CN116179725A - 一种鰤鱼诺卡氏菌多重pcr检测用引物对组合及检测方法 - Google Patents

一种鰤鱼诺卡氏菌多重pcr检测用引物对组合及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于鰤鱼诺卡氏菌检测鉴定技术领域，具体公开了一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法，本发明设计了鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，对于检测目标鰤鱼诺卡氏菌具备良好的效果，且具有显著特异性及较高灵敏度，引物对组合(Chen‑F/R、Miyoshi‑F/R、Jiang‑F/R)低至1ng/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Chen‑F/R、4296‑F/R、Jiang‑F/R)低至62.5pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie‑F/R、Chen‑F/R、Jiang‑F/R)低至250pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(4296‑F/R、4001‑F/R、4299‑F/R)低至500pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie‑F/R、Chen‑F/R、4298‑F/R)低至1.2ng/μL混合样品仍可被检出。

Description

一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法
技术领域
本发明涉及鰤鱼诺卡氏菌检测鉴定技术领域，特别是一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原，为一种革兰氏阳性好氧菌，鰤鱼诺卡氏菌可以引起鱼类“结节病”症状，使患病鱼的体表出现不同程度的溃疡，且其肝脏、肾脏、脾脏等内脏器官和肌肉、鳃等组织出现白色结节，引起慢性、传染性疾病。由于夏季水温一般可达25-28℃，是适合鰤鱼诺卡氏菌生长的温度，所以诺卡氏菌病发病时间大多集中于夏季。鱼类感染该病前期没有明显的症状表现，大概经过两周后，病鱼摄食能力与活动能力都会降低，沉于水底。鱼类伴随着感染鰤鱼诺卡氏菌的时间增加，其组织与器官会出现白色结节。据可靠数据统计，感染该病后鱼类死亡率最高可达90％，未及时发现鱼类患病迹象，很难有效控制鱼类死亡而带来的经济损失。
近年来，鱼类诺卡氏菌病越来越引起学者的关注，有很多快速检测方法也应运而生。利用16S rRNA基因建立鰤鱼诺卡氏菌的特异性PCR检测方法(Miyoshi，2003)。利用16SrRNA～23S rRNA转录间隔区建立诺卡氏菌real-time PCR检测方法(王国良，2012)。利用rpoB基因建立诺卡氏菌real-time PCR检测方法(孙渭歌，2014)和王国良等(2011)利用LAMP技术以16S～23S rRNA建立鱼类诺卡氏菌特异性检测方法(Itano，2006)。目前对于鰤鱼诺卡氏菌的检测，尚未见多重PCR检测方法的报道。由此可见，为了更加快速准确地确定致病菌，建立一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的检测方法，从而快速准确地对鰤鱼诺卡氏菌进行检测鉴定，是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及检测方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，该引物对组合为Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R，Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R，4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R五种组合中的一种，各引物的序列如下表：
Figure BDA0004024993640000021
进一步地，所述引物对组合中各引物对的浓度比例Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1，4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2，Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2。
本发明的第二个目的是要提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、48.4℃-64℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
具体地，对于引物对组合Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、57℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
具体地，对于引物对组合Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
具体地，对于引物对组合Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、48.4℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
具体地，对于引物对组合4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2的引物对组合6μL、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
具体地，对于引物对组合Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2的引物对组合6μL、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、64℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
与现有技术相比，本发明设计了鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合及利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，对于检测目标鰤鱼诺卡氏菌具备良好的效果，且具有显著特异性及较高灵敏度，引物对组合(Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R)低至1ng/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R)低至62.5pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R)低至250pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R)低至500pg/μL混合样品仍可检出；引物对组合(Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R)低至1.2ng/μL混合样品仍可被检出；用于鱼体检测，具有较好的应用价值，为鰤鱼诺卡氏菌的快速检测提供新方法，助力于鱼类诺卡氏菌病的防控。
附图说明
图1为10对候选引物的温度梯度PCR扩增电泳图。
图2为8对引物的温度梯度PCR扩增鰤鱼诺卡氏菌的电泳图。
图3为筛选多重PCR的引物组合电泳图。
图4为多重PCR引物浓度配比优化电泳图。
图5为多重PCR灵敏度电泳图。
图6为多重PCR特异性检测电泳图。
图7为多重PCR检测患病与健康鱼组织的电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
以下实施例所用样品与主要试剂如下：鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株(N.seriolaeZJ0503)从患病卵形鲳鲹中分离鉴定及由本实验室保存。大肠杆菌BL21菌株(Escherichiacoli BL21)购于北京全式金生物技术有限公司并由本实验室保存。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila SZ20180916)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiaeZQ0910)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.Piscicida1.1032)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus HY9901)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviaeBNCC139095)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda ATCC15947)、副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus ATCC17802)、舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii GIM1.892)由本实验室保存。患病与健康杂交鳢购于广东宏利水产养殖公司，通过DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)肝脏、体肾、脾脏、肌肉组织DNA。Premix TaqTM PCR预混液购自TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR仪为耶拿分析仪器公司。
实施例1
本实施例主要是提供一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，该引物对组合为Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R，Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R，4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R五种组合中的一种，各引物的序列如表1所示。
Figure BDA0004024993640000061
为了获取上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，需要筛选特异性基因组DNA片段并设计PCR引物，具体地：将已知的4个种间特异、种类保守的鰤鱼诺卡氏菌特异性基因片段(ORF 4298、ORF 4299、ORF 4001、ORF 4296)作为待检目标片段，通过BLAST比对分析，针对各目的片段设计特异性PCR引物(表1)。加上16S-23S intergenic spacers(ITS)、16S rRNA、16S-23S rRNA、ORF 3659及其PCR引物(如表2)，一并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成10对PCR引物。
表2
Figure BDA0004024993640000071
进而，通过温度梯度PCR，确定10对PCR引物的最佳退火温度，并且筛选出PCR反应程序接近、PCR产物长度有差异的鰤鱼诺卡氏菌特异性基因片段作为多重PCR的候选检测目标片段。PCR反应条件为95℃变性5min；95℃变性30S，分别在8个设定的退火温度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)退火30S，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL、表1中的引物对(浓度100ng/μL)各1μL、DNA模板1μL、用ddH2O补足至20μL。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
使用引物Kono-F/R、引物Miyoshi-F/R、引物Nose-F/R、引物Labrie-F/R、引物Jiang-F/R、引物Chen-F/R、引物4298-F/R、引物4299-F/R、引物4001-F/R、引物4296-F/R分别温度梯度PCR扩增鰤鱼诺卡氏菌16S-23S intergenic spacers(ITS)、16S rRNA、16S-23SrRNA、16S rRNA、16S-23S rDNA ITS、ORF 3659、ORF 4298、ORF 4299、ORF 4001、ORF 4296基因片段如图1所示(图1中：A：引物Kono-F/R；B：引物Miyoshi-F/R；C：引物Nose-F/R；D：引物Labrie-F/R；E:引物Jiang-F/R；F：引物Chen-F/R；G：引物4298-F/R；H：引物4299-F/R；I：引物4001-F/R；J：引物4296-F/R；M：DL2000 DNA Marker；1～9分别为空白对照，45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)。由图1可知，PCR产物均可得到清晰主条带，空白对照组未出现扩增条带。如PCR扩增出现杂带，则淘汰其作为多重PCR候选引物。各个目的片段的温度梯度PCR检测结果如表3所示，淘汰有杂带的引物：Kono-F/R、Nose-F/R。
表3
Figure BDA0004024993640000081
Figure BDA0004024993640000091
筛选出可以扩增出单一、特异性条带的PCR引物对后，使用总引物Miyoshi-F/R：Labrie-F/R：Jiang-F/R：Chen-F/R：4298-F/R：4299-F/R：4001-F/R：4296-F/R＝1:1:1:1:1:1:1:1配比来扩增鰤鱼诺卡氏菌对应的基因片段，用以考查各引物在同一PCR体系中的竞争力；设置50μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液25μL，总引物15μL(多对候选引物等比例加入)，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板为5μL，用ddH2O补足至50μL；PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性30S，分别在8个设定的退火温度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)退火30S，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
PCR电泳图如图2所示，由图2可知：第5-7孔出现了三条明显条带，其中上下两条片段分别为ORF 3659(566bp)、16S-23S rDNA ITS(156bp)，而且在53-61.6℃竞争力较强，位于中间的条带有可能是16S rRNA(432bp)、ORF4298(406bp)、ORF 4296(439bp)。分别选取16S rRNA(432bp)、ORF 4298(406bp)、ORF 4296(439bp)与ORF 3659、16S-23S rDNA ITS进行组合(标号为组合①、②、③)。第9孔出现的三条明显条带分别对应的目的片段是16SrRNA(1069bp)、ORF 3659(566bp)、16S-23S rDNA ITS(156bp)，在65℃时这三种目标基因对应的引物对竞争力较强，所以选择此三种目标基因为组合④；此外选取自行设计的四种目的片段ORF 4001(377bp)、ORF 4299(294bp)、ORF 4298(406bp)、ORF4296(439bp)，再根据PCR产物具有明显长度差异的原则，设定组合⑤(ORF4298、ORF 4001、ORF 4299)和组合⑥(ORF 4296、ORF 4001、ORF 4299)。根据前期随机3组引物对组合扩增的实验结果，设定了组合⑦：16S rRNA(1069bp)、ORF3659(566bp)、ORF4298(406bp)。
综上，初步选择了七种作为多重PCR检测方法建立的引物组合，分别是：组合①Chen-F/R(566bp)、Miyoshi-F/R(432bp)、Jiang-F/R(156bp)；组合②Chen-F/R(566bp)、4296-F/R(439bp)、Jiang-F/R(156bp)；组合③Chen-F/R(566bp)、4298-F/R(406bp)、Jiang-F/R(156bp)；组合④Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、Jiang-F/R(156bp)；组合⑤4298-F/R(406bp)、4001-F/R(377bp)、4299-F/R(294bp)；组合⑥4296-F/R(439bp)、4001-F/R(377bp)、4299-F/R(294bp)；组合⑦Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、4298-F/R(406bp)。
进一步地，选定扩增效果较好的几组多重PCR候选引物对组合，设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL(设置3组不同的引物配比，使得引物对1：引物对2：引物对3分别为1:1:1，DNA模板为2μL，用ddH2O补足20μL。延伸时间设定为1min。退火温度范围设定在45℃-65℃。其结果如图3所示，图3中：A:组合①(引物组合:Chen-F/R:Miyoshi-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1)；B:组合②(引物组合:Chen-F/R:4296-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1)；C:组合③(引物组合:Chen-F/R:4298-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1)；D:组合④(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1)；E:组合⑤(引物组合:4298-F/R:4001-F/R:4299-F/R-F/R＝1:1:1)；F:组合⑥(引物组合:4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝1:1:1)；G:组合⑦(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:4298-F/R＝1:1:1)；M:DL2000 DNA Marker；N:空白对照；1-8分别是退火温度为45℃,46℃,48.4℃,53℃,57℃,61.6℃,64℃,65℃。
具体地，对组合③Chen-F/R:4298-F/R:Jiang-F/R进行多重PCR扩增，设置20μLPCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL(设置总引物配比，使得Chen-F/R:4298-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1)，结果(图3C)显示ORF 4298(406bp)目的片段未能检测出明显荧光条带。对组合⑤4298-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝1:1:1进行多重PCR扩增，结果(图3E)显示目的片段ORF4298未能检测出任何荧光条带。故排除组合③、⑤建立多重PCR的可能性。而组合①(图3A)、②(图3B)④(图3D)、⑥(图3F)和⑦(图3G)在一定的退火温度下扩增获得了3条清晰的条带，可用于鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的建立。
对组合①Chen-F/R(566bp)、Miyoshi-F/R(432bp)、Jiang-F/R(156bp)，进行多重PCR的引物配比优化：设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL(Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1)。结果(图3A)显示，16S rRNA目的片段检测出荧光条带很淡。调整引物组合为Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1时，结果(图4A)显示,三个目的片段都能检测出清晰明显条带。；图4中：组合①Chen-F/R:Miyoshi-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1；B:组合②Chen-F/R:4296-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1；C:组合⑥4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝1:1:2；D:组合⑥4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝2:1:2；E:组合⑦Labrie-F/R:Chen-F/R:4298-F/R＝1:1:2；M:DL2000 DNA Marker；N:negative control；1-8分别是退火温度为45℃,46℃,48.4℃,53℃,57℃,61.6℃,64℃,65℃
对组合②Chen-F/R(566bp)、4296-F/R(439bp)、Jiang-F/R(156bp)，进行多重PCR的引物配比优化：：设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL(Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1)，结果(图3B)显示，ORF 4296片段检出荧光条带比较淡。调整引物组合为Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1时，结果(图4B)显示，三条目的片段的荧光条带都清晰明亮。
对组合④Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、Jiang-F/R(156bp)，进行多重PCR的引物配比优化：设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL(Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1)。结果(图3D)显示，三个目的基因片段都出现清晰条带，且3个条带的亮度差别较小。因为引物浓度比例为Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1时效果较好，直接使用该比例。
对组合⑥4296-F/R(439bp)、4001-F/R(377bp)、4299-F/R(294bp)，进行多重PCR的引物配比优化：设置20μL PCR反应体系，其中Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL，当总引物浓度比值为4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝1：1：1时，ORF 4299片段只能检测出一条很淡的荧光条带(图3F)；调整三对引物配比为4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝1：1：2，结果显示，退火温度61.6-64℃时ORF 4296片段扩增条带减弱(图4C)。调整三对引物配比为4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2时，三个目的基因片段都出现清晰条带，且3个条带的亮度差别较小(图4D)。
对组合⑦Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、4298-F/R(406bp)，进行多重PCR的引物配比优化：设置20μL PCR反应体系，其中Premix TaqTM PCR预混液10μL，总引物为6μL。结果显示当总引物浓度比值为Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：1时，ORF4298片段的荧光显示很淡，未能检测出明显条带(图3G)。调整引物配比为Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2时，三个目的基因片段都出现清晰条带，且3个条带的亮度差别较小(图4E)，所以选择该配比为最佳引物配比。
进一步地，对组合①Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1进行温度梯度PCR，同时扩增目的片段ORF 3659(566bp)、16S rRNA(432bp)、16S-23SrDNA ITS(156bp)，设置8个退火温度的温度梯度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)，多重PCR反应程序为95℃5min、95℃30S、退火温度30S、72℃1min、30个循环、72℃延伸10min，对多重PCR反应体系退火温度进行优化，结果(图4A)显示，45℃-65℃均为3条清晰目的条带，其中泳道5的目的条带最亮且亮度差异较小，故选择57℃为多重PCR反应的最佳退火温度。
对组合②Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1进行温度梯度PCR，同时扩增目的片段ORF 3659(566bp)、ORF 4296(439bp)、16S-23S rDNA ITS(156bp)，设置8个退火温度的温度梯度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)，多重PCR反应程序为95℃5min、95℃30S、退火温度30S、72℃1min、30个循环、72℃延伸10min，对多重PCR反应体系退火温度进行优化，结果(图4B)显示，45℃-65℃均为3条清晰目的条带，其中第4泳道的目的条带最亮且差异小，故选择53℃为多重PCR反应的最佳退火温度。
对组合④Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1进行温度梯度PCR，同时扩增目的条带16S rRNA(1069bp)、ORF 3659(566bp)、16S-23S rDNA ITS(156bp)，设置8个退火温度的温度梯度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)，多重PCR反应程序为95℃5min、95℃30S、退火温度30S、72℃1min、30个循环、72℃延伸10min，对多重PCR反应体系退火温度进行优化，结果(图3D)显示45℃-65℃均出现3条清晰目的条带，其中泳道3的3条目的条带最亮且亮度差异不大，故选择48.4℃作为多重PCR反应的最佳退火温度。
对组合⑥4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2进行温度梯度PCR，同时扩增目的条带ORF 4296(439bp)、ORF 4299(294bp)、ORF 4001(377bp)：设置8个退火温度的温度梯度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)，多重PCR反应程序为95℃5min、95℃30S、退火温度30S、72℃1min、30个循环、72℃延伸10min，对多重PCR反应体系退火温度进行优化，结果(图4B)显示45℃-61.6℃均出现3条清晰目的条带，其中第4泳道条带最亮，故选择53℃作为多重PCR反应的最佳退火温度。
对组合⑦Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2进行温度梯度PCR，同时扩增目的条带16S rRNA(1069bp)、ORF3659(566bp)、ORF4298(406bp)：设置8个退火温度的温度梯度(45℃，46℃，48.4℃，53℃，57℃，61.6℃，64℃，65℃)，多重PCR反应程序为95℃5min、95℃30S、退火温度30S、72℃1min、30个循环、72℃延伸10min，对多重PCR反应体系退火温度进行优化，结果(图4C)显示45℃-65℃均出现3条清晰目的条带，其中第7泳道条带效果较好，故选择64℃作为多重PCR反应的最佳退火温度。
实施例2
本实施例主要提供了一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，利用上述鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测。
具体地，经过上述多重PCR反应条件参数的优化，确立组合①的多重PCR反应体系(20μL)为Premix TaqTM PCR预混液(TaKaRa公司)10μL、总引物6μL(引物组合配比Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1)、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、57℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min。
经过多重PCR反应条件参数的优化，确立组合②的多重PCR反应体系(20μL)为Premix TaqTM PCR预混液(TaKaRa公司)10μL、总引物6μL(引物组合配比Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1)、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min。
经过上述多重PCR反应条件参数的优化，确立组合④的多重PCR反应体系(20μL)为Premix TaqTM PCR预混液(TaKaRa公司)10μL、总引物6μL(引物组合配比Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1:1:1)、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、48.4℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min。
经过上述多重PCR反应条件参数的优化，确立组合⑥的多重PCR反应体系(20μL)为Premix TaqTM PCR预混液(TaKaRa公司)10μL、总引物6μL(引物组合配比4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2:1:2)、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min。
经过上述多重PCR反应条件参数的优化，确立组合⑦的多重PCR反应体系(20μL)为Premix TaqTM PCR预混液(TaKaRa公司)10μL、总引物6μL(引物组合配比Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1:1:2)、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、64℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min。
为了确定本实施例的多重PCR的检测灵敏程度，根据优化后的多重PCR反应条件和程序，对提取好的鰤鱼诺卡氏菌DNA进行等比稀释，形成8个浓度梯度，进行多重PCR的灵敏程度检测。
对组合①Chen-F/R(566bp)、Miyoshi-F/R(432bp)、Jiang-F/R(156bp)进行多重PCR灵敏度检测,如图5所示(图5中：A:组合①(引物组合:Chen-F/R:Miyoshi-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度57℃)；B:组合②(引物组合:Chen-F/R:4296-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度53℃)；C:组合④(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1,退火温度48.4℃)；D:组合⑥(引物组合:4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝2:1:2,退火温度53℃)；E:组合⑦(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:4298-F/R＝1:1:2,退火温度64℃)；M:DL2000DNA Marker；N:negative control；A,B,C,D:1-8分别是鰤鱼诺卡氏菌DNA浓度16ng/μL,4ng/μL,1ng/μL,500pg/μL,250pg/μL,125pg/μL,62.5pg/μL,31.3pg/μL；E:1-8分别是鰤鱼诺卡氏菌DNA浓度60ng/μL,12ng/μL,6ng/μL,1.2ng/μL,120pg/μL,12pg/μL,6pg/μL,3pg/μL)：结果(图5A)显示，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为1ng/μL时仍能同时扩增出三条目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达1ng/μL。
对组合②Chen-F/R(566bp)、4296-F/R(439bp)、Jiang-F/R(156bp)进行多重PCR灵敏度检测：结果(图5B)显示，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为62.5pg/μL时仍能同时扩增出三条目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达62.5pg/μL。
对组合④Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、Jiang-F/R(156bp)进行多重PCR灵敏度检测，结果(图5C)显示，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为250pg/μL时仍能同时扩增出三条目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达250pg/μL。
对组合⑥4296-F/R(439bp)、4001-F/R(377bp)、4299-F/R(294bp)进行多重PCR灵敏度检测：根据扩增结果(图5D)显示，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为500pg/μL时能同时扩增出三条目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度达500pg/μL。
对组合⑦Labrie-F/R(1069bp)、Chen-F/R(566bp)、4298-F/R(406bp)进行多重PCR灵敏度检测：扩增结果(图5E)显示，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为1.2ng/μL时仍能同时扩增出三条目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达1.2ng/μL。
本实施例还对多重PCR的特异性进行检测，具体地：
对组合①Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1进行多重PCR特异性检测，如图6所示(图6中：A:组合①(引物组合:Chen-F/R:Miyoshi-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度57℃)；B:组合②(引物组合:Chen-F/R:4296-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度53℃)；C:组合④(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1,退火温度48.4℃)；D:组合⑥(引物组合:4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝1:2:2,退火温度53℃)；E:组合⑦(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:4298-F/R＝1:1:2,退火温度64℃)；M:DL2000 DNA Marker；1-10:大肠杆菌BL21(阴性对照),鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503(阳性对照),嗜水气单胞菌SZ20180916,无乳链球菌ZQ0910,美人鱼发光杆菌杀鱼亚种1.1032,溶藻弧菌HY9901,豚鼠气单胞菌BNCC139095,迟缓爱德华氏菌ATCC15947,副溶血弧菌ATCC17802,舒伯特气单胞菌GIM1.892)：结果(图6A)显示，阳性对照出现156bp、432bp、566bp三条目标荧光条带，阴性对照组无荧光条带，其他致病菌组也未出现荧光条带，证明以组合①建立的多重PCR具有很好的特异性。
对组合②Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1进行多重PCR特异性检测：结果(图6B)显示，阳性对照出现156bp、439bp、566bp三条目标荧光条带，阴性对照组无荧光条带，其他致病菌组也未出现荧光条带，证明以组合②建立的多重PCR具有很好的特异性。
对组合④Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1进行多重PCR特异性检测，结果(图6C)显示，阳性对照出现156bp、566bp、1069bp三条目标荧光条带，阴性对照组无荧光条带，其他致病菌组也未出现荧光条带，证明以组合④建立的多重PCR具有很好的特异性。
对组合⑥4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2进行多重PCR特异性检测：结果(图6D)显示，阳性对照出现294bp、377bp、439bp三条目标荧光条带，阴性对照组和其他致病菌组均无荧光条带，证明以组合⑥建立的多重PCR具有很好的特异性。
对组合⑦Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2进行多重PCR特异性检测：结果(图6E)显示，阳性对照出现406bp、566bp、1069bp三条目标荧光条带，阴性对照组和其他致病菌组均无荧光条带，证明以组合⑦建立的多重PCR具有很好的特异性。
应用实例
使用优化后的PCR程序和条件，对组合①Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R进行多重PCR的鱼体应用检测：结果，如图7所示(图7中：A,B:组合①(引物组合:Chen-F/R:Miyoshi-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度57℃)；C,D:组合②(引物组合:Chen-F/R:4296-F/R:Jiang-F/R＝1:2:1,退火温度53℃)；E,F:组合④(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:Jiang-F/R＝1:1:1,退火温度48.4℃)；G,H:组合⑥(引物组合:4296-F/R:4001-F/R:4299-F/R＝2:1:2,退火温度53℃)；I,J:组合⑦(引物组合:Labrie-F/R:Chen-F/R:4298-F/R＝1:1:2,退火温度64℃)；M:DL2000 DNA Marker；A,C,E,G,I:1:大肠杆菌(阴性对照)；2:鰤鱼诺卡氏菌(阳性对照)；3-6:分别为患诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏,体肾,脾脏,肌肉；B,D,F,H,J:1:大肠杆菌(阴性对照)；2:鰤鱼诺卡氏菌(阳性对照)；3-6:分别为健康杂交鳢的肝脏,体肾,脾脏,肌肉)患鰤鱼诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)均能扩增出目标片段(156bp、432bp、566bp)，大肠杆菌(阴性对照)未检测出任何条带(图7A)。而健康杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与大肠杆菌(阴性对照)均不能检测出目标片段，只有鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)出现阳性条带(图7B)。表明以组合①建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR具有较好的实际应用价值。
对组合②Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R进行多重PCR的鱼体应用检测：结果显示，患鰤鱼诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)均能扩增出目标片段(156bp、439bp、566bp)，大肠杆菌(阴性对照)未检测出任何条带(图7C)。而健康杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与大肠杆菌(阴性对照)均不能检测出目标片段，只有鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)出现阳性条带(图7D)。表明以组合②建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR具有较好的实际应用价值。
对组合④Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R进行多重PCR的鱼体应用检测：结果显示，患鰤鱼诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)均能扩增出目标片段(156bp、566bp、1069bp)，大肠杆菌(阴性对照)未检测出任何条带(图7E)。而健康杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与大肠杆菌(阴性对照)均不能检测出目标片段，只有鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)出现阳性条带(图7F)。表明以组合④建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR具有较好的实际应用价值。
对组合⑥4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R进行多重PCR的应用检测：结果显示，患鰤鱼诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)均能扩增出目标片段(294bp、377bp、439bp)，大肠杆菌(阴性对照)未检测出任何条带(图7G)。而健康杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与大肠杆菌(阴性对照)均不能检测出目标片段，只有鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)出现阳性条带(图7H)。表明以组合⑥所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR具有较好的实际应用价值。
对组合⑦Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R进行多重PCR应用于鱼体的检测：结果显示，患鰤鱼诺卡氏菌病杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)均能扩增出目标片段(406bp、566bp、1069bp)，大肠杆菌(阴性对照)未检测出任何条带(图7I)。而健康杂交鳢的肝脏、体肾、脾脏、肌肉与大肠杆菌(阴性对照)均不能检测出目标片段，只有鰤鱼诺卡氏菌DNA(阳性对照)出现阳性条带(图7J)。表明以组合⑦所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR具有较好的应用价值。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，其特征在于，该引物对组合为Chen-F/R、Miyoshi-F/R、Jiang-F/R，Chen-F/R、4296-F/R、Jiang-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、Jiang-F/R，4296-F/R、4001-F/R、4299-F/R，Labrie-F/R、Chen-F/R、4298-F/R五种组合中的一种，各引物的序列如下表：
Figure FDA0004024993630000011
2.根据权利要求1所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合，其特征在于：所述引物对组合中各引物对的浓度比例Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1，Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1，4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2，Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2。
3.一种鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求2所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合进行多重PCR检测，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测用引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、48.4℃-64℃30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
4.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，对于引物对组合Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Chen-F/R：Miyoshi-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、57℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
5.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，对于引物对组合Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Chen-F/R：4296-F/R：Jiang-F/R＝1：2：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
6.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，对于引物对组合Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Labrie-F/R：Chen-F/R：Jiang-F/R＝1：1：1的引物对组合6μL、鰤鱼诺卡氏菌DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、48.4℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰荧光条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
7.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，对于引物对组合4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、4296-F/R：4001-F/R：4299-F/R＝2：1：2的引物对组合6μL、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、53℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
8.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR检测方法，其特征在于，对于引物对组合Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2的多重PCR反应，具体包括：
多重PCR反应体系为：Premix TaqTM PCR预混液10μL、Labrie-F/R：Chen-F/R：4298-F/R＝1：1：2的引物对组合6μL、DNA模板2μL、加ddH2O补足20μL；多重PCR反应程序为95℃5min；95℃30S、64℃退火30S、72℃1min、30个循环；72℃延伸10min；PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR电泳图上是否出现清晰条带确定是否含有鰤鱼诺卡氏菌DNA目标片段。
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