CN105063192B - 用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及其应用 - Google Patents

用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及利用该分子标记鉴定施氏鲟种质的方法。利用特异性引物PCR扩增后获得的fzd8基因片段在施氏鲟与其它鲟鱼之间存在的种间序列差异，经序列比对直接鉴定出施氏鲟或其产品。本发明在鲟科鱼类中筛选fzd8核基因片段上SNP位点进行分析鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。

Description

用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及鱼类种质的鉴定方法，具体涉及一种用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及利用该分子标记鉴定施氏鲟种质的方法。
背景技术
鲟形目鱼类是地球现存最古老的鱼类之一，有“活化石”之称。施氏鲟(Acipenserdabryanus)属鲟形目、鲟科、鲟属，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龙江水系，自下游至上游额尔古纳河及石勒喀河等；多数分布于黑龙江中游和松花江下游，乌苏里江较少。由于过度捕捞和水体污染等原因，施氏鲟的资源量已经急剧减少。施氏鲟2010年被世界自然与资源保护联盟(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources简称IUCN)红色名录列为极度濒危(Critically Endangered,CR)物种，具有很高的经济价值和科研价值。
目前对于鲟形目鱼类的鉴定主要采用形态学和分子生物学等方法，由于形态学不适用于鱼子酱等鲟鱼产品的鉴定，通常采用线粒体上的分子标记鉴定鲟鱼及其产品。如Boscari等(Boscari,E.,et al.,Species and hybrid identification of sturgeoncaviar:a new molecular approach to detect illegal trade.Molecular ecologyresources,14(3):489-498.May 2014DOI:10.1111/1755-0998.12203ISSN 1755-098X)采用线粒体D-loop和S7对施氏鲟进行了鉴定，对施氏鲟的鉴定准确性不高，操作繁琐。中国专利申请号200510010346.0，名称为“一种鉴定史氏鲟、达氏鳇的技术”的发明专利，它是在施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA检测中使用具有种属特异性的DNA分子标记AHN，AHN引物大小为10bp，碱基序列为cacccggatg。用此引物对施氏鲟、达氏鳇及其产品DNA进行PCR检测，施氏鲟可获得200bp电泳带，达氏鳇则无此带，达到对两种鱼及其产品进行鉴定、标识的目的。该专利方法仅能在一定程度上鉴定出施氏鲟，区分施氏鲟与达乌尔鳇，仅适用于已知为施氏鲟或达乌尔鳇的疑似样本，因此适用范围较窄。因此，亟待开发出能够简便快速、准确检测施氏鲟与其他鲟鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定和市场监管等。
发明内容
本发明为了鉴定施氏鲟及其产品，从分子生物学层面上将形态上不易区分的施氏鲟或其产品进行鉴定，提供了一种用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及利用该分子标记鉴定施氏鲟种质的方法。本发明在鲟科鱼类中筛选核基因片段作为分子标记，应用核基因片段SNP位点， 成功鉴定了施氏鲟，同样适用于施氏鲟产品的鉴定。
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一方面，本发明涉及一种用于鉴定施氏鲟种质的分子标记，其为以待测鲟科鱼类基因组DNA为模板，通过特异性引物PCR扩增获得的fzd8基因片段，所述特异性引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’(SEQ ID NO:8)，
反向引物：5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’(SEQ ID NO:9)；
上述扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C或T。
另一方面，本发明涉及fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
正向引物：5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’(SEQ ID NO:8)；
反向引物：5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’(SEQ ID NO:9)。
另一方面，本发明涉及一种鉴定施氏鲟种质的方法，其特征在于：
(1)从待测鲟科鱼类样本中提取基因组DNA；
(2)以待测鲟科鱼类基因组DNA为模板，利用所述fzd8基因片段的特异性引物PCR扩增fzd8基因片段；
(3)检测扩增获得的fzd8基因片段并测序，经序列比对直接鉴定；
其中扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C时，样本为施氏鲟或其产品；扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为T时，样本为其他鲟鱼或其产品。
本发明所述的鲟科鱼类包括施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇中的任意一种或者多种。
所述的施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头和/或皮制品等。
根据本发明，SNP(single nucleotide polymorphism，SNP)是单个核酸差异的分子标记技术，在物种鉴定领域，方法是依据同一个目的基因序列在近缘物种间的单个碱基的差异，进而用于研究种群遗传变异和物种鉴定。
根据本发明，fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的单核苷酸多态性(SNP)位点，用于施氏鲟的种质鉴定，具有实验准确快捷，操作简便，适用范围广等优点。
本发明以施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇样本中提取的基因组DNA为模板，用本发明所述fzd8基因片段的特异性引物进行PCR扩增，得到的fzd8基因片段为707bp，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
上述fzd8基因片段经序列比对后，确定fzd8基因片段的核苷酸序列的第299位点的碱基 是C的样本来源于施氏鲟，其他鲟科鱼类样本来源的fzd8基因片段的第299位为T。即通过鉴定本发明所述特异性引物扩增出的fzd8基因片段中第299位的碱基是否为C，可鉴定施氏鲟或其产品。
本发明的有益效果表现为：
1、本发明采用核基因DNA序列作为分子标记，相较于线粒体基因，可以更准确快速地将形态上不易区分的施氏鲟或其产品鉴定出来。采用fzd8基因片段上SNP位点分析鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。
2、本发明在鲟科鱼类中筛选设计了fzd8基因片段作为分子标记，应用fzd8基因片段的SNP位点，能把施氏鲟或其产品从达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟及达乌尔鳇中鉴定出来。具有适用的待检测样本来源更广，准确性高，实验快捷，操作简便，结果准确可靠的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
本发明使用的主要仪器如下：
PCR仪：Bio-Rad iCycler和MJ100
离心机：Eppendorf Centrifuge 5415D
稳压稳流电泳仪：BIO-RAD power PAC 300
凝胶成像系统：Alphalmage Multimage Light Cabinet
电子天平、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床以及一些常用的实验设备。
本发明的1％琼脂凝胶的制备方法如下：
用天平称取0.3g琼脂糖，倒入30ml的1×TAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)，加入EB 2μL。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入1×TAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。在点样板上点上1/5体积的点样缓冲液(溴酚蓝)。
实施例1
施氏鲟种质分子标记鉴定方法，以施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达氏鳇作为研究对象，包括以下步骤：
(Ⅰ)分别取施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇样本，采用海洋组织DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取基因组DNA。
然后用琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA：
制备1％的琼脂糖凝胶，并将2μL DNA溶液加入点样缓冲液并混匀上样电泳。100V电压电泳25min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳带的亮度来确定模板DNA的浓度，并相应稀释模板，使DNA模板的浓度最终约为100ng/μL。
(Ⅱ)分别以施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇样本的基因组DNA为模板，在特定引物的引导下进行PCR扩增。
(1)PCR扩增
PCR扩增施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇的fzd8基因片段。fzd8引物参考西伯利亚鲟A.baerii的fzd8序列(GenBank号：AY333968)，应用引物设计软件Primer 5.0设计：
fzd8-F：5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’(SEQ ID NO:8)和fzd8-R：5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’(SEQID NO:9)，由Invitrogen公司合成。
fzd8-F和fzd8-R为扩增fzd8目的片段的引物对，其中的F代表上游引物(或正向引物)，R代表下游引物(或反向引物)。下文引物的F/R与之相同。
反应体系为25μL，将各组分按以下顺序依次在0.2mL的PCR管中混合：
扩增步骤为：
(2)PCR产物检测与测序
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，取检测良好的样本送Invitrogen公司测序。
测序验证其序列信息，发现施氏鲟的fzd8基因片段与其他种类的鲟形目鱼类的fzd8序列存在差异，进行后期鉴定实验。
(Ⅲ)数据分析
采用MEGA 5.0对鲟鱼样本的fzd8的测序结果分别进行比对和对齐，得到707bp的fzd8序列，施氏鲟在fzd8序列的第299位碱基为C，而达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇fzd8基因片段在该位点为T。
上述实验结果显示：本发明的施氏鲟的fzd8基因片段序列及SNP标记在GenBank中都未见报道。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
。

Claims (6)

1.一种用于鉴定施氏鲟种质的分子标记，其为以待测鲟科鱼类基因组DNA为模板，通过特异性引物PCR扩增获得的fzd8基因片段，所述特异性引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-TAACCACGACACACAGGATG-3’ ，即SEQ ID NO:8，
反向引物：5’-CTGAATAAAGACACGAACCC-3’ ，即SEQ ID NO:9；
上述扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C或T；
所述待测鲟科鱼类为施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和/或达乌尔鳇。
2.根据权利要求1所述的分子标记或特异性引物在鉴定施氏鲟种质中的应用。
3.施氏鲟种质的鉴定方法，其特征在于：
（1）从待测鲟科鱼类样本中提取基因组DNA；
（2） 以待测鲟科鱼类基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物PCR扩增fzd8基因片段；
（3） 检测扩增获得的fzd8基因片段并测序，经序列比对直接鉴定；
其中扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C时，样本为施氏鲟或其产品；扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为T时，样本为其他鲟鱼或其产品。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于：所述的其它鲟鱼为达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟和达乌尔鳇中的任意一种或者多种。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于：扩增出的施氏鲟、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟或达乌尔鳇的fzd8基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。
6.根据权利要求3－5任一项所述的鉴定方法，其中施氏鲟产品或其他鲟鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头和/或皮制品。
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