JP5566018B2 - カニ検出用プライマーセット - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、食物アレルギーの原因となるカニを特異的かつ高感度で検出することのできるプライマーセットに関する。
現在、日本においては、「カニ」は「アレルギー表示特定原材料７品目」に含まれている。これまで、甲殻類の検出法としては、エビやカニの主要アレルゲンであるトロポミオシンをELISAにより検出する方法が知られている（非特許文献１など）。しかしながら、この方法では、検出標的としているタンパク質が、エビとカニに共通して存在し、かつ他の甲殻類との間でも類似性の高いタンパク質であるため、カニだけを特異的に検出することはできない。また、甲殻類の検出法としては、16S rRNA遺伝子をターゲットとしたPCR法による方法も報告されている（非特許文献２）。しかしながら、この方法ではPCR産物の制限酵素断片長多型（RFLP）に基づいて検出を行うため、どのような種のカニ、エビであるかまでを特定できるが、PCR増幅後に数種類の制限酵素で消化して解析する必要があり、解析に手間がかかる。従って、効率的にカニをエビと明確に区別して検出することのできる簡便な手段の開発が望まれるところである。
一方、PCR法による特定の生物種の検出では、近縁種からの非特異的増幅産物の発生を避けるために特異性の高いプライマーの設計が必要である。特に、プライマーの3'側の配列は、鋳型への結合性を決める重要な要素となる。プライマーの3'側配列の特異性を高める一つの手段として、ミスマッチ塩基の導入が考えられる。非特許文献３は、プライマーにミスマッチ塩基を導入した一塩基多型判別PCRを報告するものであり、同文献には「プライマー／鋳型DNAの塩基配列のミスマッチ」と「標的PCR産物が得られるアニーリング温度」との関係が示されている。具体的には、プライマーの3’末端から２番目の１塩基、または3’末端の１塩基だけが鋳型となる塩基配列とミスマッチしている場合には、ミスマッチがない場合に比べて殆ど同じか数℃低いアニーリング温度でも目的とする増幅産物が得られたが、プライマーの3’末端から１番目と２番目の塩基がともにミスマッチしている場合には、アニーリング温度を20℃下げても目的とする増幅産物は得られなかったことが記載されている。
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Pettersson M., Bylund M., Alderborn A. Molecular haplotype determination using allele-specific PCR and pyrosequencing technology. Genomics. 82, 390-396 (2003)
本発明は、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別して特異的かつ高感度で検出する簡便な手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、カニの16S rRNA遺伝子の塩基配列において、カニをエビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基を選別し、
その選択した塩基の前後の塩基配列を含む領域から設計したプライマーの3’末端から２番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入した改変プライマーを用いたところ、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別して特異的かつ高感度で検出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
その選択した塩基の前後の塩基配列を含む領域から設計したプライマーの3’末端から２番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入した改変プライマーを用いたところ、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別して特異的かつ高感度で検出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、カニ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号１、２、３、４、５、６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(2) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、62bpの長さを有する標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、カニの検出方法。
(3) (1)に記載のプライマーセットを含む、カニ検出用キット。
(1) 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、カニ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号１、２、３、４、５、６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(2) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、62bpの長さを有する標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、カニの検出方法。
(3) (1)に記載のプライマーセットを含む、カニ検出用キット。
本発明によれば、食物アレルギーの原因となるカニを特異的かつ高感度で検出することのできるプライマーセットが提供される。本発明のプライマーセットを利用することにより、一回のPCRで、加工工程などで食品に混入する可能性のある微量のカニの有無を検出することができる。また、本発明のプライマーセットを用いたPCRで増幅される標的サイズの産物は62bpと短いため、食品の加工処理によってDNAが断片化されたものであっても、高感度でカニをエビ及びその他の甲殻類と区別して検出することができる。
本発明のカニ検出用プライマーセットは、カニに共通する塩基と、カニに共通しかつエビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基とを含む領域の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する核酸分子にアニーリングし得るオリゴヌクレオチドから構成される。また、上記カニとエビ及びその他の甲殻類を確実に区別するために、そのオリゴヌクレオチドの3’末端から2番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入したことを特徴とする。
本明細書において「カニ」とは、日本標準商品分類[平成２年６月改訂：総務省統計局・政策統括官（統計基準担当）]に定められた「7135 かに類 (5)」に含まれること、また、系統分類学・形態的特長・市場流通性を考慮し、「短尾下目」と「異尾下目のタラバガニ科」に属するものをいう。異尾下目は、カニ以外に、ヤドカリ、アナジャコ、コシオリエビと称される甲殻類を含むが、これらの種は本明細書においてカニの範囲には含まない。また、本明細書において「エビ」とは、「根鰓亜目」、「コエビ下目」、「ザリガニ下目」、「イセエビ下目」に属するものをいう。
上記のような「カニに共通する塩基と、カニに共通しかつエビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基とを含む領域」は、上記のカニ、エビ、及びその他の甲殻類の16S rRNA遺伝子として知られている複数の塩基配列を整列（アラインメント）し、比較することにより特定することができる。具体的には、カニ、エビ、及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類由来の16S rRNA遺伝子の塩基配列を比較し、カニに共通する複数の塩基を含む部分であって、その共通する塩基の中にエビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基が含まれる領域を特定する。エビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基はプライマーの3’末端に置く。
アラインメントに用いる上記の複数の塩基配列のうち、公知の塩基配列としては、カニ、エビ、及びその他の甲殻類の16S rRNA遺伝子として知られているものであればいずれのものを用いてもよく、このような塩基配列はGenBank等のDNAデータベースを用いて検索し、入手することができる。また、データベースで公開されていないないものについては、サンプルを入手した上で、適宜設計したPCRプライマーを用いて塩基配列を解読して、情報を得ることができる。
塩基配列の整列（アラインメント）には、インターネットで公開されているアラインメントソフト（例えば、CLUSTALW，URL：http：//www．ddbj．nig．ac．jp/）を利用することができる。
次に、特定した領域にプライマーを設計する。プライマーの設計にあたっては、例えば「PCR法最前線−基礎技術から応用まで」（蛋白質・核酸・酵素 臨時増刊号1996年 共立出版株式会社）や「バイオ実験イラストレイテッド3本当に増えるPCR：細胞工学別紙 目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著1996年 株式会社秀潤社）、「PCRテクノロジー−DNA増幅の原理と応用−」（Henry A Erlich編、加藤邦之進 監修、宝酒造株式会社）等に基づいて設計すればよいが、加工食品からの検出の場合には、DNAが分解して短くなっている可能性が考えられ、このような観点から200bp以内の増幅産物を得ることができるプライマーを設計することが好ましい。
プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。
次に、上記で設計したプライマーに対して確実にカニをエビ及びその他の甲殻類と区別して検出するための特異性を付与するため、3’側塩基の改変を行う。上記のように「エビ及びその他の甲殻類と区別できる塩基」はプライマーの3’末端に設定されている。もし、プライマーの3’末端から２番目の塩基を標的とするカニやその近縁種（エビなど）の配列とは異なるミスマッチ塩基とすれば、カニのDNAに対してはプライマーの3’末端から２番目の１塩基のみがミスマッチとなるが、近縁種のDNAに対しては少なくとも3’末端から１番目と２番目の２塩基が連続してミスマッチすることになる。そうすることで、多少感度は低下しても、標的とするカニへの特異性が向上し、近縁種のDNAを誤って検出しないと考えた。この考え方に基づき、設計したプライマーのオリゴヌクレオチドの3’末端から２番目の塩基をミスマッチ塩基に置換した。
本発明のカニ検出用プライマーセットは、上記のようにして設計・改変された７種のオリゴヌクレオチドを含み、具体的には、一方のプライマーとして(a)配列番号１、２、３、４、５、６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物と、もう一方のプライマーとして、(b)配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される。
上記各配列番号に示す塩基配列は、以下のとおりである。
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号１）
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号２)
GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号３)
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号４）
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号５）
GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号６）
TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号７）
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号１）
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号２)
GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号３)
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号４）
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号５）
GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号６）
TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号７）
上記の(a)のオリゴヌクレオチドと（b）のオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットを用いてPCR増幅を行うと、試料にカニが含まれる場合は、カニ以外のエビ及びその他の甲殻類では認められないカニに特異的な増幅産物が得られる。従って、カニをエビ及びその他の甲殻類と区別して特異的に検出することができる。
上記のプライマーセットはキット化することもできる。本発明のキットは、上記プライマーセットを少なくとも含むものであればよく、必要に応じて、PCRの陽性コントロールとなる標的配列を含むDNA分子、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬（プライマーセットを除く）、SYBR Green等を用いたReal time PCR試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、説明書などを含んでいてもよい。
本発明によればまた、上記のプライマーセットを用いたカニの検出方法が提供される。 本方法は、試料より抽出したDNAを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRによる増幅産物の有無を指標として検出することを特徴とする。
試料としては、カニを含む可能性のある食品原料や製品、カニが混入する可能性のある食品原料や製品であればよく、特に制限されない。本発明の方法により得られた検出結果は、食品のアレルギー表示に利用できるほか、生産者の意図していない製造ラインにおけるコンタミネーションの有無の確認に利用できる。
試料からのDNAの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール/クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法などにより行うことができる。また、試薬メーカーより販売されている各種DNA抽出キットを用いても良い。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行うことが望ましい。
次に、上記の操作で得られたDNA試料を鋳型とし、前記のプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅産物の有無を検出する。PCR増幅は上記のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。PCR反応液の組成、PCR条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、前記のプライマーセットを用いたPCRにおいて高感度でPCR増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。例えば、全液量が25〜50μLとなる範囲で、鋳型となるDNA 50ng、PCR反応用緩衝液、フォワードプライマー0.2〜0.5μM、リバースプライマー0.2〜0.5μM、DNAポリメラーゼ（Taq ポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼなど）0.025U／μL、dNTP各200μMを混合し、94〜96℃ 10分×1サイクル、（94〜96℃ 30秒、52〜58℃ 30秒、72℃ 30秒）×40サイクル、72℃ 7分×1サイクルで反応を行う。これは一例にすぎず、PCR反応液の組成、反応温度や時間は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。これらPCRの一連の操作は、市販のPCRキットやPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
PCRにより目的の増幅断片が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、DNAハイブリダイゼーション、Real time PCR（end pointやdissociation curve解析を含む）等の公知の方法を用いて確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検出しようとするカニの16S rRNA遺伝子領域において両プライマーとプライマーに挟まれる領域の塩基数となる。例えば、上記のプライマーセットを用いた場合には、目的とする増幅断片のサイズは62bpである。一般的な加工食品においては、加工工程でDNAが断片化している可能性が高いが、PCR産物の長さが62bpであることから、加工度の高い食品においてもカニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別して検出することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）カニ検出用プライマーの合成
(1) 16S rRNA遺伝子領域のアラインメント
カニ（352配列）、エビ［根鰓亜目（69配列）、コエビ下目（201配列）、ザリガニ下目（221配列）、イセエビ下目（52配列）］、オキアミ（19配列）、アミ（18配列）、シャコ（15配列）について16S rRNAの遺伝子の塩基配列情報を取得した。塩基配列情報は、GenBankに登録された種についてはデータベースから取得し、購入した種についてはシークエンスにより16S rRNAの遺伝子の塩基配列を決定した。これらの塩基配列情報を元に、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用い、同領域の配列をアラインメントし、比較した。
（実施例１）カニ検出用プライマーの合成
(1) 16S rRNA遺伝子領域のアラインメント
カニ（352配列）、エビ［根鰓亜目（69配列）、コエビ下目（201配列）、ザリガニ下目（221配列）、イセエビ下目（52配列）］、オキアミ（19配列）、アミ（18配列）、シャコ（15配列）について16S rRNAの遺伝子の塩基配列情報を取得した。塩基配列情報は、GenBankに登録された種についてはデータベースから取得し、購入した種についてはシークエンスにより16S rRNAの遺伝子の塩基配列を決定した。これらの塩基配列情報を元に、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用い、同領域の配列をアラインメントし、比較した。
まず、カニに共通である塩基、カニに共通でエビ及びその他の甲殻類とは異なる塩基を選別したところ、カニとエビを一度に区別できる塩基は存在しなかった。そこで、エビを４つのグループ（根鰓亜目・コエビ下目・ザリガニ下目・イセエビ下目）に分けて、それぞれの配列とカニの配列を比較し、カニと区別できる塩基を改めて選別した。その結果、カニと根鰓亜目・ザリガニ下目を区別できる塩基、カニと根鰓亜目・コエビ下目・イセエビ下目を区別する塩基など複数の塩基を選別できた。次に、選別した塩基の前後の塩基配列がプライマー設計に適している領域を選択し、この領域の配列からプライマーを下記の基準で設計した。
＜設計基準＞
(a) 加工品を対象とすることからPCR増幅産物は200bp以下であることが望ましい。
(b) プライマーの3’側の塩基配列とテンプレートDNA配列との相同性は高いこと。
(c) プライマー長は20〜30baseの範囲とし、Tm値は50〜60℃間で設定すること。
(d) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこと。
(e) 広範囲のカニに結合するプライマーであること。
(a) 加工品を対象とすることからPCR増幅産物は200bp以下であることが望ましい。
(b) プライマーの3’側の塩基配列とテンプレートDNA配列との相同性は高いこと。
(c) プライマー長は20〜30baseの範囲とし、Tm値は50〜60℃間で設定すること。
(d) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこと。
(e) 広範囲のカニに結合するプライマーであること。
アラインメントによって選別した塩基と上記のプライマー設計基準に基づき、カニと根鰓亜目・ザリガニ下目を区別するフォワードプライマー４種（F8-1〜F8-4）とカニと根鰓亜目・コエビ下目・イセエビ下目を区別するリバースプライマー１種（R1214）を設計した。
F8-1：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAA（配列番号８）
F8-2：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAA（配列番号９）
F8-3：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAG（配列番号１０）
F8-4：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAG（配列番号１１）
R1214：TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAACT（配列番号１２）
F8-1：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAA（配列番号８）
F8-2：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAA（配列番号９）
F8-3：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAG（配列番号１０）
F8-4：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAG（配列番号１１）
R1214：TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAACT（配列番号１２）
設計した上記のフォワードプライマー４種の混合プライマーとリバースプライマー１種からなるプライマーセットを用いたPCRでは、カニで5pg DNAの感度が得られたが、ザリガニ下目やイセエビ下目のエビで増幅産物が確認された。これは、上記のフォワードプライマーの3’末端塩基（A）は、ザリガニ下目のエビ配列とはマッチしない塩基、また、上記のリバースプライマーの3’末端塩基（T）は、イセエビ下目のエビ配列とはマッチしない塩基が設定されているが、各プライマーはそれ以外の部位でエビ配列に結合し、伸長反応が起こり得るためと考えられた。
そこで、特異性の改善を行うために、上記のプライマーの3’側数塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入する手法（Pettersson M., Bylund M., Alderborn A. Molecular haplotype determination using allele-specific PCR and pyrosequencing technology. Genomics. 82, 390-396 (2003)）を用いてプライマー3’側数塩基の標的配列への結合選択性を高め、ザリガニ下目やイセエビ下目の増幅を抑えることを試みた。
具体的には、プライマーの3’末端から2番目の塩基にミスマッチ塩基を導入するために、置換塩基の種類を検討した結果、上記のフォワードプライマー（F8-1, F8-2, F8-3, F8-4）の3’末端から2番目の塩基「A」をミスマッチ塩基「T」に置換したプライマー（F8-1(mT), F8-2(mT), F8-3(mT), F8-4(mT)）に改変し、リバースプライマー(R1214)の3’末端から2番目の塩基「C」をミスマッチ塩基「G」に置換したプライマー(R1214(mG))に改変した。これらの改変プライマーを用いてPCRを行ったところ、アニーリング温度48℃、Mg濃度1.5mMの条件でもザリガニ下目やイセエビ下目の増幅が抑えられ、カニに対する特異性の向上が確認できた。一方、カニ検出の感度は5pg DNAから50〜500pg DNAに低下したため、感度向上のために、さらに、PCR条件（Mg濃度、アニーリング温度、プライマーの種類、および濃度）を検討した。
その結果、3'末端塩基が異なるためにF8-1(mT), F8-2(mT)と競合すると考えられたF8-3(mT), F8-4(mT)は除外し、また、いくつかのカニの種類の感度向上のために、F8-5,6,7,11を新たに追加し、その配列の3’末端から2番目の「A」を、ミスマッチ塩基「T」に置換して最終的に6種のオリゴヌクレオチド（F8-1(mT)：配列番号１）, F8-2(mT)：配列番号２), F8-5(mT)：配列番号３), F8-6(mT)：配列番号４), F8-7(mT)：配列番号５), F8-11(mT)：配列番号６)）と、R1214の3’末端から2番目の「C」をミスマッチ塩基「G」に置換した1種のオリゴヌクレオチド（R1214(mG) ：配列番号７）の計7種のオリゴヌクレオチドを本発明のカニ検出用プライマーとして決定した。
F8-1(mT)：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号１)
F8-2(mT)：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号２)
F8-5(mT)：GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号３)
F8-6(mT):GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号４)
F8-7(mT)：GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号５)
F8-11(mT)：GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号６)
R1214(mG)：TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号７）
F8-1(mT)：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号１)
F8-2(mT)：GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号２)
F8-5(mT)：GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号３)
F8-6(mT):GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号４)
F8-7(mT)：GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号５)
F8-11(mT)：GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号６)
R1214(mG)：TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号７）
(2) プライマーを用いたPCRシミュレーション
サンプルとして甲殻類（食用となるカニ、エビ、オキアミ、アミ、シャコおよび微少な甲殻類）、魚介類（頭足類、貝類、棘皮類、魚類）の16S rRNA遺伝子配列を対象とし、上記のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）を用い、Amplify simulatorによるPCRシミュレーションを行い、検出の有無を確認した。
サンプルとして甲殻類（食用となるカニ、エビ、オキアミ、アミ、シャコおよび微少な甲殻類）、魚介類（頭足類、貝類、棘皮類、魚類）の16S rRNA遺伝子配列を対象とし、上記のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）を用い、Amplify simulatorによるPCRシミュレーションを行い、検出の有無を確認した。
カニについては、食用カニとして収集した73配列からは標的産物が増幅されることが予想された。なお、食用とはならない小型のカニの一部には、上記プライマーセットのフォワードプライマーまたはリバースプライマーの3’末端塩基とは異なる塩基を持つ配列が報告されているものもあった（収集したカニ全352配列うちの10数配列）。このため、これら小型のカニの一部からは標的産物が得られないことが予想されたが、食用でないことや、その近縁種の配列にはプライマーの3’末端塩基とマッチしている種も存在し、標的産物が増幅されると予想されたことから、特に問題となることはないと考えられた。
エビについては、収集した約500配列のうち、その殆どの配列で増幅しないと予想されたが、コエビ下目、ザリガニ下目の数種で、イセエビ下目では、セミエビ科（後記実施例２で用いたウチワエビが属する）の近縁種で増幅が予想された。
オキアミ、アミは、フォワードプライマーが結合せず、フジツボ、カメノテではフォワード、リバースプライマーが結合しないと予想された。シャコについては、フォワード、リバースプライマーが結合し、標的産物が増幅されると予想された。その他微少な甲殻類として、アミの近縁種であるヨコエビ目、ワラジムシ目及びアゴアシ網、コノハエビ亜網、ミジンコ網、ムカシエビ上目、ムカデエビ綱、カイムシ綱、カシラエビ網などについては、プライマーの3’末端塩基が異なることやプライマー配列の相同性の点から、標的産物は増幅されないと予想された。
頭足類、貝類については、3’末端塩基が一致する種も存在するが、3’側の塩基配列の相同性が低いため、PCR シミュレーションでは増幅されないと予想された。念のため、頭足類、貝類は実際のサンプルを使用したPCRでも確認することとした。棘皮類（ウニ、ナマコ）は、フォワードプライマー、リバースプライマーともに3’末端塩基が一致せず、増幅しないと予想された。魚類は、フォワードプライマー、リバースプライマーともに3’末端塩基が一致せず、増幅しないと予想された。
（実施例２）プライマーの特異性及び感度評価（１）
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
(i) カニ(13種類)
短尾下目：ズワイガニ、ベニズワイガニ、タカアシガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、マルズワイガニ、ワタリガニ、シャンハイガニ、アサヒガニ
異尾下目・タラバガニ科：タラバガニ、アブラガニ、ハナサキガニ、イバラガニ
(ii) エビ(14種類)
根鰓亜目：クルマエビ、アカエビ、ブラックタイガー、シバエビ、サクラエビ
コエビ下目：シマエビ、アマエビ、ボタンエビ
ザリガニ下目：アメリカザリガニ、オマールエビ、スキャンピー
イセエビ下目：イセエビ、ウチワエビ、キューバロブスター
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類（3種類）
ツノナシオキアミ、イサザアミ、シャコ
(iv) 頭足類(4種類)
マダコ、アカイカ、ヤリイカ、スルメイカ
(v) 貝類（5種類）
アサリ、ハマグリ、ホタテ、サザエ、アワビ
(vi)魚類(7種類)
ブリ、サケ、タラ、サバ、カツオ、マグロ、アジ
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
(i) カニ(13種類)
短尾下目：ズワイガニ、ベニズワイガニ、タカアシガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、マルズワイガニ、ワタリガニ、シャンハイガニ、アサヒガニ
異尾下目・タラバガニ科：タラバガニ、アブラガニ、ハナサキガニ、イバラガニ
(ii) エビ(14種類)
根鰓亜目：クルマエビ、アカエビ、ブラックタイガー、シバエビ、サクラエビ
コエビ下目：シマエビ、アマエビ、ボタンエビ
ザリガニ下目：アメリカザリガニ、オマールエビ、スキャンピー
イセエビ下目：イセエビ、ウチワエビ、キューバロブスター
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類（3種類）
ツノナシオキアミ、イサザアミ、シャコ
(iv) 頭足類(4種類)
マダコ、アカイカ、ヤリイカ、スルメイカ
(v) 貝類（5種類）
アサリ、ハマグリ、ホタテ、サザエ、アワビ
(vi)魚類(7種類)
ブリ、サケ、タラ、サバ、カツオ、マグロ、アジ
[DNA抽出]
上記の各サンプルを水洗いした後、身(可食部）を0.1g秤量し、15mlチューブに入れ、Buffer G2（QIAGEN社製）2ml、Proteinase K（QIAGEN社製）100μl、100mg/ml RNaseA（QIAGEN社製）4μlを加え、混合し、50℃で2時間保温した（途中数回攪拌を行った）。 次に、遠心分離 (3500×g,15分間)を2回行い、上清を回収した。Buffer QBT 1mlで平衡化したGenomic Tip 20/Gカラム（QIAGEN社製）を15mlチューブにセットし、上清全量をアプライした。Buffer QC（QIAGEN社製）3mlでカラムを洗浄後、50℃に加温しておいたBuffer QF（QIAGEN社製）1mlでDNAを溶出し、イソプロパノール沈殿処理を行い、TE溶液50μlに溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。
上記の各サンプルを水洗いした後、身(可食部）を0.1g秤量し、15mlチューブに入れ、Buffer G2（QIAGEN社製）2ml、Proteinase K（QIAGEN社製）100μl、100mg/ml RNaseA（QIAGEN社製）4μlを加え、混合し、50℃で2時間保温した（途中数回攪拌を行った）。 次に、遠心分離 (3500×g,15分間)を2回行い、上清を回収した。Buffer QBT 1mlで平衡化したGenomic Tip 20/Gカラム（QIAGEN社製）を15mlチューブにセットし、上清全量をアプライした。Buffer QC（QIAGEN社製）3mlでカラムを洗浄後、50℃に加温しておいたBuffer QF（QIAGEN社製）1mlでDNAを溶出し、イソプロパノール沈殿処理を行い、TE溶液50μlに溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。
(2) プライマーの感度および特異性評価
上記のようにしてサンプルから抽出したDNAをTE（pH8.0）で20ng/μlに希釈して得られたDNA溶液、および、同DNA溶液を20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0)緩衝液で段階希釈し調製したDNA溶液2pg/μlをPCRのテンプレートとし、本発明のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）を用いてPCRを行った。なお、配列番号１と２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについては、3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号４と５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについても同様に3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。
上記のようにしてサンプルから抽出したDNAをTE（pH8.0）で20ng/μlに希釈して得られたDNA溶液、および、同DNA溶液を20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0)緩衝液で段階希釈し調製したDNA溶液2pg/μlをPCRのテンプレートとし、本発明のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）を用いてPCRを行った。なお、配列番号１と２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについては、3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号４と５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについても同様に3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。
PCR反応は、0.2mlチューブ、GeneAmp PCR System9700（Applied Biosytems社製）またはGeneAmp PCR System9600（PerkinElmer社製）を用い、下記表１のPCR反応液組成とPCR反応条件（条件Ａ、条件Ｂ）にて行った。
表中のDNAとしては、カニは2pg/μl DNA溶液を使用し、その他のサンプルは20ng/μl DNA溶液を使用した。カニの2pg/μl DNA溶液は、20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0) 緩衝液で段階希釈して調製した。また、表中の各試薬は、Applied Biosystems社製を使用した。
次に、PCR増幅産物を3％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図１に示す。本発明のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）によれば、条件Ａおよび条件Ｂのいずれの場合も、カニで62bpの標的増幅産物が確認でき、5pg DNAの感度が得られた（図１）。
一方、特異性については、試験したエビ、アミ、オキアミ等のその他の甲殻類、頭足類、貝類、魚類のいずれも増幅が見られず、特異性が確保された（図２）。ただし、オマールエビ、スキャンピーについては、50ng DNAの場合、PCR装置の違いによって検出される場合もあったが、仮に検出された場合も、5ng DNAでは検出されないことが確認できているため、実際の食品等の検査においては問題ないと考えられる。
また、セミエビはPCRシミュレーションでは増幅は予想されたが、セミエビ科に属するウチワエビは実際のPCRで、増幅されなかった。シャコについては、PCR シミュレーションでの予想通り、増幅してくることが確認された。しかしながら、シャコは加工品としての利用は少なく、従って、加工食品に混入することもほとんどないことから、PCRにおいてカニと混同される恐れは少なく、問題はないと考えられる。仮に製品へのシャコの混入を確認したい場合は、シャコを特異的に検出するプライマーセットを用いることで、有無を確認できる（後記実施例４参照）。
（実施例３）プライマーの特異性及び感度評価（２）
試験サンプルとして、下記のカニ６種、エビ５種及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類３種を用いた。
(i) カニ（5pg DNA）：ズワイガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、タラバガニ、マルズワイガニ、ワタリガニ
(ii) エビ（50ng DNA）：クルマエビ、ボタンエビ、オマールエビ、スキャンピー、イセエビ
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類（50ng DNA）：オキアミ、アミ、シャコ
試験サンプルとして、下記のカニ６種、エビ５種及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類３種を用いた。
(i) カニ（5pg DNA）：ズワイガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、タラバガニ、マルズワイガニ、ワタリガニ
(ii) エビ（50ng DNA）：クルマエビ、ボタンエビ、オマールエビ、スキャンピー、イセエビ
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類（50ng DNA）：オキアミ、アミ、シャコ
上記の各サンプルより実施例２と同様にしてDNAを抽出した。カニ以外のサンプルについては抽出したDNAをTE（pH8.0）で20ng/μlに希釈して調製したDNA溶液、カニについては同DNA溶液を20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0)緩衝液で段階希釈して調製した2pg/μlDNA溶液をそれぞれ2.5μl用いてPCRのテンプレートとし、本発明のカニ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー：配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット）にてPCRを行った。PCRは、プライマー濃度を0.25μMと0.5μM（ともに配列番号１，２：３：４，５：６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを２：１：２：１混合）とする以外は前記条件A、Bと同じ反応条件（アニーリング温度は54または56℃）および反応液組成にて実施した。添加するプライマー量の増減は滅菌水で調節した。
PCRを行った後、PCR増幅産物を3％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。結果を下記表２に示す。
本発明のカニ検出用プライマーセットによれば、実施例２と同様、カニ、シャコで陽性（＋）、エビ、オキアミ、アミで陰性（−）という結果が得られた。よって、フォワードプライマーの配合比を変更した場合も、カニの目標とする感度（5pg DNA）とカニ特異性が得られることが確認できた。また、プライマー濃度が高い場合、オマールエビ、スキャンピーDNAから僅かに増幅産物が検出された（±）が、実施例２の結果と差異はなかった。
（実施例４）シャコ検出用プライマーセット
前記実施例２、３の結果に示されるように、本発明のカニ検出用プライマーセットによれば、シャコ（50ng DNA）で陽性という結果が得られる。そこで、本発明のカニ検出用プライマーセットによって得られた陽性判定がシャコによるものではないかを確認する手段として、下記のシャコ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：F2-1とF2-2の等量混合プライマーとリバースプライマー：R54-1とR54-2の等量混合プライマー；増幅産物95bp）を作成した。なお、配列番号１３と１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー（F2-1とF2-2）については、3’末端から9塩基目をG/Cの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号１５と１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー（R54-1とR54-2）ついても同様に3’末端から15塩基目をC/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。シャコ検出プライマーセットを用いたPCRでは、シャコDNA 5pgを検出し、カニ(13種類)、エビ(14種類)、ツノナシオキアミ、イサザアミ、頭足類(4種類)、貝類（5種類）、魚類(7種類)を検出しないことを確認した。
F2-1：TTGTATGAATGGTCGGACAAGAT (配列番号１３）
F2-2：TTGTATGAATGGTCCGACAAGAT (配列番号１４）
R54-1：ATCGTCCCTCCATATCATTTAAGCTTTTTT (配列番号１５)
R54-2：ATCGTCCCTCCATATTATTTAAGCTTTTTT (配列番号１６)
前記実施例２、３の結果に示されるように、本発明のカニ検出用プライマーセットによれば、シャコ（50ng DNA）で陽性という結果が得られる。そこで、本発明のカニ検出用プライマーセットによって得られた陽性判定がシャコによるものではないかを確認する手段として、下記のシャコ検出用プライマーセット（フォワードプライマー：F2-1とF2-2の等量混合プライマーとリバースプライマー：R54-1とR54-2の等量混合プライマー；増幅産物95bp）を作成した。なお、配列番号１３と１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー（F2-1とF2-2）については、3’末端から9塩基目をG/Cの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号１５と１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー（R54-1とR54-2）ついても同様に3’末端から15塩基目をC/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。シャコ検出プライマーセットを用いたPCRでは、シャコDNA 5pgを検出し、カニ(13種類)、エビ(14種類)、ツノナシオキアミ、イサザアミ、頭足類(4種類)、貝類（5種類）、魚類(7種類)を検出しないことを確認した。
F2-1：TTGTATGAATGGTCGGACAAGAT (配列番号１３）
F2-2：TTGTATGAATGGTCCGACAAGAT (配列番号１４）
R54-1：ATCGTCCCTCCATATCATTTAAGCTTTTTT (配列番号１５)
R54-2：ATCGTCCCTCCATATTATTTAAGCTTTTTT (配列番号１６)
このシャコ検出用プライマーセットのシャコDNAに対する感度を、本発明のカニ検出用プライマーセットのシャコDNAに対する感度と同等の感度に合わせるためにPCRのサイクル数を検討し、感度の調整を行なった。
まず、本発明のカニ検出用プライマーセットのシャコDNAに対する感度を確認した。前記表１の条件A（アニーリング温度54℃、40サイクル）のPCRにおいて、シャコDNA 5pgから標的サイズの増幅産物が得られた。次に、サイクル数を45サイクルに変更して感度を確認したところ、シャコDNA 5pgは検出、500fgは不検出という結果が得られた（図３）。以上の結果から、本発明のカニ検出用プライマーセットでは45サイクルと同様に、40サイクルでもシャコDNA 5pgは検出、500fgは不検出であると推定された。
次に、上記シャコ検出用プライマーセットを用い、下記表３に示すPCR反応液組成とPCR反応条件（サイクル数X＝28、30、32、34サイクル）にてそれぞれPCRを行い、カニ検出用プライマーセットのシャコDNAに対する感度と同等の感度となるサイクル数を検討した。
その結果、30サイクルでシャコDNA 5pgは検出、500fgは不検出であった（図４）。また、カニ検出用プライマーセット、シャコ検出用プライマーセットの感度とPCRのサイクル数との関係を下記表４にまとめる。
以上の結果から、増幅産物のバンド強度には差があるが、検出するシャコDNA量で比較すると、カニ検出用プライマーセットを用いたPCRでサイクル数を40にした場合とシャコ検出用プライマーセットを用いたPCRでサイクル数を30にした場合とでは、シャコDNAに対する感度がほぼ同等となるといえる。
従って、シャコ検出用プライマーセットによるPCRをサイクル数30で行うことによって、本発明のカニ検出用プライマーセットで陽性判定となるレベルのシャコDNAが試料に含まれているかどうかを確認することが可能となる。そこで、シャコ検出法をカニ検出法と併用することで、カニ検出法による判定の精度を高めることができる。つまり、カニPCRが陽性でシャコPCRが陰性の場合はカニが含まれていることになる。仮に、カニPCRが陽性でシャコPCRも陽性の場合は、シャコは含まれていると言えるが、カニが含まれているかどうかの判断が難しいものになる。
（実施例５）市販製品の分析
上記のような懸念があることから、実際に市場の製品でシャコが含まれている製品がどの程度あるのかを確認するために、シャコの市販製品への混入リスク（本発明のカニ検出用プライマーセットで検出する量のシャコが混入しているかどうか）の検証を行った。
上記のような懸念があることから、実際に市場の製品でシャコが含まれている製品がどの程度あるのかを確認するために、シャコの市販製品への混入リスク（本発明のカニ検出用プライマーセットで検出する量のシャコが混入しているかどうか）の検証を行った。
使用原材料名にカニの表示がある製品8品と表示がない製品19品の計27品目について、
それぞれの製品から調製したDNA（50ng）をテンプレートとして、上記シャコ検出用プライマーセットまたはカニ検出用プライマーセットを用いてPCRを行った（30サイクル）。結果を表５に示す。カニ検出用プライマーセットを用いたPCRを「カニPCR」、シャコ検出用プライマーセットを用いたPCRを「シャコPCR」と表記する。
それぞれの製品から調製したDNA（50ng）をテンプレートとして、上記シャコ検出用プライマーセットまたはカニ検出用プライマーセットを用いてPCRを行った（30サイクル）。結果を表５に示す。カニ検出用プライマーセットを用いたPCRを「カニPCR」、シャコ検出用プライマーセットを用いたPCRを「シャコPCR」と表記する。
表５に示されるように、27製品すべてにおいてシャコの標的サイズの増幅産物は検出されなかったことから、市販製品へのシャコの混入リスクは低いことが予想され、本発明のカニ検出用プライマーセットによる陽性判定がシャコの混入によるものである可能性は実際上小さいと考えられる。
Claims (3)
- 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、カニ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号１、２、３、４、５、６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、62bpの長さを有する標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、カニの検出方法。
- 請求項１に記載のプライマーセットを含む、カニ検出用キット。
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