CN103890192A - 用于stec细菌的检测和鉴定的序列以及它们的使用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于核酸序列的存在的检测和鉴定STEC细菌的快速方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。这个方法优选地用于检测食物或水样品中，诸如牛肉富集物中的STEC细菌。本发明还涉及用于实施本发明的方法的分离的多核苷酸、复制组合物、试剂盒和试剂片。
Description
技术领域
本发明涉及基于核酸序列的存在检测和鉴定产志贺毒素大肠杆菌（Escherichia coli）的方法，优选基于PCR的检测方法，以及涉及寡核苷酸分子及用于其的试剂和试剂盒。
背景技术
大肠杆菌（E.coli）是革兰氏阴性、杆状细菌。虽然大多数大肠杆菌（E.coli）的菌株是良性的，并且被发现是人和其他动物的肠道正常菌群，但一些菌株是致病的并且能够导致疾病。不同的致病大肠杆菌（E.coli）菌株在流行病学，临床病程和导致疾病爆发的潜力方面是不同的。
产志贺毒素大肠杆菌（Escherichia coli）（STEC）是一种肠出血性大肠细菌，其可引起轻度至严重的肠道疾病，肾脏问题，甚至中枢神经系统效应。这些菌株的致病性是由于，在很大程度上，其产生的志贺样毒素Stx1和Stx2。另外，由eae基因编码的紧密黏附素粘附蛋白的生成已被证实与细菌的致病性有关，因为其具有某种表面抗原，包括O26、O111、O121、O45、O103、和O145抗原。
一种熟知的STEC细菌血清型是大肠杆菌（E.coli）血清型O157:H7，其已经与多起食物和水传播的爆发相关。美国农业部以零容忍标准控制这种细菌血清型作为碎牛肉中的掺杂物。由于其严格的监管，市场上存在众多针对大肠杆菌（E.coli）O157:H7的测试。然而，众多其他STEC细菌菌株也能致病，对其他STEC细菌血清型，或一般来讲STEC细菌的检测对于改善食品安全是很重要的。
因此，期望用于样品中STEC细菌的准确检测和鉴定的测试。
发明内容
本发明的一个方面是检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含适宜的引物对用于扩增eae基因、Stx1A基因和Stx2A基因中的一个或多个的至少一部分；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
在某些例子中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ IDNO:688（eae）的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO:145或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；并且其中所述探针包含SEQ ID NO:160或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
在某些实施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO:191或其互补序列的至少15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:146-159的序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:192-205的序列，并且所述探针包含选自SEQ IDNOs:161-175的序列。在附加的实施例中，所述探针的3'末端直接或间接连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:176的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。
在其他例子中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ IDNO:686（Stx1A）的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；并且其中所述第一引物和探针选自：
(I)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及其包含SEQ ID NO:16或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；
(II)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:49或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；以及
(III)包含SEQ ID NO:55或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:56或其互补序列的探针；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
在某些实施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO:58的至少15个连续的核苷酸或包含SEQ ID NO:73。在其他的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:2-15，48的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:59-72的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID NOs:17-30，49-52的序列。在另外的实施例中，所述探针的3'末端直接或间接连接到所述第一引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:53、54或57，或包含SEQ ID NO:31的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。
在进一步的例子中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ IDNO:687（Stx2A）的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；并且其中所述第一引物和探针选自:
(I)包含SEQ ID NO:74或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:89或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；
(II)包含SEQ ID NO:120或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:121或122或其互补序列的探针；以及
(III)包含SEQ ID NO:125或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:126或其互补序列的探针；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的扩增。
在某些实施例中，所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:128的至少15个连续的核苷酸或包含SEQ ID NO:143或144。在其他的实施例中，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:75-88的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:129-144的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID NOs:90-104的序列。在附加的实施例中，所述探针的3'末端直接或间接连接到所述第一引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物能被可检测地标记。在附加的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:123、124、或127，或包含SEQ ID NO:105的至少15个连续的核苷酸。在一些实施例中，所述样品包括食物样品或水样品。
在另外的方面，本发明涉及包含引物-探针复合物的分离的多核苷酸，其中所述引物-探针复合物包含：
(A)引物区和探针区，所述引物区包含含有SEQ ID NO:1的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，所述探针区包含SEQ ID NO:16的至少15个连续的核苷酸；
(B)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:48，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:49-52的核酸序列；
(C)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:55，所述探针区包含SEQ ID NO:56；
(D)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:74的至少15个连续的核苷酸，所述探针区包含SEQ ID NO:89的至少15个连续的核苷酸；
(E)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:120，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:121-122的核酸序列；
(F)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:125，所述探针区包含SEQ ID NO:126；以及
(G)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:145的至少15个连续的核苷酸，所述探针区包含SEQ ID NO:160的至少15个连续的核苷酸；
其中所述探针区和所述引物区各自具有5'和3'末端，其中所述探针区的所述3'末端经由接头部分连接到所述引物区的所述5'末端，并且其中所述引物-探针复合物还包含可检测的标签。
在另外的方面，本发明涉及用于样品中STEC细菌的检测的试剂盒和试剂片，其包含本发明的分离的多核苷酸。
本发明的另外的方面是检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含适宜的引物对，用于扩增下列的至少一部分：
(i)所述eae基因；和
(ii)所述Stx1A和Stx2A基因中的一个或多个；以及
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
在某些例子中，所述eae基因的一部分的扩增包括SEQ ID NO:688的至少一部分的扩增。在其他例子中，所述Stx1A和Stx2A基因的一个或多个的一部分的扩增包括SEQ ID NOs:686和687之一或二者的至少一部分的扩增。在某些实施例中，所述反应混合物包含适宜的引物对，用于扩增SEQ ID NOs:686-688中的所有三者的至少一部分。
在附加的实施例中，所述反应混合物还包含适宜的引物对用于扩增编码所述O26、O111、O121、O45、O103、O145、和O157表面抗原的基因的一个或多个的至少一部分。在某些例子中，此类扩增包括选自SEQ IDNOs:689-696的一个或多个核酸序列的扩增。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:686的适宜的引物对包含（A）第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:1-15和48的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:58-72的核酸序列；或（B）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:55，所述第二引物包含SEQ ID NO:73。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中：（I）其中所述第一引物选自SEQ ID NOs:1-15，所述探针包含选自SEQ ID NOs:31-47的核酸序列；（II）其中所述第一引物包含SEQID NO:48，所述探针包含选自SEQ ID NOs:49-52的核酸序列；并且（III）所述第一引物包含SEQ ID NO:55，所述探针包含SEQ ID NO:56。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:31-47、53-54、和57的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:687的适宜的引物对包括：（A）第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:74-88的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:128-142的核酸序列；（B）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:120，所述第二引物包含SEQ ID NO:143；或（C）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:125，所述第二引物包含SEQ ID NO:144。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中：（I）其中所述第一引物选自SEQ ID NOs:74-88，所述探针包含选自SEQ ID NOs:89-104的核酸序列；（II）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:120，所述探针包含选自SEQ IDNOs:121-122的核酸序列；并且（III）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:125，所述探针包含SEQ ID NO:126。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:105-119、123-124、和127的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:688的所述适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:145-159的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:191-205的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包含选自SEQ IDNOs:160-175的核酸序列。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:176-190的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:689的适宜的引物对包括：（A）第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:206-220的序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:258-272的核酸序列；（B）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:251，所述第二引物包含SEQ ID NO:273；或（C）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:255，所述第二引物包含SEQ ID NO:274。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包括：（I）其中所述第一引物选自SEQ ID NOs:206-220，所述探针包含选自SEQ ID NOs:221-235的核酸序列；（II）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:251，所述探针包含选自SEQ ID NOs:252-253的核酸序列；以及（III）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:255，所述探针包含SEQ ID NO:256。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQID NOs:236-250，254，和257的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:690的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:275-289和324的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:327-341的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包括：（I）其中所述第一引物选自SEQ ID NOs:275-289，所述探针包含选自SEQ ID NOs:290-306的核酸序列；以及（II）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:324，所述探针包含SEQ ID NO:325。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:307-323和326的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:691的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:342-356的核酸序列，所述和第二引物包含选自SEQ ID NOs:393-407的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包含选自SEQ IDNOs:357-374的核酸序列。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:375-392的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:692适宜的引物对包括：（A）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述第二引物包含SEQ ID NO:480；（B）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述第二引物包含SEQ ID NO:481；或（C）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:462，所述第二引物包含SEQID NO:482。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包括：（I）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述探针包含SEQ ID NO:457；（II）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述探针包含SEQ ID NO:460；以及（III）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:462，所述探针包含SEQ ID NO:463。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:458、461和464的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:693的所述适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:408-423的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:465-479的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包含选自SEQ IDNOs:424-439的核酸序列。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:440-455的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:694的适宜的引物对包括：（A）第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:483-497和537的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:540-554的核酸序列；（B）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:528，所述第二引物包含SEQ ID NO:555；（C）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:531，所述第二引物包含SEQ ID NO:556；或（D）第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述第二引物包含SEQ ID NO:557。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包括：（I）其中所述第一引物选自SEQ ID NOs:483-497，所述探针包含选自SEQ ID NOs:498-512的核酸序列；（II）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:528，所述探针包含SEQ ID NO:529；（III）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:531，所述探针包含SEQ ID NO:532；（IV）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述探针包含SEQ ID NO:535；（V）其中所述第一引物包含SEQ ID NO:537，所述探针包含SEQID NO:538。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:513-527、530、533、536、和539的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:695的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:558-572的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:603-617的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包含选自SEQ IDNOs:573-587的核酸序列。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:588-602的核酸序列。
在某些例子中，用于扩增SEQ ID NO:696的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:618-633的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:671-685的核酸序列。在附加的例子中，所述反应混合物还包含探针，其中所述探针包含选自SEQ IDNOs:634-653的核酸序列。在进一步的例子中，所述探针的3'末端连接到所述引物的5'末端，形成引物-探针复合物。在进一步的例子中，所述引物-探针复合物被可检测地标记。在附加的例子中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:654-670的核酸序列。
在一个具体实施例中：
(A)用于扩增SEQ ID NO:686的适宜的引物对包括
(I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:1-15和48的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:58-72的核酸序列；或者
(II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:55，所述第二引物包含SEQ ID NO:73；
(B)用于扩增SEQ ID NO:687的适宜的引物对包括
(I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:74-88的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:128-142的核酸序列；
(II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:120，所述第二引物包含SEQ ID NO:143；或者
(III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:125，所述第二引物包含SEQ ID NO:144；
(C)用于扩增SEQ ID NO:688的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:145-159的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:191-205的核酸序列；
(D)用于扩增SEQ ID NO:689的适宜的引物对包括
(I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:206-220的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:258-272的核酸序列；
(II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:251，所述第二引物包含SEQ ID NO:273；或者
(III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:255，所述第二引物包含SEQ ID NO:274；
(E)用于扩增SEQ ID NO:690的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:275-289和324的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:327-341的核酸序列；
(F)用于扩增SEQ ID NO:691的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:342-356的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:393-407的核酸序列；
(G)用于扩增SEQ ID NO:692的适宜的引物对包括
(I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述第二引物包含SEQ ID NO:480；
(II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述第二引物包含SEQ ID NO:481；或者
(III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:462，所述第二引物包含SEQ ID NO:482；
(H)用于扩增SEQ ID NO:693的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:408-423的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:465-479的核酸序列；
(I)用于扩增SEQ ID NO:694的适宜的引物对包括
(I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:483-497和537的核酸序列，所述第一引物包含选自SEQID NOs:540-554的核酸序列；
(II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:528，所述第二引物包含SEQ ID NO:555；
(III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:531，所述第二引物包含SEQ ID NO:556；或者
(IV)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述第二引物包含SEQ ID NO:557；
(J)用于扩增SEQ ID NO:695的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:558-572的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:603-617的核酸序列；并且
(K)用于扩增SEQ ID NO:696的适宜的引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQ ID NOs:618-633的核酸序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NOs:671-685的核酸序列。
在附加的例子中，所述反应混合物包含用于扩增SEQ ID NOs:686-688以及SEQ ID NOs:689-696中的一个或多个的适宜的引物对。
在具体的例子中，所述样品包括食物样品或水样品。
在附加的实施例中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-685的核酸序列。
在其他的实施例中，本发明涉及包含引物-探针复合物的分离的多核苷酸，其中所述引物-探针复合物包含：
(A)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:1-15的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:16-30的核酸序列；
(B)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:48，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:49-52的核酸序列；
(C)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:55，所述探针区包含SEQ ID NO:56；
(D)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:74-88的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:89-104的核酸序列；
(E)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:120，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:121-122的核酸序列；
(F)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:125，所述探针区包含SEQ ID NO:126；
(G)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:145-159的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:160-175的核酸序列；
(H)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:206-220的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:221-235的核酸序列；
(I)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:251，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:252-253的核酸序列；
(J)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NO:255的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NO:256的核酸序列；
(K)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:275-289的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:290-306的核酸序列；
(L)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:324，所述探针区包含SEQ ID NO:325；
(M)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:342-356的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:357-374的核酸序列；
(N)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:408-423的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:424-439的核酸序列；
(O)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:456，所述探针区包含SEQ ID NOs:457；
(P)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:459，所述探针区包含SEQ ID NO:460；
(Q)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:462，所述探针区包含SEQ ID NO:463；
(R)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:483-497的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:498-512的核酸序列；
(S)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:528，所述探针区包含SEQ ID NO:529；
(T)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:531，所述探针区包含SEQ ID NO:532；
(U)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:534，所述探针区包含SEQ ID NO:535；
(V)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:537，所述探针区包含SEQ ID NO:538；
(W)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:558-572的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:573-587的核酸序列；
(X)引物区和探针区，所述引物区包含选自SEQ ID NOs:618-633的核酸序列，所述探针区包含选自SEQ ID NOs:634-653的核酸序列。
在某些例子中，所述探针区和引物区各自具有5'和3'末端，其中所述探针区的3'末端经由接头部分连接到所述引物区的5'末端。在其他例子中，所述引物-探针复合物还包含可检测的标签。
在另外的实施例中，本发明涉及用于检测样品中STEC细菌的试剂盒，其包含本专利申请的分离的多核苷酸。在其他的实施例中，本发明涉及试剂片，其包含本专利申请的复制组合物。
序列说明
SEQ ID NO:1-30是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）Stx1A基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQID NO:686的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:1-30的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:58-72的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:1-15之一结合选自SEQ ID NOs:16-30的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQID NOs:31-47的寡核苷酸。
SEQ ID NO:48-52是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）Stx1A基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQID NO:686的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:48-52的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:58-72的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:48结合选自SEQ ID NOs:49-52的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:53-54的寡核苷酸。
SEQ ID NO:55-56是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）Stx1A基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQID NO:686的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:55-56的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:73，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:55结合包含SEQ ID NO:56的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:56探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:55引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:57。
SEQ ID NO:74-104是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）Stx2A基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:74-104的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:128-142的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:74-88之一结合选自SEQ ID NOs:89-104的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:105-119的寡核苷酸。
SEQ ID NO:120-122是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）基因靶标的一部Stx2A分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:120-122的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:143，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:120结合选自SEQ ID NOs:121-122的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:123-124的寡核苷酸。
SEQ ID NO:125-126是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）Stx2A基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:125-126的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:144，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:125结合包含SEQ ID NO:126的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:126探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:125引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQID NO:127。
SEQ ID NO:145-175是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）eae基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQID NO:688的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:145-175的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:191-205的一个。在某些实施例中，SEQID NOs:145-159之一结合选自SEQ ID NOs:160-175的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ IDNOs:176-190的寡核苷酸。
SEQ ID NO:206-235是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O26表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:206-235的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:258-272的一个。在某些实施例中，SEQ ID NOs:206-220之一结合选自SEQ ID NOs:221-235的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:236-250的寡核苷酸。
SEQ ID NO:251-253是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O26表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:251-253的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:273，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:251结合选自SEQ ID NOs:252-253的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:251引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQID NO:254。
SEQ ID NO:255-256是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O26表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列。可使用选自SEQ ID NO:255-256的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:274，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:255结合包含SEQ ID NO:256的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:256探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:255引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:257。
SEQ ID NO:275-306是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）表面抗原基因SO111靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:690的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:275-306的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:327-341的一个。在某些实施例中，SEQ ID NOs:275-289之一结合选自SEQ ID NOs:290-306被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:307-323的寡核苷酸。
SEQ ID NO:324-325是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）SO111表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:690所述靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:324-325的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:327-341的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:324结合包含SEQ ID NO:325的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:325探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:324引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:326。
SEQ ID NO:342-374是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O121表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:691所述靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:342-374的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:393-407的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:342-356之一结合选自SEQ ID NOs:357-374的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:375-392的寡核苷酸。
SEQ ID NO:408-439是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:693的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:408-439的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:465-479的一个。在某些实施例中，SEQ ID NOs:408-423之一结合选自SEQ ID NOs:424-439的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:440-455的寡核苷酸。
SEQ ID NO:456-457是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:456-457的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:480，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:456结合包含SEQ ID NO:457的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:457探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:456引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:458。
SEQ ID NO:459-460是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:459-460的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:481，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:459结合包含SEQ ID NO:460的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:460探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:459引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:461。
SEQ ID NO:462-464是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:464-464的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:482，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:462结合包含SEQ ID NO:463的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:463探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:462引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:464。
SEQ ID NO:483-512是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:483-512的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:540-554的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:483-497之一结合选自SEQ ID NOs:498-512的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:513-527的寡核苷酸。
SEQ ID NO:528-529是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:528-529的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:555，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:528结合包含SEQ ID NO:529的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:529探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:528引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:530。
SEQ ID NO:531-532是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:531-532的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:556，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:531结合包含SEQ ID NO:532的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:532探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:531引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:533。
SEQ ID NO:534-535是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用选自SEQ ID NO:534-535的引物结合适宜的反向引物，诸如SEQ ID NO:557，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:534结合包含SEQ ID NO:535的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:535探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:534引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:536。
SEQ ID NO:537-538是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:537-538的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:540-554的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:537结合包含SEQ ID NO:538的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:538探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述SEQ ID NO:537引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并且用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并淬灭其荧光，诸如SEQ ID NO:539。
SEQ ID NO:558-587是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O145表面抗原基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:695的靶序列。可使用选自SEQ ID NOs:558-587的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NOs:603-617的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:558-572之一结合选自SEQ ID NOs:573-587的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NOs:588-602的寡核苷酸。
SEQ ID NO:618-653是能够用作引物或探针的核苷酸序列，用于扩增和检测大肠杆菌（E.coli）O157原噬菌体致病因子基因靶标的一部分，诸如本文提供的如SEQ ID NO:696的靶序列。可使用选自SEQ ID NO:618-653的引物结合适宜的反向引物，诸如选自SEQ ID NO:671-685的一个，进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NO:618-633之一结合选自SEQ IDNO:634-653的探针被用作引物。在某些其他的实施例中，所述被选探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针被可检测地标记并用于结合分离的淬灭剂寡核苷酸，所述分离的淬灭剂寡核苷酸能够杂交至所述探针并且淬灭其荧光，诸如选自SEQ ID NO:654-670的寡核苷酸。
SEQ ID NO：686是大肠杆菌（E.coli）Stx1A基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中Stx1A基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:686的适宜的引物包括SEQ ID NO:1-30、48-52、55-56、和58-73。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:1-15的正向引物和选自SEQ ID NO:58-72的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:16-30的探针和任选地选自SEQ ID NO:31-47的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在其他的实施例中，使用SEQ ID NO:48作为正向引物和选自SEQ ID NO:58-72的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:49-52的探针和任选地选自SEQ ID NO:53-54的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:55作为正向引物和SEQ ID NO:73作为反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:56作为探针和任选地SEQ IDNO:57作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：687是大肠杆菌（E.coli）Stx2A基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中Stx2A基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:687的适宜的引物包括SEQ ID NO:74-104、120-122、125-126和128-144。在某些实施例中，使用选自SEQ IDNO:74-88的正向引物和选自SEQ ID NO:128-142的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:89-104的探针和任选地选自SEQ ID NO:105-119的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在其他的实施例中，使用SEQ ID NO:120作为正向引物和SEQ ID NO:143作为反向引物进行扩增，当使用选自SEQID NO:121-122的探针和任选地选自SEQ ID NO:123-124的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:125作为正向引物和SEQ ID NO:144作为反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:126作为探针和任选地SEQ ID NO:127作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：688是大肠杆菌（E.coli）eae基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中eae基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:688的适宜的引物包括SEQ ID NO:145-175。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:145-159的正向引物和选自SEQ ID NO:191-205的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:160-175的探针和任选地选自SEQ ID NO:176-190的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：689是大肠杆菌（E.coli）O26表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O26表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:689的适宜的引物包括SEQ ID NO:206-235、251-253、255-256、和258-274。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:206-220的正向引物和选自SEQ ID NO:258-272的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:221-235的探针和任选地选自SEQ ID NO:236-250的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在其他的实施例中，使用SEQ ID NO:251作为正向引物和SEQ ID NO:273作为反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:252-253的探针和任选地SEQ ID NO:254作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:255作为正向引物和SEQ ID NO:274作为反向引物进行扩增，当使用SEQ IDNO:256作为探针和任选地SEQ ID NO:257作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：690是大肠杆菌（E.coli）O111表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O111表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:690的适宜的引物包括SEQ ID NO:275-306、324-325、和327-341。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:275-289的正向引物和选自SEQ ID NO:327-341的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:290-306的探针和任选地选自SEQ IDNO:307-323的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在其他的实施例中，使用SEQ ID NO:324作为正向引物和选自SEQ ID NO:327-341的反向引物进行扩增，当使用包含SEQ ID NO:325的探针和任选地包含SEQ ID NO:326的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：691是大肠杆菌（E.coli）O121表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O121表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:691的适宜的引物包括SEQ ID NO:342-356和393-407。在某些实施例中，使用选自SEQ IDNO:342-356的正向引物和选自SEQ ID NO:393-407的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:357-374的探针和任选地选自SEQ ID NO:375-392的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：692是大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O45表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:692的适宜的引物包括SEQ ID NO:456-457、459-460、462-463、和480-482。在某些实施例中，使用SEQ ID NO:456作为正向引物和SEQ ID NO:480作为反向引物进行扩增，当使用包含SEQ ID NO:457的探针和任选地包含SEQ ID NO:458的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:459作为正向引物和SEQ ID NO:481作为反向引物进行扩增，当使用包含SEQID NO:460的探针和任选地包含SEQ ID NO:461的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:462作为正向引物和SEQ IDNO:482作为反向引物进行扩增，当使用包含SEQ ID NO:463的探针和任选地包含SEQ ID NO:464的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：693是大肠杆菌（E.coli）O45表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O45表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:692的适宜的引物包括SEQ ID NO:408-439，和465-479。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:408-423的正向引物和选自SEQ ID NO:465-479的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:424-439的探针和任选地选自SEQ ID NO:44-455的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：694是大肠杆菌（E.coli）O103表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O103表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:694的适宜的引物包括SEQ ID NO:483-512、528-529、531-532、534-535、537-538、和540-557。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:483-497的正向引物和选自SEQ ID NO:550-554的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:498-512的探针和任选地选自SEQ ID NO:513-527的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在其他的实施例中，使用SEQ ID NO:528作为正向引物和SEQ ID NO:555作为反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:529作为探针和任选地SEQ ID NO:530作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:531作为正向引物和SEQ ID NO:556作为反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:532作为探针和任选地SEQ ID NO:533作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在附加的实施例中，使用SEQ ID NO:534作为正向引物和SEQ ID NO:557作为反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:535作为探针和任选地SEQ ID NO:536作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。在另外的实施例中，使用SEQ ID NO:537作为正向引物和选自SEQ ID NO:550-554的反向引物进行扩增，当使用SEQ ID NO:538作为探针和任选地SEQ ID NO:539作为淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：695是大肠杆菌（E.coli）O145表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O145表面抗原基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:695的适宜的引物包括SEQ ID NO:558-587和603-617。在某些实施例中，使用选自SEQ IDNO:558-572的正向引物和选自SEQ ID NO:603-617的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:573-587的探针和任选地选自SEQ ID NO:588-602的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO：696是大肠杆菌（E.coli）O157原噬菌体致病因子基因的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中O157原噬菌体致病因子基因的存在，并且最终地检测样品中STEC细菌的存在。用于扩增SEQ ID NO:696的适宜的引物包括SEQ ID NO:618-653和671-685。在某些实施例中，使用选自SEQ ID NO:618-633的正向引物和选自SEQ ID NO:671-685的反向引物进行扩增，当使用选自SEQ ID NO:634-653的探针和任选地选自SEQ ID NO:654-670的淬灭剂寡核苷酸完成检测时。
SEQ ID NO:697-700包含用于扩增SV40DNA的核苷酸序列，其在一些例子中被用作阳性对照反应。在某些例子中，使用SEQ ID NO:697或698作为正向引物结合SEQ ID NO:700作为反向引物进行扩增。在某些实施例中，SEQ ID NOs:697或698之一结合SEQ ID NO:699探针作为被用作引物。在某些其他的实施例中，所述SEQ ID NO:699探针的3'末端经由适宜的接头部分，诸如18-碳的隔片，连接到所述被选引物的5'末端。在附加的实施例中，所述探针由报告基因-淬灭剂对可检测地标记，并在所述探针区的侧翼具有自身互补序列，从而使得核酸分子自杂交形成茎-环结构，从而使得通过淬灭剂分子淬灭所述报告基因信号。
所述序列符合37C.F.R.1.1.822.821-1.825（“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)），并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)（WIPO）ST.25标准（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C）。核苷酸和氨基酸序列数据所用的符号和形式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规则。
优选实施例具体说明
申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而无论所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围都意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。
定义
在本公开中，使用了多个术语和缩写。给出了如下定义。
如本文所用，术语“约”或“大约”表示在给定值或范围的20%内，优选地在10%内，还更优选地在5%内。
术语“包含”旨在包括由术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施例。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
术语“分离的”指如下物质，例如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含或者去除了在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序及类似的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一条或多条链构成。
术语“扩增产物”或“扩增子”指在引物引导的扩增反应期间产生的核酸片段。引物引导的扩增的典型方法包括聚合酶链反应（PCR），连接酶链反应（LCR），或链置换扩增反应（SDA）。如果选择了PCR方法，所述复制组合物可包含用于核酸复制的所述组分，例如：核苷酸三磷酸、具有适当序列的两个（或多个）引物、热稳定的聚合酶、缓冲剂、溶质和蛋白质。在美国专利4,683,202（1987，Mullis，等人）和美国专利4,683,195（1986，Mullis，等人）中提供了这些试剂和它们用于扩增核酸的详述步骤。如果选择LCR方法，则所述核酸复制组合物可包含，例如：热稳定的连接酶（例如，水生栖热菌（Thermus aquaticus）连接酶），两组邻近的寡核苷酸（其中每组的一个成员与每个所述靶链互补），Tris-HCl缓冲液，KCl，乙二胺四乙酸（EDTA），NAD，二硫苏糖醇，以及鲑精DNA。参见，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:1074-1078（1985）。
术语“引物”指（合成的或天然存在的）寡核苷酸，当被置于其中通过聚合酶催化互补链合成的条件下时，它能够作为沿互补链进行核酸合成或复制的起始点。引物还能包含可检测的标签，例如5'末端标签。在某些实施例中，本发明的引物为长度8-60个的核酸。在其他的实施例中，引物为长度10-50，14-40，或20-30个的核酸。在特定实施例中，引物为长度至少约8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，49或60个的核苷酸。
术语“探针”是指（合成的或天然存在的）寡核苷酸，其与所关注的多核苷酸互补（但不一定完全互补）并且通过与所关注的多核苷酸的至少一条链杂交形成双链结构。探针或引物-探针复合物还可包含可检测的标签。在某些实施例中，本发明的探针为长度8-60个的核酸。在其他的实施例中，探针为长度10-50，14-40，或20-30个的核酸。在特定实施例中，探针为长度至少约8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，49或60个的核苷酸。
探针可以是一个独立的实体或复合或换句话讲连接到引物，诸如其中探针经由其3'末端连接到引物的5'末端。此类连接可以为直接的或非直接的，诸如当所述连接通过接头完成时，其可以为核苷酸或非核苷酸接头并且其可以为非扩增的接头，诸如六乙二醇（HEG）或18-碳接头。在这种情况下，这将被命名为“引物-探针复合物”。此类引物-探针复合物的一个例子可见于以引用的方式并入本文的美国专利6,326,145，其被常称为“蝎子探针”或“蝎子引物”。
如本文所用，术语“标签”和“可检测的标签”是指能够检测包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶的辅助因子、酶抑制子、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、半导体纳米晶体、配基（例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原）等的分子。可检测的标签也可包括报告基因和淬灭剂的组合。
术语“报告基因”是指物质或其一部分，其能够表现出可检测的信号，其信号能被淬灭剂抑制。所述报告基因的可检测的信号为例如在可检测范围内的荧光。术语“淬灭剂”是指物质或其一部分，其能够抑制、降低、抑制等由所述报告基因产生的可检测的信号。
如本文所用，术语“淬灭”和“荧光能量传递”是指如下过程，即，当报告基因和淬灭剂密切接近时，并且所述报告基因被能量源激发，所述激发态的能量的主要部分非辐射性地转移至所述淬灭剂，其中它要么非辐射性地耗散或者以不同于所述报告基因的发射波长发射。
优选地，所述报告基因可选自用适宜的连接基团修饰的荧光有机染料，以连接至所述寡核苷酸，诸如连接至所述末端3'碳或末端5'碳。所述淬灭剂也可选自有机染料，取决于本发明的实施例，所述有机染料可以为荧光的，也可以不是荧光的。一般来讲，如果所述淬灭剂是荧光的或只是通过非辐射衰减从所述报告基因释放被转移的能量，所述淬灭剂的吸收带会至少基本上覆盖所述报告基因的荧光射线带以优化淬灭。非荧光淬灭剂或暗淬灭剂通常通过从被激发的报告基因吸收能量起作用，但不放射性地释放所述能量。
对于特定探针的适宜的报告基因-淬灭剂对的选择可根据已知技术进行。在例如Berlman的Handbook of Fluorescence Spectra of AromaticMolecules，第二版，Academic Press，New York，1971中列出并详述了可选择的来自示例性报告基因-淬灭剂对的荧光和暗淬灭剂以及它们相关的光学性能，其内容以引用的方式并入本文。在例如Haugland的Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes ofEugene,Oreg.,1992中可找到经由常见的反应基团（能添加至本发明的寡核苷酸）的共价连接修饰报告基因和淬灭剂的例子，其内容以引用方式并入本文。
优选的报告基因-淬灭剂对可选自呫吨类染料，包括荧光素和罗丹明染料。这些化合物的多个适宜形式可商购获得，所述化合物苯基上具有取代基，其可被用作结合位点或作为连接至寡核苷酸的结合官能团。另一个用作报告基因的优选的荧光化合物基团为萘胺，其在α-或β-位点具有氨基。包含在此类萘胺化合物中的有1-二甲基氨萘基-5磺酸、1-苯氨基-8-萘磺酸和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸。其他染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯；吖啶诸如9-异硫氰酸酯吖啶；N-(p-(2-苯并
唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并
二唑；芪类；芘等等。
最优选地，所述报告基因和淬灭剂选自荧光素和罗丹明染料。连接至寡核苷酸的这些染料和适当的连接方法为本领域所熟知。
淬灭剂的适宜的例子可选自6-羧基-四甲基-罗丹明、4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸（DABYL）、四甲基罗丹明（TAMRA）、BHQ-0TM、BHQ-1TM、BHQ-2TM、以及BHQ-3TM，其中每个购自Biosearch Technologies,Inc.ofNovato,Calif.，QSY-7TM、QSY-9TM、QSY-21TM和QSY-35TM，其中每个购自Molecular Probes,Inc.等。
报告基因的适宜的例子可选自染料诸如SYBR绿、5-羧基荧光素（5-FAMTM购自Applied Biosystems of Foster City,Calif.）、6-羧基荧光素（6-FAM），四氯-6-羧基荧光素（TET）、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素（HEX）、6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素（6-TETTM购自Applied Biosystems）、羧基-X-罗丹明（ROX）、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素（6-JOETM购自Applied Biosystems）、VICTM染料产品（购自Molecular Probes,Inc.）、NEDTM染料产品（购自Applied Biosystems）等。
包含报告基因和淬灭剂的探针的一个例子是处于单分子或双分子构象的蝎子探针。在单分子蝎子中，所述引物-探针复合物的探针部分侧翼为自身互补区，当所述探针从其靶DNA解绑时所述自身互补区使得所述探针形成茎-环结构。另外，在单分子蝎子（探针）中，报告基因通常连接在或靠近所述自身互补区的一个，诸如在所述蝎子探针的5'末端处，而淬灭剂连接在或靠近另一个所述自身互补区，诸如紧接所述非扩增接头的5'，使得当所述探针处于其茎-环构象时所述淬灭剂足够靠近所述报告基因以导致淬灭。在双分子蝎子（探针）中，通常不采用自身互补侧翼区，而是采用分离的“阻断寡核苷酸”或“淬灭寡核苷酸”结合所述蝎子探针。当所述探针从其靶DNA解绑时，这个阻断寡核苷酸能杂交至所述蝎子探针的探针区。另外，在双分子蝎子（探针）中，所述报告基因通常连接到所述蝎子探针的探针区，诸如所述蝎子探针的5'末端，而所述淬灭剂连接至所述阻断寡核苷酸，诸如所述阻断寡核苷酸的3'末端，使得当所述探针从其靶DNA解绑并且相反杂交至所述阻断寡核苷酸时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。
包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个例子是在5'-核酸外切酶测定中使用的探针，诸如
实时聚合酶链反应技术。在此上下文中，所述寡核苷酸探针邻近5'端其将具有足够数量的磷酸二酯键使得产生的5'至3'核酸酶活性能高效地降解所述绑定探针以分离所述报告基因和淬灭剂。包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个例子是Molecular Beacon型探针，其包含探针区，侧翼具有自身互补区，所述自身互补区使得所述探针从所述探针的靶序列解绑时形成茎-环结构。此类探针通常具有连接至或靠近一侧末端的报告基因和连接或靠近另一侧末端的淬灭剂，使得当所述探针处于解绑状态并且从而形成茎-环结构时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。
术语“复制抑制部分”是指任何连接至寡核苷酸的3'末端羟基的原子、分子或化学基团，其将阻止核酸链复制的链延伸的引发。例子包括但不限于：3'-脱氧核苷酸（例如，虫草素），双脱氧核苷酸，磷酸酯，配体（例如，生物素和二硝基苯酚），报告基因分子（例如，荧光素和罗丹明），碳链（例如，丙醇），错配的核苷酸或多核苷酸，或肽核酸单位。术语“非参与”是指对于核酸分子的扩增反应缺乏探针或引物的参与。具体地非参与探针或引物是将不作为底物或被DNA或RNA聚合酶延伸的探针或引物。“非参与探针”本质上不能通过聚合酶延伸链。它可以有或没有复制抑制部分。
当所述核酸分子的单链形式能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他核酸分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold SpringHarbor，NY（1989），尤其是在该文献第11章和表11.1（全文以引用方式并入本文）中进行了例示。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。对于同源核酸初步筛选，低严格性杂交条件对应于Tm为55℃，可使用例如5XSSC，0.1%SDS，0.25%牛奶，并且无甲酰胺；或30%甲酰胺，5XSSC，0.5%SDS。中度严格性杂交条件对应于更高的Tm，例如，40%甲酰胺，和5X或6XSSC。杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性（对应较高的Tm）按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经获得了计算Tm的方程式（参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51）。对于较短核酸（即寡核苷酸）的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性（参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8）。在一个优选的实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。更优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约11个核苷酸，至少约12个核苷酸，至少约13个核苷酸，至少约14个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少约16个核苷酸，至少约17个核苷酸，至少约18个核苷酸，至少约19个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约21个核苷酸，至少约22个核苷酸，至少约23个核苷酸，至少约24个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约26个核苷酸，至少约27个核苷酸，至少约28个核苷酸，至少约29个核苷酸，或者，最优选地，至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于例如，Sambrook等人（supra）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology中，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版（1987）。
寡核苷酸
已开发出通过检测选自Stx1A，Stx2A，eae，O26，O111，O121，O45，O103，O145，和O157的一个或多个基因靶标来检测STEC细菌的方法。在某些实施例中，所述方法涉及检测Stx1A和Stx2A之一或二者，以及检测eae，以及，任选地O26，O111，O121，O45，O103，O145，和O157中的一个或多个。在另外的实施例中，所述方法涉及检测SEQ IDNO:686-688中的一个或多个。在某些实施例中，所述方法涉及检测SEQID NO:686-687中的一个或多个，以及检测SEQ ID NO:688，以及任选地SEQ ID NO:689-696中的一个或多个。已开发出用于检测此类核苷酸序列和STEC细菌的后续检测和鉴定的寡核苷酸，包括正向和反向引物、探针和淬灭剂寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可用做聚合酶链反应扩增的引物。表1中示出了示例性的引物对和它们对应的靶标、阻断寡核苷酸和探针。
表1–靶序列和与其相关的引物、探针和淬灭剂
这些引物和探针的每个是基于大肠杆菌（E.coli）基因组的对应区域的序列分析而设计的。
在某些实施例中，用于扩增和/或检测SEQ ID NO:686的引物包含SEQ ID NO:1、48、或55、或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在其他的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:686的探针包含SEQ ID NO:16、49-52、或56、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，对于淬灭此类探针信号有用的淬灭剂包含SEQID NO:41、53、54、或57、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在附加的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:686的第二引物或反向引物包含SEQ ID NO:58或73、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，可使用这些序列的至少约16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个连续的核苷酸。
在某些实施例中，用于扩增和/或检测SEQ ID NO:687的引物包含SEQ ID NO:74、120、或125、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在其他的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:687的探针包含SEQ ID NO:89、121、122、或126、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，对于淬灭此类探针信号有用的淬灭剂包含SEQ ID NO:105、123、124、或127、或与其互补的序列的至少约15个连续的核苷酸。在附加的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:687的第二引物或反向引物包含SEQ ID NO:128、143、或144、或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，可使用这些序列的至少约16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个连续的核苷酸。
在某些实施例中，用于扩增和/或检测SEQ ID NO:688的引物包含SEQ ID NO:145，或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在其他的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:688的探针包含SEQ ID NO:160，或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，对于淬灭此类探针信号有用的淬灭剂包含SEQ ID NO:176，或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在附加的实施例中用于扩增和/或检测SEQ ID NO:688的第二引物或反向引物包含SEQ ID NO:191，或与其互补序列的至少约15个连续的核苷酸。在另外的实施例中，可使用这些序列的至少约16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个连续的核苷酸。
这些寡核苷酸引物也可用于其他核酸扩增方法诸如连接酶链反应（LCR）（Backman等人，1989，EP0320308；Carrino等人，1995，J.Microbiol.Methods23：3-20）；基于核酸序列的扩增（NASBA），（Carrino等人，1995，supra）；和自主序列复制（3SR）和‘Q复制酶扩增’（Pfeffer等人，1995Veterinary Res.Comm.19:375-407）。
本发明的所述寡核苷酸引物也可包含可检测的标签，例如5'末端标签。
此外，本发明的寡核苷酸也可用作杂交探针。表1中提供了有用的探针的一些例子。很多情况下采用使用DNA探针的杂交检测食物、临床的和环境样品中的病原体，并且一般来讲所述方法学对本领域技术人员是已知的。普遍认为探针杂交的敏感性和特异性的程度低于通过之前描述的扩增技术实现的敏感性和特异性。本发明的核酸探针也可具有可检测的标签，诸如在蝎子探针测定或在5'核酸外切酶检测测定中采用的报告基因-淬灭剂组合，诸如所述
测定。
在本发明的一个实施例中，可致使所述核酸探针的3'末端核苷酸无法通过核酸聚合酶延伸。此类阻断可例如通过复制抑制剂部分的连接进行，诸如报告基因或淬灭剂，通过连接部分，或通过在3'-末端核苷酸制备双脱氧核苷酸，连接至所述核酸探针的末端3'碳。作为另外一种选择，通过引入一个或多个经修饰的核苷酸间键合到所述寡核苷酸的3'末端，可致使所述核酸探针的3'末端对聚合酶的3'至5'的延伸活性不可透过。最低限度地，必须修饰所述3'末端核苷酸间键合，然而，可修饰附加的核苷酸间键合。在聚合酶链反应过程中阻止从所述核酸探针的3'末端伸长和/或封闭所述DNA聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性的核苷酸间修饰，可包括硫代磷酸酯键合、甲基膦酸酯键合，硼烷磷酸酯键合，以及其他类似聚合酶-抗性核苷酸间键合。阻止探针的3'延伸的一种替代方法是采用丝裂霉素C或其他类似抗肿瘤抗生素在所述探针的3'末端，形成加合物，诸如Basu等人，Biochemistry32:4708-4718，1993中所述。因此，只要不从所述核酸探针裂解所述淬灭剂，保护所述核酸探针的3'末端以免裂解的精确机制不是必需的。
在基于扩增的检测技术诸如在3'-核酸外切酶测定中，可任选地使用核酸探针序列和本发明的所述引物序列对。在表1中示出了优选的引物/探针组合。
在一些实施例中，在引物-探针复合物中同时使用了对应的引物和探针。在此类实施例中，所述探针的3'末端通常连接到所述引物的5'末端。本发明的这些引物-探针复合物可包含不可扩增的接头，其将所述探针区的3'末端连到所述引物区的5'末端。这个不可扩增的接头阻止互补链延伸进入所述引物-探针复合物的探针区。此类不可扩增的接头的例子包括六乙烯乙二醇（HEG）和优选地18-碳接头。本发明的引物-探针复合物也可包含自身互补区，当所述探针从其靶DNA解绑时其使得所述引物-探针复合物形成茎-环结构，这可用于例如使所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近，以导致所述报告基因信号被淬灭。在一些情况下，可使用淬灭剂寡核苷酸和引物-探针复合物，其中所述探针区从其靶DNA解绑时淬灭剂寡核苷酸能杂交至所述引物-探针复合物的探针区。如果所述报告基因连接到所述引物-探针复合物并且所述淬灭剂连接到所述阻断寡核苷酸，这将使所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近以使得淬灭发生。在表1中提供了对应的引物、探针和淬灭剂的例子。
测定方法
可以任何适宜的方式完成所述被选基因靶标和/或由SEQ ID NO:686-696确定的所述基因组DNA区的检测，以及样品中STEC细菌的存在的后续检测。优选的方法是引物导向的扩增方法和核酸杂交方法。这些方法可用于检测样品中的STEC细菌，所述样品是复合的基质或是经纯化的培养物，例如，来源于疑似被污染的动物、环境或食物来源。
本发明的优选的实施例包括：（1）在非选择性生长培养基中培养复合样品混合物以复苏靶细菌，（2）释放总靶细菌DNA，以及（3）采用本发明的引物对和任选地包含可检测的标签的核酸探针，对总DNA实施扩增方案。
引物导向的扩增测定方法
本领域已知有多种引物导向的核酸扩增方法可用于本发明中，包括热循环方法（例如，聚合酶链反应（PCR），反转录-聚合酶链反应（RT-PCR），和LCR），以及等温方法和链置换扩增反应（SDA）。优选的方法是聚合酶链反应（PCR）。在一个优选的实施例中，表1中列出的对应的正向和反向引物对可用作引物用于引物导向的核酸扩增，以检测所述所关注的靶基因和/或SEQ ID NO:686-696，并且最终地检测和鉴定STEC细菌。
样本制备：
根据本发明的所述寡核苷酸和方法可直接用于任何适宜的临床或环境样品，无需样本制备。为了获得更高的灵敏度，并且在时间不是限制性因素的情况下，预处理所述样品并且进行预扩增富集是优选的。
检测食品源性细菌病原体的最低行业标准为，可靠地检测25克的食品基质中一个病原体细胞的存在的方法，如Andrews等人，1984，“FoodSample and Preparation of Sample Homogenate”，Bacteriological AnalyticalManual,第八版的第一章，Revision A，Association of Official AnalyticalChemists，Arlington，VA中所述。为了满足这个严格的标准，已开发出富集方法和培养基以增强所述靶病原体细胞的生长，以通过生物化学，免疫学或核酸杂交方法方便其检测。典型的富集步骤使用了培养基，其将增强所述靶细菌的生长和健康并且也会抑制存在的任何背景或非靶微生物的生长。例如，USDA示出了对于富集碎牛肉的样品以测试病原性大肠杆菌（E.coli）的方案（美国食品和药物管理局，Bacterial AnalyticalManual）。
已开发出多种细菌病原体的选择性培养基，本领域技术人员了解选择适于待富集的特定生物体的培养基。非选择性培养基的综述性讨论和配方在由Association of Analytical Chemists，Suite400，2200Wilson Blvd，Arlington，VA22201-3301出版和发行的FDA Bacteriological AnalyticalManual（1998）中有所描述。
在选择性生长后，取出所述复合混合物的样品用于进一步分析。这个取样步骤可以通过本领域的技术人员熟知的多种方式完成。在一个优选的实施例中，取出5μl所述富集培养物，然后添加至200μl的包含蛋白酶的裂解溶液中。加热所述裂解溶液至37℃，20分钟，随后在95℃蛋白酶失活10分钟，如
System User’s Guide(DuPont Qualicon,Inc.,Wilmington,DE)中所述。
聚合酶链反应（PCR）测定方法：
用于检测本发明的基因靶标和随后样品中STEC细菌的存在的优选的方法包括（a）对SEQ ID NO:686-696中的两个或多个使用表1中列出的引物对进行PCR扩增以得到PCR扩增结果；以及（b）检测所述扩增，从而所述扩增阳性检出表明了样品中STEC细菌的存在。
在另一个优选的实施例中，在进行PCR扩增之前，可进行制备所述样品的步骤。所述制备步骤可包括下列步骤的至少一个：（1）细菌富集，（2）从所述样品分离细菌细胞，（3）细胞裂解，以及（4）总DNA提取。
扩增条件：
技术人员会理解，使用根据本发明的寡核苷酸，任何一般来讲可接受的PCR条件可用于成功检测所述基因靶标和所述靶STEC细菌，并且根据待测样品和其他实验室条件，对PCR条件进行常规优化可能是必要的，以达到最佳的灵敏度和特异性。理想情况下，他们实现了来自所有的预期特定靶标的PCR扩增结果而对于其他的非靶标物种没有给出PCR结果。
检测/检验/分析：
SEQ ID NO:686-696的引物导向的扩增产物可用多种方法分析。匀质检测是指用于检测扩增产物的优选的方法，其中不需要分离（诸如通过凝胶电泳）来自模版或引物的扩增产物。通常通过在扩增过程中或紧接扩增测量所述反应混合物的荧光水平完成均质检测。此外，在本发明中能使用异质检测方法，其涉及在检测过程中或之前分离扩增产物。
可使用匀质检测以实施“实时”引物导向的核酸扩增和检测，使用本发明的引物对（例如，“实时”PCR和“实时”反转录PCR）。在美国专利6,171,785，5,994,056，6,326,145，5,804,375，5,538,848，5,487,972，和5,210,015中示出了优选的“实时”方法，其中的每个据此全文引入以供参考。
尤其优选的“实时”检测方法是在美国专利6,326,145中示出的所述蝎子探针测定法，其据此全文引入以供参考。在所述蝎子探针测定法中，使用蝎子探针（单分子或双分子）作为引物-探针复合物进行PCR扩增，所述蝎子探针具有一个适当的报告基因-淬灭剂对，使得在所述引物伸长之前淬灭所述报告基因的可检测的信号。伸长后，所述淬灭效应被消除，并且存在的信号数量被定量。随着扩增产物数量增加，将会观察到可检测的信号的等同增加，从而使得将存在的扩增产物的数量确定为测得的可检测信号数量的函数。当在本发明的蝎子探针测定法中使用多于一种的蝎子探针时，每种探针可连接不同的可检测的标签（例如，报告基因-淬灭剂对），从而允许独立于其他探针地检测每种探针。
在某些实施例中，使用不同标记的蝎子探针进行SEQ ID NO:686-696中的两个或多个的扩增和检测。表1提供了引物和探针的例子，包括其导向的所述靶序列。表2、表3和表8中提供了引物、探针和淬灭剂的附加的具体例子，其能被单独或组合使用以检测STEC细菌。
另一个优选的“实时”检测方法是所述5'-核酸外切酶检测方法，如美国专利5,804,375，5,538,848，5,487,972，和5,210,015中示出的，其中的每个据此全文引入以供参考。在所述5'-核酸外切酶检测中，在PCR过程中使用修饰过的探针，其结合在所述扩增引物对的两个成员中间或之间。所述修饰过的探针具有报告基因和淬灭剂，并且被设计为在PCR过程中生成可检测的信号以表明其已经与所述靶核酸序列杂交。只要所述报告基因和所述淬灭剂都在所述探针之上，所述淬灭剂则使所述报告基因停止发射可检测的信号。然而，在扩增过程中随着聚合酶延伸所述引物，所述聚合酶固有的5'至3'核酸酶活性降解了所述探针，将所述报告基因和所述淬灭剂分离，并且使得可检测的信号能够被发射。一般来讲，在扩增循环过程中生成的可检测的信号的数量与每个循环中生成的产物数量成正比。
已经熟知淬灭的效率是所述报告基因和所述淬灭剂的接近度的强函数，即，随着两个分子逐渐靠近，所述淬灭效率增加。由于淬灭强烈依赖于所述报告基因和所述淬灭剂的物理接近，所述报告基因和所述淬灭剂优选地连接至所述探针，彼此在几个核苷酸内，通常彼此在30个核苷酸内，更优选地在从约6至16个核苷酸的分离内。通常，通过将报告基因-淬灭剂对的一个成员连接至所述探针的5'末端，并且将另一个成员连接至约6至16个核苷酸之外来实现这种分离。
另外，当在本发明的5'-核酸外切酶检测分析中使用多于一种的探针时，诸如导向SEQ ID NO:686-696中的两个或更多个的一种探针，每种探针可连接不同的可检测的标签（例如，报告基因-淬灭剂对），从而允许独立于其他探针地检测每种探针。
匀质检测的另一个优选的方法涉及DNA熔融曲线分析的使用，尤其是采用来自DuPont Qualicon Inc.的
系统硬件和试剂片。在美国专利6,312,930以及PCT公开WO97/11197和WO00/66777中给出了所述系统的细节，其中的每个据此全文引入以供参考。
熔融曲线分析通过监测在每个扩增循环过程中在选定的时间点处的所述靶标扩增产物（“靶扩增子”）的荧光对双链核酸分子（“dsDNA”or“靶”）进行检测和定量。
如技术人员所熟知的，当温度高于双链DNA的熔融温度时，双链DNA的两条链分离或熔融。双链DNA分子的熔融是一个过程，并且在给定溶液条件下，熔融起始于一个温度（以下被指定为TMS），并且结束于另一个温度（以下被指定为TME）。熟悉的术语，Tm，被指定为熔融完成50%时的温度。
典型的PCR循环涉及变性期，其中所述靶双链DNA熔融，涉及引物退火期，其中所述温度最适合于引物结合现已单链的靶标，以及链伸长期（在温度TE处），其中所述温度最适于DNA聚合酶起作用。
根据本发明，TMS应比TE高，并且TME应低于（通常基本上低于）DNA聚合酶热失活的温度。熔融特性受到给定双链DNA分子内在属性的影响，诸如脱氧核苷酸组合物和所述双链DNA的长度。
嵌入染料会结合到双链DNA。当暴露于适当的光激发波长时，所述染料/双链DNA复合物会产生荧光，其取决于染料，并且所述荧光的强度可与所述双链DNA的浓度成比例。利用DNA嵌入染料检测和定量双链DNA的方法是本领域已知的。对于这些目的，许多染料是已知的并用于本领域。本方法也利用了此类关系。
此类嵌入染料的例子包括但不限于SYBR
溴化乙锭，碘化丙啶，
{喹啉，1-1'-[1,3-丙二基双[(二甲基亚氨基)-3,1-丙二基]]双[4-[(3-甲基-2(3H)-苯并
唑亚基)甲基]]-，四碘化物}，和
{喹啉，4-[(3-甲基-2(3H)-苯并
唑亚基]甲基]-1-[3-(三甲基氨基)-丙基]-,二碘化物}。本发明最优选的是非对称氰化物染料，诸如由MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)生产的SYBR
通过监测温度增加时荧光的变化实现熔融曲线分析。当温度到达对于靶扩增子特异性的TMS时，所述双链DNA开始变性。当所述双链DNA变性时，所述嵌入染料从DNA解离并且荧光降低。荧光的对数值的变化的负值除以温度的变化对所述温度作图，这一数学分析得到被称为熔融曲线的峰图。
应当理解本发明能使用这些技术的组合进行操作，诸如通过用蝎子探针导向一个靶区域并且用
探针导向第二个靶区域。也应当理解本发明不限于上述技术。相反，本领域技术人员会认识到也可使用本领域已知的用于检测扩增的其他技术。例如，可使用核酸探针实施诸如基于PCR的定量序列检测的技术，当在溶液中以单链状态存在时，所述核酸探针被构造成使得所述报告基因和淬灭剂足够接近以基本上淬灭所述报告基因的射线。然而，在所述未受损的报告基因-淬灭剂核酸探针与扩增的靶核酸序列杂交时，所述报告基因和淬灭剂足够远离彼此。因此，所述淬灭被基本上减弱导致检测到的荧光射线增加。
除了匀质检测方法，本领域已知多种其他异质检测方法可用于本发明中，包括标准非变性凝胶电泳（例如，丙烯酰胺或琼脂糖），变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳。标准非变性凝胶电泳是一种简单和快速的PCR检测方法，但可能不适于所有应用。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种分离方法，其检测小DNA片段（200-700bp）在变性行为上的差异。所述分离的原理是基于片段长度和核苷酸序列两者。在相同长度的片段中，能够检测出小到一个碱基对的差异。这与非变性凝胶电泳相反，其中仅根据大小分离DNA片段。非变性凝胶电泳结果的这种限制因为DNA分子间的电荷密度接近中性，并且在它们的分离中不起作用。随着所述DNA片段大小的增加，它通过凝胶的速度减小。
DGGE主要用于基于它们的变性特征和序列分离相同大小的DNA片段。使用DGGE，当加热或采用化学变性剂时，DNA分子的两条链分离，或熔融。DNA双链的变性受到两个因素的影响：1）在互补碱基对间形成的氢键（由于富含GC区域熔融的变性条件高于富含AT的区域）；以及2）同一条链的相邻碱基间的吸引力，或“堆集”。因此，DNA分子可具有多个熔融域，其中它们各个的特征变性条件的每个由它们的核苷酸序列确定。另外，DGGE利用一个事实，即具有相同长度和DNA序列（在特定变性域内仅有一个核苷酸的例外）的相同的DNA分子，在不同的温度或Tm处变性。因此，当所述双链（ds）DNA片段通过增加的化学变性剂梯度电泳时，它开始变性并经历构象和流动性两种变化。所述双链（ds）DNA片段行进会比变性的单链（ss）DNA片段快，因为在凝胶基质中所述分子的单链部分的分支化结构变成缠结的。随着所述变性环境增强，所述双链DNA片段会完全分离，并且分子通过凝胶的流动性被阻滞在DNA链分离的特定低变性域的变性浓度处。在实践中，电泳是在恒定的温度下进行（60℃左右）并且在将导致DNA分子100%变性的浓度处使用化学变性剂（即，40%甲酰胺和7M尿素）。这个可变变性梯度是由梯度仪生成的，使得每种DGGE凝胶的组合物从0%变性剂至100%变性剂逐渐变化。当然，也可加入包含降低变性剂范围的梯度（例如，35%至60%）以增强DNA的分离。
用于DGGE中的原理也可应用于第二种方法，其使用温度梯度替代化学变性剂梯度。这个方法被称为温度梯度凝胶电泳（TGGE）。这种方法使用温度梯度诱导从双链DNA至单链DNA的构象变化，以分离具有不同序列的相同大小的片段。如在DGGE中，具有不同核苷酸序列的DNA片段会停留在凝胶中的不同位点。可使用引物设计中的变型有利于增加DGGE对于所述PCR产物的表征和识别的实用性。这些使用引物设计变型的方法和原理在PCR Technology Principles and Applications，Henry A.Erlich Ed.，M.Stockton Press，NY，pages71to88（1988）中有所描述。
仪器：
当使用匀质检测时，优选地使用激光荧光计测量荧光水平，例如ABIPrism Model7500Fast Sequence Detector。然而，本发明包括了用于测量样品中荧光水平的类似检测系统。
试剂和试剂盒：
可使用任何形式的任何适宜的核酸复制组合物（“复制组合物”）。用于PCR扩增的典型的复制组合物可包含，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，靶标特异性引物和适宜的聚合物。
如果所述复制组合物是液体形式的，可使用在本领域中已知的适宜的缓冲剂（Sambrook，J.等人，supra）。
作为另外一种选择，如果所述复制组合物包含在片剂形式中，则典型的片剂化试剂可包括诸如稳定剂和结合剂。在美国专利4,762,857和4,678,812中示出了优选的片剂化技术，其中每个据此全文引入以供参考。
本发明的优选的复制组合物包含（a）选自表1的至少一对引物对，和（b）热稳定的DNA聚合酶。另一个优选的复制组合物包含（a）选自表1的至少两对引物对，每对导向不同的靶标DNA区域；和（b）热稳定的DNA聚合酶。在一些实施例中，包括了引导SEQ ID NO:686-696中的三个或更多个的引物对。在另外的实施例中，包括了引导SEQ ID NO:686-696中的四个或更多个的引物对。在另外的实施例中，包括了引导SEQ IDNO:686-696中的五个或更多个的引物对。
本发明的更优选的复制组合物包含（a）选自表1的至少两对引物对和任何对应的探针或阻断寡核苷酸，其中使用的每个核酸探针或引物-探针复合物包含可检测的标签；和（b）热稳定的DNA聚合酶。优选地，所述可检测的标签包含报告基因，其能够发射可检测的信号和淬灭剂，其能够基本上淬灭所述报告基因，并且当所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近时阻止可检测的信号的发射。
本发明的优选的试剂盒包含上述复制组合物的任一种。本发明的优选的片剂包含上述复制组合物的任一种。更优选地，本发明的试剂盒包含前述优选的片剂。
在一些情况下，在反应中可包括内部阳性对照。所述内部阳性对照可包括对照模板核酸（例如DNA或RNA），对照引物和对照核酸探针。之前已经描述包含在PCR反应内的内部阳性对照的优点（美国专利6,312,930和PCT申请WO97/11197，其中的每个据此全文引入以供参考），并且包括：（i）可使用单引物扩增所述对照物；（ii）所述对照扩增产物的数量不依赖于样品中包含的任何靶标DNA或RNA；（iii）所述对照DNA能用其他扩增试剂标记以易于使用，并且在手动和自动测试程序中都有高度重复性；（iv）所述对照可用于均质检测，即，不从反应物分离产物DNA；并且（v）所述内参具有不同于反应中其他潜在扩增产物的熔融特征，和/或在所述对照核酸上具有可检测标签，其不同于引导至所述靶标的核酸探针上的所述可检测的标签。
对照DNA将具有适当的大小和碱基组合物以允许在引物引导的扩增反应中扩增。可从大肠杆菌（E.coli）基因组或从另一个来源获得所述对照模板DNA序列，但必须在相同条件下可重复扩增以允许所述靶标扩增产物的扩增。
优选的对照序列包括，例如，定向SV40DNA的对照引物和探针。
所述对照反应适用于验证所述扩增反应。所述对照DNA的扩增发生在与被测试的所述样品相同的反应管中，因此当样品为靶标阴性、即没有生成靶标扩增产物时，表明是成功的扩增反应。为了获得所述扩增反应的显著验证，在每个扩增反应中必须包括适宜数量的所述对照DNA模板的复制。
在一些情况下，包括附加的阴性对照复制组合物可能是有用的。所述阴性对照复制组合物将包含与所述复制组合物相同的试剂，但没有聚合酶。当所述方法使用荧光检测方法时，此类对照的主要作用是监测均质形式的伪背景荧光。
可根据是否设计用于扩增靶标DNA或对照DNA来修饰复制组合物。将扩增所述靶标DNA的复制组合物（测试复制组合物）可包含（i）聚合酶（一般来讲是热稳定的），（ii）能杂交至所述靶标DNA的引物对，和（iii）用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。将扩增所述对照DNA（阳性对照或阳性复制复合物）的复制组合物可包含（i）聚合酶（一般来讲是热稳定的）；（ii）所述对照DNA；（iii）至少一个能够杂交至所述对照DNA的引物；和（iv）用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。此外，用于靶DNA或对照DNA扩增的所述复制组合物可包含核酸探针，优选地其具有可检测的标签。
核酸杂交方法
除了引物引导的扩增测定方法，在本发明中能使用核酸杂交测定方法用于STEC细菌的检测。核酸杂交测试的基本组成包括探针、怀疑含有STEC细菌的样品及特定的杂交方法。通常探针长度变化可从少至5个碱基至诊断序列的全长，并且将取决于要完成的特定测试。只需要探针分子的一部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基未与正确的互补碱基配对。
在核酸杂交方法中尤其有用的探针是SEQ ID NO:1-696，或由其衍生的序列的任一种。
所述样品可包含也可不包含STEC细菌。所述样品可采取多种形式，然而一般来讲是从怀疑被污染的动物、环境或食物来源提取的。可直接检测所述DNA，但最优选地，在探针和靶标分子的杂交能够发生之前必须备妥所述样品核酸以接触所述探针。因此生物体的DNA优选地不含细胞并在杂交能够发生前被置于合适的条件下。溶液法杂交的方法使所述DNA的纯化成为必需，以获得所述样品DNA和所述探针的杂交。这意味着采用溶液法检测样品中靶序列需要首先纯化所述样品中的核酸以去除蛋白、脂质和其他细胞组分，随后在杂交条件下与所述探针接触。用于纯化所述样品核酸的方法是常见的和本领域熟知的（Sambrook等人，supra）。
在一个优选的实施例中，可直接在细胞溶解物中进行杂交测定，无需提取核酸。这省去了样品处理方法中的多个步骤并加快测定。为在粗制细胞溶解物中进行此类测定，通常需要在如上所述制备的细胞溶解物中加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，所述离液剂允许短寡核苷酸探针与DNA在室温下进行灵敏和严格的杂交（Van Ness和Chen，Nucl.AcidsRes.19:5143-5151（1991））。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。通常，离液剂的终浓度将为约3M。如果需要，技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中，通常为30-50%（v/v）。
作为另外一种选择，可在探针杂交之前纯化所述样品核酸。对于本领域技术人员多种方法是已知的（例如，苯酚-氯仿提取，IsoQuick提取(MicroProbe Corp.，Bothell,WA)，以及其他方法）。预杂交纯化对于标准过滤器杂交测定尤其有用。此外，通过结合体外RNA扩增方法诸如自主序列复制（参见例如Fahy等人，In PCR Methods and Applications，ColdSpring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1991），页数25-33）或反转录酶PCR（Kawasaki，In PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，M.A.Innis等人，Eds.，（1990），页数21-27）纯化方便了测量以增加测定灵敏度。
一旦DNA被释放，可通过多种方法中的任一种对它进行检测。然而，最适用的实施例具有速度、方便、灵敏度和特异性中的至少一些特性。
杂交方法在本领域为人们所熟知。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20%至60%体积，优选30%体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50%v/v甲酰胺、约0.15M至1M氯化钠、约0.05M至0.1M缓冲剂，诸如柠檬酸钠、Tris-1MHCl、PIPES或HEPES（pH范围约6-9）、约0.05%至0.2%去污剂，诸如十二烷基硫酸钠，或0.5-20mM之间的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)（约300-500千道尔顿）、聚乙烯吡咯烷酮（约250-500千道尔顿）和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA（如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA），以及任选约0.5%至2%重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂，诸如体积排阻剂，其包括多种极性水溶性或可膨胀试剂（例如聚乙二醇）、阴离子聚合物（例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯）和阴离子糖类聚合物（例如硫酸葡聚糖）。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要组分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价联接到其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与DNA序列的一部分互补。
测定试剂盒可包括夹心测定。此试剂盒将包含第一组分以用于收集疑似被污染的样品和缓冲剂，所述缓冲剂用于所述样品的支出和裂解。第二组分将包含干燥或液体形式的介质，用于靶标和探针多核苷酸的杂交，以及用于通过洗涤去除不期望和非双链的形式。第三组分包含固体支持体（量油计），其上固定了（或共轭了）未标记的核酸探针，所述核酸探针与所关注的一个或多个靶标互补，例如SEQ ID NO:686-696中的一个或多个。第四组分包含标记探针，其与所述相同DNA链的第二个不同的区域互补，其杂交至所述第三组分的固定的未标记核酸探针。
在一个优选的实施例中，SEQ ID NO:1-685或其衍生物可被用作同质或异质测定形式的3'封端的检测探针。例如，由这些序列生成的探针可为3'封端的或非参与性的，并且将不会通过核酸扩增反应被延伸、或参与核酸扩增反应。另外，所述探针掺入了能充当活性配体的标签，其作为所述探针/分析物杂交体的固定的连接点，或作为报告基因以产生可检测的信号。因此，分离自疑似大肠杆菌（E.coli）污染的样品的基因组或cDNA，在过量的所述3'封端的检测探针的存在下，通过标准的引物引导的扩增方案进行扩增以生成扩增产物。因为所述探针是3'封端的，它不会参与或干扰所述靶标的扩增。在最终的扩增循环后，所述检测探针退火至所述扩增DNA的相关部分，随后通过所述活性配体在载体上捕获所述退火的复合物。
在一些情况下希望掺入标记了dNTP的配体，在复制组合物中带有所述标签探针以利于所述PCR反应产物在载体上的固定以及随后通过所述标记探针试剂的方法检测所述被固定的产物。例如生物素、地高辛或地高辛标记的dNTP可被添加至PCR反应组合物。所述生物素、地高辛或掺入地高辛的PCR产物可随后分别固定至链霉抗生物素蛋白、抗地高辛或抗地高辛抗体载体上。随后可通过所述探针标签的存在检测所述固定的PCR产物。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。
实例1
所述stx，eae，O157，O45，O103，和O145引物和探针的包容性/排
他性的测定
分析生物体样品以确定指向stx1/2，eae，O157，O45，O103，和O145靶标的本发明的
探针的包容性/排他性。对于包容性，使用了适于每个测定（O157:H7，O45，O103和O145，以及包含stx1，stx2，和eae的多个其他生物体）的独立的真实的STEC分离物。对于排他性，使用密切相关的非靶标生物体，包括并非所述测试的靶标的其他STEC生物体，以保证所述测定法可将所述靶标生物体和其他非靶标生物体区分开。
DNA溶解物的制备
被测材料是所述靶标和非靶标生物体在37℃、BHI培养基中过夜生长的纯培养物。纯培养物生长过夜至大约1×109cfu/ml的细胞密度。对于排他性，测试了未稀释的过夜培养物。对于包容性，过夜培养物以大约1:10,000稀释至TSB中。20μl的待测所述材料加入200μl的
裂解试剂(DuPont Qualicon,Wilmington,DE)。所述混合物在37℃孵育20分钟，随后在95℃再孵育10分钟，并且最终冷却至5℃。
PCR条件
5-30μl的DNA溶解物被用于水合物冻干的PCR反应组分以获得DNA溶解物/PCR反应组分混合物。所述PCR反应组分包括冻干的试剂片，其包含APTATaqDNA聚合酶(Roche,Mannheim,Germany)，脱氧核苷酸(Roche DiagNOtics,Indianapolis,IN)，BSA，surfactamps(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，和阳性对照DNA。此外，在表2和3中列出的所述引物、淬灭剂和
包括在提供的数量中。对于
探针，表2和3中也提供了所述5'末端标签和接头。这些
探针的每个被设计为双分子
使得其结构包括（以5'至3'顺序）5'荧光末端标签、探针序列、18-碳不可扩增的接头和引物序列。表2和3也列出了淬灭标签，其被连接至对应的淬灭剂寡核苷酸的3'末端。
表2-用于包容性和排他性测试的核酸引物、探针和淬灭剂
表3-用于包容性和排他性测试的核酸引物、探针和淬灭剂
在Q7仪器(DuPont Qualicon,Wilmington,DE)上进行扩增和测试。热循环条件如下：在94℃下2分钟，随后在94℃下10秒钟43个循环，然后63℃下40秒，在每个循环的63℃步骤中捕集荧光信号。
结果
由表4至7可以看出，各个
探针都能将多个靶标同非靶标区分开。
表4–O45，O103，和O145包容性
表5–O157:H7，stx，和eae包容性
表6–非大肠杆菌（E.coli）排他性
表7–大肠杆菌（E.coli）排他性
nt=未测试
实例2
O26，O111，和O121引物和探针的包容性/排他性测定
由于O26，O111，和O121是附加的STEC细菌的菌株，分析生物体的样品以建立本发明的多个O26，O111，和O121
探针的包容性和排他性。对于包容性，使用了独立的，真实的大肠杆菌（E.coli）O26，O111，和O121分离物。对于排他性，使用了非大肠杆菌（E.coli）菌种和不属于这三种血清型的大肠杆菌（E.coli）以确保所述测定法会将所述靶标生物体（O26，O111，和O121）同其他细菌区分开。
DNA溶胞产物制备
使用实例1中所述方法学制备DNA溶解物
PCR条件
30μl的DNA溶胞产物被用于水合物冻干的PCR反应组分，以获得实例1中所述的DNA溶胞产物/PCR反应组分混合物。表8列出的所述引物和探针包括提供的数量。对于所述
探针，在表8中也提供了所述5'末端标签,内部标签和接头。这些
探针的每个被设计为单分子
使得其结构包括（以5'至3'顺序）5'荧光末端标签、5'茎序列、探针序列、3'茎序列、内部淬灭剂、18-碳非可扩增的接头、以及引物序列，其中所述5'和3'茎序列是彼此的反向互补序列，使得它们形成茎-环结构，导致当所述探针未绑定其靶标时所述5'末端标签的淬灭。
表8-用于包容性和排他性测试的核酸引物、探针和淬灭剂
在
Q7仪器(DuPont Qualicon,Wilmington,DE)上进行扩增和测试。所述热循环条件如下：在94℃下2分钟，随后在94℃下10秒钟40个循环，然后63℃下40秒，在每个循环的63℃步骤中捕集荧光信号。
结果
如表9-11中所示，使用多个
探针，本发明的方法能够将O26，O111，和O121血清型同非靶标菌株区分开，非靶标菌株包括其他O-型的大肠杆菌（E.coli）菌株和非大肠杆菌（E.coli）菌株（空白结果表明阴性结果）。
表9–O26，O111，和O121包容性
表10–非大肠杆菌（E.coli）菌种的排他性
表11–对其他大肠杆菌（E.coli）O-型的排他性
Claims (19)
1.用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:688的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO:145或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；并且其中所述探针包含SEQ ID NO:160或其互补序列的至少15个连续的核苷酸；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:191或其互补序列的至少15个连续的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一引物包含选自SEQ ID NO:146-159的序列，所述第二引物包含选自SEQ ID NO:192-205的序列，并且所述探针包含选自SEQ ID NO:161-175的序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述探针的3'末端直接或间接连接到所述第一引物的5'末端，形成引物-探针复合物，并且其中所述引物-探针复合物被可检测地标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:176的至少15个连续的核苷酸。
6.用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:686的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；并且其中所述第一引物和探针选自：
(I)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:16或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；
(II)包含SEQ ID NO:1或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:49或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；以及
(III)包含SEQ ID NO:55或其互补序列的第一引物，以及包含SEQID NO:56或其互补序列的探针；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:58的至少15个连续的核苷酸或包含SEQIDNO:73。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一引物包含选自SEQ ID NO:2-15，48的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NO:59-72的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID NO:17-30，49-52的序列。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述探针的3'末端直接或间接连接到所述第一引物的5'末端，形成引物-探针复合物，并且其中所述引物-探针复合物被可检测地标记。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:53、54、或57，或包含SEQ ID NO:31的至少15个连续的核苷酸。
11.用于检测样品中STEC细菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述应混合物包含用于扩增和检测SEQ ID NO:687的至少一部分的第一引物、第二引物和探针；其中所述第一引物、第二引物和探针的每个包含5'末端和3'末端；并且其中所述第一引物和探针选自：
(I)包含SEQ ID NO:74或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:89或其互补序列的至少15个连续的核苷酸的探针；
(II)包含SEQ ID NO:120或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:121或122或其互补序列的探针；以及
(III)包含SEQ ID NO:125或其互补序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:126或其互补序列的探针；
(b)使用步骤（a）的所述反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测步骤（b）的所述扩增。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:128的至少15个连续的核苷酸或包含SEQ ID NO:143或144。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一引物包含选自SEQ IDNO:75-88的序列；所述第二引物包含选自SEQ ID NO:129-144的序列；并且所述探针包含选自SEQ ID NO:90-104的序列。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述探针的3'末端直接或间接连接到所述第一引物的5'末端，形成引物-探针复合物，并且其中所述引物-探针复合物被可检测地标记。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，所述淬灭剂寡核苷酸包含SEQ ID NO:123、124、或127，或包含SEQ ID NO:105的至少15个连续的核苷酸。
16.根据权利要求1、6或11所述的方法，其中所述样品包括食物样品或水样品。
17.包含引物-探针复合物的分离的多核苷酸，其中所述引物-探针复合物包含：
(A)引物区和探针区，所述引物区包含含有SEQ ID NO:1的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，所述探针区包含SEQ ID NO:16的至少15个连续的核苷酸；
(B)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:48，所述探针区包含选自SEQ ID NO:49-52的核酸序列；
(C)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:55，所述探针区包含SEQ ID NO:56；
(D)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:74的至少15个连续的核苷酸，所述探针区包含SEQ ID NO:89的至少15个连续的核苷酸；
(E)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:120，所述探针区包含选自SEQ ID NO:121-122的核酸序列；
(F)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:125，所述探针区包含SEQ ID NO:126；以及
(G)引物区和探针区，所述引物区包含SEQ ID NO:145的至少15个连续的核苷酸，所述探针区包含SEQ ID NO:160的至少15个连续的核苷酸；
其中所述探针区和所述引物区各自具有5'和3'末端，其中所述探针区的所述3'末端经由接头部分连接到所述引物区的所述5'末端，并且其中所述引物-探针复合物还包含可检测的标签。
18.用于检测样品中STEC细菌的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求17所述的分离的多核苷酸。
19.试剂片，包含根据权利要求18所述的复制组合物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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