tendo o dito alelo QTL.
2. Método para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a. detectar em uma planta de milho a presença de um QTL que é ligado e associado a um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: i. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 6, ii. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 7, iii. um "T” na posição 51 da SEQ ID NO: 8, iv. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 9, v. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 10, vi. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 11, vii. um "A" na posição 51 da SEQ ID NO: 12, e viii. um "G" na posição 51 da SEQ ID NO: 13; e b. selecionar a dita planta de milho que tem o QTL que é ligado e associado a um ou mais marcadores estabelecidos em (i) a (viii) da etapa (a).
3. Método para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a. detectar em uma planta de milho a presença de um QTL que é ligado e associado a um haplótipo que compreende: i. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 6, ii. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 7, iii. um "T” na posição 51 da SEQ ID NO: 8, iv. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 9, v. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 10, vi. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 11, vii. um "A" na posição 51 da SEQ ID NO: 12, e viii. um "G" na posição 51 da SEQ ID NO: 13; e b. selecionar a dita planta de milho que tem o QTL que é ligado e associado ao haplótipo.
4. Método para selecionar uma planta de milho com resistência à podridão de colmo causada por antracnose, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: a. detectar na planta de milho um haplótipo que compreende: i. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 6, ii. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 7, iii. um "T” na posição 51 da SEQ ID NO: 8, iv. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 9, v. um "T" na posição 51 da SEQ ID NO: 10, vi. um "C" na posição 51 da SEQ ID NO: 11, vii. um "A" na posição 51 da SEQ ID NO: 12, e viii. um "G" na posição 51 da SEQ ID NO: 13; e b. selecionar a dita planta de milho que tem o dito haplótipo.
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