CN114729405A - 确定样品中b1/nap1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn‑027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的引物对和寡核苷酸探针、在用于确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的核酸扩增过程或核酸检测过程中使用的寡核苷酸组、用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒以及确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在或不存在的方法。

Description

确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的 方法
技术领域
本发明涉及用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的引物对和寡核苷酸探针、在用于确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的核酸扩增过程或核酸检测过程中使用的寡核苷酸组、用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒以及确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在或不存在的方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridioides difficile)(同义词“C.difficile”，以前命名为Clostridium difficile，非专利文献1)是一种产生孢子的革兰氏阳性杆菌，其产生介导人和动物的肠道疾病的致病性毒素。取决于患者的年龄、肠道菌群和艰难梭菌菌株，艰难梭菌感染(CDI)的临床结果可能是无症状的，或者可能会出现严重的疾病综合征，例如腹泻、腹痛、发热和白细胞增多。
同时，艰难梭菌被认为是住院患者或接受抗生素或抗癌治疗等破坏正常肠道菌群的治疗的患者感染性腹泻的主要原因。由于上述治疗对肠道菌群造成的损害，艰难梭菌可能过度生长并产生毒素A、毒素B和二元毒素CDT，它们会出现腹泻等症状。艰难梭菌从受感染个体的粪便中排出，并且可能通过定植的手或器械通过口腔，特别是通过口腔粘膜转染给其他个体。
目前，通过限制性内切酶分析称为B1型、通过脉冲场凝胶电泳称为北美(NA)脉冲场1型(NAP1)和通过PCR核糖分型称为027(B1/NAP1/027)的艰难梭菌菌株被认为是在北美和欧洲引起艰难梭菌相关疾病的最重要的单一流行菌株(非专利文献2)。
因此，需要确定高毒力艰难梭菌，特别是艰难梭菌B1/NAP1/027菌株的存在。
目前检测方法主要集中在样品(优选粪便样品)中毒素A、毒素B和二元毒素CDT的鉴定。
测试方法包括针对毒素A和/或B的组织培养细胞毒性测定和/或艰难梭菌培养鉴定和/或酶免疫分析(EIA)，以及针对谷氨酸脱氢酶(GDH，艰难梭菌细胞壁抗原)的EIA。然而组织培养细胞毒性测定和培养鉴定费力耗时，因为只能在24至96小时内获得结果，而EIA测试结果的特异性相对较低。
直接粪便培养和细胞毒素中和试验(CCNA)测试是目前诊断CDI的参考标准方法。然而，这两种方法都费力耗时，并且必须由合格的、受过培训的人员执行。
最近，聚合酶链式反应测试已经可用。这些方法以高灵敏度、特异性和低周转时间检测相关基因。一项测试涉及使用引物组，该引物组可以检测三个基因的组，即分别编码毒素A和B的tcdA和tcdB以及以突变形式存在于高毒力艰难梭菌菌株中的tcdC，因此允许毒素A和B的过表达(专利文献1)。该方法能够检测高毒力艰难梭菌菌株，特别是属于B1/NAP1/027组的艰难梭菌菌株。然而，该测试需要许多工艺步骤和使用不同的实验室设备，这使得其设置复杂、昂贵且耗时。
用于艰难梭菌诊断的市售产品包括BD GeneOhm Cdiff(BD Diagnostics；SanDiego,CA,USA)、Prodesse ProGastro Cd(Gen-Probe Inc.；San Diego,CA,USA)、XpertClostridium difficile(Cepheid；Sunnyvale,CA,USA)和illumigene Clostridiumdifficile(Meridian Biosciences；Cincinnati,OH,USA)实时PCR测试。所有测试都靶向tcdB基因，除了靶向tcdA基因的illumigene Clostridium difficile测试之外。XpertClostridium difficile/Epi(Cepheid)另外能够检测二元毒素。据报道，与CCNA和/或产毒培养相比，PCR测定的灵敏度和特异性分别提高了77％至100％和93％至100％(非专利文献3)。
然而，仍然需要提供一种替代方法来确定高毒力艰难梭菌菌株的存在，特别是属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株，其中该方法优选具有合适的灵敏度和/或特异性，简单、节省时间和/或成本。
因此，本发明解决的问题是提供用于确定属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，该方法优选具有合适的特异性和/或灵敏度，更优选简单、节省时间和/或成本。
引用列表
非专利文献1：“Reclassification of Clostridium difficile asClostridioides difficile(Hall and O'Toole 1935)Prévot 1938”,Lawson et al.,Anaerobe 2016；40:95-99
非专利文献2：“Comparison of Seven Techniques for Typing InternationalEpidemic Strains of Clostridium difficile:Restriction Endonuclease Analysis,Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PCR-Ribotyping,Multilocus Sequence Typing,Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis,Amplified Fragment LengthPolymorphism,and Surface Layer Protein A Gene Sequence Typing”,Killgore G,Thompson,et al.,J Clin Microbiol 46(2)February 2008,p.431–437
非专利文献3：“Multiplex Real-Time PCR Method for SimultaneousIdentification and Toxigenic Type Characterization of Clostridium difficileFrom Stool Samples”,Abdullah Kilic et al.,Annals of Lab Medicine,2015May；35(3),p.306-313
专利文献1：WO 2010/116290 A1
发明内容
本发明解决的一个或多个问题由独立权利要求的主题解决，即用于与在属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的引物对或寡核苷酸探针、包含所述引物对或寡核苷酸探针的寡核苷酸组、用于检测样品中属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的包含所述引物对或寡核苷酸探针的试剂盒以及用于确定属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法。在下文的详细描述和/或附图以及从属权利要求中阐述了优点(优选实施方案)。
因此，本发明的第一方面涉及用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的引物对，其特征在于，所述引物对包含以下或由以下组成：
a.第一分离寡核苷酸a)，所述第一分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸；或具有至少10个核苷酸的分离寡核苷酸，所述分离寡核苷酸包含或由所述分离寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述分离寡核苷酸包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间，和
b.第二分离寡核苷酸b)，所述第二分离寡核苷酸b)与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交，所述第二分离寡核苷酸b)优选包含或由与SEQ ID No.2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中寡核苷酸包含至少10个核苷酸，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸b)和SEQ ID No.2之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到21个核苷酸残基之间。
根据第一发明方面的引物对通常用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交并对其进行扩增，所述氯霉素乙酰转移酶基因优选为根据SEQ ID No.3的氯霉素乙酰转移酶基因，更优选为根据SEQ ID No.4的氯霉素乙酰转移酶基因。
本发明的第二方面涉及用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的寡核苷酸探针，其特征在于，所述寡核苷酸探针包含或由分离寡核苷酸a)组成，所述分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少15个核苷酸；或具有至少15个核苷酸的分离寡核苷酸，所述分离寡核苷酸包含或由所述分离寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述分离寡核苷酸包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在15到25个核苷酸残基之间，优选为20到25个核苷酸残基。
根据第二发明方面的寡核苷酸探针通常用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交并对其进行检测，所述氯霉素乙酰转移酶基因优选为根据SEQ ID No.3的氯霉素乙酰转移酶基因，更优选为根据SEQ ID No.4的氯霉素乙酰转移酶基因。寡核苷酸探针可以是任何合适的探针，例如杂交探针、水解探针等。
本发明的第三方面涉及在用于确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的核酸扩增过程或核酸检测过程中使用的寡核苷酸组，其特征在于所述寡核苷酸组包含第一发明方面的本发明引物对或第二发明方面的本发明寡核苷酸探针，并且包含一种或多种添加剂。
本发明的第四方面涉及用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，所述试剂盒包含第一发明方面的本发明引物对、第二发明方面的本发明寡核苷酸探针和/或第三发明方面的本发明寡核苷酸组，其特征在于，所述引物对的寡核苷酸a)和寡核苷酸b)或所述寡核苷酸探针的寡核苷酸a)在严格条件下与SEQ ID No.3的至少一部分杂交。
本发明的第五方面涉及确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，所述方法包括以下或由以下组成：
a.使用样品的变性核酸提取物作为模板和根据第一发明方面的本发明引物对或根据第三发明方面的本发明寡核苷酸组或根据第四发明方面的包含本发明引物对的本发明试剂盒进行核酸杂交和扩增反应，其中所述寡核苷酸组和试剂盒分别包含所述引物对，以产生在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分的扩增子，
b.检测步骤a)中产生的扩增子，和
c.根据步骤b)中检测到的扩增子，确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在。
如上文公开的本发明的创造性方面可以包括如从属权利要求中阐述的或如以下详细描述和/或附图中公开的优选发明实施方案的任何可能的(子)组合，只要所得的特征组合对于本领域技术人员来说是合理的。
附图说明
本发明进一步的特征和优点将从附图中得出，其中
图1表示在用于检测艰难梭菌菌株第1组(B1/NAP1/027组的R2091菌株)、第2组(ATCC 9689菌株，与B1/NAP1/027组密切相关)和第3组(630菌株，无NAP1组)的比较PCR研究中的生长曲线的图。
图2表示在用于检测艰难梭菌菌株第1组(B1/NAP1/027组的R2091菌株)、第2组(ATCC 9689菌株，与B1/NAP1/027组密切相关)和第3组(630菌株，无NAP1组)的比较PCR研究中的熔解曲线的图。
具体实施方式
本发明的发明人已经发现，第一发明方面的本发明引物对和第二发明方面的本发明寡核苷酸探针特别能够确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在，而与B1/NAP1/027密切相关的菌株以及其他菌株确实没有被确定。特异性是由于本发明的引物对和本发明的寡核苷酸探针已经被优化以分别特异性扩增和检测作为靶标的在CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的这一部分，所述部分对B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株是特异性的，并且在其他密切相关的菌株中不存在。因此，本发明的引物对和本发明的寡核苷酸探针对属于B1/NAP1/027组的艰难梭菌菌株显示出高特异性。此外，第四发明方面的本发明检测方法提供了用于高毒力艰难梭菌菌株(更优选属于B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株)的简单且高灵敏度的检测方法(详细信息参见实施例部分)。
根据本发明所有方面的优选实施方案，在高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码氯霉素乙酰转移酶基因的寡核苷酸包含SEQ ID No.3或由SEQ ID No.3组成。SEQ ID No.3表示的寡核苷酸是指代表高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中的完整氯霉素乙酰转移酶基因的寡核苷酸组。根据第一发明方面的另一个优选实施方案，在高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码氯霉素乙酰转移酶基因的寡核苷酸包含SEQ ID No.4或由SEQ ID No.4组成，因为该序列对于属于B1/NAP1/027组的艰难梭菌菌株是特异性的。
在本发明的上下文中，表述“另外地或替代地另一个优选实施方案”或“另外地或替代地优选实施方案”或“配置该优选实施方案的另外或替代方式”是指除了本发明主题(包括本发明方面中的每一个的任何优选实施方案)的特征之外或替代该特征，该优选实施方案中公开的特征或特征组合可以组合，只要所得的特征组合对于本领域技术人员来说是合理的。
如在本发明的发明内容部分中已经提到的，根据第一发明方面的本发明引物对通常用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交并对其进行扩增，而根据第二发明方面的本发明寡核苷酸探针通常用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交并对其进行检测。
第一发明方面的本发明引物对或第二发明方面的本发明寡核苷酸探针的分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间。替代地，具有至少10个核苷酸的分离寡核苷酸可用作寡核苷酸a)，其包含或由所述寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述寡核苷酸含有或由与SEQ IDNo.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间。为了提高杂交准确度，分离寡核苷酸a)可以包含15个或更多、更优选20个或更多、优选22个或更多、或者25至50个核苷酸。
在本发明的上下文中，术语“核苷酸”和“核苷酸残基”同义使用。
在本发明的上下文中，术语“比对”是指将两个序列的核苷酸残基匹配以达到最大水平的同一性的结果，其中该比对是不加空位的(ungapped)序列比对。特别地，为了计算序列同一性，使用寡核苷酸a)和SEQ ID No.1的比对，这意味着将寡核苷酸a)的各个核苷酸残基序列与SEQ ID No.1的相应核苷酸残基序列匹配。为了使用寡核苷酸b)和SEQ ID No.2的比对计算序列同一性，将寡核苷酸b)的各个核苷酸残基序列与SEQ ID No.2的相应核苷酸残基序列匹配。
在本发明的上下文中，表述“比对中的核苷酸残基的总数”(同义词：“比对长度”)是指两个比对序列之一的比对匹配核苷酸残基和插入的非匹配核苷酸残基的数量。分别比对的核苷酸残基分别形成相应的核苷酸残基对。“比对中的核苷酸残基的总数”/“比对长度”用作序列同一性计算的分母。各自的相应核苷酸残基对中的核苷酸残基可以分别显示核苷酸残基的同一性(同义词：“匹配的核苷酸残基”)或核苷酸残基的非同一性。
在本发明的上下文中，表述“匹配的核苷酸残基”或“核苷酸残基的同一性”是指各个核苷酸残基对的核苷酸残基代表相同的核苷酸残基或相同的核苷酸残基类似物，例如锁核酸(LNA)和DNA。
第二发明方面的本发明寡核苷酸探针的分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中寡核苷酸包含至少15个核苷酸，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间。替代地，具有至少15个核苷酸的分离寡核苷酸可用作寡核苷酸a)，其包含或由所述寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述寡核苷酸含有或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间。为了提高杂交准确度，分离寡核苷酸a)可以包含20个或更多、优选22个或更多、或者25至50个核苷酸。
在本发明的上下文中，表述“寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸”和“寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少15个核苷酸”分别表示寡核苷酸a)包含具有至少10/15个核苷酸的序列，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10/15到25个核苷酸残基之间。这种理解来自使用措辞“包含或由至少88％组成”，据此得出，寡核苷酸a)包含具有至少88％的序列同一性的序列或由具有至少88％的序列同一性的序列组成。此外，考虑到所要求保护的寡核苷酸a)的长度为至少10/15个核苷酸，因此其可能小于或大于SEQ ID No.1的25个核苷酸的长度，措辞“与SEQ ID No.1的序列同一性”要求序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10/15到25个核苷酸残基之间。相同的理解涉及包含至少10/15个核苷酸的用作寡核苷酸a)的分离寡核苷酸，其包含或由所述寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述寡核苷酸包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中序列同一性分别计算为寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10/15到25个核苷酸残基之间。
本发明引物对的第二分离寡核苷酸b)通常选自与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交的引物寡核苷酸，所述氯霉素乙酰转移酶基因优选为SEQ ID No.3，更优选为SEQ ID No.4。更优选地，本发明引物对的第二分离寡核苷酸b)包含或由与SEQ ID No.2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸，并且其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸b)和SEQ ID No.2之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到21个核苷酸残基之间。为了提高杂交准确度，分离寡核苷酸b)可以优选包含15个或更多、更优选20至50个核苷酸。
在本发明的上下文中，表述“寡核苷酸b)包含或由与SEQ ID No.2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸”是指寡核苷酸b)包含具有至少10个核苷酸的序列，其中所述序列同一性分别计算为寡核苷酸b)和SEQ ID No.2之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到21个核苷酸残基之间。这种理解来自使用措辞“包含或由至少90％组成”，据此得出，寡核苷酸b)包含具有至少90％的序列同一性的序列或由具有至少90％的序列同一性的序列组成。此外，考虑到所要求保护的寡核苷酸b)的长度为至少10个核苷酸，因此其可能小于或大于SEQ ID No.2的21个核苷酸的长度，措辞“与SEQ ID No.2的序列同一性”要求序列同一性分别计算为寡核苷酸b)和SEQ ID No.2之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中比对中的核苷酸残基的总数在10到21个核苷酸残基之间。
根据示例性实施方案，本发明的引物对包含或由根据SEQ ID No.1的分离寡核苷酸a)和根据SEQ ID No.2的分离寡核苷酸b)组成。
根据第一发明方面的另外地或替代地进一步的优选实施方案，本发明的引物对的寡核苷酸a)和/或寡核苷酸b)可以彼此独立地包含一个或多个添加的官能性(functionality)，例如特别是可通过荧光共振能量转移(FRET)检测的猝灭剂和/或荧光团、放射性同位素，和/或可以包含一种或多种修饰的核苷酸，例如锁核酸(LNA)。这种添加的官能性可以增强本发明的引物对与靶标的杂交和/或本发明的寡核苷酸探针的检测。
根据示例性实施方案，本发明的寡核苷酸探针包含以下或由以下组成：根据SEQID No.1的分离寡核苷酸a)或其互补序列和一种或多种用于检测B1/NAP1/027组的艰难梭菌(特别是用于定量检测B1/NAP1/027组的艰难梭菌)的合适的检测官能性，例如猝灭剂和/或荧光团部分，更优选分别在寡核苷酸探针的5’端和3’端的荧光团部分和猝灭剂部分。
选择B1/NAP1/027组的艰难梭菌的参考菌株R20291的基因组作为实例以优化第一发明方面的本发明引物对和第二发明方面的本发明寡核苷酸探针。全测序的基因组以基因登录号FN545816.1保存。
如实施例部分(执行的实施例1和2)中详细阐述的，本发明的引物对有助于与B1/NAP1/027组(第1组)的高毒力艰难梭菌菌株特异性杂交并对其进行扩增，而本发明的引物对不与通过核糖分型确定的与B1/NAP1/027密切相关的菌株(第2组)以及其他艰难梭菌菌株，例如630(第3组)杂交也不对其进行扩增。因此，与第2组的密切相关菌株或第3组的其他菌株相比，本发明的引物对对于确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株具有高度特异性。
对于本发明的寡核苷酸探针也是如此，它有助于与B1/NAP1/027组(第1组)的高毒力艰难梭菌菌株特异性杂交并对其进行检测，而本发明的寡核苷酸探针不与通过核糖分型确定的与B1/NAP1/027密切相关的菌株(第2组)以及其他艰难梭菌菌株(例如630)(第3组)杂交并对其进行检测。因此，与第2组的密切相关菌株或第3组的其他菌株相比，本发明的寡核苷酸探针对于检测B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株具有高度特异性。
关于本发明的第一和第二方面公开的所有特征和实施方案可单独组合或彼此(子)组合并与本发明的第三至第五方面(包括其优选实施方案中的每一个)分别(子)组合，前提是所得到的特征组合对技术人员来说是合理的。
根据本发明的第三方面，提供了用于在确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的核酸扩增过程中使用的寡核苷酸组，其特征在于所述寡核苷酸组包含第一发明方面的本发明引物对或第二发明方面的本发明寡核苷酸探针，以及一种或多种溶剂。合适的溶剂在现有技术中很容易获得。
关于本发明的第三方面公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明的第一、第二、第四和第五方面中的每一个(包括其优选实施方案中的每一个)分别(子)组合，前提是所得到的特征组合对技术人员来说是合理的。
根据本发明的第四方面，一种用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，其包含根据第一发明方面的本发明的引物对、根据第二发明方面的本发明的寡核苷酸探针和/或根据第三发明方面的寡核苷酸组，其特征在于本发明的引物对的寡核苷酸a)和寡核苷酸b)或寡核苷酸探针的寡核苷酸a)分别在严格条件下与SEQ IDNo.3的至少一部分、优选SEQ ID No.4的至少一部分杂交。例如，如果反应不够严格，将产生许多长度可变的假扩增子。如果反应过于严格，则不会产生产物。因此，扩增反应的严格性由技术人员常规地调节和调整以影响扩增子谱的结果，特别是通过改变变量，例如试剂浓度、循环条件。
根据另外地或替代地优选实施方案，用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的本发明试剂盒进一步包含选自以下组的一种、两种、三种、四种或更多种成分(反应物)：酶，例如聚合酶(例如taq DNA聚合酶)、连接酶、解旋酶或重组酶；脱氧核苷酸；对照模板；缓冲剂和反应添加剂。优选地，缓冲剂溶解在水中，优选不含核酸酶的水中，并且包含选自以下组的一种或多种成分或由选自以下组的一种或多种成分组成：盐，例如氯化钾(KCl)、硫酸铵(NH4)2SO4、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，或蛋白质，例如白蛋白，包括牛血清白蛋白；和/或反应添加剂包含选自以下组的一种、两种或更多种成分或由选自以下组的一种、两种或更多种成分组成：辅因子，例如氯化镁(MgCl2)；二甲基亚砜(DMSO)；荧光团，例如嵌入双链核酸链中的荧光染料(例如SYBR Green I)；和猝灭剂。
本发明试剂盒中的一种或多种成分可以以浓缩形式存在，即在将它们应用于扩增反应之前需要稀释，优选用不含核酸酶的水。作为实例，一种或多种成分可以以两倍浓缩的形式存在，即分别浓缩的成分需要稀释至浓缩体积的两倍。
作为实例，本发明的试剂盒中用于检测B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的严格条件包括不含核酸酶的水和0.05至0.1U/μl聚合酶，优选taq DNA聚合酶，10至200mM Tris-HCl，0.5至5mM，优选3mM MgCl2，50至500mM，优选50mM KCl和6.8至9.1范围内的pH，优选8.4至8.8的pH。此外，试剂盒中还存在适量的检测剂，例如荧光团，优选嵌入双链DNA的荧光染料。
关于本发明的第四方面公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明的第一、第二、第三和第五方面中的每一个(包括其优选实施方案中的每一个)分别(子)组合，前提是所得到的特征组合对技术人员来说是合理的。
根据本发明的第五方面，提供了一种确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法。如上所述，本发明的检测方法提供了一种简单且因此具有成本效益的检测方法，其同时表现出高灵敏度。
本发明的方法包括步骤a)进行核酸杂交和扩增反应，该反应使用样品的变性核酸提取物作为模板和本发明的引物对或本发明的寡核苷酸组或本发明的试剂盒，其中所述寡核苷酸组和试剂盒分别包含所述引物对，以产生在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分的扩增子。样品的变性核酸提取物可以是商购的，或者可以根据现有技术的合适方法(例如描述为“Optimized Protocol for Simple Extraction of High-Quality Genomic DNA fromClostridium difficile for Whole-Genome Sequencing”(James Heng Chiak Sim等人，Journal of Clinical Microbiology，2015年7月，第53卷，第7期，第2329–2331页))从标本样品产生。任何合适的试剂盒都可用于DNA分离，例如Genomic Mini Kit(A&ABiotechnology)。人类艰难梭菌感染的诊断和分型可通过合适的标准操作程序(SOP)进行，例如欧洲疾病预防和控制中心2018年10月19日发布的“用于人类艰难梭菌感染诊断和分型的实验室程序(Laboratory procedures for diagnosis and typing of humanClostridium difficile infection)”。
根据另外的或替代的优选实施方案，扩增反应选自由以下组成的组：聚合酶链式反应(PCR)如实时PCR(qPCR)、连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、多重PCR连接酶检测反应测定、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重寡核苷酸连接PCR(MOL-PCR)、等温DNA扩增、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、聚合酶螺旋反应(PSR)、链置换扩增。特别是，实时PCR(qPCR)不仅可以定性，还可以定量检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株。
连接酶链式反应(LCR)尤其适用于除了本发明的引物对之外，使用用于第二模板链的第二引物对的情况。
连接酶检测反应(LDR)是一种改进的LCR技术，其中只有两个寡核苷酸而不是四个寡核苷酸在一条靶标链上相邻结合。
对于多重连接依赖性探针扩增(MLPA)，两个寡核苷酸探针在靶序列上相邻结合，并且仅在它们的互补靶DNA存在时才连接。
多重寡核苷酸连接PCR(MOL-PCR)类似于MLPA，但流式细胞仪用于识别每个珠粒以测量每个珠粒-探针复合物的荧光强度。对于MOL-PCR，反向引物而不是正向引物被荧光标记。
滚环扩增(RCA)是一种非等温酶促过程，它使用DNA或RNA聚合酶产生单链DNA(ssDNA)或RNA分子，所述分子是模板的一系列互补单元的连接。
解旋酶依赖性扩增(HAD)遵循复制叉机制进行扩增，其利用DNA解旋酶发挥解旋活性。解旋酶将双链DNA分离成单链DNA，用于靶DNA的体外扩增。扩增由外切核酸酶缺陷型DNA聚合酶在单一恒温下延长。通过凝胶电泳检测HAD产物。
信号介导的RNA扩增技术(SMART)基于信号放大，不依赖于靶序列的复制。SMART方法由两个单链寡核苷酸探针组成，这些探针与特定的靶序列退火，然后形成三向连接(3WJ)结构。该反应由Bst DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和DNA聚合酶这三种酶在41℃的恒温下进行。通过ELOSA实时检测扩增子。
重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温方法，通过使用DNA聚合酶、重组酶和DNA结合蛋白在37-42℃的温度下扩增靶DNA序列。通过荧光团、猝灭剂基团和微流体装置检测扩增产物。
聚合酶螺旋反应(PSR)可在1小时内完成，具有高灵敏度(高达109个拷贝)和高特异性以检测靶标。PSR方法利用了PCR(其中只需要一对引物)和等温扩增技术(如LAMP测定)的优点。
链置换扩增是基于HincII切割其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链的能力以及外切核酸酶缺陷型klenow(exo-klenow)在缺口处延伸3’-末端并置换下游DNA链的能力。指数扩增是由耦合正义和反义反应产生的，其中从正义反应中置换出来的链作为反义反应的靶标，反之亦然。
本发明的确定方法进一步包括作为步骤b)检测步骤a)中产生的扩增子。根据另外的或替代的优选实施方案，通过使用非特异性检测方法检测扩增子，例如用合适的方式检测荧光。作为实例，可以检测非特异性插入到扩增子的双链核酸链中的荧光染料。SYBRGreen I是常用的荧光DNA结合染料的实例，它结合所有双链DNA，并通过测量整个循环中荧光的增加来监测检测。SYBR Green I的最大激发和发射波长分别为494nm和521nm。Sigma的基于SYBR的QPCR检测的特异性通过加入热启动介导的taq聚合酶JumpStart Taq大大增强。替代地，荧光团和猝灭剂作为FRET对，例如可以在TaqMan测定或使用杂交探针的技术中使用。作为实例，第二发明方面的本发明寡核苷酸探针可用于检测步骤a)产生的扩增子。
该方法进一步包括作为步骤c)确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在，如果在步骤b)中阳性检测到扩增子，则根据步骤b)中检测到的扩增子确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在。换言之，如果在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分的扩增子在步骤a)中产生并且在步骤b)中被检测到，那么在步骤c)中确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在。这又意味着，如果在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分的扩增子没有在步骤a)中产生并且因此没有在步骤b)中被检测到，那么不能在步骤c)中确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在。如实施例部分所述，用于确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的本发明方法是高度特异性的。这意味着，本发明的引物对在遇到与B1/NAP1/027组密切相关的艰难梭菌菌株或其他菌株时，不会在步骤a)中产生扩增子，因此，这些菌株确实不会被确定为B1/NAP1/027组的艰难梭菌。此外，鉴于扩增反应的使用，本发明的方法还是高灵敏度的，并且简单、具有时间和成本效益。
一般而言，待通过第五发明方面的本发明方法检测的样品可以是任何合适的标本。根据另外或替代的优选实施方案，用于确定B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的样品选自由人类样品、动物样品、对象样品或食物样品组成的组，更优选选自分别来自人或动物的粪便样品、涂片测试样品、体液样品或组织样品。
关于本发明的第五方面公开的所有特征和实施方案可单独组合或与本发明的第一、第二、第三和第四方面中的每一个(包括其优选实施方案中的每一个)分别(子)组合，前提是所得到的特征组合对技术人员来说是合理的。
实施例：
本发明的进一步特征和优点将从以下参照附图对本发明方面的示例实施例的描述中得出。
下文关于示例实施例公开的所有特征可以单独或以任何子组合分别与本发明的不同方面的特征(包括其优选实施方案的特征)组合，只要所得到的特征组合对本领域技术人员来说是合理的。
实施例1：本发明的引物对/本发明的探针对B1/NAP1/027菌株与艰难梭菌的其他 菌株的选择性的生物信息学比较
为了显示本发明的引物对和本发明的寡核苷酸探针的特异性，进行了以下比对。首先，将存在于艰难梭菌菌株R2091完整基因组中的根据SEQ ID No.3的氯霉素乙酰转移酶基因的靶序列输入基本局部比对搜索工具(BLAST)，以比对B1/NAP1/027组的艰难梭菌的靶序列与任何已知的同源物。从BLAST比对获得的结果分组如下：
下表1中列出的第1组包含与靶序列具有100％查询覆盖率(query cover)和同一性的菌株，所有菌株均被识别为属于B1/NAP1/027组的艰难梭菌的标本，并被视为在本发明方法的检测步骤b)中表现出真阳性得分。
表1：
Figure BDA0003640234660000181
Figure BDA0003640234660000191
Figure BDA0003640234660000201
下表2中列出的第2组包含查询覆盖率和同一性系数较低的菌株，因此在序列上有一些差异，例如缺失或倒位，所有菌株均被识别为不属于B1/NAP1/027组的艰难梭菌的标本，但被认为是密切相关的。已选择该组，因为预计它们可能在本发明方法的检测步骤b)中产生假阳性得分。
表2：
Figure BDA0003640234660000211
第3组包括所有其他菌株，例如艰难梭菌630菌株，它们与靶序列不显示同源性。
实施例2：用于比较本发明的引物对对B1/NAP1/027菌株与艰难梭菌的其他菌株的 选择性的PCR研究
样品制备方案：
1.艰难梭菌ATCC 9689细菌在含5％羊血平板(Oxoid；目录号PB5039A)的哥伦比亚琼脂上在37℃在厌氧条件下(AnaeroGen Compact，Oxoid；目录号AN0010C和AN0020D)生长48小时。
2.使用接种环从平板上刮下艰难梭菌菌落，并悬浮在10mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中，至等于1.0McFarland。
3.对于DNA提取，每个样品使用100μl体积的1.0McFarland悬浮液。
4.根据制造商的方案，使用Genomic Mini Kit(A&A Biotechnology)提取细菌DNA。
类似地，样品制备是针对艰难梭菌630菌株进行的。对于艰难梭菌R20291菌株，提供了DNA来源作为样品材料。
相应的细菌培养物和/或DNA材料可以从Public Health England、LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH和ATCC获得。
在LightCycler 480(ROCHE)上进行实时PCR的反应混合物：
10μl RT HS-PCR Mix
Figure BDA0003640234660000221
A(A&A Biotechnology)
8μl H2O无菌水，不含核酸酶。用DEPC处理。(A&A Biotechnology)
1μl引物混合物(10mM Tris-HCl pH 8.0溶液)(每种2.5μM)
1μl DNA(阴性对照-1μl无菌水)
PCR反应条件：
初始变性：95℃ 5分钟
45个循环：
步骤1-95℃ 15秒
步骤2-55℃ 25秒
步骤3-72℃ 15秒
熔解-65至97℃
图1是分别用于检测第1组(B1/NAP1/027组的R2091菌株)、第2组(ATCC 9689菌株，与B1/NAP1/027组密切相关)和第3组(630菌株，无NAP1组)的艰难梭菌菌株的比较PCR测定中的生长曲线图。当比较各组的生长曲线时，很明显，第1组的指数生长比第2组和第3组更早开始。
图2是分别用于检测第1组(B1/NAP1/027组的R2091菌株)、第2组(ATCC9689菌株，与B1/NAP1/027组密切相关)和第3组(630菌株，无NAP1组)的艰难梭菌菌株的比较PCR测定中的熔解曲线图。当比较各组的熔解曲线时，很明显，第1组的熔解温度为84℃，比第2组和第3组的熔解温度高4℃。
结合生长曲线和熔解曲线的结果，显然对于第1组，在本发明的引物(特别是本发明的引物对)和氯霉素乙酰转移酶靶序列之间发生了预期的杂交和随后的扩增，而对于第2组和第3组，各自的生长曲线和熔解曲线与引物二聚体的产生有关，不会导致氯霉素乙酰转移酶靶序列的预期扩增。表4提供了各自执行的实施例1和2的概述。
表4：
Figure BDA0003640234660000231
表4表明，执行的实施例2的PCR研究结果证实了执行的实施例1的生物信息学结果，这意味着本发明的引物对相对于第2组的密切相关菌株或第3组的其他菌株，对于检测B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株具有高度特异性。PCR扩增方法也高度敏感，并且简单、具有时间和成本效益。
根据 ISA/EP 细则91条修正
序列表
<110> 好奇诊断有限责任公司
<120> 确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法
<130> C4703WO
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAP1F
<400> 1
gggagaagta taaaacagaa cgtgc 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAP1R
<400> 2
gccccaagta ataactggtg c 21
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213> 梭菌
<220>
<223> 氯霉素乙酰转移酶基因
<400> 3
atgggcatgg aatataaata tacaaaaatt gatttgaata aatggaatag aggtaaattg 60
tttcaaagct acattgataa tatgcgtatt gttatgagct taaccgtaga tattgatgta 120
acaaagttta ttgaattttc aaagaagcat gatttaaaat tttatccagc tatgatatgg 180
gctgtttcaa aggttgttaa tgaacatgat gagttcaaat atagttggga taataatggg 240
aatttaatta agtgggatta tatttctccg tcctatactg aatttcataa agaagatgaa 300
aatttcacaa agatagttac agatttttct gatagcatat ttgaatttca taaacgtttt 360
atattagata gggagaagta taaaacagaa cgtgcatttg tggaaaatca atctttgaac 420
ttttttgatg tatcttgttt accgtgggta aaatataatc attttgatgt tcatgttttt 480
gacgagggaa aatttcttgc accagttatt acttggggca aatatgaatt agagcaagaa 540
agatatataa tgcctcttac aatgaatata catcatgccg tagcagatgg attccattta 600
tccagatttt ttaatgaagt acaagaattg ataaactcaa tttaa 645
<210> 4
<211> 149
<212> DNA
<213> 梭菌
<220>
<223> 引物与其杂交的氯霉素乙酰转移酶基因的一部分
<400> 4
gggagaagta taaaacagaa cgtgcatttg tggaaaatca atctttgaac ttttttgatg 60
tatcttgttt accgtgggta aaatataatc attttgatgt tcatgttttt gacgagggaa 120
aatttcttgc accagttatt acttggggc 149

Claims (15)

1.一种引物对，其用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交，其特征在于，所述引物对包含以下或由以下组成：
a.第一分离寡核苷酸a)，所述第一分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸；或具有至少10个核苷酸的分离寡核苷酸，所述分离寡核苷酸包含或由所述分离寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述分离寡核苷酸包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为所述寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中所述比对中的核苷酸残基的总数在10到25个核苷酸残基之间，和
b.第二分离寡核苷酸b)，所述第二分离寡核苷酸b)与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交，所述第二分离寡核苷酸b)优选包含或由与SEQ ID No.2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少10个核苷酸，并且其中所述序列同一性分别计算为所述寡核苷酸b)和SEQ ID No.2之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中所述比对中的核苷酸残基的总数在10到21个核苷酸残基之间。
2.一种寡核苷酸探针，其用于与在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分杂交，其特征在于，所述寡核苷酸探针包含或由分离寡核苷酸a)组成，所述分离寡核苷酸a)包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，其中所述寡核苷酸包含至少15个核苷酸；或具有至少15个核苷酸的分离寡核苷酸，所述分离寡核苷酸包含或由所述分离寡核苷酸的互补寡核苷酸序列组成，所述分离寡核苷酸包含或由与SEQ ID No.1至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性组成，并且其中所述序列同一性分别计算为所述寡核苷酸a)和SEQ ID No.1之间的比对的匹配核苷酸残基的数量与比对中的核苷酸残基的总数的比率，其中所述比对中的核苷酸残基的总数在15到25个核苷酸残基之间，优选为20到25个核苷酸残基。
3.根据权利要求1所述的引物对，其中所述寡核苷酸a)和所述寡核苷酸b)彼此独立地包含15个或更多个核苷酸，优选20个或更多个核苷酸。
4.根据权利要求1或3所述的引物对或根据权利要求2所述的寡核苷酸探针，其中在高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码氯霉素乙酰转移酶基因的所述寡核苷酸包含或由SEQ ID No.3组成。
5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的引物对或根据权利要求2或4中任一项所述的寡核苷酸探针，其中在高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码氯霉素乙酰转移酶基因的所述寡核苷酸包含或由SEQ ID No.4组成。
6.根据权利要求1和3-5中任一项所述的引物对或根据权利要求2、4和5中任一项所述的寡核苷酸探针，其中所述引物对中的寡核苷酸a)和寡核苷酸b)各自独立地进一步包含一种或多种添加的官能性，或其中所述寡核苷酸探针中的寡核苷酸a)进一步包含一种或多种添加的官能性，优选选自猝灭剂和/或荧光团、放射性同位素和/或一种或多种修饰的核苷酸，优选锁核酸(LNA)。
7.一种寡核苷酸组，其用于确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的核酸扩增反应或核酸检测反应，其特征在于，所述寡核苷酸组包含根据权利要求1和3-6中任一项所述的引物对或根据权利要求2和4-6中任一项所述的寡核苷酸探针，并且包含一种或多种溶剂。
8.一种用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1或3-6中任一项所述的引物对、根据权利要求2和4-6中任一项所述的寡核苷酸探针或根据权利要求7所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述引物对的寡核苷酸a)和寡核苷酸b)或所述寡核苷酸探针的寡核苷酸a)分别在严格条件下与SEQ ID No.3的至少一部分、优选SEQ ID No.4的至少一部分杂交。
9.根据权利要求8所述的用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含选自以下组的一种、两种、三种、四种或更多种成分：酶，例如聚合酶、连接酶、解旋酶或重组酶；脱氧核苷酸；对照模板；缓冲剂和反应添加剂。
10.根据权利要求9所述的用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，其中所述缓冲剂溶解在溶剂、优选不含核酸酶的水中，并且包括选自以下组的一种或多种成分或由选自以下组的一种或多种成分组成：盐，例如氯化钾(KCl)、硫酸铵(NH4)2SO4、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，或蛋白质，例如白蛋白，包括牛血清白蛋白；和/或反应添加剂包含或由选自以下组的一种、两种或多种成分组成：辅因子，例如氯化镁(MgCl2)；二甲基亚砜(DMSO)；荧光团，例如嵌入双链核酸链中的荧光染料；和猝灭剂。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的用于检测样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的试剂盒，其中所述严格条件包括不含核酸酶的水和0.05至0.1U/μl聚合酶，优选taq DNA聚合酶，10至200mM Tris-HCl，0.5至5mM，优选3mM MgCl2，50至500，优选50mM KCl，pH范围为6.8至9.1，优选pH为8.4至8.8。
12.一种确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，所述方法包括以下或由以下组成：
a.使用样品的变性核酸提取物作为模板和根据权利要求1和3-6中任一项所述的引物对或根据权利要求7所述的寡核苷酸组或根据权利要求8-11中任一项所述的试剂盒进行核酸杂交和扩增反应，其中所述寡核苷酸组和所述试剂盒分别包含所述引物对，以产生在B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的CTn-027家族的转座子中编码的氯霉素乙酰转移酶基因的至少一部分的扩增子，
b.检测步骤a)中产生的扩增子，和
c.根据步骤b)中检测到的扩增子，确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在。
13.根据权利要求12所述的确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)如实时PCR(qPCR)、连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、多重PCR连接酶检测反应测定、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重寡核苷酸连接PCR(MOL-PCR)、等温DNA扩增、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、聚合酶螺旋反应(PSR)、链置换扩增。
14.根据权利要求12或13所述的确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，其中所述扩增子通过使用非特异性检测方法进行检测，例如荧光检测。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的确定样品中B1/NAP1/027组的高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，其中所述样品是人类样品、动物样品或食物样品，优选选自粪便样品、涂片测试样品、体液样品或组织样品。
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