JP2009207486A - カニ検出用プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カニの16S rRNA遺伝子の塩基配列から設計したプライマーとなりうるオリゴヌクレオチドの3’末端から2番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入したオリゴヌクレオチドから構成される、カニ検出用プライマーセット。
【選択図】なし
Description
その選択した塩基の前後の塩基配列を含む領域から設計したプライマーの3’末端から2番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入した改変プライマーを用いたところ、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別して特異的かつ高感度で検出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
(1) 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、カニ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1、2、3、4、5、6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号7に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(2) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、62bpの長さを有する標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、カニの検出方法。
(3) (1)に記載のプライマーセットを含む、カニ検出用キット。
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号1)
GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号2)
GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号3)
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号4)
GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号5)
GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号6)
TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号7)
(実施例1)カニ検出用プライマーの合成
(1) 16S rRNA遺伝子領域のアラインメント
カニ(352配列)、エビ[根鰓亜目(69配列)、コエビ下目(201配列)、ザリガニ下目(221配列)、イセエビ下目(52配列)]、オキアミ(19配列)、アミ(18配列)、シャコ(15配列)について16S rRNAの遺伝子の塩基配列情報を取得した。塩基配列情報は、GenBankに登録された種についてはデータベースから取得し、購入した種についてはシークエンスにより16S rRNAの遺伝子の塩基配列を決定した。これらの塩基配列情報を元に、解析ソフトCLUSTAL X(1.8)、FROG-Win、SEQ-09を用い、同領域の配列をアラインメントし、比較した。
(a) 加工品を対象とすることからPCR増幅産物は200bp以下であることが望ましい。
(b) プライマーの3’側の塩基配列とテンプレートDNA配列との相同性は高いこと。
(c) プライマー長は20〜30baseの範囲とし、Tm値は50〜60℃間で設定すること。
(d) プライマーはダイマーや立体構造を形成しないこと。
(e) 広範囲のカニに結合するプライマーであること。
F8-1:GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAA(配列番号8)
F8-2:GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAA(配列番号9)
F8-3:GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGAG(配列番号10)
F8-4:GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGAG(配列番号11)
R1214:TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAACT(配列番号12)
F8-1(mT):GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCATATCGTA (配列番号1)
F8-2(mT):GCGTTATTTTTTTTGAGAGTTCTTATCGTA (配列番号2)
F8-5(mT):GCGTAATTTTTTCTGAGAGTTCTTATCATA (配列番号3)
F8-6(mT):GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACATATCGTA (配列番号4)
F8-7(mT):GCGTTATTTTTTTTAAGAGTACTTATCGTA (配列番号5)
F8-11(mT):GCGTTATTTCTTTTGAGAGCTCATATCGTA (配列番号6)
R1214(mG):TTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAAGT (配列番号7)
サンプルとして甲殻類(食用となるカニ、エビ、オキアミ、アミ、シャコおよび微少な甲殻類)、魚介類(頭足類、貝類、棘皮類、魚類)の16S rRNA遺伝子配列を対象とし、上記のカニ検出用プライマーセット(フォワードプライマー:配列番号1〜6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー:配列番号7に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット)を用い、Amplify simulatorによるPCRシミュレーションを行い、検出の有無を確認した。
(1) PCRテンプレートDNAの抽出
[サンプル]
(i) カニ(13種類)
短尾下目:ズワイガニ、ベニズワイガニ、タカアシガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、マルズワイガニ、ワタリガニ、シャンハイガニ、アサヒガニ
異尾下目・タラバガニ科:タラバガニ、アブラガニ、ハナサキガニ、イバラガニ
(ii) エビ(14種類)
根鰓亜目:クルマエビ、アカエビ、ブラックタイガー、シバエビ、サクラエビ
コエビ下目:シマエビ、アマエビ、ボタンエビ
ザリガニ下目:アメリカザリガニ、オマールエビ、スキャンピー
イセエビ下目:イセエビ、ウチワエビ、キューバロブスター
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類(3種類)
ツノナシオキアミ、イサザアミ、シャコ
(iv) 頭足類(4種類)
マダコ、アカイカ、ヤリイカ、スルメイカ
(v) 貝類(5種類)
アサリ、ハマグリ、ホタテ、サザエ、アワビ
(vi)魚類(7種類)
ブリ、サケ、タラ、サバ、カツオ、マグロ、アジ
上記の各サンプルを水洗いした後、身(可食部)を0.1g秤量し、15mlチューブに入れ、Buffer G2(QIAGEN社製)2ml、Proteinase K(QIAGEN社製)100μl、100mg/ml RNaseA(QIAGEN社製)4μlを加え、混合し、50℃で2時間保温した(途中数回攪拌を行った)。 次に、遠心分離 (3500×g,15分間)を2回行い、上清を回収した。Buffer QBT 1mlで平衡化したGenomic Tip 20/Gカラム(QIAGEN社製)を15mlチューブにセットし、上清全量をアプライした。Buffer QC(QIAGEN社製)3mlでカラムを洗浄後、50℃に加温しておいたBuffer QF(QIAGEN社製)1mlでDNAを溶出し、イソプロパノール沈殿処理を行い、TE溶液50μlに溶解した。抽出したDNAはND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies,Inc)でスペクトルを測定し、DNA濃度、純度を算出した。
上記のようにしてサンプルから抽出したDNAをTE(pH8.0)で20ng/μlに希釈して得られたDNA溶液、および、同DNA溶液を20ng/μlサケ精子DNA含有TE (pH 8.0)緩衝液で段階希釈し調製したDNA溶液2pg/μlをPCRのテンプレートとし、本発明のカニ検出用プライマーセット(フォワードプライマー:配列番号1〜6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合プライマーとリバースプライマー:配列番号7に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのセット)を用いてPCRを行った。なお、配列番号1と2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについては、3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号4と5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマーについても同様に3’末端から8塩基目をA/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。
試験サンプルとして、下記のカニ6種、エビ5種及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類3種を用いた。
(i) カニ(5pg DNA):ズワイガニ、ケガニ、ダンジネスクラブ、タラバガニ、マルズワイガニ、ワタリガニ
(ii) エビ(50ng DNA):クルマエビ、ボタンエビ、オマールエビ、スキャンピー、イセエビ
(iii) アミ、オキアミ等のその他の甲殻類(50ng DNA):オキアミ、アミ、シャコ
前記実施例2、3の結果に示されるように、本発明のカニ検出用プライマーセットによれば、シャコ(50ng DNA)で陽性という結果が得られる。そこで、本発明のカニ検出用プライマーセットによって得られた陽性判定がシャコによるものではないかを確認する手段として、下記のシャコ検出用プライマーセット(フォワードプライマー:F2-1とF2-2の等量混合プライマーとリバースプライマー:R54-1とR54-2の等量混合プライマー;増幅産物95bp)を作成した。なお、配列番号13と14に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー(F2-1とF2-2)については、3’末端から9塩基目をG/Cの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。配列番号15と16に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー(R54-1とR54-2)ついても同様に3’末端から15塩基目をC/Tの混合塩基に指定した一本のプライマーとして合成した。シャコ検出プライマーセットを用いたPCRでは、シャコDNA 5pgを検出し、カニ(13種類)、エビ(14種類)、ツノナシオキアミ、イサザアミ、頭足類(4種類)、貝類(5種類)、魚類(7種類)を検出しないことを確認した。
F2-1:TTGTATGAATGGTCGGACAAGAT (配列番号13)
F2-2:TTGTATGAATGGTCCGACAAGAT (配列番号14)
R54-1:ATCGTCCCTCCATATCATTTAAGCTTTTTT (配列番号15)
R54-2:ATCGTCCCTCCATATTATTTAAGCTTTTTT (配列番号16)
上記のような懸念があることから、実際に市場の製品でシャコが含まれている製品がどの程度あるのかを確認するために、シャコの市販製品への混入リスク(本発明のカニ検出用プライマーセットで検出する量のシャコが混入しているかどうか)の検証を行った。
それぞれの製品から調製したDNA(50ng)をテンプレートとして、上記シャコ検出用プライマーセットまたはカニ検出用プライマーセットを用いてPCRを行った(30サイクル)。結果を表5に示す。カニ検出用プライマーセットを用いたPCRを「カニPCR」、シャコ検出用プライマーセットを用いたPCRを「シャコPCR」と表記する。
Claims (3)
- 以下の(a)のオリゴヌクレオチドと、(b)のオリゴヌクレオチドとから構成される、カニ検出用プライマーセット。
(a) 配列番号1、2、3、4、5、6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物
(b) 配列番号7に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 試料より抽出したDNAを鋳型とし、請求項1に記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、62bpの長さを有する標的サイズの増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、カニの検出方法。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む、カニ検出用キット。
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JP2011092141A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Tokyo Univ Of Marine Science & Technology | エビ類検出用プライマーセット |
CN106755518A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-05-31 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种梭子蟹肌孢虫实时定量pcr检测试剂盒 |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006280281A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Nissin Food Prod Co Ltd | プライマー及び特定動物の検出方法 |
JP2008000128A (ja) * | 2006-01-12 | 2008-01-10 | House Foods Corp | エビ検出用プライマーセット |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006280281A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Nissin Food Prod Co Ltd | プライマー及び特定動物の検出方法 |
JP2008000128A (ja) * | 2006-01-12 | 2008-01-10 | House Foods Corp | エビ検出用プライマーセット |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011092141A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Tokyo Univ Of Marine Science & Technology | エビ類検出用プライマーセット |
CN106755518A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-05-31 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种梭子蟹肌孢虫实时定量pcr检测试剂盒 |
CN110724749A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-01-24 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c104及其应用 |
CN112080567A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-12-15 | 河北大学 | 三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用 |
CN112080567B (zh) * | 2020-08-25 | 2022-12-06 | 河北大学 | 三疣梭子蟹不同体重群体的微卫星标记及在遗传多样性分析中的应用 |
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