CN104498482B

CN104498482B - 青檀微卫星dna分子标记及分离筛选方法

Info

Publication number: CN104498482B
Application number: CN201410705075.XA
Authority: CN
Inventors: 张小平; 李晓红; 刘康; 邵剑文; 张莉; 刘慧君; 盛继露; 俞剑宇
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Wuhan Bajiaxing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: CN104498482A

Abstract

本发明公开了中国特有经济树种青檀的微卫星DNA分子标记，包括青檀微卫星(AG)_n和(AC)_n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，获得72个含有微卫星重复序列的阳性克隆；筛选得到12个多态性高且能够稳定扩增的微卫星标记，分别是：Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11、Pt12。本发明建立了青檀的微卫星DNA分子标记技术体系，利用这些标记可进行青檀遗传多样性分析和物种演化历史的重建，同时也可为青檀的苗林育种提供遗传学上的依据，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

Description

青檀微卫星DNA分子标记及分离筛选方法

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术，具体涉及青檀微卫星DNA分子标记及分离筛选方法。

背景技术

微卫星(Microsatellite)，又称简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSRs)、短串联重复(Short Tandem Repeats，STR)、简单序列长度多态性(Simple SequenceLength Polymorphism，SSLP)，是指以1-6个核苷酸组成的核心序列为基本重复单位所构建的简单串联重复序列，最常见的两核苷酸重复是(AC/TG)_n和(AG/TC)_n。这类序列广泛存在于真核生物基因组的不同座位上，其重复次数在同一物种不同个体的遗传型间呈现出高度多态性。研究表明，这种重复序列数量间的差异，可能与DNA复制过程中的“链滑”现象相关。微卫星侧翼序列为相对保守的单拷贝序列，这为开发特异性引物，进而通过PCR技术分析检测重复序列在不同物种或同一物种不同个体间的多态性提供了有利途径。根据重复单元的构成和分布，微卫星DNA序列被分为三种类型：单一型(pure)、复合型(compound)、间断型(interrupted)。例如：

单一型：ACACACACACACACACACAC

复合型：ACACACACACACAGAGAGAG

间断型：ACACACTTACACACTTACAC

微卫星遗传标记具有以下特点：在真核生物基因组中分布广泛、数量多、多态性丰富、共显性、孟德尔式遗传、选择中性等。作为一种优良分子标记，目前微卫星标记已在遗传图谱的构建、群体遗传变异分析和物种进化、基因定位、品种鉴定、遗传辅助育种等方面得到广泛应用。

青檀(Pteroceltis tatarinowii Maxim.)又名翼朴、檀树，落叶乔木，属于榆科(Ulmaceae)青檀属(Pteroceltis)，是第三纪残遗单种属植物，也是我国特有树种。青檀的树皮(韧皮纤维)是宣纸的重要原材料——檀皮的来源。宣纸最早产于唐代的安徽泾县，延续至今已经有1500多年历史，历代享有“纸寿千年，墨润万变”的美誉，为众多书画家们所推崇，在我国历史文化发展与演化过程中具有重要的地位和价值。2007年，由中科院科技史所和中国文房四宝协会牵头，联合成功申报中国“文房四宝”为世界非物质文化遗产。青檀具有极其重要的经济开发利用价值，截至2011年底，仅安徽省泾县就有宣纸生产企业17家、年产宣纸750吨左右，书画纸生产及其加工企业260多户、年产书画纸7000多吨，宣纸书画纸从业人员15000多人，年销售收入5亿多元。此外，青檀根系发达，耐干旱和贫瘠，尤喜生于钙质土壤，是石灰岩山地水土保持的优良树种，目前已经在安徽省石台县进行了应用，起到了显著的水土保持效果。因此，青檀这一树种集经济效益和生态效益为一体，具有重要的应用价值。但是，近年来由于过度的资源利用和物种自身生物学特性的双重影响，青檀的野生种群分布范围和资源量正日益减少，分布区域已渐成“岛屿状”。在1987年公布的第一批中国珍稀濒危保护植物名录中，青檀被列为国家III级重点保护对象(傅立国,金鉴明.中国植物红皮书——稀有濒危植物:第一分册[M].北京:科学出版社,1992,686.)。目前，青檀檀皮的产量和质量日益不能满足市场需求。

迄今，研究人员陆续从不同角度对青檀进行了研究，包括群落种群特征、种子休眠机制、檀皮质量的影响因素、遗传多样性等。掌握物种野生种群的遗传多样性和分布格局，分析其影响机制，是制定物种科学有效保护对策的重要前提，也可为经济树种的林苗育种提供分子辅助标记。目前，关于青檀种内遗传多样性及演化历史的研究相对薄弱，已报道的分子标记包括：Li X.H.等采用的叶绿体非编码区psbA-trnH和trnS-trnG；Chai X.Y.等和李晓红等应用的核基因简单重复序列间多态性ISSR。由于叶绿体基因系细胞质遗传，信息量较少，而ISSR标记为显性标记，不能区分纯合子和杂合子，重复性和稳定性较差，因此，上述已报道的青檀遗传标记还不能提供足够的遗传信息。为了进一步了解青檀野生种群的遗传多样性和分布格局等遗传信息，需要开发新的分子遗传标记。

发明内容

本发明的目的在于开发青檀的微卫星DNA分子标记及分离筛选方法，建立青檀微卫星DNA技术体系，使这些分子标记可应用于对青檀的遗传变异和演化历史的研究。

本发明的技术方案如下：

本发明的青檀微卫星DNA分子标记，所述的微卫星分子标记为编号依次是Pt1-Pt12的12个多态性位点，其核苷酸序列依次为：SEQ ID No.1-SEQ ID No.12。

本发明所述的青檀微卫星DNA分子标记的分离筛选方法，包括步骤：青檀微卫星DNA富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、阳性克隆测序以及扩增筛选多态性检测。

上述所述青檀微卫星DNA富集文库的构建包括基因组DNA的提取与酶切、酶切产物两端加接头、PCR检测接头连接、磁珠富集、PCR富集以及连接克隆载体后导入感受态细胞培养。

上述所述感受态细胞的制备方法为：挑取平板上的E.coli DH5α单菌落，接种于含5ml的LB液体培养基中，37℃振荡，培养过夜；取1mL培养液于50mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5小时至对数生长期，检测菌液的OD₆₀₀值，当OD₆₀₀达到0.3-0.5左右时停止培养；将培养液放在冰上冷却10-15分钟；将培养液分装至1.5mL离心管中，于4℃，5000rpm，离心10分钟，弃上清；合并弃上清后的培养物，冰浴30分钟；取出于4℃，5000rpm，离心10分钟；弃上清，加入200μL预冷甘油10％/0.1M CaCl₂，小心用枪头混匀，重新悬浮细胞，置于-80℃冰箱保存备用。

青檀微卫星DNA分子标记的分离，包括青檀微卫星(AG)_n和(AC)_n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，获得72个含有微卫星重复序列的阳性克隆。筛选得到12个多态性高且能够稳定扩增的微卫星标记，分别标记为：Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11、Pt12。Pt1为421个核苷酸，Pt2为306个核苷酸，Pt3为370个核苷酸，Pt4为322个核苷酸，Pt5为328个核苷酸，Pt6为380个核苷酸，Pt7为360个核苷酸，Pt8为370个核苷酸，Pt9为327个核苷酸，Pt10为389个核苷酸，Pt11为346个核苷酸，Pt12为423个核苷酸。

本发明提供了青檀的微卫星DNA分子标记及分离筛选方法，具体为12个青檀的微卫星位点及扩增这12个微卫星位点的引物序列和扩增方法，本发明青檀的微卫星DNA分子标记可作为一种可靠有效的分子标记应用于青檀不同地理种群内和种群间遗传变异时空动态格局、交配系统以及分子辅助育种的研究。利用这些标记可进行青檀遗传多样性分析和物种演化历史的重建，同时也可为青檀的苗林育种提供遗传学上的依据。

附图说明

图1：Pt1位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图2：Pt2位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图3：Pt3位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图4：Pt4位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图5：Pt5位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图6：Pt6位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图7：Pt7位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图8：Pt8位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图9：Pt9位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图10：Pt10位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图11：Pt11位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

图12：Pt12位点的引物扩增20个青檀个体基因组DNA的STR分型图。

在图1-图12中，1-20分别代表1-20个不同的青檀单株，横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。每对引物在20个青檀单株中的扩增片段大小呈现多态性，如在图1中，引物Pt1在1-20个青檀个体扩增的等位基因片段大小(bp)依次为：

1：227，227；2：225，227；3：225，227；4：225，227；5：227，229；

6：229，229；7：227，233；8：227，227；9：227，229；10：227，229

11：229，233；12：227，229；13：229，233；14：227，229；15：227，229；

16：229，229；17：227，229；18：227，229；19：229，233；20：229，233

其余图同理进行读数判断多态性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明。

实施例1

1.青檀微卫星DNA富集文库的构建

1.1基因组DNA的提取与酶切：

参照Doyle J.介绍的CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants:CTAB totalDNA isolation.In:Hewitt G.M.,Johnston A.(Eds.),Molecular Techniques inTaxonomy.Springer-Verlag,Berlin,Germany,1991,283-293.)从硅胶干燥的青檀叶片中提取基因组DNA。用限制性内切酶Sau3AI(购自TaKaRa公司)酶切基因组，酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-900bp大小的DNA片段并用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)回收。

1.2加接头：

将经过1.1工序胶回收纯化后的酶切产物两端加接头：

oligo A:(5'-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3')

oligo B:(5'-PO₄-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3')

在T4连接酶(购自Promega公司)作用下16℃水浴连接过夜。

1.3PCR检测接头连接：

以oligo A为引物，以1.2所制的连接产物为模板进行PCR扩增，50μL反应体系如下：5μL 10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)，4μL dNTP(2.5mM)，0.25μL exTaq酶(购自TaKaRa公司)，4μL oligo A(10μM)，5μL连接产物，加双蒸水(ddH₂O)补至50μL。PCR反应程序如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃复性45秒，72℃延伸45秒，变性-复性-延伸三个步骤重复35次；72℃终延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化回收。

1.4磁珠富集

将1.3所制的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸杂交探针(AC)₁₂和(AG)₁₂均在65℃下温育杂交2小时(用探针(AG)_n和(AC)_n分别进行富集以得到含有与它们能成功杂交的片段)。将杂交混合体系与悬浮好的磁珠混合均匀，室温静置30分钟，然后将离心管放到磁力架上，去除上清。为去除杂交混合液中不含微卫星的基因组片段，将离心管依次用洗涤缓冲液Ⅰ(6×SSC，0.1％SDS)，室温洗涤一次，60℃洗涤一次，每次5分钟，洗涤液Ⅱ(2×SSC，0.1％SDS)60℃洗涤两次，每次5分钟，洗涤液Ⅲ(1×SSC，0.1％SDS)60℃洗涤两次，每次5分钟，最后用洗涤液Ⅳ(0.1×SSC)室温下洗涤一次。加入50μL TE缓冲液，在PCR仪上95℃变性10分钟，释放出含有微卫星片段的单链DNA，置于磁力架上迅速收集上清，重复三次。

1.5PCR富集

以1.4所制的磁珠富集产物为模板，oligo A为引物进行PCR扩增，50μL反应体系如下：富集后的DNA 5μL，10×ex Taq缓冲液(含Mg²⁺)5μL，dNTP混合液(各2.5mM)4μL，exTaq酶(购自TaKaRa，5U/μL)0.25μL，oligo A引物(10μM)4μL，加双蒸水补至50μL。PCR反应程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，56℃复性45秒，72℃延伸45秒，变性-复性-延伸三个步骤循环35次；72℃终延伸10分钟。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳电泳检测后，用纯化试剂盒回收纯化。

1.6感受态细胞的制备：

挑取平板上的E.coli DH5α单菌落，接种于含5ml的LB液体培养基(不含Amp)中，37℃振荡，培养过夜。取1mL培养液于50mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5小时至对数生长期，检测菌液的OD₆₀₀值，当OD₆₀₀达到0.3-0.5左右时停止培养。将培养液放在冰上冷却10-15分钟。将培养液分装至1.5mL离心管中，于4℃，5000rpm，离心10分钟，弃上清。弃上清后三管并一管(第一管加入1mL预冷的0.1M CaCl₂，混匀，吸出至第二管，依次将三管合并成一管)，冰浴30分钟。取出后于4℃，5000rpm，离心10分钟。弃上清，加入200μL预冷甘油10％/0.1M CaCl₂，小心用枪头混匀，重新悬浮细胞。置于-80℃冰箱保存备用。

1.7连接转化

取1.5工序所制的PCR富集后的纯化产物与TA克隆载体(PMD19-T Vector)(购于TaKaRa公司)连接，10μL连接反应体系包括：5μL缓冲液I，1μL PMD19-T Vector，4μL富集纯化产物。混匀，短暂离心，于16℃连接仪上连接2-3小时。取出感受态细胞冻存管，冰上复苏10分钟至液态；将10μL的连接产物加入到80μL感受态细胞中，枪头轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃水浴热激90秒；冰浴2分钟，加入900μL LB培养基，37℃，200rpm，震荡培养1小时；室温4500rpm，离心3分钟，弃800μL上清液；将剩余的培养液打匀后用干净的涂抹棒涂布于预先准备的LB/Amp/X-gal/IPTG平板上；将平板37℃正向放置培养半小时后，然后于37℃烘箱中倒置培养过夜。

2.含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计：

2.1含微卫星序列的阳性克隆的筛选：

待1.7工序过夜培养的的菌落大小适中，在超净工作台上用灭过菌的牙签挑取平板上白色单克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板中事先加入300μL含Amp抗性的液体LB培养基)。挑菌结束后，用不干胶将孔板盖好后于37℃，200rpm振荡培养5-8小时至菌液浑浊。

以连接转化所得的菌液为模板，利用接头引物oligo A分别与探针引物(AC)₁₂和(AG)₁₂进行PCR扩增。15μL PCR反应体系包括：Taq酶0.075μL(购自TaKaRa，5U/μL)，10×PCRBuffer(Mg²⁺Free)缓冲液1.5μL，MgCl₂(25mM)0.9μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1.2μL，引物oligo A(10μM)1.2μL，探针引物(10μM)0.6μL，菌液1μL，补双蒸水至15μL。PCR反应程序如下：95℃预变性3分钟；95℃变性35秒，56℃退火45秒，72℃延伸45秒，变性至退火三个步骤循环35次；72℃延伸10分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，具有2条或者3条电泳条带的为阳性克隆，可能插入了目的微卫星片段。

2.2阳性克隆测序及引物设计

选取阳性克隆菌液，取10μL加入1.5mL离心管中，然后加入300μL含有Amp抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养4小时。送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，利用通用引物(M13+/M13-)进行测序，DNA自动测序仪型号为ABI PRISM 3730。共得到72条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星DNA侧翼序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计出微卫星引物72对。将这72对引物进行PCR扩增检测，其中23对引物能稳定扩增出目的条带。

2.3群体扩增筛选多态性引物

用1.1工序CTAB法提取青檀基因组DNA，用2.2工序获得的23对能稳定扩增的引物，进行群体扩增多态性检测。分别将FAM、HEX和TAMRA三种荧光修饰标记于通用引物M13的5'端(M13序列：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)。通过三个引物(引物1：带有M13尾巴的正向引物，即TP-M13引物；引物2：SSR反向引物；引物3：5′端带有荧光标记的M13正向引物)对目的片段进行PCR扩增。上述用到了加荧光标记的M13(引物3)、筛选出的23对引物(引物1，引物2)共3个引物，23对筛选出的引物对分别在正向引物加M13尾巴构成引物1，反向引物作为引物2。

利用双重抑制PCR原理，只需要对通用引物M13的5′端加荧光标记，因而节省了荧光分型测序成本。15μL PCR反应体系如下：10×PCR buffer(Mg²⁺Free)1.5μL，MgCl₂(25μM)1.2μL，dNTP mixture(各2.5mM)1.2μl，引物1(10μM)0.4μL，引物2(10μM)0.4μL，引物3(10μM)0.1μL，基因组DNA(2.5ng)0.3μL，Taq酶(购自TaKaRa公司，5U/μL)0.1μL，补充双蒸水至15μL。PCR反应程序如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，优化的相应温度退火30秒，72℃延伸30秒，变性至延伸三个步骤循环27次；95℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环10次；72℃终延伸8分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物按不同荧光信号组合后送上海点晶生物科技有限公司，以ABI PRISM3700测序仪进行毛细管电泳分型检测。分型结果用Genemarker 1.6分析软件(Applied Biosystem公司)判读等位基因片段数值。共有12对引物能够在供试的20个青檀个体中扩增出目的片段，并且扩增出的目的等位基因片段的长度呈现出多态性：在部分青檀个体中为纯合状态，在部分青檀个体中为杂合状态，且目的片段的荧光读数不同(见图1-12，表1)。12个多态性位点Pt1-Pt12如下：

Pt1为421个核苷酸，Pt2为306个核苷酸，Pt3为370个核苷酸，Pt4为322个核苷酸，Pt5为328个核苷酸，Pt6为380个核苷酸，Pt7为360个核苷酸，Pt8为370个核苷酸，Pt9为327个核苷酸，Pt10为389个核苷酸，Pt11为346个核苷酸，Pt12为423个核苷酸。

12个多态性位点的引物序列(5'-3')分别为：

Pt1正向引物:CATATTTCCTCTTCCCCTAA

Pt1反向引物:ACAGCTCACCCATACCTTC

Pt2正向引物:CACCTTTGCTTACTCCCTG

Pt2反向引物:AATGTACTCGCTAATGAACC

Pt3正向引物:AGCGACTGAGGGTTTCATG

Pt3反向引物:GCTTCTGCTCCGCCTTTCT

Pt4正向引物:CAGGGCACTCCAATAGAATAG

Pt4反向引物:ATGGTGCTGGGATGGGAAG

Pt5正向引物:CATTTGGATACACCAGGAAGG

Pt5反向引物:CAGCCATTGATGCTTAGTCC

Pt6正向引物:TCTAGGCTGTATAAAGGGAC

Pt6反向引物:GATGAAGTAAATGGGGAATC

Pt7正向引物:CATGTCACCATTACCGAAC

Pt7反向引物:ACACAGTAAGAAAACACACC

Pt8正向引物:TGGCGATGTGAAGCCCTAAG

Pt8反向引物:TCATTTCAACGGTCAAGATTAC

Pt9正向引物:CAATAATAGCCTTGCATCTC

Pt9反向引物:CTCCCTTTGAACAAACCTC

Pt10正向引物:CCTGTCCAGCTACTAATTTG

Pt10反向引物:GTCTGCGATGGTATCTGTT

Pt11正向引物:CAGGTCCAGAGGGAGAAAC

Pt11反向引物:CCCAGGGTCAAATAGGTAAT

Pt12正向引物:GCTTCCTTGGGTCTCATCC

Pt12反向引物:TCCACAGACGAGTAGTTCTCC。

表1：12个青檀微卫星引物的特性和多态位点的特征

2.4结果分析

使用Cervus3.0软件计算期望杂合度、观测杂合度来描述青檀微卫星DNA多态位点的特征，结果如表1所示，在20个青檀个体中，青檀等位基因数变异范围为3-16；观测杂合度的变异范围为0.250-0.950；期望杂合度的变异范围为0.401-0.817。由附图1-12可以看出，本发明的12个微卫星序列的长度在供试的20个青檀个体中均出现了多态性。因此，本发明的这12个微卫星分子标记能用于青檀遗传多样性及其变异时空格局、交配系统以及分子辅助育种的研究。

本发明专利是在国家自然科学基金项目(30970292；30840020；41401062)、国家重点实验室开放课题(143115)和安徽师范大学创新基金(2013cxjj 15)共同支持下完成。本发明提供了12个青檀的微卫星位点及扩增这12个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于青檀不同地理种群内和种群间遗传变异时空动态格局、交配系统以及分子辅助育种的研究。利用这些标记可进行青檀遗传多样性分析和物种演化历史的重建，同时也可为青檀的苗林育种提供遗传学上的依据。

Claims

1.青檀微卫星DNA分子标记组合，其特征在于：所述的微卫星分子标记组合由SEQ IDNo.1-12组成。