CN113957158B

CN113957158B - 一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113957158B
Application number: CN202111534154.5A
Authority: CN
Inventors: 蒲静; 汪琳; 高志强; 白子龙; 任彤; 赵相鹏; 杜思乐; 张伟; 尹羿; 张小寒; 张佳玮; 赖平安; 种焱
Original assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Current assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN113957158A

Abstract

本发明公开了一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。本发明首先公开了用于检测施(史)氏鲟线粒体基因D‑LOOP的引物探针组，序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明还公开基于所述引物探针组建立的检测施(史)氏鲟线粒体基因D‑LOOP的方法。本发明以施(史)氏鲟线粒体基因D‑LOOP部分基因作为靶区域设计引物和TaqMan‑MGB探针，建立并优化得到可检测施(史)氏鲟线粒体基因的方法，该方法快速、灵敏和特异，可用于纯种鲟鱼的鉴定，具有较为广阔的应用前景。

Description

一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于鲟鱼种质鉴定及鲟鱼源性成分检测领域，特别涉及一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

我国鲟鱼商业养殖从二十世纪九十年代起兴，先后突破了施(史)氏鲟、匙吻鲟、小体鲟、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟、大杂交(达氏鳇♀×史氏鲟♂)、鳇、中华鲟、长江鲟等近10种主要鲟鱼的全人工繁殖技术，鲟鱼养殖与鲟鱼子酱加工已经发展成产业，成为世界鲟鱼养殖产量第一国和鲟鱼子酱加工出口大国。伴随着鲟鱼养殖产业的迅猛发展，许多鲟鱼养殖场不明亲鱼种质，随意杂交，导致鲟种质资源混杂，生产苗种质量和数量均有所下降，制约鲟产业的整体发展。如何保护鲟鱼野生种群、同时合理守法的进行鲟鱼养殖和遗传育种、健康发展鲟鱼产业，是当前研究的重点。

因而，鲟鱼品种的鉴定非常重要，一方面可以保护濒危野生鲟鱼物种；此外，通过鉴定亲本可以明确鲟鱼的品系，用于指导鲟鱼的杂交育种、养殖和生产；同时对商品鱼进行品种鉴定，可在国内流通环节提供检测鉴定证明，更好的监督、规范鲟鱼养殖产业的健康发展。建立施(史)氏鲟鉴定方法，为鲟形目的物种鉴定摸索经验、奠定工作基础，可在进出口贸易和国内鲟鱼养殖交易市场率先应用，指导实际工作，保护和促进国内鲟鱼产业的健康可持续发展。

目前，物种鉴定方法研究比较多的是针对线粒体基因细胞色素B(Cytb)、细胞色素氧化酶亚单位I(CO I)、DNA控制区(D-LOOP)等建立的特异性PCR方法。微卫星标记是进行种群遗传学研究中常用的分子标记，具有共显性、分辨率、重复率及可信度高的优点，是水产研究中使用最为广泛的核基因组标记。鲟的种质鉴定可分别从线粒体基因组和核基因组两个层面展开，是全面准确的检测杂交鲟父母本来源的有效方式。但由于鲟形目鲟鱼种类繁多，且不同品种的鲟鱼基因序列同源性很高，目前国内外发表的文献，通常是使用十几对微卫星引物并结合软件分析，对不同种属的鲟鱼进行鉴定。这些方法引物复杂、操作繁琐、花费时间长，还需要专业的分子生物学软件，对检测人员的专业程度要求较高，不适用于口岸基层实验室，不能满足海关口岸快速通关的要求。

TaqMan荧光定量PCR检测技术与常规PCR技术相比，具有很多突出的优点，不仅检测速度快(仅需2h)，结果可靠，而且不需要开盖分析产物，从而减少气溶胶污染的机会。因此，基于TaqMan荧光定量PCR检测技术对施(史)氏鲟线粒体基因进行检测鉴定，可用于纯种鲟鱼的种质鉴定，具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用。该引物对特异性强、灵敏度高，MGB探针相比传统普通TaqMan探针缩短了探针长度，提高了qPCR的信噪比和分辨率。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。

一方面，本发明提供了一种用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对，以及SEQ ID No.3所示的TaqMan-MGB探针。

优选的，所述TaqMan-MGB探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有MGB无荧光淬灭基团。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测施氏鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物在检测西伯利亚鲟线粒体基因中的应用。

又一方面，本发明还提供了一种用于检测施氏鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物在制备检测施氏鲟线粒体基因的试剂或试剂盒中的应用。

又一方面，本发明提供了一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的试剂盒，所述试剂盒的有效成分为用于检测施氏鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物。

优选的，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应的试剂。

又一方面，本发明还提供了一种检测施氏鲟线粒体基因的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物探针组合物进行荧光定量PCR扩增反应，获得扩增曲线和Ct值；

3)根据扩增曲线和Ct值进行结果判断，具体结果判断方法为：

若待测样品的扩增曲线呈S形且Ct值<30，则待测样本为阳性，即待测样本含有施氏鲟线粒体基因，该样品为施氏鲟纯种或者是母本基因来自施氏鲟的杂交鲟；

若待测样品无典型扩增曲线或无Ct值时，则待测样本为阴性，即待测样本中不含有施氏鲟线粒体基因，则该样品不是施氏鲟纯种；

若待测样品的Ct值≥30时，须复检再予以判断。

优选的，所述待测样品为鲟鱼的鳍条组织及含有鲟鱼源性成分的食品或化妆品。

本发明的积极进步效果在于：

本发明以施(史)氏鲟线粒体基因D-LOOP部分基因作为靶区域设计引物和TaqMan-MGB探针，建立并优化得到可检测施(史)氏鲟线粒体基因的方法，该方法具有如下优点：

1)快速：该方法对PCR产物进行实时监控，PCR结束即可获得结果；

2)灵敏：该方法灵敏度高，对系列稀释的质粒DNA进行检测，结果显示检测灵敏度可达1.55×10^-7ng/μL；

3)特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了MGB标记探针，可有效鉴别施(史)氏鲟线粒体基因序列，该检测方法检测常见的可能污染靶标的物种DNA，结果为阴性，未发现交叉反应。

附图说明

图1示出利用用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物和TaqMan-MGB探针对含施(史)氏鲟线粒体部分D-LOOP基因的质粒DNA进行荧光定量PCR检测的检测极限结果；

图2示出利用用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物和TaqMan-MGB探针对含施(史)氏鲟线粒体部分D-LOOP基因的质粒DNA进行荧光定量PCR检测的线性回归结果；

图3示出利用用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物和TaqMan-MGB探针对五种纯种鲟鱼进行荧光定量PCR检测的特异性试验结果；

图4示出利用用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物和TaqMan-MGB探针对临床样品—纯种施(史)氏鲟进行荧光定量PCR检测的结果；

图5示出利用检测施(史)氏鲟线粒体COI基因的引物对纯种施(史)氏鲟DNA进行PCR扩增的结果；图中：1为施(史)氏鲟DNA-PCR扩增结果；2为俄罗斯鲟DNA-PCR扩增结果；3为西伯利亚鲟DNA-PCR扩增结果；P为阳性对照；M为DL2000分子量标准；N为阴性对照；

图6示出去除引物709bp扩增序列Blast分析结果。

具体实施方式

一种用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对，以及SEQ ID No.3所示的TaqMan-MGB探针。

本发明中，选择施(史)氏鲟线粒体基因特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％～60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在20个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右，采用MGB修饰，并标记荧光基团。其中，TaqMan-MGB探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有MGB无荧光淬灭基团。

用于检测的引物对和TaqMan探针核苷酸序列如下：

1)5’-CAGATAAGAACGACAAGGTGGAACA-3'(SEQ ID NO.1)

2)5’-GGGGTAGGGGGTTTGTCGA-3’(SEQ ID NO.2)

3)5’-[FAM]-CGTCCAATCGTCATGTG-[MGB]-3’(SEQ ID NO.3)

本发明还提供了一种用于检测施(史)氏鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物在检测施(史)氏鲟线粒体基因中的应用以及在制备检测施(史)氏鲟线粒体基因的试剂或试剂盒中的应用。引物探针组合物包括SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对，以及SEQ ID No.3所示的TaqMan-MGB探针。

本发明还提供了一种用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的试剂或试剂盒，其有效成分为上述用于检测施(史)氏鲟线粒体D-LOOP基因的引物探针组合物。进一步的，所述试剂或试剂盒还包括荧光定量PCR反应的其他试剂，例如荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照、无核酸酶水等，所述荧光定量PCR反应液可包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶。优选的，所述阴性对照可为不含有施(史)氏鲟源性成分的组织样品，例如用0.01mol/LpH7.2 PBS缓冲盐水制成质量百分比为20％的鸡组织悬液。所述阳性对照可为含有目的扩增基因的质粒DNA：将人工合成的长度为250bp的施(史)氏鲟线粒体D-LOOP部分基因克隆于pBluescript II SK+载体的Sac I和Not I位点之间获得的。质粒浓度为10⁵copies/μL。

施(史)氏鲟线粒体D-LOOP部分基因250bp序列如下：

本发明中所述试剂或试剂盒的制备方法，包括将各条引物和TaqMan-MGB探针进行单独包装的步骤。

本发明还提供了一种检测施(史)氏鲟线粒体基因的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

3)根据扩增曲线和Ct值进行结果判断。

本发明中，所述结果判断方法为：

若待测样品的扩增曲线呈S形且Ct值<30，则待测样本为阳性，即待测样本含有施(史)氏鲟线粒体基因，该样品为施(史)氏鲟纯种或者是母本基因来自施(史)氏鲟的杂交鲟；

若待测样品无典型扩增曲线或无Ct值时，则待测样本为阴性，即待测样本中不含有施(史)氏鲟线粒体基因，则该样品不是施(史)氏鲟纯种；

若待测样品的Ct值≥30时，须复检再予以判断。

本发明中，所述待测样品可以为鲟鱼鳍条等组织、及可能含有鲟鱼成分的食品或化妆品等。为提高核酸提取效率，尤其是所述待测样品为可能含有鲟鱼成分的食品或化妆品时，在提取DNA前需要进行前处理。

本发明中，所述荧光定量PCR扩增反应的反应体系为如下表所示：

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	1×PCR缓冲液
25mmol/LMgCl₂	2.0mmol/L
		2.5mmol/LdNTP	0.2mmol/L
正义引物	0.3μmol/L
		反义引物	0.3μmol/L
TaqMan-MGB探针(FAM标记)	0.15μmol/L
		TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.25μL
DNA模板	5μL
		加DEPC水至总体积	25μL

优选的，所述荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃/3min；95℃/15s，56℃/15s，60℃/30s，35个循环；荧光收集设于60℃退火延伸阶段。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1施(史)氏鲟线粒体基因快速检测方法的建立

一、用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针

选择施(史)氏鲟线粒体基因特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％～60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在20个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右，采用MGB修饰，并标记荧光基团。

具体引物对和TaqMan探针的核苷酸序列如下：

用于检测的引物对和TaqMan探针(引物探针I)：

1)5’-CAGATAAGAACGACAAGGTGGAACA-3'(SEQ ID NO.1)

2)5’-GGGGTAGGGGGTTTGTCGA-3’(SEQ ID NO.2)

3)5’-[FAM]-CGTCCAATCGTCATGTG-[MGB]-3’(SEQ ID NO.3)

其中，所述用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的单链DNA分子组成，分别为施(史)氏鲟线粒体基因的检测通用的正义引物和反义引物。

二、检测施(史)氏鲟线粒体基因的方法

采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测技术建立用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的检测方法如下：提取待测样品中的DNA，以DNA为模板，分别采用步骤一中引物探针进行荧光定量PCR扩增反应，获得扩增曲线和Ct值，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有施(史)氏鲟线粒体基因，具体包括如下步骤：

1、待测样品的前处理与DNA提取

对于含有鲟鱼源性成分的食品或者化妆品按照如下方法进行前处理和DNA提取：

食品或者化妆品样品：多点取样，取100mg样品加200μL缓冲液GA(来自DNA提取试剂盒)，振荡至彻底悬浮。加入50μL Proteinase K溶液，混匀，37℃消化过夜后，取上清液使用天根TIANamp血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，目录号：DP304)按照说明提取总DNA。

对于其他血液、组织直接使用天根TIANamp血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，目录号：DP304)按照说明提取总DNA。

2、以步骤1的待测样本的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线

以步骤1得到的待测样本的DNA为模板，以不含鲟鱼成分的组织样品作为阴性对照和含有对应目的扩增基因的质粒DNA作为阳性对照分别采用步骤一中引物探针进行荧光定量PCR扩增反应，获得扩增曲线和Ct值。

所述阴性对照的不含鲟鱼成分样品为用0.01mol/LpH7.2 PBS缓冲盐水制成质量百分比为20％的不含鲟鱼成分的组织悬液。

所述阳性对照为含有目的扩增基因的质粒DNA，分别为：

用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的阳性对照：直接合成含SEQ ID NO.1所示的长度为250bp的施(史)氏鲟线粒体D-LOOP部分基因，并克隆于pBluescript II SK+载体的SacI和Not I位点之间，经测序确认后，命名为pBSK-B-DL250即为施(史)氏鲟线粒体基因荧光PCR阳性对照品母液。

荧光定量PCR扩增反应的反应体系：通过梯度改变Mg²⁺浓度(1.5mmol/L～6.0mmol/L)和引物探针浓度(引物浓度0.2μmol/L～1.0μmol/L，探针浓度0.1μmol/L～0.5μmol/L)对PCR扩增的反应体系进行了优化，最终选择反应体系为25μL体系，配方如表1所示。

表1反应体系的配方

其中，10×PCR缓冲液、25mmol/L MgCl₂购于Promega公司；dNTP购自TaKaRa公司，引物和探针，上海生工生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/LKCl、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton X-100。

Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司；

DEPC水，用纯净水经两次蒸馏后，加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1.034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃/3min；95℃/15s，56℃/15s，60℃/40s，35个循环；荧光收集设于60℃退火延伸阶段。

3、根据扩增曲线和Ct值进行结果判断

若待测样品的Ct值在≥30时，须复检再予以判断。

实施例2施(史)氏鲟线粒体基因荧光PCR快速检测方法的灵敏度、特异性、重复性试验

1.灵敏度试验

将1.55ng/μL的含施(史)氏鲟线粒体D-LOOP部分基因的质粒pBSK-S-DL250作10倍系列稀释，利用引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法对各个稀释样品进行检测，结果如图1所示，构建的检测施(史)氏鲟线粒体线粒体基因的方法检测极限达1.55×10^-7ng/μL。

用荧光PCR仪Q5配套软件对Ct值和质粒DNA的量进行线性回归分析，建立标准曲线，计算相关系数，结果显示，对于用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法得到的标准曲线如图2所示，DNA的浓度与试验测得的Ct值呈线性相关，R²＝0.99，斜率k＝-3.19，截距为22.16，PCR效率为105.4％；表明利用实施例1中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法可用于施(史)氏鲟线粒体DNA的检测和定量。

2.特异性试验

利用实施例1步骤一中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法(实施例1步骤二所述方法)对施(史)氏鲟(纯种)提取的总DNA，俄罗斯鲟(纯种)提取的总DNA，小体鲟(纯种)提取的总DNA，西伯利亚鲟(纯种)提取的总DNA，达氏鳇(纯种)提取的总DNA进行检测，结果如图3所示，显示实施例1步骤一中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法与除施(史)氏鲟(纯种)以外的其他种类的鲟鱼DNA和阴性对照均无交叉反应，特异性良好。

3.重复性试验

利用实施例1步骤一中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法(实施例1步骤二所述方法)对不同浓度的已知浓度的质粒pBSK-S-DL250(实施例1中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的阳性对照)进行重复性试验，结果见表2，表明本发明实施例1步骤一中用于检测施(史)氏鲟线粒体基因的引物对和TaqMan-MGB探针构建的检测方法重复性与稳定性良好。

表2重复性试验结果

实施例3从某海关出口纯种鲟鱼中检测施(史)氏鲟线粒体基因的实例

采用实施例1步骤二所述方法对某海关出口的申报为施(史)氏鲟样品进行检测，检出施(史)氏鲟线粒体基因DNA，说明为施(史)氏鲟纯种或其母本为施(史)氏鲟的杂交鲟。

1.以待检鲟鱼提取的DNA为模板的检测

剪取一小段鲟鱼背部鳍条，使用0.01mol/LpH 7.4PBS充分清洗后，用无菌剪刀尽量剪碎鳍条，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入50μL Proteinase K溶液，混匀，37℃消化过夜后，取上清液使用TIANamp血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)按照说明提取总DNA。分别利用实施例1中步骤一中引物探针对鲟鱼鳍条的DNA为模板进行检测，并以鸡肉组织提取的DNA作为阴性对照，利用实施例1步骤一中引物探针建立的检测方法的检测结果见图4，结果表明在鲟鱼DNA中检出施(史)氏鲟线粒体基因DNA，说明该样品为施(史)氏鲟纯种或其母本为施(史)氏鲟的杂交鲟。

2.采用文献报道的针对水生动物线粒体基因COI的通用PCR引物，对检测为阳性的DNA进行验证，其中所用的引物和产物长度见表3。

表3针对水生动物线粒体COI基因的通用引物序列及扩增产物长度

PCR扩增体系为50μL体系，其中包括：5μL DNA模板，1×PCR缓冲液，2.5mmol/LdNTPs 4μL，50μmol/L上、下游引物各0.5μL，2.5U HS Taq DNA聚合酶。

反应条件为：94℃/3min；94℃/30s，50℃/30s，72℃/40s，40个循环；72℃/5min。反应结束后，使用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析，扩增结果如图5。

将PCR产物送上海生工测序，CO I引物扩增得到的有效序列为709bp，经GenBankBlast分析与施(史)氏鲟线粒体相应基因参考序列(GenBank号MH973733.1)100％一致(见图6)，表明普通PCR结合测序检测结果与本发明所建立的检测方法结果一致。表明普通PCR结合测序检测结果与本发明所建立的检测方法结果一致。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国海关科学技术研究中心

<120> 一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用

<130> P210378DD1SQ

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

cagataagaa cgacaaggtg gaaca 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ggggtagggg gtttgtcga 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cgtccaatcg tcatgtg 17

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> （施（史）氏鲟线粒体D-LOOP部分基因）

<400> 4

atttgggttt ccattcactg acatgtagaa ctccttcaga taagaacaac aaggtggaac 60

atatattact gtccgagaga atgaatagtg aatggtacaa tgacataccc ctgatgtcac 120

acatggcctg tgctgtgtac aggaagatgt ttcacagagc ctggttttat cttctcacat 180

gacgattgga cgtttgttat cgacaaaccc cctaccccct tatgtcggac aggccttata 240

tttcttgtca 250

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tntcnacnaa ycayaargay attgg 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

tanacytcng grtgnccraa raayca 26

Claims

1.一种用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成的引物对，以及SEQ ID NO.3所示的TaqMan-MGB探针。

2.根据权利要求1所述的用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物，其特征在于，所述TaqMan-MGB探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有MGB无荧光淬灭基团。

3.权利要求1或2所述的用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物在检测施氏鲟线粒体基因中的应用。

4.权利要求1或2所述的用于检测施氏鲟线粒体基因D-LOOP的引物探针组合物在制备检测施氏鲟线粒体基因的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种用于检测施氏鲟线粒体基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的有效成分为权利要求1或2所述的引物探针组合物。

6.根据权利要求5所述的用于检测施氏鲟线粒体基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应的试剂。

7.一种检测施氏鲟线粒体基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

3)根据扩增曲线和Ct值进行结果判断，具体结果判断方法为：

若待测样品的Ct值≥30时，须复检再予以判断。

8.根据权利要求7所述的检测施氏鲟线粒体基因的方法，其特征在于，所述待测样品为鲟鱼的鳍条组织及含有鲟鱼源性成分的食品或化妆品。