JP2008194013A - 毒きのこの検出のためのオリゴヌクレオチド、プライマー、並びにそれを用いた診断キット、検出キット及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】子実体の形態によらない、毒きのこ（クサウラベニタケ及びドクササコ）の迅速かつ特異的な検出法の開発が望まれていた。
【解決手段】毒きのこ（クサウラベニタケ (Entoloma rhodopolius)及びドクササコ （Clitocybe acromelalga））のリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を含むＤＮＡ、クサウラベニタケ又はドクササコに特異的な配列を有するＤＮＡプライマー及びプローブ、それらを用いたＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイなどの遺伝子関連技術を用いることで、子実体の形態によらない、迅速かつ特異的な毒きのこの検出法を提供する。
【選択図】 図６

Description

本発明は、毒きのこの検出のためのオリゴヌクレオチド、プライマー、並びにそれを用いた診断キット、検出キット及び方法に関する。

日本には、４０００−５０００種と非常に多くのきのこが存在しているといわれているが、その正確な数は不明であり、そのうちの大半のきのこは食毒不明である。日本に存在するきのこのうち、僅かに、約１００種類ほどが食用きのことして知られ、約４０種類ほどが毒きのことして知られている。

毒きのこによる中毒は自然の毒による中毒の７０％を占め、死亡例の６０％を占めている。厚生労働省の統計によると２００２年から２００６年までの５年間において約２５０件の毒きのこによる中毒が発生し、のべ患者数は８００名を越え、数名の死者も出ている。食中毒の原因きのことしては、ツキヨタケ (Omphalotus japonicus）、クサウラベニタケ (Entoloma rhodopolius)及びドクササコ （Clitocybe acromelalga）が中毒症例の多いことが知られている。このような毒きのこによる中毒が起きる原因は、きのこを形態により正確に同定するにはかなりの熟練が必要であり、一般の人が毒きのこを食用のきのこと間違えて誤食するためである。

このようなきのこ類の種の同定は、子実体の形態に基づいているが、その正確な同定には、かなりの熟練を要し、大学などの研究機関や博物館などに所属する高度な専門家に頼らざるを得ない。そのため、医療機関、又は、科学捜査研究所や保健所などの行政機関の一般的な職員が、きのこの同定をするのはきわめて困難である。

毒きのこの中毒が疑われる患者が発生した場合、迅速に適切な治療をする必要があるが、そのためには原因となるきのこを正確に同定することが重要である。しかし、正確な同定をするためには、ある程度の子実体の形態が保持されている必要があるため、中毒患者や死者が出た際の食中毒の原因きのこのように、子実体破片や細かく切断して調理されたきのこ等の、形態や色などの本来のきのこの特徴を保持していないものについては、専門家でも容易に同定することができない。

ＰＣＲ法に基づいたきのこの品種の識別に関しては、マイクロサテライト領域をＰＣＲ法により増幅し、検出する技術が報告されていた（特許文献１）。また、病原菌の検出には、リボソームＲＮＡのＰＣＲ法を介した増幅による検出が可能であることが報告されていた（特許文献２）。また、非特許文献１及び２によると、ニセクロハツや幻覚性きのこのリボソームＲＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列をシークエンスすることで、これらの品種を調べる方法が報告されていた。

特開平１１−３１８４６５号公報 特開２００５−２６１２２８号公報 下野義人、高松進、尾崎武司：日本菌学会大会講演要旨集 第４４号 ４３項 （２０００年） 丸山拓郎ら：食品衛生学雑誌 第４４号 ４４−４８項 （２００３年）

目視により毒きのこを正確に同定するためには、子実体の形態がある程度保持されている必要があり、子実体破片や細かく切断して調理したきのこ、一旦食用されてしまったきのこ等、形態や色などの本来のきのこの特徴を保持していないものについては、専門家でも同定することができないという問題点があった。

また、ＰＣＲ法を用いてユニバーサルプライマーによりリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を増幅し、ダイレクトシークエンスで塩基配列を決定することで、きのこを同定する技術が用いられている（非特許文献１及び２）が、塩基配列の決定には、多大な時間と費用がかかるため更なる改善法の開発が望まれていた。

さらに、菌株によっては、異核共存体であるために、異なる核間の変異が存在することがある。また、野生のきのこの場合、他の糸状菌や酵母の子実体への付着や混入している場合がある。また、調理後や食用後のきのこでは、更に異物の混入が顕著であり、これらの場合、ダイレクトシークエンスによる塩基配列の決定が非常に困難である。その際には大腸菌を宿主とした組み換えプラスミドにＰＣＲ産物をサブクローニングするなどの操作が必要になり、更に多くの時間と費用と必要であった。

また、特にクサウラベニタケは、菌糸体の分離培養が不可能であり、通常、野生のきのこを採取するしか、遺伝資源を獲得する手段がないため、遺伝子の解析例自体が行われてこなかった。

さらに、これまでのところ、ＰＣＲ法を用いた細菌や真菌等の微生物の特異的検出法は知られているが、クサウラベニタケなどの毒きのこの検出法は報告されておらず、また、従来の微生物の特異的検出法では検出できなかった。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、クサウラベニタケ及びドクササコの５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを単離し、更にクサウラベニタケ又はドクササコを迅速、高感度に検出し得るプライマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明によれば、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドを用いると、サザンブロット、マイクロアレイ、ＰＣＲ法などのハイブリダイズを介したクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定が可能となり、子実体の形態によらないこれらのきのこの検出が可能となる。

また、本発明によれば、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。このヌクレオチドを用いると、サザンブロット、マイクロアレイ、ＰＣＲ法などのハイブリダイズを介したクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定をより簡便に行うことが可能になる。

また、本発明によれば、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡが提供される。このＤＮＡを参照することにより、クサウラベニタケ及びドクササコの検出のためのヌクレオチドを、より簡便かつ迅速に設計できる。また、このＤＮＡをポジティブコントロールとして用いることで、より確実にこれらの毒きのこの有無を判断することも可能となる。

また、本発明によれば、クサウラベニタケ又はドクササコのスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、クサウラベニタケ又はドクササコのスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットが提供される。このプライマーは、ＰＣＲ法を用いた迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定を可能にし、子実体の形態によらないこれらのきのこの検出を可能にする。

また、本発明によれば、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットが提供される。このプライマーは、ＰＣＲ法を用いたクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定をより簡便に可能にする。

また、本発明によれば、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域、あるいは配列番号１又は２で示される塩基配列のポリヌクレオチド、の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを備えるＤＮＡマイクロアレイが提供される。このマイクロアレイは、多種類のきのこや食品等の網羅的な同時解析を可能にする。

また、本発明によれば、上記のプライマーセットを含むクサウラベニタケ又はドクササコの検出キットが提供される。この検出キットは、ＰＣＲ法を用いた迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定を可能にし、子実体の形態によらないこれらの毒きのこの検出が可能となる。

また、本発明によれば、上記のプライマーセットを含むクサウラベニタケ中毒又はドクササコ中毒の診断キットが提供される。この診断キットは、中毒と疑わしき患者の消化器の内容物、吐瀉物、糞尿などを対象とし、ＰＣＲ法を用いることで、迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定を可能にし、それに基づいた中毒の診断を可能にする。

また、本発明によれば、上記のプライマーセットを用いて、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を増幅することを特徴とするクサウラベニタケ又はドクササコの検出方法が提供される。この検出方法は、きのこの種間で配列の異なる領域をＰＣＲ法の標的に選ぶことで、簡便で特異的なこれらの毒きのこの検出を可能にする。

また、本発明によれば、調理された食品中に存在する毒きのこの検出キット及び検出方法であって、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなる、プライマーセットを含む検出キット及び検出方法が提供される。この検出キット及び検出方法は、調理されているため、子実体の形態が明らかでない食品中の毒きのこに対しても、そのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いることで検出を可能にする。

また、本発明によれば、毒きのこ中毒の診断キットであって、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む診断キットが提供される。この診断キットは、食用されたことにより子実体の形態が明らかではなくなった毒きのこに対しても、そのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いることで検出を可能にし、毒きのこ中毒の診断の上で有利な効果を奏す。

本発明により、毒きのこ（クサウラベニタケ、ドクササコ等）の特異的かつ迅速な検出及び同定をするためのヌクレオチド、プライマーセット、検出方法及びキットが提供される。

〔用語の説明〕
本明細書における「毒きのこ」とは、哺乳動物、特にヒトに対し、有害な作用を有する成分を含み、その成分のために食用することが出来ない（食用すると顕著な有害作用を与える）きのこのことをいう。また、本明細書においては、特定の条件において食用可能なきのこは、食用可能な条件以外では毒きのことみなしてもよい。例えば、生食できないきのこ（加熱により失われる有害成分を含む）は、生食条件下においては、毒きのことみなしてもよい。

また、本明細書における「クサウラベニタケ」とは、ハラタケ目イッポンシメジ科イッポンシメジ属に属するクサウラベニタケ（学名：Entoloma rhodopolius）のことをいう。食用きのこであるウラベニホテイシメジ（Entoloma sarcopum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）と子実体の形態が似ているため、混同して中毒を起こしやすい。有害成分は、溶血性タンパク質、ムスカリンなどであり、消化器系や神経系の症状、特に腹痛、嘔吐、下痢などを引き起こし、症状がひどい場合は、死に至ることもある。また、出願日現在においては、クサウラベニタケの菌糸体の分離培養は不可能である。

また、本明細書における「ドクササコ」とは、ハラタケ目キシメジ科カヤタケ属に属するドクササコ（学名：Clitocybe acromelalga）のことをいう。カヤタケなどカヤタケ属の他の食用きのこと混同して中毒を起こしやすい。特に食用きのこであるカヤタケ（Clitocybe gibba）、ナラタケ（Armillaria mellea）、アカハツ（Lactarius akahatu）、ハツタケ（Lactarius hatutake）、キチチタケ（Lactarius chrysorrheus）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipe）と混同されやすい。有害成分は、クリチジン、アクロメリン酸などが知られている。ドクササコを食用すると、軽い吐き気を経て、数日後に手足、鼻、陰茎など身体の末端部分が赤く火傷を起こしたように腫れ、その部分に激痛が生じ、一ヶ月以上続く。

上記二種のきのこは、ツキヨタケに次いで、国内で中毒が多く発生する毒きのこであり、（クサウラベニタケは分離培養ができないため特に）毒きのこの識別のための技術や、中毒発生後の診断・状況把握のための技術の開発が強く望まれている。

また、本明細書における「リボソームＲＮＡ遺伝子」とは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の各サブユニットをコードする領域とその間の非コード領域を含めた遺伝子全体をいう。図１ａに示すように、リボソームＲＮＡ遺伝子には、沈降係数（Ｓ）の異なるリボソームＲＮＡ、すなわち、１８Ｓ（スモールサブユニット）、５．８Ｓ、２８Ｓ（ラージサブユニット）、５ＳリボソームＲＮＡをコードする部分が存在する。このリボソームＲＮＡ遺伝子の中でも、特に、１８Ｓ、５．８Ｓ、ＩＴＳ１及び２からなる部分は一つのＲＮＡとして転写され、後にスプライスを受けて各部へと切断されるため、本明細書においてはこの領域を「リボソームＲＮＡ前駆体（領域）」ともいい、実質的には、配列番号１又は２で示される塩基配列の領域に相当する。

また、本明細書における「スペーサー領域」とは、コード領域とコード領域との間に存在し、アミノ酸をコードしない領域（非コード領域）のことをいい、本明細書においては、リボソームＲＮＡ遺伝子上におけるスペーサー領域のことをいう。スペーサー領域は、コード領域に比べ、種間による塩基配列の差が大きいため、本発明に好適に用いることができる。図１ａ及びｂに示すように、染色体上では、一つのリボソームＲＮＡ遺伝子がタンデムにつながった構造をとっており、スペーサー領域としては、５．８Ｓサブユニットのコード領域を挟むＩＴＳ１及び２と、５Ｓサブユニットのコード領域を挟む形のＩＧＳ１及びＩＧＳ２が知られている。なお、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２は、ＲＮＡに転写後スプライスされるために、ＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer：転写領域内部のスペーサー）領域と称される。本発明においては、種内においては比較的保存されているＩＴＳ領域が好ましく用いられるが、ＩＧＳ領域を用いることも可能である。

また、ＩＴＳ領域、ＩＧＳ領域共に、タンデム構造の繰り返しの中で、配列が異なることがあるが、その変異の幅は種間の差（ホモロジーが５０％以下のこともある）に比べて小さく、本発明の結果には影響を与えない。しかし、プライマーやヌクレオチドの設計の際などに、配列表１又は２に示す塩基配列そのものではなく、これと９０％、より好ましくは９５％の同一性を有すか、あるいは数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。この際の同一性は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の提供するｂｌａｓｔ２ｓｅｑにおいて標準的な初期パラメーターを用いて計算することが可能である。

また、本明細書における「ヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドのことをいい、特にそのオリゴマー（例えば、２−１００ｂｐ程度）及びポリマー（例えば、１００ｂｐ−）を、それぞれ「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という。本実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、を含むオリゴマー又はポリマーを含む。

また、本明細書における「プライマー」とは、ＰＣＲ反応において、鋳型とハイブリダイズし、ＰＣＲ反応を開始するのに必要なオリゴヌクレオチドのことをいう。ＰＣＲ反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、ＰＣＲ反応を行えるように、好ましくは特異的なＰＣＲ生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、より好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計される。このようなプライマーは、プライマーのＧＣ（グアニン・シトシン）の比率や、融解温度などの当業者によく知られた技術常識、並びにＢＬＡＳＴ等の公知のプログラム及びデータベースを用いることにより、当業者には容易に設計可能である。その際、プライマーの３’側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することも可能である。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１０ｂｐ−１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ−３５ｂｐの鎖長を有するように設計される。特に本発明に好適なプライマーについては、実施形態の説明で、詳しく述べる。

また、本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドに対し、別のポリヌクレオチド（あるいはオリゴヌクレオチド）が水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべきポリヌクレオチドには同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、他の全てのポリヌクレオチドに対して特異的である必要は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、毒きのこの検出においては、食用きのこのポリヌクレオチドに対して結合しなければ、「特異的にハイブリダイズする」といってもよい。

ハイブリダイズの条件は、そのヌクレオチドの使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとしてのヌクレオチドならば、ＰＣＲでのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選ばれる。また、サザンブロットやマイクロアレイなどで用いられる時には、そのハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするように選ばれる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするものが好ましいが、目的を満たす物であれば、これに限られない。（ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。）なお、ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。

また、本明細書において、「調理」とは、各種の加熱による加工や、形の加工（切る）、あるいは、他の調味料又は食品との混合、などの、通常用いられる食品の加工法のことをいう。加熱による加工に関しては、これに限られないが、例えば、煮る（主に１００℃程度）、揚げる（主に１８０℃程度）、焼く（主に２００度以上）、がよく用いられる。

〔実施形態〕
以下、本発明の実施形態について、説明する。

ある実施形態は、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドを用いると、サザンブロット、マイクロアレイ、ＰＣＲ法などのハイブリダイズを介した遺伝子関連技術によるクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定が可能となり、子実体の形態によらないこれらの毒きのこの検出が可能となる。

また、更なる他の実施形態は、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドを用いると、サザンブロット、マイクロアレイ、ＰＣＲ法などのハイブリダイズを介したクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定が可能となり、子実体の形態によらないこれらのきのこの検出が可能となる。この塩基配列を基にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを設計することで、新たにクサウラベニタケ又はドクササコのシークエンスを行うことなく、簡便かつ確実に上記のヌクレオチドを入手し、これらの毒きのこの検出に用いることができる。

すなわち、上記の実施形態のオリゴヌクレオチドを用いると、高度な専門技術をもつ専門家にしかできなかった子実体の形態を用いた従来の同定法に比べ、本発明の方法を使用することにより、毒きのこを誰でも簡単かつ迅速に、そして確実に同定することができる。また、このヌクレオチドを用いたこれらの方法は、従来の子実体の形態で識別する方法よりも、客観性・再現性の高い検出を可能にする。また、このヌクレオチドは、ＰＣＲや核酸化学合成の技術などを用いて合成され、比較対照とはハイブリダイズしないことの確認（配列上の確認を含む）後に、提供される。

上記の実施形態のオリゴヌクレオチドは、使用目的に応じて長さや配列が選ばれるが、プローブやプライマーとして用いられる時、ハイブリダイズする部分は１０−１００塩基、好ましくは１５−５０塩基、より好ましくは１５−３０塩基である。また、このヌクレオチドは、ハイブリダイズさせる対象の配列と、８０％、より好ましくは９０％、更に好ましくは９５％の同一性を有していることが望ましい（これはハイブリダイズに使用する以下の全てのオリゴヌクレオチドに対していえることである）。

また、更なる他の実施形態は、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡである。このＤＮＡを参照することにより、より簡便かつ迅速に、クサウラベニタケ及びドクササコの検出のためのヌクレオチドを設計できる。また、このＤＮＡをポジティブコントロールとして用いることで、より確実にこれらの毒きのこの有無を判断することも可能となる。

一般に、きのこは、菌株によっては異核共存体であり、異なる核間の変異が存在することがある。また、他の糸状菌（カビなど）や酵母の子実体への付着や混入している場合も多く、手がかりの無い状況での配列決定は困難な場合もある。特に、クサウラベニタケは分離培養が不可能であるため、従来は、クサウラベニタケについて遺伝子関連技術を用いて分析を行うことは非常に困難であった。本発明者は、鋭意努力の末、新鮮なクサウラベニタケを大量に集めて解析することにより、初めてクサウラベニタケのリボソームＲＮＡ前駆体領域付近（配列番号１）を配列決定することに成功した。このことにより、特にクサウラベニタケにおいては、以後、非常に困難なシークエンス作業を経ることなく、迅速かつ簡便に検出を行うことが可能となった。

上記の実施形態の、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡは、クサウラベニタケ又はドクササコの５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡ及びその隣接領域（ＩＴＳ領域）を含むものであり、例えば、以下のようにして得ることができる。

（５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその隣接領域の単離）
（１）ゲノムＤＮＡの調整
ゲノムＤＮＡの供給源としては、自然界から採取したクサウラベニタケ及びドクササコの子実体、又は、分離保存してあるドクササコの菌糸体が挙げられる。

例えば、自然界から採取した子実体をよく水洗し、ペーパータオル等で水分を除いた後、数ミリ角に裁断し、液体窒素中で粉々に粉砕する。次いで、粉砕した子実体から、界面活性剤を用いる方法や、プロテアーゼ処理などの本技術分野で知られる通常の方法や、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットなどによりゲノムＤＮＡを抽出することができる。

（２）ＰＣＲによる５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその隣接領域の増幅
一般にきのこを含む糸状菌及び酵母などの真菌のゲノムにおいて、５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする領域及びその隣接領域は、図２のような構造であることが知られている。真菌の５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその隣接領域の増幅することができるホワイトらのユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ１(配列番号７)及びＩＴＳ４(配列番号８)〔White et al.: PCR protocols, Academic Press, San Diego, pp. 315(1990)〕を用いて，上記（１）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行うことにより目的のＤＮＡを得ることができる。

（３）塩基配列の決定
得られたＰＣＲ断片を、pT7-blue T-vector（Novagen社）等の適切なベクターにサブクローニング後、塩基配列の決定を行う。又は、ＰＣＲ断片を用いてダイレクトシークエンシングを行う。塩基配列の決定はマキサムーギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオミシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機(例えばApplied Biosystems社製3130ジェネティックアナライザ等)を用いて配列決定が行われる。

上記のようにして、目的のＤＮＡを得ることができるが、この際に用いたプライマーＩＴＳ１及びＩＴＳ４を、他の適切なプライマーに変えることにより、リボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のＤＮＡ及びその配列を得ることや、他のきのこの該当する領域のＤＮＡ及びその配列を得ることも可能である。

また、配列表１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡに関しては、本明細書で塩基配列が開示されているため、他のより簡便な取得方法も可能である。例えば、化学合成によってこれらのＤＮＡを得てもよく、本ＤＮＡのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得てもよく、あるいはこの塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズされたものを取得してもよい。

また、更なる他の実施形態は、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットである。このプライマーセットは、種によって特異性のあるリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いた迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの特異的な検出・同定を可能にする。

また、更なる他の実施形態は、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットである。配列番号１又は２で示される塩基配列を基にプライマーを設計することで、新たにシークエンスをするなど、実験や条件検討の必要数を減少させ、より簡便に、ＰＣＲ法を用いた検出系を構築することが可能となる。

上記の実施形態のＰＣＲ法を用いた検出・同定法においては、従来のＰＣＲ法及びダイレクトシークエンスを用いた方法などと異なり、シークエンスなどの手間がかからず、また、専門家でも同定不可能な、加熱調理したクサウラベニタケ及びドクササコの子実体片など、子実体の原型を留めていないものからの同定も可能となる。また、食用された調理後のきのこを試料として、きのこの検出・同定を行うことも本発明の検出・同定方法の実施形態に含まれる。

上記の実施形態にかかるプライマー（セット）の作成について、以下に例示し、説明する。
（クサウラベニタケ及びドクササコ検出用プライマーの合成）
配列番号１にクサウラベニタケ、配列番号２にドクササコの検出に用いられる塩基配列を例示する。これらの塩基配列を比較し、クサウラベニタケ又はドクササコに特徴的な配列を見出し、その配列を有する合成オリゴヌクレチオドを本実施形態にかかるプライマー（セット）として用いることができる。

例えば、クサウラベニタケ又はドクササコ検出に用いることができる５’側プライマー及び３’側プライマーとしては、配列番号１又は２で示される塩基配列の任意の領域から選択することができる。但し、種の異なる菌株間で違いが認められ、ＧＣ含量の多い領域を含まず、プライマー同士でハイブリダイズしないような領域が好ましい。

例えば、５'側プライマーとしては，配列番号１においては、クサウラベニタケと形態学的に類似したきのこ〔ウラベニホテイシメジ（Entoloma sarcopum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）〕間で違いが見られる領域を１０−５０塩基、より好ましくは１５−２５塩基選択し、プライマーとすることができる。またこれらのプライマーは、あらゆる任意の組み合わせで用いることができる。

また、配列番号２においては、ドクササコと形態学的に類似したきのこ〔カヤタケ（Clitocybe gibba）、ナラタケ（Armillaria mellea）、アカハツ（Lactarius akahatu）、ハツタケ（Lactarius hatutake）、キチチタケ（Lactarius chrysorrheus）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipe）〕間で違いが見られる領域を１０−５０塩基、より好ましくは１５−２５塩基選択し、プライマーとすることができる。少なくともこれらのプライマーは、あらゆる任意の組み合わせで用いることができる。

次に、本発明に係るＰＣＲによる検出法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（本発明のプライマーを用いたクサウラベニタケ及びドクササコの検出）
（１）被検体サンプル溶液の調製
毒きのこを含むことが疑われる被検体サンプル溶液の調製は、生の子実体、茹でたり、揚げたり、焼いたりした子実体片から界面活性剤を用いる方法などの通常の方法によってＤＮＡを抽出すればよく、これをフェノール、クロロホルム、エタノール等を使用して精製し、被検体サンプル溶液とする。また、市販のＤＮＡ抽出キットを使用することもできる。

（２）ＰＣＲによるクサウラベニタケ及びドクササコの検出
毒きのこの検出は，本発明に係るクサウラベニタケ及びドクササコ特異的プライマーを用いて、リボソームＲＮＡのコード領域、スペーサー領域、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその隣接領域を増幅させ、増幅断片をアガロースゲル電気泳動法やポリアクリミドゲル電気泳動法などにより分画後、ゲルをエチジウムブロマイドなどを用いて染色し、ＵＶランプ下で増幅断片の有無を確認することにより行うことができる。

増幅は、標準的なプロトコル[例えばSambrook, J et al. : Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照]に従ったＰＣＲによって行うことができる。すなわち、ＤＮＡサンプルを変性して一本鎖にする。次いで、目的のＤＮＡ配列の一方の鎖の５’側に相補的な５’側プライマー、及び他方の鎖の３’側に相補的な３’側プライマー、鋳型として用いるＤＮＡ、四種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを含有する反応系を用い、鋳型ポリヌクレアーゼと上記二種のプライマーをアニーリングさせる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼにより四種のデオキシヌクレオチド三リン酸から各鋳型上に相補鎖を合成させる。そして生成した二本鎖を熱変性によって一本鎖にした後、それぞれの鎖を鋳型として上記と同じアニーリング、相補鎖の合成の手順を繰り返すことによりプライマーに挟まれた部分のみを指数関数的に増やすことができる。

このように、プライマーに狭まれた部分のＤＮＡ配列は上記一連の操作をＮサイクル（通常、Ｎ＝２０−４０）行うことにより、理論上２^Ｎ倍に増幅されたＤＮＡ断片が得られる。ＤＮＡポリメラーゼは１分間に数百から数千塩基の合成が行えるので、１サイクルは、５分から７分で行うことができる。従って、例えば、２５サイクルの増幅であれば３時間程度で終了し、この場合、各サイクルの効率が９０％であると仮定すれば（１＋０．９）^２５すなわち約１００万倍に増幅させることができる。さらに、近年のＰＣＲ技術の進歩はめざましく、１サイクルの時間は、１分以内に短縮することも可能である。これらのことから、ＰＣＲを用いる場合、他の手法に比べ、非常に迅速で、かつ、極めて高感度な検出が可能となる。

なお、ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしてはＤＮＡの開裂温度において耐熱性であるポリメラーゼ、例えばＴａｑ又はＴｔｈポリメラーゼ等を用いることが望ましい。これらを用いることにより、各サイクルの熱変性のたびに酵素の補充をする必要がほとんどなくなるので、より簡便かつ迅速に行うことができる。

更に、上記実施の形態において、リアルタイムＰＣＲを用いることで、ワンステップあるいは短いステップ数の工程で、簡便かつ非常に迅速に検出を行うことが可能となる。リアルタイムＰＣＲとしては、例えば、各種蛍光ＰＣＲベースの技術を用いることが可能である。蛍光ＰＣＲベースの技術としては、例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉなどの各種の蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標：ロシュ社）、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社)を用いる）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法などが挙げられるが、これに限られない。

ある実施形態において、増幅されるＤＮＡ断片は、クサウラベニタケ又はドクササコが保有する５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の隣接領域の一部を含むＤＮＡ断片である。ＰＣＲ法等においてはプライマーに挟まれる部分のＤＮＡ配列が増幅されるため、そのＤＮＡ断片の大きさは、用いるプライマーの種類に依存する。最後に、増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲルやアクリルアミドゲルを用いて染色し、ＵＶランプ下で増幅断片の有無を確認することができる。

なお、上記の実施形態の説明においては、ＤＮＡを取り上げたが、ＩＴＳ領域はスプライシング前のｍＲＮＡにも存在しているため、ＲＮＡを対象にＰＣＲを行うことも可能であり、本発明の実施形態に含まれる。この場合は、上記のＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡの抽出と、逆転写酵素によるＤＮＡへの変換が行われるが、これらの反応は本技術分野の通常の技術知識の範囲内で行うことができる。

また、更なる実施形態は、上記の５’側プライマーが配列番号３又は５で示される塩基配列を含むプライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、より確実にクサウラベニタケ又はドクササコを他の類似きのこと区別して検出することが可能となる。

また、更なる実施形態は、上記の３’側プライマーが配列番号４又は６で示される塩基配列を含むプライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、より確実にクサウラベニタケ又はドクササコを他の類似きのこと区別して検出することが可能となる。

例えば、上記プライマーを用いると、１０９ｂｐ（クサウラベニタケに対し、配列番号３及び４の塩基配列を含むプライマーセットを用いた場合）又は１０８ｂｐ（ドクササコに対し、配列番号５及び６の塩基配列を含むプライマーセットを用いた場合）のＤＮＡ断片が増幅される。

また、更なる他の実施形態は、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域、あるいは配列番号１又は２で示される塩基配列のポリヌクレオチド、の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを備えるＤＮＡマイクロアレイである。このマイクロアレイは、多種類のきのこや食品等の網羅的な同時解析を可能にし、食中毒などが起きた際の原因究明に非常に有効となる。本実施形態に係るマイクロアレイは、プローブ用のオリゴヌクレオチドをチップに固定する工程を含む方法で提供することができる。

マイクロアレイのプローブのためのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５ｂｐの鎖長のオリゴヌクレオチドとなるように設計される。そのマイクロアレイは一つのスポット当り一種又は二種以上の任意のプローブを含み、何れかのスポットに一種又は二種以上の本発明に係るオリゴヌクレオチドが含まれているものとする。このオリゴヌクレオチドはマイクロアレイ用チップに物理的結合又は化学的結合によって固定されていてもよい。

マイクロアレイ用チップの素材は公知の全ての種類の物質であってもよく、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、チップ表面にオリゴヌクレオチドを固定することができる反応基やニトロセルロース又は３次構造形成物が更に含まれていてもよい。例えば、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレン又はポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。オリゴヌクレオチドの固定は、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティング又はスポッティングなどの方法を用いることができる。

上記のオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイ上の一つのスポット当り２ｐｇ−１００ｐｇ固定することができる。また、マイクロアレイ上のスポットは１倍数以上であってもよく、好ましくは２ないし３倍数である。この時、スポットは、例えば、直径５０μｍ−５００μｍ、スポットの間隔は１０μｍ−５００μｍであってもよいが、スポットの大きさ及び稠密度はマイクロアレイ分析システムの解像度によって適切に調節することが好ましい。本実施形態に係るマイクロアレイは、マイクロウェルプレート、例えば９６ウェルプレートのウェルに設置し、既存の９６ウェルプレートを利用した自動装備（Biomek、Genetix roboなど）を用いて、試料分子、標識、混成化及び洗浄過程を機械的に処理することも可能である。

また、更なる他の実施形態は、上記のプライマーセットを含むクサウラベニタケ又はドクササコの検出キット及び検出方法である。この検出方法は、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を増幅することを特徴とする。この検出キット及び検出方法は、ＰＣＲ法を用いた迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定を可能にし、子実体の形態によらない検出が可能となる。また、複数の毒きのこの検出キットを組合わせて一つの検出キットとすることもでき、この場合は、マイクロアレイを用いる際と同様に、同時に多種類のきのこの検出・同定が可能となり、食中毒等の原因究明に非常に有効となる。

また、更なる実施形態は、上記の実施形態において、ＰＣＲ法で増幅するリボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部が５．８ＳリボソームＲＮＡの少なくとも一部である検出方法である。クサウラベニタケ又はドクササコの５．８ＳリボソームＲＮＡを標的とすることで、より確実に、他の類似のきのことの鑑別を可能にする。

また、更なる他の実施形態は、上記のプライマーセットを含むクサウラベニタケ中毒又はドクササコ中毒の診断キットである。この診断キットは、ＰＣＲ法を用いることで、迅速かつ簡便なクサウラベニタケ又はドクササコの検出・同定を可能にする。また、この診断キットは、食用されたことにより子実体の形態が明らかではなくなったクサウラベニタケ又はドクササコに対しても、そのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いることで検出を可能にし、これらのきのこによる中毒の診断の上で効果的である。

また、更なる他の実施形態は、毒きのこ中毒の診断キットであって、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む診断キットである。この診断キットは、食用されたことにより子実体の形態が明らかではなくなった毒きのこに対しても、そのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いることで検出を可能にし、毒きのこ中毒の診断の上で有効である。

上記の実施形態では、具体的には、患者の消化器の内容物、吐瀉物、糞尿などから試料を作成し、ＰＣＲ法を用いてこれらの毒きのこ由来のＤＮＡ断片の増幅を試みる。きのこは、繊維質が多く消化が悪いため、プロテアーゼやヌクレアーゼ等によって部分的に消化された後の試料からも検出可能である。また、これらの試料に含まれる目的ＤＮＡ断片は、切断されていることも多いため、プライマーは３０−５００ｂｐ、より好ましくは３０−３００ｂｐ、更に好ましくは５０−１５０ｂｐの断片を増幅するように設計されるが、対象の試料の状態に依存するため、これに限られない。激しい条件下では、５００ｂｐ以上の断片の存在量が少ないため（後述する実施例参照）、増幅するＤＮＡ断片が５００ｂｐ以下ではほとんどの試料に対して検出することができる。３００ｂｐ以下ではより確実に検出が可能となり、１５０ｂｐ以下では更に検出できる確実性が増すと共に、ＰＣＲによる増幅の上で有利となる。一方、増幅するＤＮＡ断片が３０ｂｐ以上であれば、プライマー二量体との区別が可能となり、５０ｂｐ以上ではプライマー二量体の区別をより確実に行うことができる。

また、更なる他の実施形態は、調理された食品中に存在する毒きのこの検出キット又は検出方法であって、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、その毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含む検出キット又は検出方法である。この検出キット又は検出方法は、調理されているために子実体の形態が明らかでない食品中の毒きのこに対しても、そのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域を対象としたＰＣＲ法を用いることで検出を可能にする。すなわち、食中毒と疑わしき症状が観察された際の食事に対して、ＰＣＲ法を用いて検査をすることにより、従来は困難であった食事中の原因毒きのこの同定を迅速かつ簡便に可能にする。また、調理後に形態が顕著に変化していなくとも、そもそも育成環境により子実体の色や大きさが変化しており、形態による識別が困難な毒きのこの同定においても効果的である。

本発明者らの検討により、熱をかけるなど核酸を分解する方向に働くような調理を行った後の料理に対しても、毒きのこをＰＣＲ反応により検出することが可能であることが初めて明らかとなった。更に、このような物理学的あるいは化学的変化を受けたきのこのＤＮＡに対し、短い断片を増幅の標的とすることで、より確実に検出を行うことができることも明らかにした。すなわち、試料の状況に依存するため、これに限られるわけではないが、これらの試料中の目的ＤＮＡ断片は、切断されていることが多いため、プライマーは３０−５００ｂｐ、より好ましくは３０−３００ｂｐ、更に好ましくは５０−１５０ｂｐの断片を増幅するように設計される。激しい条件下では、５００ｂｐ以上の断片の存在量が少ないため（後述する実施例参照）、増幅するＤＮＡ断片が５００ｂｐ以下ではほとんどの試料に対して検出することができる。３００ｂｐ以下ではより確実に検出が可能となり、１５０ｂｐ以下では更に検出できる確実性が増すと共に、ＰＣＲによる増幅の上で有利となる。一方、増幅するＤＮＡ断片が３０ｂｐ以上であれば、プライマー二量体との区別が可能となり、５０ｂｐ以上ではプライマー二量体の区別をより確実に行うことができる。

以上をまとめると、上記の実施形態における遺伝子を用いたきのこの同定法は、従来の目視による専門家による同定法に比べ、きのこの形態への非依存性、作業の迅速化、客観性・再現性・確実性の向上、コストダウン、更には、一般的な遺伝子関連技術修得者ならば誰でも容易に実施可能である点など、多くの利点を有する。このような利点は、上記に記載済みのもの以外にも、救急医療現場における中毒の原因となるきのこの同定、保健所などの食中毒データ収集が求められる機関における、きのこの同定不能による食中毒原因「不明」の減少、あるいは、科学捜査研究所などにおける法医学鑑定の進歩、の観点からも効果的である。

なお、上記の実施形態により説明されるオリゴヌクレオチド、プライマーセット、診断キット、検出キット及び検出方法は、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。例えば、上記の実施形態において、リボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の代わりに、ＩＴＳ領域、あるいはＩＴＳ１領域又はＩＴＳ２領域を用いてもよく、このような態様の診断キット、診断マーカー及び検出法が本願発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。

〔実施例１〕
＜子実体からのＤＮＡの調製＞
野外から採取したきのこは、それぞれの“かさ”の部分を３ｃｍ角に切断した。さらに“炒め”に使うものは３ｍｍ厚にスライスした。それらを調理する場合、“焼き”は２４０℃のホットプレートで油をしかず片面を２分間ずつ焼いた。“炒め”は油をしいた２４０℃のホットプレートで２分間炒めた。“揚げ”は、それぞれのきのこに市販のてんぷら粉をまぶし、それを１８０℃の油で２分間揚げた。“茹で”では沸騰水中にきのこを入れ、３０分、６０分、１２０分、１８０分間茹でた。

生のきのこ及び調理したきのこは、ペーパータオルで軽く水分をとり、液体窒素で凍結させた後、乳鉢できのこが粉々になるまで粉砕した。

液体窒素中で粉砕したきのこを1.5 mlのマイクロチューブに300 mg入れ、表1に示す組成のExtraction Bufferを500μl添加した。２０％ＳＤＳを 33 μl加え完全に混合して、６５℃湯浴中で１時間保温した。その後、５Ｍ酢酸カリウムを167 μl加え完全に混合し、氷中で２０分間放置した。その後、４℃、13,000 rpmで３０分間遠心し、上清をイソプロパノールを333 μl入れた新しいマイクロ遠心チューブに移して混合した。これを４℃、13,000 rpmで５分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させ、上清を完全に除去した後、乾燥させた。

乾燥したＤＮＡペレットに表２に示す組成のTE2 bufferを100μl加えて溶解し、ＲＮａｓｅ溶液（10 mg/ml）を5μl加え、３７℃湯浴中で１時間インキュベートした。その後、Tris飽和フェノール（Tris-HCl（pH 8.0）を飽和させた0.1％８−ヒドロキシキノリンを含有するフェノール）及びクロロホルム?イソアミルアルコール（24：1）の等量混合物を500 μl加え、転倒混和した後、12,000 rpmで１５分間遠心し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに回収した。

そこに、回収した量の１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH 5.2）と２倍量の９９．５％エタノールを加え、−８０℃で３０分間放置した。そして、４℃で13,000 rpmで２０分間遠心し、上清を除去した。これに、７０％エタノールを500μl加え、４℃、13,000 rpmで５分間遠心し、上清を除去し、乾燥させた。乾燥後、表３に示すTE bufferを20 μl加えてＤＮＡを溶解し、ＤＮＡ抽出液とした。

〔実施例２〕
＜調理後のきのこの子実体からのＤＮＡの検出＞
（１）調理後のきのこの子実体のＤＮＡの確認
調理したきのこからＰＣＲ反応に十分なＤＮＡが抽出されているかどうかを調べた。用意した毒きのこ（ツキヨタケ、クサウラベニタケ、カキシメジ）を〔実施例１〕に記載のように調理し、ＤＮＡ抽出液を得た。得られたＤＮＡの大きさなどをアガロース電気泳動により調べた結果の一部を図２に示す。

図２に示すように、“焼き”や“炒め”や“揚げ”の調理をしたものでは、未調理と比べＤＮＡはやや分解していたが、２０ｋｂｐ程度のサイズの大きなＤＮＡが確認できたものもあり、また小さい場合でも、５ｋｂｐ程度の大きさのＤＮＡが確認できた。一方、“茹で”の調理をしたものは“焼き”、“炒め”や“揚げ”の調理をしたものよりもＤＮＡの断片化が激しく、特に１２０分間以上茹でたもので断片化が激しかったが、それでも５００ｂｐ以上のＤＮＡが電気泳動によって確認でき、最大で約２ｋｂｐのＤＮＡを確認できたものがあった。これは“焼き”、“炒め”や“揚げ”の調理は高温ではあるが、短時間しか熱にさらされないのに対して、“茹で”は長時間熱にさらされたためであると考えられた。しかし、何れの調理法においても、ＰＣＲで検出可能な長さの断片が抽出できることが明らかとなった。

（２）調理後の子実体から得たＤＮＡのＰＣＲ反応による増幅
次に（１）で得られたＤＮＡを用い、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲをおこない、ＤＮＡが増幅するかどうかを調べた（条件等の詳細は〔実施例３〕を参照のこと）。その結果、図３に示すように、何れの調理がなされたきのこから抽出したＤＮＡを鋳型にした場合でも、ＰＣＲ法によりリボソーム遺伝子の一部を増幅することができた。

以上の結果から、“焼き”“炒め”“揚げ”などの調理を施したきのこの子実体からも、ＰＣＲによりリボソームＤＮＡの増幅及び検出が可能であることが明らかとなった。

〔実施例３〕
＜クサウラベニタケ又はドクササコの５．８ＳリボソームＲＮＡコードする領域を含むＩＴＳ領域の増幅と配列の決定＞
（１）５．８ＳリボソームＲＮＡコードする領域を含むＩＴＳ領域を得るためのプライマー（ユニバーサルプライマー）の作製
プライマーは、ホワイトらの方法〔White et al.: PCR protocols, Academic Press, San Diego, pp. 315(1990)〕に従い、真菌の５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーを合成した。すなわち、５’センスプライマー配列として5’-GCATTGAATTCTGAACACA-3’(ＩＴＳ１プライマー、配列番号７)を、３’アンチセンスプライマーとして5’-GCATTGAATTCTGAACACA-3’((ＩＴＳ４プライマー、配列番号８)を合成した。なお、合成オリゴヌクレチオドは、化学合成した。

（２）クサウラベニタケ又はドクササコの５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする領域を含むＤＮＡのＰＣＲ法による増幅と配列決定
鋳型としては、クサウラベニタケ又はドクササコの子実体から、〔実施例１〕に記載のとおりに調製したＤＮＡを用い、プライマーとしては上記（２）で作製したプライマーＩＴＳ１及びプライマーＩＴＳ４を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液の組成は以下の表４の通りである。

ＰＣＲは、サーマルサイクラー(Takara社製、TP-650型)を用い、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長反応の条件を１サイクルとして、３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems社）を用い、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems社3130xl型）により配列決定した。

その結果、図４に示すように、クサウラベニタケから得られた配列番号１においては、クサウラベニタケは、形態学的に類似したきのこであるウラベニホテイシメジ（Entoloma sarcopum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）との間に多くの差異を持つことが明らかとなった。なお、この配列中、ＩＴＳ１領域は１２−２４８であり、ＩＴＳ２領域は４０７−９０３である（それぞれ、プライマーＩＴＳ１及びプライマー４の配列を更に含む）。

また、図５に示すように、ドクササコから得られた配列番号２においては、ドクササコは、形態学的に類似したきのこであるカヤタケ（Clitocybe gibba）、ナラタケ（Armillaria mellea）、アカハツ（Lactarius akahatu）、ハツタケ（Lactarius hatutake）、キチチタケ（Lactarius chrysorrheus）、ホテイシメジ（Clitocybe clavipes）との間に多くの差異を持つことが明らかとなった。なお、この配列中、ＩＴＳ１領域は１２−２５２であり、ＩＴＳ２領域は４１１−６３１である（それぞれプライマーＩＴＳ１及びプライマー４の配列を更に含む）。

〔実施例４〕
＜クサウラベニタケ及びドクササコに由来するＤＮＡ断片の特異的検出＞
（１）きのこ子実体からのＤＮＡの調製
クサウラベニタケ及びドクササコを含むきのこの１９種(表５参照のこと)のＤＮＡを〔実施例１〕と同様の手順で調製した。

（２）オリゴヌクレオチドプライマーの選択及び合成
〔実地例２〕において解読したクサウラベニタケ又はドクササコ由来の塩基配列を形態学的によく似た他のきのこと比較検討し、種間で違いが認められ、ＧＣ含量の多い領域を含まず、プライマー同志でハイブリダイズしないような塩基配列領域を選択した（図４及び図５、囲み線部分）。すなわち、クサウラベニタケ検出用のセンスプライマーとして5’-TTTGAGAACTGCTGTGAAAATC-3’（配列番号３）を、アンチセンスプライマーとして 5’-GGCACAAAGTCCCTATATGTTTA-3’（配列番号４）を選択した。カキシメジ検出用のセンスプライマーとして5’-GGTGCACACCTGATAACCA-3’（配列番号５）を、アンチセンスプライマーとして5’-AGCTTAAGCTTTCGCACCAG-3’（配列番号６）を選択した。上記プライマーの化学合成は常法に従って行った。

（３）クサウラベニタケ及びドクササコに由来するＤＮＡ断片の特異的検出
上記（１）で調製したＤＮＡを上記（２）で合成したプライマーを使用し、以下の方法でＰＣＲ法を用いて増幅させた。すなわち、SYBRR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）を用い、各プライマーが５０μMの濃度になるように加えＰＣＲ反応を行った。反応条件は９５℃で５秒の変性、６５℃で５秒のアニーリング、７２℃で１５秒の伸長を１つのサイクルとして２０サイクル行った。ＰＣＲ反応液の組成は以下の表６の通りである。

（４）増幅ＤＮＡ断片の検出
上記（３）によるＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片を含む反応液をＤＮＡサイズマーカーとともに２％アガロースゲルにて電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド染色した。その結果の一部をそれぞれ図６及び７に示す。クサウラベニタケに対してこのプライマーを用いて行ったＰＣＲ（図６のレーン１、２及び３）では１０９塩基対の特異的なＤＮＡ断片が得られ、ドクササコに対してこのプライマーを用いて行ったＰＣＲ（図７のレーン１）では１０８塩基対の特異的なＤＮＡ断片が得られた。クサウラベニタケ以外のきのこ（図６のレーン４−２１）及びドクササコ以外のきのこ（図７のレーン２−１９）からは、バンドは検出できなかった。

以上の結果から、子実体の形態を用いた従来の同定法が高度な専門技術をもつ専門家にしかできなかったのに対し、本発明の方法を用いれば、誰でも簡単かつ迅速かつ正確に、クサウラベニタケ又はドクササコを同定できることが明らかとなった。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

以上のように、本発明にかかる毒きのこの検出のためのオリゴヌクレオチド、プライマー、並びにそれを用いた診断キット、検出キット及び方法は、遺伝子関連技術を用いることにより、毒きのこ（クサウラベニタケ、ドクササコ等）の特異的かつ迅速な検出及び同定を可能にする。

ゲノムＤＮＡ上でリボソームＲＮＡをコードする領域を示す図である。 ゲノムＤＮＡ上で５．８ＳリボソームＲＮＡをコードする領域及びその隣接領域を示す図である。矢印は、ユニバーサルプライマーの位置を示す。 調理した毒きのこから抽出したＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を示す電気泳動写真である。 調理した毒きのこから抽出したＤＮＡに対し、ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応を行った結果を示す電気泳動写真である。 クサウラベニタケと形態のよく似たきのこの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＩＴＳ領域の塩基配列(ただしＩＴＳ１とＩＴＳ４のプライマー部位は除く)とそのアラインメントを示す図である。囲み部分は今回特異的検出のためにプライマーとして用いた部分である。 クサウラベニタケと形態のよく似たきのこの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＩＴＳ領域の塩基配列(ただしＩＴＳ１とＩＴＳ４のプライマー部位は除く)とそのアラインメントを示す図である。 ドクササコと形態のよく似たきのこの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＩＴＳ領域の塩基配列(ただしＩＴＳ１とＩＴＳ４のプライマー部位は除く)とそのアラインメントを示す図である。囲み部分は今回特異的検出のためにプライマーとして用いた部分である。 ドクササコと形態のよく似たきのこの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＩＴＳ領域の塩基配列(ただしＩＴＳ１とＩＴＳ４のプライマー部位は除く)とそのアラインメントを示す図である。 配列番号３及び４の塩基配列を含むクサウラベニタケ特異的プライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅結果を示す電気泳動写真である。 配列番号５及び６の塩基配列を含むドクササコ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅結果を示す電気泳動写真である。

Claims (15)

1. クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
2. 配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
3. 請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドを備えるＤＮＡマイクロアレイ。
4. 配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
5. クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなる、プライマーセット。
6. 配列番号１又は２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなる、プライマーセット。
7. 前記５’側プライマーが配列番号３又は５で示される塩基配列を含む、請求項５に記載のプライマーセット。
8. 前記３’側プライマーが配列番号４又は６で示される塩基配列を含む、請求項５又は６に記載のプライマーセット。
9. 請求項４ないし７の何れか一項に記載のプライマーセットを含む、クサウラベニタケ又はドクササコの検出キット。
10. 請求項４ないし７の何れか一項に記載のプライマーセットを含む、クサウラベニタケ中毒又はドクササコ中毒の診断キット。
11. 請求項４ないし７の何れか一項に記載のプライマーセットを用いて、クサウラベニタケ又はドクササコのリボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部を増幅することを特徴とする、該クサウラベニタケ又はドクササコの検出方法。
12. 調理された食品中に存在する毒きのこの検出キットであって、
    該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなる、プライマーセット
    を含む、検出キット。
13. 毒きのこ中毒の診断キットであって、
    該毒きのこのスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなる、プライマーセット
    を含む、診断キット。
14. 前記リボソームＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部が５．８ＳリボソームＲＮＡの少なくとも一部である、請求項１３に記載の検出方法。
15. 調理された食品中に存在する毒きのこの検出方法であって、
    該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする５’側プライマーと、該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域のポリヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズする３’側プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを用いて、該毒きのこのリボソームＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅することを特徴とする、検出方法。