CN1973052B

CN1973052B - 检测和区分病原性大肠杆菌的dna序列

Info

Publication number: CN1973052B
Application number: CN2005800211942A
Authority: CN
Inventors: 弗兰克·R.·伯恩斯
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: AU2005267200B2; EP1759017A1; CA2566336C; CA2566336A1; ES2380630T3; AU2005267200A1; JP2008504031A; ATE542919T1; JP4782784B2; WO2006012323A1; US20090068647A1; US8232057B2; BRPI0512489A; CN1973052A; EP1759017B1

Abstract

特异性检测和区分复合样品中病原性大肠杆菌的寡核苷酸序列和方法。所述复合样品可以是食品样品、水样品，或者选择性富集的食品基质。本发明的检测方法可以使用有或无内部阳性对照物的PCR扩增方法及合适的引物对。进行所述方法的试剂可以在试剂盒中或者以片剂形式提供。

Description

检测和区分病原性大肠杆菌的DNA序列

发明领域

本发明涉及一种基于核酸序列的存在而快速检测和区分大肠杆菌的方法，特别涉及基于PCR的检测方法，及涉及用于此目的的寡核苷酸分子和试剂及试剂盒。

发明背景

大肠杆菌是一种革兰氏阴性杆状细菌。尽管大多数大肠杆菌菌株是良性的并且作为在人及其它动物中正常的肠道细菌而被发现，但一些菌株是病原性的并且有时可以导致致命疾病。病原性大肠杆菌的不同菌株的流行病学、临床进程和导致疾病发作的潜力不同。疾病通常通过粪/口途径传播。

病原性(pathogenicity)与一些血清型相关联，如由O和H抗原定义的血清型。不同的病原性血清型与不同的临床疾病进程相关，并且与从公众健康观点出发的不同水平考虑考虑相关。一些疾病的暴发是由携带病原性大肠杆菌的食品和水引起的。

特别是一种血清型大肠杆菌O157:H7与几种食品和水导致的暴发相关并且被USDA规定为绞细牛肉中的掺杂物为零耐受标准。

由于大肠杆菌是遍在的，并且大多数血清型是非病原性的，因此检测病原性血清型及区分牵涉在不同的临床和公众健康问题中的病原性血清型的能力是有用的。

因此希望具有一种快速检测病原性大肠杆菌及区分涉及较高公众健康和疾病控制考量的那些病原性大肠杆菌的测试方法。

发明概述

本发明包括：

一种检测样品中病原性大肠杆菌存在的方法，所述方法包括(a)使用选自如下一组的引物对对样品进行PCR扩增：(i)SEQ ID NO：2和3，(ii)SEQ ID NO：5和6，(iii)SEQ ID NO：8和9，(iv)SEQ ID NO：10和11，(v)SEQ ID NO：13和14，及(vi)SEQ ID NO：16和17，以产生PCR扩增结果；(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果以检测所述引物对的扩增产物，其中所述引物对的扩增产物的阳性检测结果提示样品中存在病原性大肠杆菌。优选地，所述引物对选自由(a)(ii)、(a)(iii)和(a)(iv)组成的组。

一种检测样品中病原性大肠杆菌存在的方法，所述方法包括：(a)使用选自如下一组的两种不同引物对对样品进行PCR扩增：(i)SEQID NO：2和3，(ii)SEQ ID NO：5和6，(iii)SEQ ID NO：8和9，(iv)SEQID NO：10和11，(v)SEQ ID NO：13和14，和(vi)SEQ ID NO：16和17，以产生PCR扩增结果；(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果以检测所述两种不同引物对的扩增产物，其中所述两种不同引物对的扩增产物的阳性检测结果提示样品中存在病原性大肠杆菌。这两种不同引物对优选包含(a)(ii)和(a)(iii)，更优选包括(a)(ii)和(a)(iv)。

在任何上述方法的步骤(b)中，均使用解链曲线分析来检测扩增产物。

任何上述方法均进一步包括在步骤(a)之前制备用于PCR扩增的样品的步骤。优选地，所述制备步骤包括至少一个如下步骤：(1)细菌富集，(2)从样品中分离细菌细胞，(3)细胞裂解，及(4)总DNA提取。

在任何上述方法中，其中所述样品包括食品样品、水样品，或者选择性富集的食品基质。

一种用于检测病原性大肠杆菌的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，或者SEQ ID NO：17。

一种用于检测病原性大肠杆菌的试剂盒，其包括(a)选自如下一组的至少一个引物对：(i)SEQ ID NO：2和3，(ii)SEQ ID NO：5和6，(iii)SEQ ID NO：8和9，(iv)SEQ ID NO：10和11，(v)SEQ ID NO：13和14，及(vi)SEQ ID NO：16和17；和(b)热稳定的DNA聚合酶。所述试剂盒优选同时包含(a)(ii)和(a)(iii)，更优选同时包含(a)(ii)和(a)(iv)。

一种用于进行PCR的复制组合物，其包括选自如下一组的至少一个引物对：(i)SEQ ID NO：2和3，(ii)SEQ ID NO：5和6，(iii)SEQ IDNO：8和9，(iv)SEQ ID NO：10和11，(v)SEQ ID NO：13和14，及(vi)SEQ ID NO：16和17；和(b)热稳定的DNA聚合酶。所述复制组合物优选同时包含(a)(ii)和(a)(iii)，更优选同时包含(a)(ii)和(a)(iv)。

一种包括上述任何复制组合物的片剂，及包括所述片剂的用于检测样品中病原性大肠杆菌的试剂盒。

序列概述

SEQ ID NO：1是病原性大肠杆菌的核苷酸序列，对其进行的检测特别示出其存在病原性大肠杆菌血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、或者O145:HNM。SEQ ID NO：1由引物SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3限定(bounded by)、含有这两个引物以及被这两个引物扩增。

SEQ ID NO：2是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：3的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、或者O145:HNM的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：3是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：2的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、或者O145:HNM的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：4是病原性大肠杆菌的核苷酸序列，对其进行的检测特别示出血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、O26:HNM、O145:HNM或者0111:HNM的病原性大肠杆菌的存在。SEQ ID NO：4由引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6限定、含有这两个引物以及被这两个引物扩增。

SEQ ID NO：5是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：6的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、O26:HNM、O145:HNM或者0111:HNM的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：6是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：5的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM、O55:H7、O26:H11、O26:HNM、O145:HNM或者0111:HNM的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：7是病原性大肠杆菌的核苷酸序列，对其进行的检测特别示出血清型O157:H7、O157:HNM或者O55:H7的病原性大肠杆菌的存在。SEQ ID NO：7由引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9限定、含有这两个引物以及利用这两个引物被扩增。SEQ ID NO：5也由引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11扩增，SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11分别是SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的修饰物。

SEQ ID NO：8是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：9的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM或者O55:H7的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：9是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：8的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM或者O55:H7的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：10是SEQ ID NO：8的修饰物。SEQ ID NO：10包括SEQ ID NO：8的全部序列，并且向其中加入了富GC夹(GC richclamp)。加入这个夹不改变靶特异性，但是改变扩增产物的解链温度。SEQ ID NO：10是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：11的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM或者O55:H7的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：11是SEQ ID NO：9的修饰物。SEQ ID NO：11包括SEQ ID NO：9的全部序列，并且向其中加入了富GC夹。加入这个夹不改变靶特异性，但是改变扩增产物的解链温度。SEQ ID NO：11是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：10的聚合酶链反应中特异性扩增血清型O157:H7、O157:HNM或者O55:H7的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：12是病原性大肠杆菌的核苷酸序列，对其进行的检测特别示出包括O157:H7在内的各种病原性大肠杆菌血清型的存在。SEQ ID NO：12由引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14限定、含有这两个引物以及利用这两个引物被扩增。

SEQ ID NO：13是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：14的聚合酶链反应中特异性扩增包括O157:H7在内的病原性大肠杆菌血清型的DNA。

SEQ ID NO：14是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：13的聚合酶链反应中特异性扩增包括O157:H7在内的病原性大肠杆菌血清型的DNA。

SEQ ID NO：15是病原性大肠杆菌的核苷酸序列，对其进行的检测特别示出包括O157:H7在内的各种血清型的病原性大肠杆菌的存在。SEQ ID NO：15由引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17限定、含有这两个引物以及利用这两个引物被扩增。

SEQ ID NO：16是病原性大肠杆菌基因组一个区域的5’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：17的聚合酶链反应中特异性扩增包括O157:H7在内的各种血清型的病原性大肠杆菌的DNA。

SEQ ID NO：17是病原性大肠杆菌基因组一个区域的3’引物的核苷酸序列，其在含有细菌DNA和SEQ ID NO：16的聚合酶链反应中特异性扩增包括O157:H7在内的各种血清型的病原性大肠杆菌的DNA。

所述序列符合37C.F.R.§§1.821-1.825(″Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules″)及世界知识产权组织(WIPO)Standard ST.25(1998)和EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2和49.5(a-bis)和Section 208和Annex C of the AdministrativeInstructions)。核苷酸和氨基酸序列数据使用的符号和格式符合37C.F.R.§1.822所述规定。

附图简述

图1示出解链曲线分析方法。在解链期间捕捉到靶DNA的荧光改变。对荧光对数改变量的相反数除以温度改变量相对于温度作图的数学分析产生称作解链曲线的图示峰。

图2示出用引物组1(PSl)扩增的病原性大肠杆菌O157:H7阳性样品的代表性解链曲线分析。扩增的靶(SEQ ID NO：1)的解链曲线为大约83℃。

图3示出用引物组2(PS2)扩增的病原性大肠杆菌O157:H7阳性样品的代表性解链曲线分析。扩增的靶(SEQ ID NO：4)的解链曲线为大约88℃。

图4示出用引物组3(PS3)扩增的病原性大肠杆菌O157:H7阳性样品的代表性解链曲线分析。扩增的靶(SEQ ID NO：7)的解链曲线为大约80℃。

图5示出内部阳性对照的引入和用引物组2(PS2)和引物组4(PS4)扩增的大肠杆菌O157:H7DNA。用引物组2(PS2)扩增的靶(SEQ IDNO：4)在大约88℃产生解链曲线。在5’末端添加了丰富GC的引物组4(PS4)将扩增的靶(加入了来自GC夹中的GC的SEQ ID NO：7)的解链曲线相对于SEQ ID NO：7(大约80℃)转变为更高温度(大约83℃)，由此可以更易于与内部阳性对照解链曲线(大约81℃)区分。

优选的实施方案详述

本发明阐述的每个参考文献均以其全文并入作参考。

定义

在本说明书中，使用了许多术语和缩写。本文提供了如下定义。

“聚合酶链反应”缩写为PCR。

术语“分离的”是指这样的材料如核酸分子和/或蛋白质，其基本上不含或者另外除去了在天然环境中通常与该材料伴随的或者相互作用的成分。分离的多核苷酸可以纯化自其天然存在于其中的宿主细胞。可以使用本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法获得分离的多核苷酸。该术语还包含重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文可互换使用。这些术语包含核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或者改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其混合物的一或多条链组成。

术语“扩增产物”是指在引物指导的扩增反应期间产生的核酸片段。典型的引物指导的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)或者链置换扩增(SDA)。如果选择PCR方法，则复制组合物可包含用于核酸复制的成分，例如三磷酸核苷酸、具有合适序列的两(或多个)引物、热稳定聚合酶、缓冲液、溶质和蛋白质。这些试剂及关于其在扩增核酸中的应用的详细描述在美国专利No.4,683,202(1987，Mullis，et al.)和美国专利No.4,683,195(1986，Mullis，et al.)中提供。如果选择LCR方法，则核酸复制组合物可包含例如热稳定连接酶(例如T.aquaticus连接酶)、两套相邻的寡核苷酸(其中每套寡核苷酸的一个成员与每个靶链互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NAD、二硫苏糖醇和鲑精DNA。见例如Tabor et al.，Proc.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078(1985))所述。

术语“引物”是指(合成或者天然发生的)寡核苷酸，当被置于互补链的合成由聚合酶催化的条件下时，其能作为核酸沿着互补链合成或者复制的起始点。

术语“探针”是指与感兴趣的多核苷酸互补(非必需完全互补)并且与感兴趣的多核苷酸的至少一条链通过杂交而形成双链结构的寡核苷酸(合成的或者天然发生的)。

术语“复制抑制部分(replication inhibitor moiety)”是指与寡核苷酸的3’末端羟基基团附着的任何原子、分子或者化学基团，其阻断用于复制核酸链的链延伸的起始。例子包括但不限于：3′-脱氧核苷酸(例如虫草菌素)，二脱氧核苷酸，磷酸酯，配体(例如生物素和二硝基酚)，报道分子(例如荧光素和罗丹明)，碳链(例如丙醇)，错配的核苷酸或者多核苷酸，或者肽核酸单位。术语“非参与性”是指在核酸分子的扩增反应中没有探针或者引物的参与。特别地，非参与性探针或者引物是不作为DNA或者RNA聚合酶的底物或者不被DNA或者RNA聚合酶延伸的探针或引物。“非参与性探针”固有地不能被聚合酶链延伸。其可以具有或者不具有复制抑制部分。

当一种单链形式核酸分子在合适的温度和溶液离子强度条件下可以与其它核酸分子退火时，则这种核酸分子与另一种核酸分子如cDNA、基因组DNA或者RNA是“可杂交的”。杂交和洗涤条件为本领域所熟知，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)所述，特别是第11章和其中的表11.1所述(以其全文并入作参考)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。对于初步筛选同源核酸而言，可以使用相应于55°Tm的低严格杂交条件，例如5×SSC、0.1％SDS、0.25％牛奶及没有甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×SSC、0.5％SDS。中等严格杂交条件相应于较高的Tm，例如40％甲酰胺、5×或者6×SSC。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。杂交核酸的合适严格性依赖于核酸的长度和互补的程度，本领域熟知这些变量。两个核苷酸序列之间的相似性或者同源性程度越高，则具有这些序列的核酸的杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(相应于较高的Tm)以如下顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体而言，计算Tm的方程已经获得(见Sambrook et al.，如前，9.50-9.51所述)。对于较短的核酸即寡核苷酸杂交而言，错配的位置变得更重要，寡核苷酸的长度决定了其特异性(见Sambrook et al.，如前，11.7-11.8所述)。在一个优选的实施方案中，可杂交的核酸的长度为至少大约10个核苷酸。更优选地，可杂交的核酸的最小长度为至少大约15个核苷酸；更优选为至少大约20个核苷酸；最优选所述长度为至少30个核苷酸。另外，技术人员意识到温度和洗涤溶液盐浓度可以根据如探针的长度等因素的需要加以调节。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。

本文所用术语“表达”是指衍生自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还可以是指mRNA翻译为多肽。

本发明使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)(在下文称作Maniatis)及Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，published by Greene PublishingAssoc and Wiley-Interscience(1987)所描述。

引物/寡核苷酸

本发明的寡核苷酸已被开发用于检测和鉴别病原性大肠杆菌。

本发明的寡核苷酸以SEQ ID NO：1-17表示。

本发明的某些寡核苷酸可被用作聚合酶链反应(PCR)的引物，如下表1所示。

表1

引物组	SEQ ID NO：
		PS1	2和3
PS2	5和6
		PS3	8和9
PS4	10和11
		PS5	13和14
PS6	16和17

基于对大肠杆菌O157:H7基因组区域的序列分析设计了引物组PS1(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)，PS2(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6)，PS3(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)，PS5(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)和PS6(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)。引物组PS4(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)是PS3的引物的修饰物，其提高了PCR产物的解链点而不改变引物的特异性。对NCBI数据库进行的Blast搜索表明与已知功能的基因无显著的序列同源性。引物设计无任何软件程序辅助。

这些寡核苷酸引物也可以用于其它核酸扩增方法，如连接酶链反应(LCR)(Backman et al.，1989，EP 0 320 308；Carrino et al.，1995，J.Microbiol.Methods 23：3-20)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Carrino et al.，1995，如前)、及自身持续的序列复制(3SR)和“Q复制酶扩增”(Pfeffer et al.，1995Veterinary Res.Comm.，19：375-407)。

本发明的寡核苷酸也可以用作杂交探针。使用DNA探针的杂交常常用于检测食品、临床和环境样品中的病原体，其使用方法为本领域技术人员所已知。通常意识到探针杂交的灵敏性和特异性程度低于通过前述扩增技术达到的程度。

测定方法

SEQ ID NO：1-17可以各种形式使用，以检测病原性大肠杆菌。最优选的是引物指导的扩增方法和核酸杂交方法。

这些方法可用于检测例如来自怀疑被污染的动物、环境或者食品源的样品中的病原性大肠杆菌。

使用本发明的核酸序列和寡核苷酸的基于扩增的方法和基于杂交的方法也可以用于证实在复合的基质或纯化的培养物中大肠杆菌的鉴别结果。本发明的一个优选实施方案包括：(1)在非选择性生长培养基中培养复合样品以使靶细菌复活，(2)释放全部的靶细菌DNA，(3)将总DNA用本发明的引物对进行扩增。

引物指导的扩增测定方法(Pirmer-Directed Amplification AssayMethods)

在一个优选的实施方案中，引物对PS1-PS6可在引物指导的核酸扩增方法中用作引物以检测病原性大肠杆菌。

本领域已知许多引物指导的核酸扩增方法，包括热循环方法(例如PCR、RT-PCR和LCR)，以及等温方法和链置换扩增方法(SDA)。

优选的方法是PCR。

样品制备

本发明的寡核苷酸和方法可直接用于任何合适的临床或环境样品，而不需要样品制备。为了达到较高的灵敏性及在时间是非限定因素的情况中，优选对样品进行预处理及进行预扩增富集。

检测食品中携带的细菌病原体的最低产业标准是在25g食品基质中可靠地检测到一个病原体细胞的存在的方法，如Andrews et al.，1984，″Food Sample和Preparation of Sample Homogenate″，Chapter 1in Bacteriological Analytical Manual，8th Edition，Revision A，Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA所述。为了确保这个严格标准，开发了富集方法和培养基以增强靶病原体细胞的生长，从而易于通过生物化学、免疫学或者核酸杂交方法进行检测。典型的富集方法应用增强靶细菌生长和健康并且还抑制存在的任何背景或非靶微生物生长的培养基。例如，美国农业部(USDA)已经宣布了对待测试病原性大肠杆菌的绞细牛肉样品进行富集的方案。美国食品和药品管理局细菌分析手册。

针对各种细菌病原体已经开发了选择性培养基，本领域技术人员已知选择适于富集特定生物体的培养基。关于非选择性培养基的综述和配方在Association of Analytical Chemists，Suite 400，2200 WilsonBlvd，Arlington，VA 22201-3301公布和发放的FDA细菌分析手册(1998)中描述。

在选择性生长之后，取复合混合物样品以进一步分析。这个取样方法可以通过本领域技术人员熟知的各种方式进行。在一个优选的实施方案中，取出5μl富集培养物，加入到200μl含有蛋白酶的裂解溶液中。将裂解溶液在37℃加热20分钟，随后在95℃加热10分钟使蛋白酶失活，如系统用户指南，Qualicon，Inc.，Wilmington，DE所述。

PCR测定方法

检测样品中病原性大肠杆菌存在的一个优选方法包括：(a)使用选自PS1、PS2、PS3、PS4、PS5和PS6的引物对对样品进行PCR扩增，产生PCR扩增结果；(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果，以检测引物对的扩增产物，其中阳性检测到引物对的扩增产物表示样品中存在病原性大肠杆菌。

更优选地，在前述方法中，所述引物对选自PS2、PS3和PS4。

检测样品中病原性大肠杆菌存在的另一种优选方法包括：(a)使用选自PS1、PS2、PS3、PS4、PS5和PS6的两种不同的引物对对样品进行PCR扩增，产生PCR扩增结果；(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果，以检测这两种不同引物对的扩增产物，其中阳性检测到这两种不同引物对的扩增产物表示样品中存在病原性大肠杆菌。

在前述方法中，所述两种引物对优选包括PS2和PS3，更优选包括PS2和PS4。

在另一个优选的实施方案中，在进行PCR扩增之前，可以进行制备样品的步骤。所述制备步骤可包括至少一个如下步骤：(1)细菌富集，(2)从样品中分离细菌细胞，(3)细胞裂解，及(4)总DNA提取。

扩增条件

本领域技术人员理解使用任何通常认可的PCR条件，可用本发明的寡核苷酸成功检测靶病原性大肠杆菌，并且根据待测试的样品及其它实验条件，可以对PCR条件进行常规优化以达到最佳的灵敏性和特异性。最理想的是这些条件从所有目标特异性靶中获得PCR扩增产物，而没有其它非靶的PCR产物。

在一个优选的实施方案中，可以使用如下试剂和循环条件。将45μl裂解物加入含有1片试剂片(由Qualicon，Inc.，Wilmington，DE生产)及5μl引物混合物的PCR试管中，达到PCR中每种引物的终浓度为0.150μmole，所述试剂片含有Taq DNA聚合酶、脱氧核苷酸、Green(Molecular Probes，Eugene，OR)和缓冲液成分。优选的PCR循环条件是：94℃，2分钟初始DNA变性，随后进行38次如下循环：94℃，15秒，及在70℃退火/延伸3分钟。

检测/检验/分析

引物指导的扩增产物可以使用各种方法分析。

同质检测是指检测扩增产物的一种优选方法，其中扩增产物不需要从模板或者引物中分离(如通过凝胶电泳)。同质检测典型通过在存在荧光染料的情况下测定反应混合物的荧光水平而实现。

在一个优选的实施方案中，使用DNA解链曲线分析进行同质检测，特别是使用Qualicon公司的系统硬件和试剂片剂进行。关于该系统的详细描述见美国专利No.6,312,930和PCT出版物No.WO97/11197和WO 00/66777所述，所述文献均以其全文并入作参考。

解链曲线分析通过在每个扩增循环期间在选择的时间点监测靶扩增产物(靶扩增子)的荧光而检测和量化双链的核酸分子(“dsDNA”或“靶”)。

如本领域技术人员所熟知，当温度高于dsDNA的解链温度时，dsDNA的两条链分离或者解链。dsDNA分子的解链是一个过程，在给定的溶液条件下，解链在一个温度(后文称作T_MS)开始及在另一个温度(后文称作T_ME)完成。熟知的术语Tm是完成50％解链的温度。

典型的PCR循环包括一个靶dsDNA解链的变性阶段，一个其中温度对于引物与单链靶结合最佳的引物退火阶段及一个其中温度对于DNA聚合酶起作用最佳的链延长阶段(在温度T_E)。

根据本发明，T_MS应该高于高于T_E，T_ME应该低于(通常显著低于)DNA聚合酶被热失活的温度。解链特性通过给定的dsDNA分子的固有性质而影响，如脱氧核苷酸组成和dsDNA的长度。

插入的染料将与双链DNA结合。染料/dsDNA复合物当暴露于合适激发波长的光线时将发出染料依赖性的荧光，荧光的强度可以与dsDNA的浓度成比例。利用插入DNA染料而检测和量化dsDNA的方法为本领域所已知。对于这些目的本领域已知许多染料并且已经加以了利用。本发明的方法也利用这种关系。

这些染料例如包括插入染料(intercalating dyes)。这类染料例如包括但不限于SYBR，溴化乙锭，碘化丙锭，-1{Quinolinium，1-1′-[1，3-propanediylbis[(dimethyliminio)-3，1-propanediyl]]bis[4-[(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)methyl]]-，tetraiodide}，及

{Quinolinium，4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-，diiodide}。本发明最优选的是非不对称的氰化物染料，如Molecular Probes公司(Eugene，OR)生产的SYBR

。

解链曲线分析通过监测随着温度升高发生的荧光变化而实现。当温度达到特异于靶扩增子的T_MS时，dsDNA开始变性。当dsDNA变性时，插入染料从DNA中解离，荧光降低。对荧光对数改变量的相反数除以温度改变量相对于温度作图的数学分析产生称作解链曲线的图示峰(见图6，其一般地例证了解链曲线分析)。

图1示出的数据转化方法包括如下步骤：

1.内插(Interpolate)数据以获得间隔均匀的数据点

2.取荧光(F)的对数

3.使log F平滑

4.计算-d(log F)/dT

5.(根据靶生物体)减少数据至11-13个间隔1度的数据点。

本发明的同质检测方法可用于检测和量化靶dsDNA，由此可以确定靶生物体的存在和水平。这种方法是非常特异性和灵敏的。在典型反应条件和体积下，可检测的靶dsDNA的最小数目是1-10个。

同质检测可用于用本发明的引物对进行“实时”引物指导的核酸扩增(例如实时PCR和实时RT-PCR)。优选的实时方法如美国专利No.6,171,785和5,994,056所述，所述文献均以其全文并入作参考。

另一种检测方法是5’核酸酶检测方法，如美国专利No.5,804,375、5,538,848、5,487,972,和5,210,015所述，所述文献在此均以其全文并入作参考。

本领域已知许多其它的PCR检测方法，包括标准非变性凝胶电泳(例如丙烯酰胺或琼脂糖)，变性梯度凝胶电泳及温度梯度凝胶电泳。标准非变性凝胶电泳是一种简便快速的PCR检测方法，但是也许不适合所有应用。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种检测小DNA片段(200-700bp)的变性行为中的差异的分离方法。分离的原理是基于片段的长度和核苷酸序列。在相同长度的片段中，可以检测到小如一个碱基的差异。这与非变性凝胶电泳相反，在非变性凝胶电泳中仅通过大小进行分离。因为DNA分子之间的电荷密度差异接近中性，并且在其分离中发挥很小的作用，因此产生非变性凝胶电泳的这种限制。随着DNA片段大小的增加，其通过凝胶的速度降低。

DGGE基于其变性曲线(profiles)和序列而主要用于分离相同大小的DNA片段。使用DGGE，当进行加热或者加入化学变性剂时，DNA分子的两条链分离或者解链。DNA双链体的变性受两个因素影响：1)互补碱基对之间形成的氢键(因为GC富集区在比AT富集区高的变性条件下解链)；2)同一链的邻近碱基之间的吸引，或者“堆积”。由此，DNA分子可具有一些解链结构域，其各自的特征性变性条件由其核苷酸序列决定。DGGE利用这样的事实，即具有相同长度和DNA序列的除了在特异的变性结构域中仅有一个核苷酸差异之外其它相同的DNA分子在不同温度或者Tm变性。因此，当双链(ds)DNA片段电泳经过梯度增加的化学变性剂时，其开始变性并经历构象和迁移率的双重改变。dsDNA片段比变性的单链(ss)DNA片段更快速地行进，因为分子的单链部分的分支结构卷入凝胶基质中。随着变性环境增加，ds DNA片段将完全解离，分子通过凝胶的迁移率在DNA链的特别低的变性结构域解离的变性剂浓度被阻滞。实际上，电泳是在恒定温度(大约60℃)进行，使用的化学变性剂浓度为导致100％的DNA分子变性的浓度(即40％甲酰胺和7M尿素)。使用梯度标记物产生这种可变的变性梯度，由此每种DGGE凝胶的组成从0％变性剂逐步变化为直至100％变性剂。当然，也可以逐步注入含有降低量的变性剂(例如35％-60％)的梯度以增加DNA的分离。

DGGE应用的原理也可以用于使用温度梯度代替化学变性剂梯度的第二利方法。这种方法称作温度梯度凝胶电泳(TGGE)。这种方法利用温度梯度诱导dsDNA在构象上改变为ssDNA，以分离具有不同序列的相等大小的片段。如在DGGE中一样，具有不同核苷酸序列的DNA片段变为固定在凝胶的不同位置。引物设计中的变化可用于有利地增强DGGE在鉴定和鉴别PCR产物中的效力。使用引物设计变化的这些方法和原理在PCR Technology Principles andApplications，Henry A.Erlich Ed.，M.Stockton Press，NY，pages 71-88(1988)中描述。

仪器

根据优选的实施方案，使用系统(DuPont Qualicon，Wilmington，DE)和解链曲线分析。

试剂和试剂盒

可以使用任何形式的任何适当的核酸复制组合物(“复制组合物”)。

进行PCR扩增的典型复制组合物可包含例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，靶特异性引物及合适的聚合酶。

如果复制组合物是液体形式，则可以使用本领域已知的合适缓冲液(Sambrook，J.et al.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

或者，如果复制组合物包含于片剂中，则可包括典型的片剂化试剂，如稳定剂和结合剂。优选的片剂化技术在美国专利No.4,762,857和4,678,812中阐述，所述文献以其全文并入作参考。

本发明的一种优选复制组合物包含：(a)选自PS1、PS2、PS3、PS4、PS5和PS6的至少一个引物对；和(b)热稳定的DNA聚合酶。更优选地，复制组合物同时包括引物对PS2和PS3，更优选同时包括引物对PS2和PS4。

本发明的一种优选试剂盒包含：(a)选自PS1、PS2、PS3、PS4、PS5和PS6的至少一个引物对；和(b)热稳定DNA聚合酶。更优选地，所述试剂盒优选同时包含引物对PS2和PS3，更优选同时包含引物对PS2和PS4。

本发明的一种优选片剂包含：(a)选自PS1、PS2、PS3、PS4、PS5和PS6的至少一个引物对；和(b)热稳定DNA聚合酶。更优选地，所述片剂优选同时包含引物对PS2和PS3，更优选同时包含引物对PS2和PS4。更优选地，本发明的试剂盒包含前述优选的片剂。

在另一种优选的实施方案中，复制组合物含有内部阳性对照。PCR反应中包含内部阳性对照的优点在先前已经描述(美国专利No.6,312,930和PCT申请No.WO 97/11197，所述文献均以其全文并入作参考)，包括：(i)对照可以使用单一引物扩增；(ii)对照扩增产物的量不依赖于样品中包含的任何靶DNA或者RNA；(iii)对照DNA可以与在人工和自动测试程序中方便应用并且保证高再现性的其它扩增试剂一起形成片剂；(iv)所述对照可以与同质检测方法一起应用，即不用从反应物中分离产物DNA；和(v)内部对照具有与反应中其它潜在扩增产物不同的解链模式。

对照DNA具有可以在引物指导的扩增反应中扩增的合适大小和碱基组成。对照DNA序列可以得自大肠杆菌基因组，或者得自其它来源，但是必须在进行靶扩增产物扩增的相同条件下可再现地扩增。

对照反应用于验证扩增反应。对照DNA的扩增在与测试样品相同的反应试管中出现，因此当样品是靶阴性即无靶扩增产物产生时指示成功扩增反应。为了明确验证扩增反应，在每个扩增反应中必须包括合适拷贝数的对照DNA。

在一些情况中，可包括另外一种阴性对照复制组合物。所述阴性对照复制组合物含有与复制组合物相同的试剂，但是没有聚合酶。这种对照的主要功能是当所述方法应用荧光检测方式时监测同质形式的假背景荧光。

复制组合物可以根据其是否被设计为用于扩增靶DNA或者对照DNA而进行修饰。扩增靶DNA的复制组合物(测试复制组合物)可包括：(i)聚合酶(通常为热稳定聚合酶)，(ii)能与靶DNA杂交的引物对，和(iii)进行扩增反应必需的缓冲液。扩增对照DNA的复制组合物(阳性对照，或者阳性复制组合物)可包括：(i)聚合酶(通常为热稳定聚合酶)，(ii)对照DNA，(iii)能与对照DNA杂交的至少一种引物，和(iv)进行扩增反应必需的缓冲液。

核酸杂交方法

特别用于核酸杂交方法中的探针是SEQ ID NO：1-17所示任何序列或者由其衍生的序列。

核酸杂交测试的基本成分包括探针、怀疑含有病原性大肠杆菌的样品、及一种特异性杂交方法。探针是与待测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待测核酸序列可以“杂交”。典型地，所述探针的长度可以在少如5个碱基至大肠杆菌诊断序列全长之间变化，并且根据待进行的特定测试而定。只有探针分子的一部分需要与待测核酸序列互补。另外，探针与靶序列之间的互补不需要是精确的。在不精确互补的分子之间也可发生杂交，这导致杂交区域中一部分碱基与正确互补的碱基未配对。探针可以由RNA或者DNA组成。核酸探针的形式可以是仅一个极性的标记的单链分子，或者是存在两个极性的标记的单链分子。与其长度一样，探针的形式由待进行的杂交测试的类型而定。

所述样品可以含有或不含有病原性大肠杆菌。样品可以采取各种形式，然而通常是提取自怀疑具有污染的动物、环境或者食物来源。

对DNA可以直接进行检测，但优选地样品核酸必须在探针与靶分子发生任何杂交之前即可以与探针接触。因此生物体的DNA在杂交发生之前必须游离于细胞并且处于适当的环境。在溶液中杂交的方法使得必须对DNA进行纯化，以能获得样品DNA与探针的杂交。这意味着利用溶液中的方法检测样品中的靶序列需要样品的核酸首先必须纯化，以去除蛋白质、脂质及其它细胞成分，然后在杂交条件下与探针接触。纯化样品核酸的方法为本领域所熟知(Maniatis，如前)。

相似地，杂交方法也是熟知的。典型地，探针和样品必须在使得核酸杂交的条件下混和。这包括将探针与样品在存在无机盐或者有机盐的条件下在适当的浓度和温度条件下接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，以使得探针与样品核酸之间可以发生任何可能的杂交。混合物中探针或者靶核酸的浓度决定了发生杂交必需的时间。探针或者靶核酸的浓度越高，则需要的杂交温育时间越短。

在一个优选的实施方案中，杂交分析可以对细胞裂解物直接进行，而不需要提取核酸。这样减少了处理样品过程中的一些步骤并加快了分析速度。为了对粗细胞裂解物进行这些分析，向如上述制备的细胞裂解物中典型地加入一种离液剂。所述离液剂通过已知核酸酶活性而使得核酸稳定。另外，所述离液剂可以使得短寡核苷酸探针与DNA在室温灵敏地及严格地杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾、及三氟乙酸铯等等。典型地，所述离液剂的终浓度为大约3M。如果需要，可以向杂交混合物中加入甲酰胺，典型为30-50％(v/v)。

或者，可以在探针杂交之前纯化样品核酸。本领域技术人员已知许多纯化方法(例如苯酚-氯仿提取方法、IsoQuick提取方法(MicroProbe Corp.，Bothell，WA)等)。预杂交纯化被特别用于标准滤膜杂交分析。另外，纯化通过结合体外RNA扩增方法如自主序列复制(见例如Fahy et al.，In PCR Methods和Applications，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1991)，pp.25-33)或者逆转录酶PCR(Kawasaki，In PCR Protocols：A Guide to Methods和Applications，M.A.Innis et al.，Eds.，(1990)，pp.21-27)而有助于增加测定的灵敏性。

一旦DNA释出，则可以通过各种方法对其进行检测。然而，最有用的实施方案至少具有一些速度、便利性、灵敏性和特异性方面的特征。

可以应用各种杂交溶液。典型地，这些溶液包含大约20-60％、优选30％体积的极性有机溶剂。一般的杂交溶液使用大约30-50％v/v甲酰胺，大约0.15-1M氯化钠，大约0.05-0.1M缓冲液如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH为大约6-9)，大约0.05-0.2％去污剂如十二烷基硫酸钠，或者0.5-20mM EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(大约300-500kD)，聚乙烯吡咯烷酮(大约250-500kdal)及血清白蛋白。典型杂交溶液中还包括大约0.1-5mg/mL的未标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(例如牛胸腺或者鲑精DNA，或者酵母RNA)、及任选地大约0.5-2％wt/vol甘氨酸。也可以包括其它添加剂，如体积排阻剂(包括各种极性水溶性或者可膨胀的制剂(例如聚乙二醇))、阴离子聚合物(例如聚丙烯酸或者聚甲基丙烯酸)、及阴离子糖聚合物(例如硫酸葡聚糖)。

核酸杂交可适应各种分析形式。最合适的形式之一是夹心分析(sandwich assay)。夹心分析特别适于在非变性条件下杂交。夹心类型分析的一个主要成分是固体支持物。所述固体支持物与未标记的并且与所述DNA序列的一部分互补的固定的核酸探针附着或者共价结合。

所述夹心分析可包含在分析试剂盒中。这种试剂盒包括用于收集怀疑被污染的样品的第一种成分及用于贮存(disbursement)和裂解样品的缓冲液。第二种成分包括干燥或者液体形式的介质，以进行靶序列与探针多核苷酸的杂交，以及通过洗涤除去非所需的形式和非双链体。第三种成分包括一种固体支持物(量尺)，在其上固定了(或者缀合了)与部分大肠杆菌基因组互补的未标记的核酸探针。第四种成分含有与第三种成分的固定的未标记的核酸探针杂交的相同DNA链的另一个并且不同的区域互补的标记的探针。

在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1-17或其衍生物可以在同源或者异源分析中用作3’封闭的检测探针。例如，从这些序列中产生的探针可以是3’封闭的或者是非参与的探针，并且不通过核酸扩增反应延伸或者参与核酸扩增反应。另外，所述探针含有可作为反应配体的标记，所述反应配体作为探针/分析物杂交体固定的附着点或者作为报道者产生可检测的信号。因此，分离自怀疑污染了大肠杆菌的样品的基因组DNA或者cDNA通过标准的引物指导的方案进行扩增，所述扩增在存在过量的3’封闭的检测探针的条件下进行以产生扩增产物。由于所述探针是3’封闭的，因此其不参与或者干扰靶序列的扩增。在最后的扩增循环之后，所述检测探针退火为扩增的DNA的相关部分，然后退火的复合物通过活性配体被捕获在支持物上。

在一些情况中，希望在复制组合物中掺入配体标记的dNTP及标记探针，以便于将PCR反应产物固定在支持物上，然后通过标记的探针试剂检测固定的产物。例如可以向PCR反应组合物中加入生物素、洋地黄毒苷或者地高辛标记的dNTP。然后掺入PCR产物中的生物素或者地高辛可以分别固定在链霉抗生物素、抗地高辛或者抗洋地黄毒苷抗体支持物上。然后固定的PCR产物可以通过探针标记的存在而检测。

本发明的探针可以设计为几种不同形式。探针的3’末端被封闭以避免通过复制抑制成分的附着而参与引物延伸反应。典型的复制抑制成分包括但非限于：双脱氧核苷酸、3-脱氧核苷酸、错配的核苷或者核苷酸序列、3’磷酸盐基团和化学制剂。优选蛹虫草菌素(3’脱氧腺苷)。

在化学合成期间使用标准的氰乙基膦酸甲酯化学方法将所述复制抑制剂与非参与性探针的3’末端核苷酸的3’羟基基团共价附着。这种方法使用固相合成化学方法，其中将3’末端共价附着于不可溶的支持物(可控有孔玻璃(CPG))，新合成的链在5’末端延伸。3-脱氧核糖核苷酸是优选的复制抑制剂。蛹虫草菌素(3-脱氧腺苷)是最优选的。由于蛹虫草菌素附着于探针的3’末端，因此合成从与CPG、5-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰-3-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、2-琥珀酰-长链烷基氨基-CPG(Glen Research，Sterling，VA)共价附着的蛹虫草菌素开始。去除二甲氧三苯甲基基团，链合成在固相蛹虫草菌素的去保护的5’羟基基团开始。在合成完成后，寡核苷酸探针从固体支持物上分裂下来，在3’末端附着的蛹虫草菌素上剩下游离的2’羟基基团。在非参与性探针合成期间也可以将其它试剂附着于3’末端，以作为复制抑制剂。这些试剂包括但非限于：其它3-脱氧核糖核苷酸、生物素、二硝基酚、荧光素和洋地黄毒苷。这些试剂的每一种也均在CPG支持物(Glen Research；Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)上衍生。

实施例

本发明在如下实施例中得以进一步阐述。应理解这些实施例虽然说明了本发明的优选实施方案，但是仅具有示例作用。

实施例中使用的一般方法和材料

适于细菌培养物维持和生长的材料和方法为本领域所熟知。适用于如下实施例的技术可见于Manual of Methods for Genus Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，eds)，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994)或者Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA或者Bacteriological Analytical Manual.6th Edition，Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA(1984)。

用于生长病原性大肠杆菌菌株和相对的非靶菌株的培养基是得自BBL(Becton-Dickenson)的脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion broth，BHI)。病原性大肠杆菌样品得自在BHI肉汤中过夜生长的培养物，然后在0.1％胨水中稀释为大约10⁶cfu/ml。相对的非靶菌株样品在BHI中在大约10⁹cfu/ml富集。

引物(SEQ ID NO：2、3、5、6、8、9、10、11)由Sigma-Genosys，Woodlands，TX制备。

PCR中使用的试剂得自

System Reagent Tablet Kits(DuPontQualicon，Wilmington，DE)，包括Green(Molecular Probes，Eugene，OR)，Taq DNAPolymerase(Applied Biosystems，Foster City，CA)，脱氧核苷酸(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)及缓冲液(EMScience，New Jersey)。

所有PCR反应均使用标准System(DuPont Qualicon，Wilmington，DE)进行。

缩写词的含义如下：“h”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“mL”是指毫升。

实施例1-3：病原性大肠杆菌特异DNA片段的扩增

基于对大肠杆菌O157:H7基因组区域进行的序列分析设计三组引物(PS1，PS2，PS3)。一组引物(PS4)是PS3的修饰，其不改变特异性但改变扩增产物的解链温度。对NCBI数据库进行Blast搜索表明与已知功能的基因没有明显的序列同源性。引物设计没有任何软件程序辅助。

用上述引物组测试如下循环条件：94℃，2分钟初始DNA变性，随后进行38次94℃，15秒的循环，并在70℃退火/延伸3分钟。

测试多个病原性和非病原性血清型的大肠杆菌菌株。

确定存在SEQ ID NO：1是用引物组1(PS1)和如上述DNA解链曲线分析实现的阳性PCR。引物组1(PS1)阳性反应导致解链曲线峰值在大约83℃出现。图2示出了病原性大肠杆菌的代表性解链曲线分析，所述大肠杆菌对于用引物组1(PS1)扩增的靶扩增产物(SEQ IDNO：1)是阳性的。

确定存在SEQ ID NO：4是用引物组2(PS2)和如上述DNA解链曲线分析实现的阳性PCR。引物组2(PS2)阳性反应导致解链曲线峰值在大约88℃出现。图3示出了病原性大肠杆菌的代表性解链曲线分析，所述大肠杆菌对于用引物组2(PS2)扩增的靶扩增产物(SEQ IDNO：4)是阳性的。

确定存在SEQ ID NO：7是用引物组3(PS3)和如上述DNA解链曲线分析实现的阳性PCR。引物组3(PS3)阳性反应导致解链曲线峰值在大约80℃出现。图4示出了病原性大肠杆菌的代表性解链曲线分析，所述大肠杆菌对于用引物组3(PS3)扩增的靶扩增产物(SEQ IDNO：7)是阳性的。

确定存在SEQ ID NO：7是用引物组4(PS4)和如上述DNA解链曲线分析实现的阳性PCR。引物组4(PS4)阳性反应导致解链曲线峰值由于CC夹而在大约83℃出现(如上文所解释，引物组4(PS4)是具有GC夹的引物组3(PS3))。图5示出了用引物系列4(PS4)阳性扩增的病原性大肠杆菌的代表性解链曲线分析。

全部的结果示于表2(PS1，实施例1)、表3(PS2，实施例2)和表4(PS3或PS4，实施例3)。

表2：用引物组PS1通过PCR扩增SEQ ID NO：1的结果(实施例1)

大肠杆菌血清型*表示病原性	测试的菌株总数	阳性PCR产物数	阴性PCR产物数
				O157:H7^*	112	112	0
O157:HNM^*	3	3	0
				O55:H7^*	3	3	0
O26:H11^*	9	8	1
				O91:H21^*	1	0	1
O91:HNM^*	1	0	1
				O113:H11^*	3	0	3
O146:H21^*	2	0	2
				O45:H2^*	2	0	2
O103:H2^*	2	0	2
				O125:HNM^*	2	0	2
O5:HNM^*	2	0	2
				O145:HNM^*	3	2	1
O1:H7	1	0	1
				O113:H7	1	0	1
O2:H7	1	0	1
				O25:H7	1	0	1
O157:H19	1	0	1
				O55:H10	1	0	1

表3：用引物组PS2通过PCR扩增SEQ ID NO：4的结果(实施例2)

大肠杆菌血清型*表示病原性	测试的菌株总数	阳性PCR产物数	阴性PcR产物数
				O157:H7^*	112	112	0
O157:HNM^*	3	3	0
				O55:H7^*	4	4	0
O26:H11^*	11	10	1
				O26:HNM	1	1	0
O91:H21^*	1	0	1
				O91:HNM^*	1	0	1
O113:H11^*	3	0	3
				O146:H21^*	2	0	2
O45:H2^*	2	0	2
				O103:H2^*	2	0	2
O125:HNM^*	2	0	2
				O5:HNM^*	2	0	2
O145:HNM^*	3	2	1
				O111:HNM^*	3	2	1
代表93种不同血清型中每一种的非病原性分离株	93	0	93

表4：用引物组PS3或者PS4通过PCR扩增SEQ ID NO：7的结果(实施例3)

大肠杆菌血清型*表示病原性	测试的菌株总数	阳性PCR产物数	阴性PCR产物数
				O157:H7^*	112	112	0
O157:HNM^*	3	3	0
				O55:H7^*	4	4	0
O26:H11^*	11	0	11
				O26:HNM	1	0	1
O91:H21^*	1	0	1
				O91:HNM^*	1	0	1
O113:H11^*	3	0	3
				O146:H21^*	2	0	2
O45:H2^*	2	0	2
				O103:H2^*	2	0	2
O125:HNM^*	2	0	2
				O5:HNM^*	2	0	2
O145:HNM^*	3	0	3
				O111:HNM^*	3	0	3
代表93种不同血清型中每一种的非病原性分离株	93	0	93

实施例4：在同一PCR反应中多个引物组和内部对照物的应用。

图5示出了其中加入内部阳性对照物的样品。所述内部阳性对照物在大约77-78℃解链，这样可与所用的两个引物组的病原性大肠杆菌扩增子明显区别开，所述引物组即引物组4(PS4)(代替引物组3(PS3)以检测SEQ ID NO：7)，产生在大约83℃的解链点曲线峰，及引物组1(PS2)以检测SEQ ID NO：4，产生在大约88℃的解链点曲线峰。

序列表

<110>Qualicon，Inc.

<120>检测和区分病原性大肠杆菌的DNA序列

<130>MD6666

<140>

<141>

<150>60/583,296

<151>2004-06-25

<160>17

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>138

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(138)

<223>specific for serotypes O157:H7，O157:HNM，O55:H7，O26:H11，or

O145HNM

<400>1

acaatactcg tactttcgaa agttcgctaa ccaggtgcta cacgcgaggt gttgcagttt 60

tctttacgat ttatcattca atcctaatcc atgcatgaca tgtggtgcct gtggggtgat 120

cctacctacg taatgtgg 138

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>5′PCR primer for SEQ ID NO：1

<400>2

acaatactcg tactttcgaa agttcgc 27

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：1

<400>3

ccacattacg taggtaggat cacc 24

<210>4

<211>464

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(464)

<223>specific for serotypes O157:H7，O157:HNM，O55:H7，O26:H11，

O26:HNM，O145HNM，or O111HNM

<400>4

caaggcgatt ctttgtcttc ttgcactaat tttttatcat aaaaatgttcctagcactgg 60

gcatcaatat cgcaggtcag aaagagctcc tggggatgcg gctggccgaa aatgaagggg 120

cgaatttctg gttcaatgtg ctgactgaac tgaaaaaccg cggtctgaac gatatcctca 180

tcgcctgtgt gtatggcctg aaagaattcc cggaggcccg catccagtta tgcatcgtgc 240

atatggtgcg caacagcatg cgcttcgtgt catggaagga atacaaagcc gtcactcgcg 300

acctgaaagc gattagcctc ccacagaaga ggcaggccag caggcactgg aagcgtttgc 360

tgcggcctgg gactgccgct atccgcagat aagccggtgc tagctgtcaa actggactaa 420

cttggcgacg tttttcgctt atccggcaga tatccgcaaa gtga 464

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>5′PCR primer for SEQ ID NO：4

<400>5

caaggcgatt ctttgtcttc ttgcac 26

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：4

<400>6

tcactttgcg gatatctgcc ggataag 27

<210>7

<211>163

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(162)

<223>specific for serotypes O157:H7，O157:HNM，or O55:H7

<400>7

tattaagaga ttgcaaagac attaagggtg gggtgaagag gaaaagaaag aaggttgcgt 60

taaacacatg ttatatagaa gaagtgcttg catcctgctc agagcttggg tttcgaactg 120

acaaaatgaa aaatttaaca cagatttaat tcatgctctt gcc 163

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>5′PCR primer for SEQ ID NO：7

<400>8

tattaagaga ttgcaaagac attaagggt 29

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：7

<400>9

ggcaagagca tgaattaaat ctgtg 25

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(41)

<223>5′pCR primer for SEQID NO：7

<400>10

ggcggcggcg gctattaaga gattgcaaag acattaaggg t 41

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(34)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：7

<400>11

9gcggcggcg gcaagagCat gaattaaatc tgtg 34

<210>12

<211>151

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(150)

<223>specific for serotype O157:H7

<400>12

aaaagttgcc gtttgcgtag aatgtagaca aaagcgtggt gtcaaggagg ggaggttaac 60

gtcatagtga agaggagtgg tggcaccgat caggtcatga tgtagtggaa gtgcctggag 120

gtgagcaggc agggcaagat tacgaaagcc c 151

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>5′PCR primer for SEQ ID NO：12

<400>13

aaaagttgcc gtttgcgtag aatgtag 27

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：12

<400>14

gggctttcgt aatcttgccc tgcctg 26

<210>15

<211>177

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(190)

<223>specific for serotype O157:H7

<400>15

catatctcca gccgccagtg tcgatgtggc acttatctgt gaacttgatg aacaatggag 60

ttttgtcgaa aacaaagctc gtcagcagtg gcactggtac gcgtataaga ccaaagctga 120

cggtgtgctg gcttacactt ttggtcctcg cactgatgaa acatgccgtg agttgcc 177

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>5′PCR primer for SEQ ID NO：15

<400>16

Catatctcca gccgccagtg tcga 24

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>3′PCR primer for SEQ ID NO：15

<400>17

gcttcaggaa ttccggcaac tcacgg 26

1

Claims

1.一种检测食品样品或者水样品中病原性大肠杆菌存在的方法，所述方法包括：

(a)使用如下的引物对对样品进行PCR扩增：

(ii)SEQ ID NO：5和6，

以产生PCR扩增结果；以及

(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果以检测所述引物对的扩增产物，其中所述引物对的扩增产物的阳性检测结果提示样品中存在病原性大肠杆菌。

2.一种用于检测食品样品或者水样品中存在病原性大肠杆菌的方法，所述方法包括：

(a)使用两种不同引物对对样品进行PCR扩增，其中所述两种引物对中的一种是(ii)SEQ ID NO：5和6，而另一种选自如下一组：

(i)SEQ ID NO：2和3，

(iii)SEQ ID NO：8和9，以及

(iv)SEQ ID NO：10和11，

以产生PCR扩增结果；以及

(b)检测步骤(a)的PCR扩增结果以检测所述两种不同引物对的扩增产物，其中所述两种不同引物对的扩增产物的阳性检测结果提示样品中存在病原性大肠杆菌。

3.权利要求2的方法，其中所述两种引物对包括(a)(ii)和(a)(iv)。

4.权利要求2的方法，其中所述两种引物对包括(a)(ii)和(a)(iii)。

5.权利要求1的方法，其中在步骤(b)中使用解链曲线分析来检测扩增产物。

6.权利要求1的方法，在所述步骤(a)之前进一步包括制备用于PCR扩增的样品的步骤。

7.权利要求6的方法，其中所述制备步骤包括至少一个如下步骤：(1)细菌富集，(2)从样品中分离细菌细胞，(3)细胞裂解，(4)总DNA提取。

8.权利要求1的方法，其中所述样品包括选择性富集的食品基质。

9.一种用于检测病原性大肠杆菌的分离的多核苷酸，其包括SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6。

10.一种用于检测病原性大肠杆菌的试剂盒，其包括：

(a)(ii)SEQ ID NO：5和6，以及任选存在的选自如下一组的引物对：

(i)SEQ ID NO：2和3，

(iii)SEQ ID NO：8和9，以及

(iv)SEQ ID NO：10和11；以及

(b)热稳定的DNA聚合酶。

11.权利要求10的试剂盒，其中成分(a)包括(a)(ii)和(a)(iv)。

12.权利要求10的试剂盒，其中成分(a)包括(a)(ii)和(a)(iii)。

13.一种用于进行PCR的复制组合物，其包括：

(i)SEQ ID NO：2和3，

(iii)SEQ ID NO：8和9，以及

(iv)SEQ ID NO：10和11；以及

(b)热稳定DNA聚合酶。

14.权利要求13的复制组合物，其中成分(a)包括(a)(ii)和(a)(iv)。

15.权利要求13的复制组合物，其中成分(a)包括(a)(ii)和(a)(iii)。

16.一种包括权利要求13、14或者15的复制组合物的片剂。

17.一种检测样品中病原性大肠杆菌的试剂盒，其包括权利要求16的片剂。