KR102373255B1

KR102373255B1 - 가자미과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법

Info

Publication number: KR102373255B1
Application number: KR1020220007921A
Authority: KR
Inventors: 김은미; 김영옥; 남보혜; 노은수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-03-11

Abstract

본 발명은 외형이 유사하여 육안으로 분류하기 어려운 가자미과(Pleuronectidae) 11종에 대해서 신속하고 정확하게 종을 판별할 수 있는 가자미과 어종 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별방법을 제공한다.

Description

가자미과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법{Genetic markers and methods for identifying species and origin of family Pleuronectidae}

본 발명은 가자미과 어종 판별용 유전자 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 가자미과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것이다.

가자미과(Pleuronectidae) 어류는 전 세계에 40속 103종, 일본에는 17속 33종, 국내에는 18속 25종이 보고되어 있다(Lee, S. J., Fish Ocean Technol. 55, 335-348. 2019). 한국에 출현하는 것으로 보고된 것은 25종이며, 이중에서 노랑가자미 등 13종은 문헌상 기록이거나 출현 빈도가 매우 낮으며, 나머지 12종(문치가자미, 용가자미, 돌가자미, 도다리, 줄가자미, 물가자미, 기름가자미, 홍가자미, 및 강도다리, 참가자미, 갈가자미, 찰가자미)이 식용으로 이용되어 중요한 수산자원으로 여겨진다. 그러나 상기 12종도 외형이 유사하여 종별로 분류되지 않으며, 기름가자미를 제외하고는 어종의 어획량도 종별로 집계되지 않고 "가자미류"로 통칭되고 있다. 최근 다양한 수산물이 국내로 수입 및 유통되고 있으며, 해양수산부 수산정보포털(www.fips.go.kr)의 수산물 수출입 통계에 따르면 가자미과 어류도 2017년 대비 수입량이 2배 이상 증가한 3,500여 톤이 수입되고 있다. 가자미과 어류는 종이 매우 다양하고 외형이 유사하여 형태학적 판별이 어려워 이를 악용하여 저가의 어종을 고가의 어종으로 속여 판매하거나 유통하는 가짜 식품(EMA, Economically Motivated Adulteration) 사례가 국내 수산시장에서 빈번하게 발생하고 있다. 이처럼 가자미과 어류는 수입산 및 국내산의 종 및 산지 확인에 대한 분쟁 개연성이 매우 높은 어종으로 유전학적 특성 분석을 통한 분류체계의 정립 및 유전정보 확보 등의 연구가 필요하다.

그러나 일부 가자미류에 대한 분자생물학적 분석은 수행된 바 있으나, 국내 분포하는 가자미류 11종의 동정을 위한 범용 유전자 마커 및 종 동정 분석법은 아직 없는 실정이다.

본 발명은 외형이 유사하여 육안으로 분류하기 어려운 가자미과(Pleuronectidae) 11종에 대해서 신속하고 정확하게 종을 판별할 수 있는 가자미과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제4포워드 프라이머; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제5포워드 프라이머; 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제6포워드 프라이머; 서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제7포워드 프라이머; 서열번호 8로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제8포워드 프라이머; 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제9포워드 프라이머; 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제10포워드 프라이머; 서열번호 11로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제11포워드 프라이머; 및 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 가자미과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 가자미로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 가자미과 어종 판별방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 가자미과 어종 판별용 유전자 마커는 외형이 유사하여 종 둔갑 등에 취약한 국내 유통되는 가자미류를 신속·정확하게 식별 가능하여 생물연구에서 필수적인 가자미류의 분류 관련 연구에 기초 정보 확보로 활용 가능하다. 또한 수입산 및 국내산 가자미과 어류의 체계적인 자원관리를 위한 분류 및 먹거리 안전성 확보에 따라 가자미류 수산자원의 체계적 관리에도 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1a 내지 1c는 본 발명의 가자미과 11종의 미토콘드리아 서열에서 설계된 COI 영역에 대한 범용 프라이머 정보와 종 특이적 프라이머를 나타내는 그림이다. G. stelleri(MH032428.1), T. kitaharae(MH032424.1), C. asperrimum(MH032407.1), E. grigorjewi(MH032414.1), C. pinetorum(MH032404.1), P. herzensteini(KF386365.1), M. achne(MH032473.1), P. stellatus(EF424428.1), K. bicoloratus(MH032487.1), P. yokohamae(KT878309.1) 및 L. aspera(MH032456.1).
도 2는 본 발명의 범용 프라이머 및 종 특이적 프라이머를 사용한 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 종판별 결과를 나타내는 겔 사진이다. (A)범용 프라이머, (B)주형 혼합물, (1), (7), (11); 각 세트에서 정상적으로 각 종들이 증폭되었을 때 나타나는 DNA 증폭산물을 의미함. 예컨대 1은 2, 3, 4, 5, 6을 모두 나타내고 있음, (2) G. stelleri, (3)T. kitaharae; (4)C. asperrimum; (5)E. grigorjewi; (6)C. pinetorum; (8)P. herzensteini; (9)M. achne; (10)P. stellatus; (12)K. bicoloratus; (13)P. yokohamae; (14)L. aspera; (M) 100 bp DNA 레더(Dynebio, 한국).
도 3은 본 발명의 종 특이적 프라이머 세트를 갖는 11종의 가자미과의 검출을 위한 민감도를 관찰한 겔 사진이다. 민감도 분석은 각 개체 당 50 ng/㎕ ~ 0.01 ng/㎕의 게놈 DNA로 결정되었다. Lane:(M) 100 bp DNA 레더(Dynebio, 한국); (1) 50 ng; (2)10 ng; (3)1 ng; (4) 0.1 ng; (5) 0.01 ng.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 "가자미(flat fish)"는 가자미목 가자미과 어류로 가자미류는 가자미목에 속하는 넙치류, 가자미류, 서대류 등을 모두 포함하며 넙치, 도다리, 서대 등 이름을 아는 몇 종을 제외하고는 모두 가자미로 총칭한다. 전 세계적으로 망둑어류 다음으로 종이 많아 520여종에 달하며 한국에서도 서대류, 넙치류를 제외하고 지금까지 30여종이 알려져 있다. 본 발명자들은 국내에서 서식하고 분포하는 가자미과(Pleuronectidae) 11종을 효과적으로 판별할 수 있는 종 특이적 유전자 마커를 개발하였다.

본 명세서에서 사용되는 "Cytochrome Oxidase subunit I(COI)"는 미토콘드리아에 있는 유전자로 종을 분류할 때 자주 쓰이는 DNA 마커로써 미토콘드리아 DNA는 모계유전을 하며, 유전적 재조합이 일어나지 않으므로 종간, 품종 간 계통 분석에 많이 이용되고 있다. 특히, Cytochrome Oxidase subunit I(COI) 유전자는 어류를 포함한 많은 종에서 종판별 마커를 위한 DNA 바코드(barcode)로써 널리 사용되고 있다.

본 명세서에서 사용되는 "프라이머"는 검출하고자 하는 종에 특이성을 가진 표적 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥의 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)"은 유전체 상에서 A, T, G, C로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다. 다형성(polymorphism)이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 부위 중 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 갖는다.

발명의 상세한 설명:

상기 종특이적 PCR 키트에 있어서, 상기 가자미과 어종은 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 갈가자미(Tanakius kitaharae), 줄가자미(Clidoderma asperrimum), 물가자미(Eopsetta grigorjewi), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Pleuronectes herzensteini), 찰가자미(Microstomus achne), 강도다리(Platichthys stellatus), 돌가자미(Kareius bicoloratus), 문치가자미(Pleuronectes yokohamae) 및 각시가자미(Limanda aspera)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 어종 판별방법에 있어서, 상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 1,064 bp의 밴드가 확인되면 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 993 bp의 밴드가 확인되면 갈가자미(Tanakius kitaharae), 709 bp의 밴드가 확인되면 줄가자미(Clidoderma asperrimum), 571 bp의 밴드가 확인되면 물가자미(Eopsetta grigorjewi), 256 bp의 밴드가 확인되면 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 1,006 bp의 밴드가 확인되면 참가자미(Pseudopleuronectes herzensteini), 613 bp의 밴드가 확인되면 찰가자미(Microstomus achne), 312 bp의 밴드가 확인되면 강도다리(latichthys stellatus), 815 bp의 밴드가 확인되면 돌가자미(Kareius bicoloratus), 517 bp의 밴드가 확인되면 문치가자미(Pleuronectes yokohamae), 및 159 bp의 밴드가 확인되면 각시가자미(Limanda aspera)로 결정함으로써 수행될 수 있고 멀티플렉스(Multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭할 수 있다.

가자미과 어류는 우리나라 전역에 분포하는 중요한 경제성 높은 수산자원이다. 그러나 종이 다양하고 외부 형태가 매우 유사하여 어종의 명확한 분류 기준 없이 종명이 오용되어 사용되거나 일부 유통과정에서 저가의 수입산 또는 유사어종을 고가의 어종으로 둔갑시키는 불법 유통 사례가 발생하고 있다. 또한 수산자원의 체계적 관리를 위한 어획량 집계 시에도 기름가자미를 제외하고는 "가자미류"로 통칭하여 유통되고 있다. 가자미과 어류에 대한 이전 연구로는 범가자미(Verasper variegatus), 도다리(Pleuronichthys cornutus), 문치가자미(Pleuronectes yokohamae), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 및 갈가자미(Tanakius kitaharae)등을 대상으로 형태특성 및 분포를 기술한 것이 대부분이며, 그 외에 한국산 가자미과 어류의 분자계통학적 연구 등이 보고되어 있다(Lee, T. Y., et al., Saero, Busan, Korea, 109. 1981). 분자 동정에 관한 연구는 2019년에 보고된 한국산 가자미과 자어 10종의 분자동정 및 형태 기재에 대한 것이 유일하며, 유전학적 분석을 활용한 가자미과 어류의 종 동정에 관한 연구는 보고된 바가 없다(Lee, S. J., et al., Fish Ocean Technol. 55, 335-348. 2019).

수산생물의 종 분류는 생물자원 관리를 위한 기본 단위이며, 생태계 연구 및 생물종의 허위 표시 방지를 통한 먹거리 안전성 확보 및 부정부량식품 근절을 위해 중요성이 인식되고 있다. 현재 사용되고 있는 다양한 종 동정 기법 중에서 분자생물학적 기법을 적용한 DNA 기반의 종 동정 분석법은 분석 대상 시료의 제조과정에서의 고열 및 건조 처리 등 물리화학적 조성의 변화에 대한 신뢰성이 높아 가공 처리된 시료에서도 보다 안정적인 분석 결과를 도출할 수 있는 장점이 있다(Axayacatl, R. O. et al., Ichthyol. Res. 55, 389-393. 2008). 그 중에서도 MSS PCR(multiplex species specific polymerase chain reaction) 분석법은 제한효소 등의 전 처리 없이 PCR 증폭 후 전기영동 분석만으로도 종 동정 결과 확인이 가능하여 제한효소 단편 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)과 유전자 증폭산물 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 방법에 비해 간편하고 재현성이 높다(Acar, C., et al., Eur. Food. Res. Technol. 243, 49-57. 2017). 또한, 염기서열 기반으로 종내 및 종간 다형성을 분석하고 프라이머(primer)를 제작하여 사용하기 때문에 유전자 변이 차이에 따른 위양성 및 위음성 결과를 보완할 수 있다(Hsieh CH, et al., Food. Chem. 121:1305-1311. 2010).

본 발명자들은 종이 다양하고 외형이 매우 유사하여 형태적 구별이 어려운 가자미과 어류를 대상으로 국내 서식 및 유통되거나 수입량이 많은 가자미과 어종인 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 참가자미(Pleuronectes herzensteini), 갈가자미(Tanakius kitaharae), 줄가자미(Clidoderma asperrimum), 돌가자미(Kareius bicoloratus), 찰가자미(Microstomus achne), 문치가자미(Pleuronectes yokohamae), 물가자미(Eopsetta grigorjewi), 강도다리(Platichthys stellatus), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 및 각시가자미(Limanda aspera)를 포함하는 10속 11종을 대상으로 유전학적 특성을 분석하고 유전정보를 확보하였다. 상기 가자미 종을 대상으로 국제생물바코드컨소시엄(Consortium for the Barcode of Life)에서 제안된 종판별 바코드 영역인 미토콘드리아 DNA 염기서열의 cytochrome c oxidase I(COI) 유전자 영역에서 종내 및 종간 유전적 변이를 분석하였고, 종간 변이가 뚜렷한 종 특이적 위치를 탐색하여 한번의 PCR 반응으로 가자미과 어류 11종의 종 동정이 가능한 MSS PCR 조건을 확립하고자 하였다(Ward, R. D., et al., FISH-BOL. J. Fish Biol. 74, 329-356. 2009). 구체적으로 국내에서 서식하고 분포하는 가자미목에서 주로 소비된 11종을 신속하게 식별하기 위해 약 1,300 bp의 미토콘드리아 COI 유전자 분석으로 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였고, PCR 증폭산물의 크기 차이로 11종의 종 동정이 가능한 프라이머를 제작하였다. 단일 PCR을 이용한 종간 교차반응을 통하여 최적의 PCR 조건을 확립하였으며, 이후 제작된 프라이머를 혼합하여 11종에 대한 다중 PCR(Multiplex species specific PCR, MSS PCR) 조건을 확립하였다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동 분석으로 크기에 따라 각각 기름가자미(1,064 bp), 갈가자미(993 bp), 줄가자미(709 bp), 물가자미(571 bp), 용가자미(259 bp), 참가자미(1,006 bp), 찰가자미(613 bp), 강도다리(312 bp), 돌가자미(815 bp), 문치가자미(517 bp), 및 각시가자미(159 bp)로 명확하게 종 동정이 가능하였다. PCR 민감도 측정 결과도 11종에서 0.1 ng/μl의 농도까지 검출 가능함을 확인하였다. 상기 MSS-PCR 분석은 이전의 생어(sanger) 시퀀싱 방법보다 쉽고 짧은 시간에 식별된 결과를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 가자미과 11종 판별용 유전자 마커는 정확도와 민감도가 우수하여, 국내 수산시장의 불법 유통 가자미류 제품에 대한 신속하고 정확한 종 동정으로 위조 표시 방지 및 소비자의 권리 보호에 기여하고 수입산 및 국내산 가자미과 어류의 체계적인 자원관리를 위한 분류 및 먹거리 안전성 확보에 따라 가자미류 수산자원의 체계적 관리에도 활용도가 높을 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 게놈 DNA 추출

본 발명에서 사용된 가자미과 시료인 기름가자미, 참가자미, 갈가자미, 줄가자미, 돌가자미, 찰가자미, 문치가자미, 물가자미, 강도다리, 용가자미, 및 각시가자미를 포함하는 10속 11종은 2019년 1월부터 6월까지 국내 수산시장에서 구매 또는 부경대학교 해양어류자원 기탁등록 보존기관에서 제공받은 표본 시료 323개체를 사용하였다(표 1 참조). 총 323개체의 시료에서 77개체는 프라이머 제조에 사용되었으며, 246개체는 제조된 프라이머 검증에 사용되었다. 상기 시료의 DNA추출은 DNeasyㄾBlood & Tissue Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다. 각 시료의 약 20 mg의 조직에서 DNeasyㄾBlood & Tissue Kit에 첨부된 매뉴얼을 참조하여 게놈 DNA를 추출하였다. 그 후 Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 정량하였으며, 유전자 분석 전까지 -20℃에 보관하였다. 상기 가자미과 시료에 대한 정보를 하기 표 1에 요약하였다.

가자미과 어종 시료 정보

학명	샘플 사이트	수집 날짜	샘플 수(N)		유래
학명	샘플 사이트	수집 날짜	디자인	검증	유래
Glyptocephalus stelleri	대진항, 주문진항, 죽도시장	2019.01.	22	56	수산시장
Tanakius kitaharae	여수	2019.01.~03.	10	20	PKNU
Clidoderma asperrimum	주문진항	2019.01.	4	11	수산시장
Eopsetta grigorjewi	목포	2019.03.	5	28	PKNU
Cleisthenes pinetorum	주문진항	2019.01.	6	30	수산시장
Pleuronectes herzensteini	주문진항 대진항	2019.01.	7	9	수산시장
Microstomus achne	후포항	2019.01.	1	11	수산시장
Platichthys stellatus	주문진항	2019.01.	5	5	수산시장
Kareius bicoloratus	주문진항 대진항	2019.01.	4	19	수산시장
Pleuronectes yokohamae	후포항	2019.01.	2	43	수산시장
Limanda aspera	중국	2019.01.	11	18	수산시장

실시예 2: 염기서열 분석

본 발명자들은 mtDNA의 COI 유전자 영역에서 종간·종내 변이 및 보존된 영역을 탐색하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information) GenBank에 등록된 가자미과 어류 11종(기름가자미, MH032428.1; 참가자미, MH032530.1; 갈가자미, MH032424.1; 줄가자미, MH032407.1; 돌가자미, MH032487.1; 찰가자미, MH032470.1; 문치가자미, KT878309.1; 물가자미, MH032414.1; 강도다리, EF424428.1; 용가자미, MH032404.1; 각시가자미, MH032456.1)의 mtDNA 염기서열 정보를 Bioedit program(http://mbio.ncsu,edu/BioEdit/biodeit.html)를 사용하여 정렬하였다(도 1a 내지 1c). 그 후 상기 정렬된 염기서열에서 보전적인 영역을 기준으로 이들 11종의 COI 유전자 영역 증폭 가능한 특이 포워드 프라이머(GJM-F128, 서열번호 12) 및 리버스 프라이머(GJM-R1370, 서열번호 13)를 제조하였다(표 2).

COI 유전자 영역 증폭을 위한 반응액의 조성은 추출한 게놈 DNA 1 ㎕, 10 x Hs Taq buffer 2 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 0.4 ㎕, 10 pmol 포워드 프라이머 0.8 ㎕, 10 pmol 리버스 프라이머 0.8 ㎕, HS Taq polymerase(Anti-HS Taq. TNT Research, Korea) 0.2 ㎕, 나머지는 멸균수로 채워 총 20 ㎕으로 제조하였다. PCR 조건은 ABI verity fast thermal cyclers(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 95℃에서 10분간 pre-denaturation 후, 95℃에서 40초간 denaturation, 54℃에서 40 초간 annealing 및 72℃에서 50초간 extension을 35 사이클로 진행하였고 마지막으로 72℃에서 7분간 final extension을 수행하였다. 그 후 증폭된 PCR 산물은 자동염기서열 분석 장비인 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다. 상기 mtDNA의 COI 유전자 영역의 범용 프라이머 염기서열 정보를 하기 표 2에 요약하였다.

범용 프라이머 염기서열 정보

프라이머	핵산서열(5'-->3')	mer	Tm(℃)	생산물 크기	GC(%)	서열번호
GJM-F128 F	GCACACGCCTTTGTAATAAT	20	59	1,262 bp	40	12
GJM-R1370 R	CGTTTGGCTGTAAATGCTTC	20	62	1,262 bp	45	13

실시예 3: 종 특이적(Species specific) 프라이머 제조

상기 가자미과 11종의 COI 유전자 영역의 양방향 염기서열은 DNASTAR SeqMan software(DNASTAR, Lagergene, USA)를 사용하여 정렬하였으며, 최종적으로 1,262 bp의 COI 유전자 영역의 염기서열을 확보하였다. 상기 확보된 염기서열은 점 돌연변이(point mutation)에 의한 종내 변이를 제외하고, 종간 특이성을 나타내는 SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)를 탐색하였다. 종 특이적 프라이머는 전기영동 분석 시 PCR 증폭 산물의 크기 차이로 각 종의 종 구분을 명확하게 하기 위해서 각 종에 대한 PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 제조하였다. 대상 종에 대해서만 증폭이 가능하도록 종식별이 가능한 SNP가 3'말단에 위치하도록 하였고, 서로 다른 11개의 포워드 프라이머를 제조하였다. 상기 제조된 종 특이적 포워드 프라이머는 실험의 편의성을 위해 서로 비슷한 Tm값에서 증폭이 가능하도록 제조하였다. 기름가자미, 갈가자미, 줄가자미, 물가자미, 용가자미의 5종은 58℃, 참가자미, 찰가자미, 강도다리, 돌가자미, 문치가자미, 각시가자미의 6종은 62℃로 제조하였고, self-dimer가 나타나지 않도록 GC 비율 등을 고려하여 설계하였다(표 3 참조). 상기 종 특이적 프라이머의 서열 정보를 하기 표 3에 요약하였다.

다중 PCR의 종-특이적 프라이머 서열

세트	명칭	서열(5'-->3')	표적 종	Tm(℃)	생산물 크기(bp)	서열번호
Set 1	Gs-F344	GGTGAACCGTTTACCCTCCC	G. stelleri	58	1,064	1
	Tk-F475	ATCAACATAAAACCGACAACC	T. kitaharae		993	2
	Ca-F700	ATACATTCTTATTCTCCCAGGT	C. asperrimum		709	3
	Eg-F835	CCACCACATGTTCACGGTA	E. grigorjewi		571	4
	Cp-F1147	CGTACACTGATTCCCCCTT	C. pinetorum		259	5
Set 2	Ph-F403	CCTCACCATTTTCTCTCTTCAT	P. herzensteini	62	1,006	6
	Ma-F793	GGCTATGATGGCTATCGGC	M. achne		613	7
	Ps-F1096	CACTTCCACTATGTCCTATCA	P. stellatus		312	8
Set 3	Kb-F594	TGCTACTAACAGACCGCAACT	K. bicoloratus	62	815	9
	Py-F892	TGCCACAATAATTATTGCCATT	P. yokohamae		517	10
	La-F1249	CCCAACATTTTCTTGGCCTT	L. aspera		159	11

실시예 4: MSS PCR 분석

본 발명자들은 MSS PCR 증폭을 위해 기름가자미, 갈가자미, 줄가자미, 물가자미, 용가자미의 5종, 참가자미, 찰가자미, 강도다리의 3종, 및 돌가자미, 문치가자미, 각시가자미 3종의 3 sets로 가자미과 어류 11종의 판별이 가능한 프라이머 혼합물(mixture)를 조성하였다. MSS PCR 증폭을 위한 반응액의 조성은 각 시료에서 추출한 게놈 DNA 1 ㎕, 10 x Hs Taq buffer 1 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 0.4 ㎕(Set A) 및 0.3 ㎕(Set B와 C), 10 pmol 포워드 프라이머 0.2 ㎕(Set A) 및 0.3 ㎕(Set B와 C), 10 pmol 리버스 프라이머 0.8 ㎕(Set A) 및 0.6 ㎕(Set B와 C), HS Taq polymerase(Anti-HS Taq. TNT Research, Korea) 0.1 ㎕, 나머지는 멸균수로 채워 총 10 ㎕로 제조하였다. PCR 조건은 ABI verity fast thermal cyclers(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 95℃에서 10분간 pre-denaturation 후, 95℃에서 40초간 denaturation, 58℃에서 40 초간(Set A) 및 62℃에서 40 초간(Set B와 C)annealing 및 72℃에서 50초간 extension을 30 사이클로 진행하였고 마지막으로 72℃에서 7분간 final extension을 수행하였다. PCR은 ABI verity fast thermal cyclers(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 이후 증폭된 PCR 증폭 산물은 2% 아가로즈 겔에서 100V, 40분간 전기영동을 이용하여 분리하였으며, 1x loading star(Dynebio, South Korea)로 염색한 후, Gel Doc image analysis system(ATTO corporation, Japan)으로 PCR 증폭 산물을 확인하였다.

실험예 1: 가자미과 11종의 종 특이 영역 탐색

본 발명자들은 NCBI 데이터베이스의 Genbank에 등록되어 있는 COI 유전자 염기서열 정보를 바탕으로 변이가 적은 보존서열을 가진 부분을 탐색하여 가자미과 11종에 특이적인 포워드 및 리버스를 제조하였다(도 1a 내지 1c). 상기 제조된 프라이머는 가자미과 11종에 모두 적용되었으며, 이를 가자미과 11종 범용 프라이머로 사용하여 PCR 증폭 여부를 확인하는 기준 마커로 사용하였다.

실험예 2: 가자미과 11종의 COI 영역 염기서열 분석

가자미과 11종에 공통으로 적용되도록 제작된 범용 프라이머로 확보된 COI 유전자 영역 염기서열(1,262 bp)은 DNA Sequence Polymorphism software(DnaSP, ver. 5.10.01) 및 DNASTAR SeqMan software(DNASTAR, Lagergene, USA)를 사용하여 분석하였다. 상기 확보된 11종의 염기서열에서 종내 유전자 변이를 배제하고, 11종 모두에서 종간 변이가 뚜렷한 종 특이적 SNPs(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)가 관찰되었다. 이를 바탕으로 종간 약 100 bp 이상의 서열 차이를 두고, SNP 3'말단에 위치하여 가자미과 어류 11종의 구별이 가능하도록 종 특이적 포워드 프라이머를 제조하였다(표 3). 그 후 유전적 다양성(Haplotype diversity) 분석 결과 용가자미 0.855, 참가자미 0.389, 문치가자미 0.896, 줄가자미 0.873, 돌가자미 0.495, 기름가자미 0.925, 찰가자미 0.889, 갈가자미 0.923, 물가자미 0.795, 각시가자미 0.948이였으며, 강도다리는 haplotype이 1개로 확인되어 유전적 다양성이 관찰되지 않았다.

실험예 3: 종 특이적 PCR 특이성 검사

본 발명자들은 결합 온도의 최대한계를 확인하기 위하여 58~62℃의 조건으로 gradient PCR 반응을 수행하였다. 각 가자미 종의 포워드 프라이머 및 범용 리버스 프라이머(GJM_1370-R)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 1.8%의 아가로스 겔에 전기영동을 수행하였다. 그 결과 가장 종 특이적 반응이 잘 나타나는 온도를 각 프라이머의 적정 온도로 설정하였다(표 3).

실험예 4: MSS PCR 특이성 검사

본 발명자들은 동일한 양의 포워드 프라이머를 첨가한 MSS PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과, 각 종들은 선명한 DNA 증폭을 나타냈으며, 증폭된 산물의 크기에 따라 기름가자미(1,064 bp), 갈가자미(933 bp), 줄가자미(709 bp), 물가자미(571 bp), 용가자미(259 bp), 참가자미(1,006 bp), 찰가자미(613 bp), 강도다리(312 bp), 돌가자미(815 bp), 문치가자미(517 bp) 및 각시가자미(159 bp)의 크기로 증폭되는 것을 확인하였다. 프라이머 이합체(dimer) 및 비-특이적 산물의 증폭은 일어나지 않았으며, 각 프라이머 세트의 DNA 혼합물에서도 교차반응 없이 종 특이적 PCR 증폭이 확인되었다(도 2).

실험예 4: MSS PCR 분석 감도

MSS-PCR 분석 감도를 확인하기 위해 가자미과 11종의 DNA를 50 ng/μl, 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0.1 ng/μl, 및 0.01 ng/μl으로 정량하여 실험하였다. 각 종별 PCR 분석 감도는 줄가자미 1종은 50 ng/μl, 기름가자미, 참가자미, 강도다리, 돌가자미, 문치가자미 5종은 0.1 ng/μl, 갈가자미, 물가자미, 용가자미, 찰가자미, 각시가자미 5종은 0.01 ng/μl의 DNA 농도까지 검출이 가능하였다(도 3).

결론적으로 본 발명자들은 형태학적으로 종 동정이 어려운 가자미과 11종을 대상으로 mtDNA의 COI 유전자 영역을 분석하여 멀티플렉스 PCR 수행이 가능한 가자미과 어종 판별용 유전자 마커를 개발하였고 가자미과 11종에 대한 프라이머의 종 특이성, 재현성, 신속성 등의 활용 가능성을 검증하였다. 따라서 본 발명의 유전자 마커는 가공된 가자미류의 수산 가공식품 또는 수입 수산물 등의 대상으로 정확한 종 동정이 가능하여 건전한 유통질서 확립 및 먹거리 안전성 확보 등에 기여하여 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Genetic markers and methods for identifying species and origin of family Pleuronectidae <130> PD21-6146 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gs-F344 <400> 1 ggtgaaccgt ttaccctccc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tk-F475 <400> 2 atcaacataa aaccgacaac c 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ca-F700 <400> 3 atacattctt attctcccag gt 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eg-F835 <400> 4 ccaccacatg ttcacggta 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cp-F1147 <400> 5 cgtacactga ttccccctt 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ph-F403 <400> 6 cctcaccatt ttctctcttc at 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ma-F793 <400> 7 ggctatgatg gctatcggc 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ps-F1096 <400> 8 cacttccact atgtcctatc a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kb-F594 <400> 9 tgctactaac agaccgcaac t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Py-F892 <400> 10 tgccacaata attattgcca tt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> La-F1249 <400> 11 cccaacattt tcttggcctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJM_128-F <400> 12 gcacacgcct ttgtaataat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GJM_1370-R <400> 13 cgtttggctg taaatgcttc 20

Claims

서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머;
서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머;
서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머;
서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제4포워드 프라이머;
서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제5포워드 프라이머;
서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제6포워드 프라이머;
서열번호 7로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제7포워드 프라이머;
서열번호 8로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제8포워드 프라이머;
서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제9포워드 프라이머;
서열번호 10으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제10포워드 프라이머;
서열번호 11로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제11포워드 프라이머; 및
서열번호 13으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 가자미과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트.
제1항에 있어서,
상기 가자미과 어종은 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 갈가자미(Tanakius kitaharae), 줄가자미(Clidoderma asperrimum), 물가자미(Eopsetta grigorjewi), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Pleuronectes herzensteini), 찰가자미(Microstomus achne), 강도다리(Platichthys stellatus), 돌가자미(Kareius bicoloratus), 문치가자미(Pleuronectes yokohamae), 및 각시가자미(Limanda aspera)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 종특이적 PCR 키트.
가자미로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및
전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 가자미과 어종 판별방법.
제3항에 있어서,
상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 1,064 bp의 밴드가 확인되면 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 993 bp의 밴드가 확인되면 갈가자미(Tanakius kitaharae), 709 bp의 밴드가 확인되면 줄가자미(Clidoderma asperrimum), 571 bp의 밴드가 확인되면 물가자미(Eopsetta grigorjewi), 256 bp의 밴드가 확인되면 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 1,006 bp의 밴드가 확인되면 참가자미(Pseudopleuronectes herzensteini), 613 bp의 밴드가 확인되면 찰가자미(Microstomus achne), 312 bp의 밴드가 확인되면 강도다리(latichthys stellatus), 815 bp의 밴드가 확인되면 돌가자미(Kareius bicoloratus), 517 bp의 밴드가 확인되면 문치가자미(Pleuronectes yokohamae), 및 159 bp의 밴드가 확인되면 각시가자미(Limanda aspera)로 결정함으로써 수행되는, 방법.
제3항에 있어서,
멀티플렉스(Multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭하는, 방법.