JP2006280281A - プライマー及び特定動物の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】サバ検出に好適である特定の配列からなるプライマーセット、サケ検出に好適である特定の配列からなるプライマーセット、アワビ検出に好適である特定の配列からなるプライマーセット、イカ検出に好適である特定の配列からなるプライマーセット、エビ又は/及びカニ検出に好適である特定の配列からなるプライマーセットを提供する。
【選択図】図1
Description
アレルギーを起こす恐れのある食品原料、特にアレルギー原因動植物は、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらにアレルギー原因動植物が混入されているか否かの品質管理を行うことが重要となる。
「特定原材料」である小麦、そば、卵、乳及び、落花生の検出法としては、ELISA法、ウェスタンブロッド法あるいはPCR法を用いた方法が確立されており、当該検出法は、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている(厚生労働省医薬局食品保健部長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成14年11月06日、食発第1106001号)。一方、「特定原材料に準ずるもの」に対する検出法は、鶏肉、豚肉、牛肉において報告されているが(特開2003-230383号「牛、豚、鶏検出用プライマー」)(Meyer R., C. Hofelein, J. Luthy, and U. Candrian; Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food; Journal of AOAC International, 78: 1542-1551, 1995)(松永孝光、柴田清弘、山田順一、新村裕、マルチプレックスPCR法による食肉及び食肉製品の肉種鑑別、日本食品科学工学会誌、第46巻、p. 187-194、1999)、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバ、いくら、ゼラチン、オレンジ、キウイフルーツ、くるみ、大豆、まつたけ、もも、やまいも、りんご、及びバナナにおいては、明確な報告はない。これらの検出法が定かでない「特定原材料に準ずるもの」に相当する特定動植物の混入の有無に関して、科学的な検証をもって品質管理を行うことは、現在、困難な状況にある。
上述のチトクロームb遺伝子検出PCRプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
CytB5(F): AAAATCGCTAATGACGCACTAGTCGA(配列番号11)
CytB6(R): GCAGACAGAGGAAAAAGCTGTTGA(配列番号12)
これは、サケ科サケ属、サルモ属以外に(サケ属、サルモ属以外は厚生労働省の「特定原材料に準ずるもの」に含まれない。)、サケ科イワナ属(イワナ)、サケ科グレイリング属(カワヒメマス)、ウナギ科ウナギ属(ウナギ)、マアナゴ科クロアナゴ属(マアナゴ)をも検出すると予想される。
また、上述のコントロール領域配列(D-loop)検出PCRプライマーの塩基配列は次の通りである。
Smc1(F): AATGTAGTAAGAACCGACCAA(配列番号13)
Smc2(R): TAGGAACCAAATGCCAGGAAT(配列番号14)
これは、サケ科サケ属、サルモ属以外に、サケ科イワナ属(イワナ)、 フエダイ科フエダイ属(フエダイの仲間)、サバ科サバ属(タイイヨウマサバ)をも検出すると予想される。サケ科サケ属、サルモ属以外に、サケ科イワナ属(イワナ)をも検出すると予想される。
Smc3(F): ACTTGGATATCAAGTGCATAAGGT(配列番号15)
Smc4(R):CCTGGTTTAGGGGTTTAACAGG(配列番号16)
これは、サケ科サケ属、サルモ属以外に、サケ科イワナ属(イワナ)をも検出すると予想される。
さらに、上述のコントロール領域配列(D-loop)検出PCRプライマーのさらに別の塩基配列は次の通りである。
Smc7(F): AACCCCTAAACCAGGAAGTCTCAA(配列番号17)
Smc8(R): CGTCTTAACAGCTTCAGTGTTATGCT(配列番号18)
これは、サケ科サケ属、サルモ属以外に、サケ科イワナ属(イワナ)をも検出すると予想される。
また、頭足類(イカやタコの仲間)の種を同定あるいは推定する方法として、ミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼIII遺伝子配列や同じくチトクロームオキシダーゼII遺伝子配列を標的としたPCRプライマーによって増幅されたDNA塩基配列を公知の塩基配列と比較する方法も報告されている(非特許文献2)。この方法で使用されているPCRプライマーは、主成分が頭足類である試料から抽出されたDNAを増幅させることは可能であるが、その他の生物に対する当該PCRプライマーの交差反応性、すなわち、検出特異性の記載は無く、さらに、食品のように複数の動植物を含む試料中の頭足類DNAを特異的に検出できるという記載もなされていない。それ故に、複数の動植物を含む食品中の頭足類DNAを特異的に検出する方法としては、十分に検証された方法ではない。
上述のチトクロームオキシダーゼIII遺伝子検出PC Rプライマーの塩基配列は次の通りである。
COIII1プライマー: AGCCCATGACCTTTAACAGG(配列番号19)
COIII2プライマー: GACTACATCAACAAAATGTCAGTATCA (配列番号20)
これは、イカやタコ類以外に、ヒト、ハエの仲間、タイセイヨウマサバ、エビ類などをも検出すると予想される。
また、上述のチトクロームオキシダーゼII遺伝子検出PCRプライマーの塩基配列は次の通りである。
COII1: ATTGCTCTGCCTTCACTACG(配列番号21)
COII2: CAAATTTCTGAGCATTGACC(配列番号22)
これは、イカやタコ類以外に、ヒト、ハエの仲間、タイセイヨウマサバ、エビ類などをも検出すると予想される。
上述のサバ属検出用PCRプライマーの塩基配列は以下の通りである。
SABA-S: CCGGGTACCCAACTCTCC(配列番号23)
SABA-AS: CACCGCTAAGAGTTGTCACAGT(配列番号24)
これは、サバ(属)以外に、ズズキ目のケツギョ(Siniperca chuatsi)をも検出すると予想される。
即ち、本発明は、以下の特定動物検出用PCRプライマーセット、特定動物検出法、並びに、特定動物検出用キットに関与する。
項1. 下記の(1)〜(20)のいずれかのPCRプライマー。
(1) 配列表の配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(2) 配列表の配列番号2における塩基番号10〜24の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(3) 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(4) 配列表の配列番号4における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(5) 配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(6) 配列表の配列番号6における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(7) 配列表の配列番号7における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPC Rプライマー
(8) 配列表の配列番号8における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(9) 配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(10) 配列表の配列番号10における塩基番号6〜20の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(11) 配列表の配列番号1の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(12) 配列表の配列番号2の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(13) 配列表の配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(14) 配列表の配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(15) 配列表の配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(16) 配列表の配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(17) 配列表の配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(18) 配列表の配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(19) 配列表の配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(20) 配列表の配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
項2. 配列表の配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項3. 配列表の配列番号2における塩基番号10〜24の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項4. 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項5. 配列表の配列番号4における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項6. 配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項7. 配列表の配列番号6における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項8. 配列表の配列番号7における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項9. 配列表の配列番号8における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項10. 配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項1 1. 配列表の配列番号10における塩基番号6〜20の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項12. 配列表の配列番号1の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項13. 配列表の配列番号2の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項14. 配列表の配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項15. 配列表の配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDN AからなるPCRプライマー。
項16. 配列表の配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項17. 配列表の配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項18. 配列表の配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項19. 配列表の配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項20. 配列表の配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項21. 配列表の配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
項22. 下記の(21)〜(30)のいずれかのプライマーセット。
(21) 項2記載のプライマーと項3記載のプライマーとからなるプライマーセット
(22) 項4記載のプライマーと項5記載のプライマーとからなるプライマーセット
(23) 項6記載のプライマーと項7記載のプライマーとからなるプライマーセット
(24) 項8記載のプライマーと項9記載のプライマーとからなるプライマーセット
(25) 項10記載のプライマーと項11記載のプライマーとからなるプライマーセット
(26) 項12記載のプライマーと項13記載のプライマーとからなるプライマーセット
(27) 項14記載のプライマーと項15記載のプライマーとからなるプライマーセット
(28) 項16記載のプライマーと項17記載のプライマーとからなるプライマーセット
(29) 項18記載のプライマーと項19記載のプライマーとからなるプライマーセット
(30) 項20記載のプライマーと項21記載のプライマーとからなるプライマーセット
項23. 項2記載のプライマーと項3記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項24. 項4記載のプライマーと項5記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項25. 項6記載のプライマーと項7記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項26. 項8記載のプライマーと項9記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項27. 項10記載のプライマーと項11記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項28. 項12記載のプライマーと項13記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項29. 項14記載のプライマーと項15記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項30. 項16記載のプライマーと項17記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項31. 項18記載のプライマーと項19記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項32. 項20記載のプライマーと項21記載のプライマーとからなるプライマーセット。
項33. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、項23〜32のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に特定動物が存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
項34. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として項23又は28記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にサバが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
項35. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として項24又は29記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にサケが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
項36. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として項25又は30記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にアワビが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
項37. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として項26又は31記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にイカが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
項38. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として項27又は32記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にエビ又は/及びカニが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
本発明における、エビ・カニグループ検出用PCRプライマーを用いた検査法で陽性反応が生じた場合、エビもしくはカニ、あるいは双方の存在を示すことになるが、このときに、PCR増幅産物の塩基配列を解析することによって、双方の存在比率を定性的に予測することも可能である。
特定動物検出用PCRプライマーセット
本発明の特定動物検出用PCRプライマーセットには、サバに特徴的な塩基配列を有するもの、サケに特徴的な塩基配列を有するもの、アワビに特徴的な塩基配列を有するもの、イカに特徴的な塩基配列するもの、並びに、エビ及びカニからなるグループに特徴的な塩基配列を有するものがある。
サバ検出用PCRプライマーセット及びサケ検出用PCRプライマーセットは、各種生物のミトコンドリアのチトクロームb遺伝子配列を既知のDNAデータベース(GenBank nucleotide sequence database)から取得あるいは、一部の生物の当該遺伝子配列を独自に解析することによって取得し、それらの厖大な塩基配列の多重並列配列図を作成後、詳細に比較検討することによって、サバ及びサケのそれぞれに特異的な当該遺伝子配列領域を選出し、その領域から新規に設計された。設計の際には、検出目的とする生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
アワビ検出用PCRプライマーセット、イカ検出用PCRプライマーセット及び、エビ・カニグループ検出用PCRプライマーセットは、各種生物のミトコンドリアの16S rRNA遺伝子を既知のDNAデータベースから取得あるいは、一部の生物の当該遺伝子配列を独自に解析することによって取得し、それらの厖大な塩基配列の多重並列配列図を作成後、詳細に比較検討することによって、アワビ、イカ、エビ、カニのそれぞれに特異的な当該遺伝子配列領域を選出し、その領域から新規に設計された。設計の際には、検出目的とする生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
本発明の特定動物検出用PCRプライマーセットを用いたPCR分析では、対象となる試料が加工品である場合も想定される。加工品を分析する場合、DNAが分解または、断片化している可能性があるので、100〜500 bp 程度の短めのPCR増幅産物を形成するようなPCRプライマーが、高感度分析のために好ましい。それ故に、PCRプライマーの設計の際には、PCR増幅産物の長さが500 bp以下となるように創意工夫して設計した。また、これらのPCRプライマーセットの反応液を同一条件にすることは、実際の分析において、操作の煩雑性を軽減できる。それ故に、PCR反応液組成において、PCRの反応性を最も左右するマグネシウム濃度が同一になるように、具体的には2.5 mM Mg2+となるように創意工夫して、PCRプライマーを設計した。さらに、各々のPCRプライマーセットを設計する際には、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するように工夫を施した。
従って、本発明の特定動物検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれるサバ、サケ、アワビあるいは、イカ、並びに、エビ・カニグループ由来DNAを高感度かつ特異的に検出することができる。
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
本発明が提供する第1〜第10のプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
配列番号1(サバS):CTGATGTTGAGTCAGCATTCGA(22 mer)
配列番号2(サバAS):GAATAGCAGGTGAAGAATTGTTGC(24 mer)
配列番号3(サケS):AACAGCTTTTTCCTCTGTnTG(21 mer)
(配列番号3において、nはC又はTを表す。)
但し、配列番号3のCのものとTのものとはミックスプライマーとして用いる。以下、全て同様である。
配列番号4(サケAS):AGCCTACGAATGCAGTTATTATAGTG(26 mer)
配列番号5(アワビS):CTTCTAAGTGAAAAGGCTTAGATTT(25 mer)
配列番号6(アワビAS):CACTTGTTAGTAAACCAAAATTCTAC(26 mer)
配列番号7(イカS):GAATGAATGGTTTGACGAAGG(21 mer)
配列番号8(イカAS):GCTTCTGCACCCTAAGGTTAC(21 mer)
配列番号9(エビ・カニS):GGACGATAAGACCCTATAA(19 mer)
配列番号10(エビ・カニAS):ATAACGCTGTTATCCCTAAA(20 mer)
また、本発明の30塩基のDNAからなるプライマーとして、例えば以下のプライマーを挙げることができる。
配列番号25(サバS):ctacacccCTGATGTTGAGTCAGCATTCGA
配列番号26(サバAS):atgtagGAATAGCAGGTGAAGAATTGTTGC
配列番号27(サケS):cgacatttcAACAGCTTTTTCCTCTGTnTG
(配列番号27において、nはC又はTを表す。)
但し、配列番号27において、CのものとTのものとはミックスプライマーとして用いる。以下、全て同様である。
配列番号28(サケAS):acgtAGCCTACGAATGCAGTTATTATAGTG
配列番号29(アワビS):attaaCTTCTAAGTGAAAAGGCTTAGATTT
配列番号30(アワビAS)
:ggatCACTTGTTAGTAAACCAAAATTCTAC
配列番号31(イカS):
ttgaggctaGAATGAATGGTTTGACGAAGG
配列番号32(イカAS):nnnnntaaaGCTTCTGCACCCTAAGGTTAC
(配列番号32において、nは任意のヌクレオチドを表す。)
なお、配列番号32において、具体例として下記配列番号33を例示できる。これはヤリイカの塩基配列を基にして設計したものである。
配列番号33(ヤリイカAS):
cctattaaaGCTTCTGCACCCTAAGGTTAC
配列番号34(エビ・カニS):
nnnnnnnnnnnGGACGATAAGACCCTATAA
(配列番号34において、nは任意のヌクレオチドを表す。)
なお、配列番号34において、具体例として下記配列番号36を例示できる。これはブラックタイガーエビの塩基配列を基にして設計したものである。
配列番号35(エビ・カニAS):
nnnnnnnnnnATAACGCTGTTATCCCTAAA
(配列番号35において、nは任意のヌクレオチドを表す。)
なお、配列番号35において、具体例として下記配列番号37を例示できる。これはブラックタイガーエビの塩基配列を基にして設計したものである。
配列番号36(ブラックタイガーエビS):
atactttaaggGGACGATAAGACCCTATAA
配列番号37(ブラックタイガーエビAS):
ctcaaagaagATAACGCTGTTATCCCTAAA
本発明は、まず第1のプライマーとして、配列表の配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとして提案する。次に、第2のプライマーとして、配列表の配列番号2における塩基番号10〜24の塩基配列を3'末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるサバ検出用PCRプライマーをアンチセンスプライマーとして提案する。第1及び第2のプライマーはサバ検出用に好適に使用できる。
これら第1のプライマーと第2のプライマーのセットは、PCRに供されることにより、双方ともサバのミトコンドリアのチトクロームb遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来ミトコンドリアのチトクロームb遺伝子を検出可能に増幅しないので、サバDNAを検出するためのPCR用プライマーセットとして使用できる。また、当該第1のプライマーと第2のプライマーをセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
これら第3のプライマーと第4のプライマーとのセットは、PCRに供されることにより、双方ともサケのミトコンドリアのチトクロームb遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来ミトコンドリアのチトクロームb遺伝子を検出可能に増幅しないので、サケDNAを検出するためのPCR用プライマーとして使用できる。また、当該第3のプライマーと第4のプライマーをセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
第3のプライマーは、配列番号3の塩基番号19がCであるものとTであるものの双方を包含する。サケの検出にあたっては、センスプライマーとして、この双方をミックスプライマーとして用いることにより、サケ(サケ属、サルモ属)を特異的に検出することができる。
また、第3のプライマーの好ましい態様である30塩基のプライマーにおいて、配列番号27の塩基番号28がCであるものとTであるものの双方を包含する。サケの検出にあたっては、センスプライマーとして、この双方をミックスプライマーとして用いることにより、サケ(サケ属、サルモ属)を特異的に検出することができる。
これら第5のプライマーと第6のプライマーのセットは、PCRに供されることにより、双方ともアワビのミトコンドリアの16S rRNA遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来ミトコンドリアの16S rRNA遺伝子を検出可能に増幅しないので、アワビDNAを検出するためのPCR用プライマーとして使用できる。また、当該第5のプライマーと第6のプライマーをセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
これら第7のプライマーと第8のプライマーのセットは、PCRに供されることにより、双方ともイカのミトコンドリアの16S rRNA遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来ミトコンドリアの16S rRNA遺伝子を検出可能に増幅しないので、イカDNAを検出するためのPCR用プライマーとして使用できる。また、当該第7のプライマーと第8のプライマーをセットとすることで、高感度に当該DNAを検出することができる。
これら第9のプライマーと第10のプライマーのセットは、PCRに供されることにより、双方ともエビ・カニグループのミトコンドリアの16S rRNA遺伝子に特異的に結合するが、その他の生物由来ミトコンドリアの16S rRNA遺伝子を検出可能に増幅しないので、エビ・カニグループを検出するためのPCR用プライマーとして使用できる。また、当該第9のプライマーと第10のプライマーをセットとすることで、より高感度に当該DNAを検出することができる。
また、第3のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(3')(最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー)、第4のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(4')(最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー)を提案する。これらのプライマーはサケ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。
また、第5のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(5')(最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー)、第6のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(6')(最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー)を提案する。これらのプライマーはアワビ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。
また、第7のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(7')(最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー)、第8のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(8')(最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー)を提案する。これらのプライマーはイカ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。
また、第9のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(9')(最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー)、第10のプライマーの好ましい態様として、配列表の配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマー(10')(最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー)を提案する。これらのプライマーはエビ・カニグループ検出用に好適に使用できる。当該各プライマーにおいても、それぞれをプライマーセットとして使用することが好ましく、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。
特定動物検出法
本発明の特定動物検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にサバ、サケ、アワビ、イカ、又は、エビ若しくは/及びカニ(エビ・カニグループ)が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
即ち、上記本発明の特定動物検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の特定動物を特異的に検出することが可能となる。このとき、サバを検出する場合には、サバ検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にサケ、アワビ、イカ、エビ・カニグループを検出する場合には、それぞれサケ検出用PCRプライマーセット、アワビ検出用PCRプライマーセット、イカ検出用PCRプライマーセット、エビ・カニグループ検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。また、本発明の、エビ・カニグループ検出用PCRプライマーセットを用いた検査で陽性反応を生じた場合、エビもしくはカニ、あるいは双方の存在を示すことになるが、このとき、PCR増幅産物の塩基配列を解析することによって、双方の存在比率を定性的に予測することも可能である。
PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の特定動物検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。さらに、PCR後に、PCR増幅産物の融解曲線分析を行い、その分析からPCR増幅産物の融解温度(Tm)値を導くことにより、PCR増幅産物が目的の増幅産物であるか否かを確認できる。状況によっては、このTm値による判断が困難な場合も想定されるが、そのような場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。
具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約89.6℃であり、PCR増幅産物のサイズは約428 bpである。融解曲線分析において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にサバが存在していたことを示唆する。
また、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約86.7℃であり、PCR増幅産物のサイズは約212 bpである。融解曲線分析において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にサケが存在していたことを示唆する。
また、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約83.9℃であり、PCR増幅産物のサイズは約189 bpである。融解曲線分析において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にアワビが存在していたことを示唆する。
また、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約81.8℃であり、PCR増幅産物のサイズは約359 bpである。融解曲線分析において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にイカが存在していたことを示唆する。
また、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のTm値は約77〜79℃であり、PCR増幅産物のサイズは約211 bpである。融解曲線分析において、当該Tm値を得た場合、又は、アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にエビもしくはカニが存在していたことを示唆する。
例えば、被験試料としては、食品原料や食品等が挙げられる。具体的に、食品原料としては、特定動物を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される特定動物を意図的に含まない食品原料が挙げられる。食品としては、ふりかけ、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した食肉具材や魚肉具材、菓子類、あるいは、これらの加工製品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、特定動物を取り扱う食品製造工場において、別途生産される特定動物を意図的に含まない食品が挙げられる。また、特定動物を含む加工製品を製造後、特定動物を含まない加工製品を製造する際には、特定動物残渣の除去を念頭においた加工製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性ならびに、製造設備の特定動物残渣の有無を確認するために、製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。
特定動物検出用キット
本発明は、また、特定動物検出キットに関する。当該キットは、上記本発明の特定動物検出用PCRプライマーセットの少なくとも1セットを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
具体的には、配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号2における塩基番号10〜24の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号6における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号7における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号8における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;及び配列番号9における5〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号10における塩基番号6〜20の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセットの1セット以上を含む特定動物検出キットが挙げられる。
そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号2の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセット;及び配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーと、配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるプライマーとのセットの1セット以上を含む特定動物検出キットが挙げられる。
中でも特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号2の塩基配列からなるプライマーとのセット;配列番号3の塩基配列からなるプライマーと配列番号4の塩基配列からなるプライマーとのセット;配列番号5の塩基配列からなるプライマーと配列番号6の塩基配列からなるプライマーとのセット;配列番号7の塩基配列からなるプライマーと配列番号8の塩基配列からなるプライマーとのセット;及び配列番号9の塩基配列からなるプライマーと配列番号10の塩基配列からなるプライマーとのセットの1セット以上を含む特定動物検出キットが挙げられる。
また、上記の各々のプライマーセット及び、当該の各々のプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物を検出するためのプローブ等を含む特定動物検出キットなども挙げられる。
当該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
実施例
以下に、本発明を実施例または試験例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
実施例1
各種動物、植物、真菌及び、細菌由来DNAに対する特定動物用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の特定動物用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
コムギ、トウモロコシ及び、ダイズの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社(BioChain Institute, Inc., USA)から購入したものを使用した。
マサバ、ゴマサバ、タイセイヨウサバ、キハダマグロ、カツオ、ブリ、ベニザケ、サケ(シロザケ)、ギンザケ、カラフトマス、スチールヘッド(ニジマス)、スルメイカ、モンゴウイカ、ヤリイカ、ミズダコ、ホタテガイ、サザエ、エゾアワビ、トコブシ、ハマグリ、アサリ、ベニズワイガニ、タラバガニ、ブラックタイガーエビ、シバエビ、アマエビ(ホッコクアカエビ)及び、シロエビの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の(筋)肉質部分を凍結後、マルチビーズショッカー(安井器械、大阪)で破砕した試料からNuc leon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits(Amersham Biosciences Corp., USA)または、DNA Extraction IsoplantII kit(Nippon Gene Co. Ltd., Japan)を用いて調製したものを使用した。
オキアミ類(未同定種)の精製DNAは、商店から購入した試料をTBS緩衝液(150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl[pH 7.5])で洗浄後、マルチビーズショッカーで破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調製したものを使用した。
クロゴキブリの精製DNAは、その脚の部分を70%エタノールで洗浄し、さらに、TBS緩衝液で洗浄後、マルチビーズショッカーで粉砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits)を用いて調製したものを使用した。
イネ(葉)は栽培農家から入手し、ネギは商店から購入した。これらの精製DNAは、植物体を70%エタノールで洗浄し、さらに、TBS緩衝液で洗浄後、マルチビーズショッカーで破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調製したものを使用した。
ソバの精製DNAは、商店から購入したそば粉をマルチビーズショッカーで粉砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調製したものを使用した。
アスペルギウス・オリゼ(Aspergillus oryzae IFO 4206)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae IFO 0282)、大腸菌(Escherichia coli JCM 1649T)及び、バチルス・セレウス菌(Bacillus cereus ATCC 14579T)の精製DNAは、各々の菌株を適切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit(Gentra Systems Inc., USA)を用いて調製したものを使用した。
マツタケ(カナダ産)(Tricholoma magnivelare)、シイタケ、ハタケシメジ、エノキダケ、マイタケ、ナメコ、エリンギ及び、アワビタケの精製DNAは、商店から購入した試料の小片を凍結後、マルチビーズショッカーで破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kitsを用いて調製したものを使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。
上述したように準備した各種動物、植物、真菌及び、細菌DNA量を測定後、滅菌水を用いて、動物、植物及び真菌DNAの濃度を1 ng/μLに、細菌DNAの濃度を50 pg/μLに調製した。調製した1 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のEx Taq キットのR-PCRバージョン(Takara Bio Inc., Japan)を用いて調製した。このキットは、10ラR-PCR buffer(Mg2+ free)、250 mM MgCl2 solution, 10 mM dNTP mixture及び、5 unit/μL Taq DNA polymerase(ホットスタートタイプ)を含む。反応液は、R-PCR bufferをベースとし、2.5 mM MgCl2、0.005% SYBR Green I(FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA)、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマー、200 μM dNTP mixture(各々200 μMのdATP、dTTP、dCTPおよび、dGTP)および、0.05 unit/μL Taq DNA polymeraseを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度でT℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、20秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。なお、Tは、サバ検出用PCRプライマーの場合には64、カニ・エビグループ検出用PCRプライマーの場合には60、サケ、アワビ及びイカ検出用PCRプライマーの場合には62とした。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。増幅サイクル終了後、メルティングカーブは、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、次に20℃/秒の速度で60℃まで降温し、10秒間同温度で保温後、さらに0.2℃/秒の速度で97℃に至るまでのゆるやかな昇温中に0.2秒毎の蛍光強度を記録することによって得た。同PCR装置のソフトウェアによってメルティングカーブから得られたPCR増幅産物のTm値は、PCRによる特異的な増幅産物の有無を推定するために使用した。さらに、1.8%(wt/vol)アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物(反応液の2 μL)を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、U V照射下において増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてΦX174 HaeIII digest DNA(Takara)を使用した。これらのPCRの結果を表1に記載した。表中の+(プラス)は電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出されたことを示し、−(マイナス)は当該増幅産物が検出されなかったことを示す。
なお、既知及び、独自に解析した各種生物のミトコンドリアのチトクロームb遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、サバ科サバ属のマサバDNA、ゴマサバDNAを検出できるが、近縁種である同科サバ属のタイセイヨウマサバDNAや同科マグロ属のタイヘイヨウマグロ(クロマグロ)DNA、キハダマグロDNA、メバチマグロDNA、同科カツオ属のカツオDNA、同科ハガツオ属のハガツオ、タイセイヨウハガツオ、同科ソウダガツオ属のマルソウダ(トックリガツオ)、並びに、サワラ属のサワラの仲間(Scomberomorus tritor)DNA及び、他の魚類を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
OLE_LINK3 また、アワビ検出用PCRプライマー(配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、エゾアワビDNAを使用した場合のみ189 bp前後の増幅産物が確認され(表1)、この増幅産物のTm値は、約83.9℃であった。他の軟体動物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった(表1)。なお、トコブシは、「特定原材料に準ずるもの」(厚生労働省医薬局食品保健部長通知、食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について、平成13年3月15日、食発第79号)で規定されるアワビに含まれておらず、トコブシDNAを検出しないように意図的に設計した当該PCRプライマーは、トコブシDNAを検出しないことを確認した。
なお、既知及び、独自に解析した各種生物のミトコンドリアの16S rRNA遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、ミミガイ科ハリオティス属のエゾアワビDNA、マダカアワビDNA、メガイアワビDNA、アカネアワビDNA、ホワイトアバロンミミガイDNA、ガマノセアワビDNA、スルスミアワビDNAを検出できるが、同科ハリオティス属のトコブシDNA、セイヨウトコブシDNA、イボアナゴDNA、マアナゴウDNA、ミミガイDNA及び、他の軟体動物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
OLE_LINK12なお、既知及び、独自に解析した各種生物のミトコンドリアの16S rRNA遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、イカ類(十腕目)の各科に属するイカDNA(例えば、コウイカ科のコウイカ、アミモンコウイカ、モンゴウイカ、ヨーロッパヒメコウイカ、トグロコウイカ科のトグロコウイカ、ヒメイカ科のホンヒメイカ、ダンゴイカ科のミミイカ、ニヨリミミイカ、ヨーロッパボウズイカ、ヤリイカ科のヤリイカ、ケンサキイカ、アオリイカ、ジンドウイカ、アカイカ科のスルメイカ、アルゼンチンイレックス、ダイオウイカ科のダイオウイカ等)を検出できるが、タコ類(八腕目)や他の軟体動物を含むその他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
OLE_LINK12 さらに、エビ・カニグループ検出用PCRプライマー(配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ベニズワイガニDNA、タラバガニDNA、ブラックタイガーエビDNA、シバエビDNA、アマエビ(ホッコクアカエビ)DNA、シロエビDNA及び、オキアミ類(未同定種)DNAを使用した場合のみ211 bp前後の増幅産物が確認され(表1)、これらの増幅産物のTm値は、約77〜80℃であった。昆虫類を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、増幅産物は見られなかった(表1)。
なお、既知及び、独自に解析した各種生物のミトコンドリアの16S rRNA遺伝子配列に関する多重並列配列図とPCRプライマー配列との関係から、当該PCRプライマーを用いたPCRは、エビ目(十脚目)DNA(エビ類、カニ類、ヤドカリ類)、オキアミ目DNA(オキアミ類)、ヨコエビ目(端脚目)DNA(ヨコエビ)、ワラジムシ目(等脚目)DNA(フナムシ、ダンゴムシ)及び、シャコ下綱(シャコ類)を検出できるが、近縁種であるミジンコ亜綱(ミジンコ、カブトエビ、ホウネンエビ)、アゴアシ亜綱(ウミホタル、フジツボ)並びに、昆虫類、蜘蛛類及び、その他の生物種DNAを検出しないことが強く示唆されている。
実施例2
特定動物用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した特定動物用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。
実施例1で調製したマサバ、ベニザケ、エゾアワビ、スルメイカ、ブラックタイガーエビ及び、ベニズワイガニの各DNAを滅菌水で希釈し、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl、1000 pg/μlのDNA溶液の希釈系列を作製し、これらの希釈された被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、実施例1に記載したようにして、PCR増幅産物のTm値を求め、さらに、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
図1に示すように、サバ検出用PCRプライマー(配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、サケ検出用PCRプライマー(配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、アワビ検出用PCRプライマー(配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、10 pg DNA/分析であり、イカ検出用PCRプライマー(配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、エビ・カニグループ検出用PCRプライマー(配列番号9及び10のPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、10 pg DNA/分析であった。
実施例3
特定動物用PCRプライマーセットを用いたPCRによる特定動物含有食品中の特定動物由来DNAの検出
サバ、サケ、イカ、エビあるいは、カニを原料として含有する市販食品等に対する本発明の特定動物用PCRプライマーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
Claims (38)
- 下記の(1)〜(20)のいずれかのPCRプライマー。
(1) 配列表の配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(2) 配列表の配列番号2における塩基番号10〜24の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(3) 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(4) 配列表の配列番号4における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(5) 配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(6) 配列表の配列番号6における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(7) 配列表の配列番号7における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(8) 配列表の配列番号8における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(9) 配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(10) 配列表の配列番号10における塩基番号6〜20の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(11) 配列表の配列番号1の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(12) 配列表の配列番号2の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(13) 配列表の配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(14) 配列表の配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(15) 配列表の配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(16) 配列表の配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(17) 配列表の配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるP CRプライマー
(18) 配列表の配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(19) 配列表の配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
(20) 配列表の配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー - 配列表の配列番号1における塩基番号8〜22の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号2における塩基番号10〜2 4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号4における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号5における塩基番号11〜25の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号6における塩基番号12〜26の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号7における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号8における塩基番号7〜21の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号9における塩基番号5〜19の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号10における塩基番号6〜20の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号1の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号2の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号3の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号4の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号5の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号6の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号7の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号8の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号9の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 配列表の配列番号10の塩基配列を3'末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー。
- 下記の(21)〜(30)のいずれかのプライマーセット。
(21) 請求項2記載のプライマーと請求項3記載のプライマーとからなるプライマーセット
(22) 請求項4記載のプライマーと請求項5記載のプライマーとからなるプライマーセット
(23) 請求項6記載のプライマーと請求項7記載のプライマーとからなるプライマーセット
(24) 請求項8記載のプライマーと請求項9記載のプライマーとからなるプライマーセット
(25) 請求項10記載のプライマーと請求項11記載のプライマーとからなるプライマーセット
(26) 請求項12記載のプライマーと請求項13記載のプライマーとからなるプライマーセット
(27) 請求項14記載のプライマーと請求項15記載のプライマーとからなるプライマーセット
(28) 請求項16記載のプライマーと請求項17記載のプライマーとからなるプライマーセット
(29) 請求項18記載のプライマーと請求項19記載のプライマーとからなるプライマーセット
(30) 請求項20記載のプライマーと請求項21記載のプライマーとからなるプライマーセット - 請求項2記載のプライマーと請求項3記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項4記載のプライマーと請求項5記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項6記載のプライマーと請求項7記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項8記載のプライマーと請求項9記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項10記載のプライマーと請求項11記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項12記載のプライマーと請求項13記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項14記載のプライマーと請求項15記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項16記載のプライマーと請求項17記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項18記載のプライマーと請求項19記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 請求項20記載のプライマーと請求項21記載のプライマーとからなるプライマーセット。
- 試料からDNAを抽出する工程と;
このDNAを鋳型として、請求項23〜32のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と;
増幅されたDNAを検出することにより試料中に特定動物が存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。 - 試料からDNAを抽出する工程と;
このDNAを鋳型として請求項23又は28記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と;
増幅されたDNAを検出することにより試料中にサバが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。 - 試料からDNAを抽出する工程と;
このDNAを鋳型として請求項24又は29記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と;
増幅されたDNAを検出することにより試料中にサケが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。 - 試料からDNAを抽出する工程と;
このDNAを鋳型として請求項25又は30記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と;
増幅されたDNAを検出することにより試料中にアワビが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。 - 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として請求項26又は31記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にイカが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
- 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として請求項27又は32記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にエビ又は/及びカニが存在しているか否かを検出する工程とを含む特定動物の検出方法。
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