JP5051574B2 - Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット - Google Patents
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Description
本発明はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用プライマーセット及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用キットに関し、特に特異性に優れた検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キットに関する。
肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、以下「Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」と略すこともある。）は、肺炎、心内膜炎、菌血症、敗血症、髄膜炎、中耳炎の原因菌の１つであり、通常ヒトの体内で共生している他のα溶血レンサ球菌と区別してＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染を検出することは臨床研究や診断において重要である。
従来、このＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染を検出、診断するために、コロニー形態、オプトヒン感受性、胆汁溶解性や血清反応等の培養による選別及び生化学的検査法が用いられている。
しかし、上述のような培養による選別及び生化学的検査法を併用した場合には、感染が判明するまでに３日以上を要するのに加え、コロニーをその形状や色の相違などから精確に選別するためには熟練した技術が必要であり、臨床診断及びその後の処置に支障をきたすおそれがあった。
一方、近年においては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出法も提案されている（特開平９−３２７３００号公報）。ＰＣＲ法による検出では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的なプライマーを用い、採取したＤＮＡサンプルを鋳型に核酸増幅を行わせることで、この核酸増幅の有無によりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの有無を検知することができる。この方法では、培養による選別と生化学的検査法を併用した場合に比べ短時間で簡便に、一定の信頼性のある検出が可能である。
従来、このＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染を検出、診断するために、コロニー形態、オプトヒン感受性、胆汁溶解性や血清反応等の培養による選別及び生化学的検査法が用いられている。
しかし、上述のような培養による選別及び生化学的検査法を併用した場合には、感染が判明するまでに３日以上を要するのに加え、コロニーをその形状や色の相違などから精確に選別するためには熟練した技術が必要であり、臨床診断及びその後の処置に支障をきたすおそれがあった。
一方、近年においては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出法も提案されている（特開平９−３２７３００号公報）。ＰＣＲ法による検出では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的なプライマーを用い、採取したＤＮＡサンプルを鋳型に核酸増幅を行わせることで、この核酸増幅の有無によりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの有無を検知することができる。この方法では、培養による選別と生化学的検査法を併用した場合に比べ短時間で簡便に、一定の信頼性のある検出が可能である。
ＰＣＲ法を用いて検出する場合には、上述したようにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特徴的な遺伝子を標的として増幅反応を行うのが一般的であり、このようなＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特徴的な遺伝子として、例えばａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードするｌｙｔＡ遺伝子や、ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードするｐｌｙ遺伝子が知られている。しかしながら、最近では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ以外の菌であって、遺伝子型及び表現型からはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと近縁のストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）（以下、「Ｓ．ｍｉｔｉｓ」と略すこともある）に分類される菌の中に、ａｕｔｏｌｙｓｉｎあるいはｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を保持するものの存在が報告されている（参照：Ｗｈａｔｍｏｒｅ Ａ．Ｍ．，他７名，”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ”ａｔｙｐｉｃａｌ”ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｌｌｉｅｄ ｔｏ Ｓ．ｍｉｔｉｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ．”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２０００，ｖｏｌ．６８，ｐ．１３７４−１３８２）。このため、ｌｙｔＡ遺伝子やｐｌｙ遺伝子を標的としてＰＣＲを行った場合にも、口腔常在菌であるＳ．ｍｉｔｉｓやストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）（以下、「Ｓ．ｏｒａｌｉｓ」と略すこともある）等の一部の菌とは区別が困難であった。
また、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行う場合には、サーマルサイクラー等の設備が必要でありコストと手間がかかる等の問題もあった。
本発明は上述のような問題点に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便で、特異性に優れたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用プライマーセット及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用キットを提供することを課題とする。
上記課題に鑑みてより特異性に優れた検出方法を開発するために、本発明者らは、まず４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｌｙｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８５４０，ＡＥ００７４８３，Ｍ１３８１２，ＡＦ４６７２４９）と、その他のａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする９種の菌株（Ｓ．ｍｉｔｉｓのｌｙｔＡ遺伝子（ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＪ６１７８１５，ＡＪ６１７８１６），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のｌｙｔＡ遺伝子（ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＪ２５２１９０，ＡＪ２５２１９１，ＡＪ２５２１９２，ＡＪ２５２１９３，ＡＪ２５２１９４，ＡＪ２５２１９５，ＡＪ２５２１９６））の塩基配列を比較した。その結果、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのみに共通する特異的な塩基配列を解明した。そして、これらの塩基配列からＬＡＭＰ法用プライマーを設計し、ｌｙｔＡ遺伝子を特異的に増幅することによりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列領域のうち第４０番目から第４５０番目の領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該ｌｙｔＡ遺伝子を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法。
上記検出方法において、ＬＡＭＰプライマーセットは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第４０番目から第４５０番目の領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものを使用することができる。さらに、これらのＬＡＭＰプライマーセットには、さらにループプライマーを含めることが可能である。
ここで、ＦＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第７６番目から第１３２番目、又は第２３９番目から第３０８番目の領域から設計することができ、ＢＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第１５３番目から第２１６番目、又は第３３２番目から第４１３番目の領域から設計することができる。また、Ｆ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第４７番目から第７６番目、又は第２２１番目から第２３７番目の領域から設計することができ、Ｂ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第２２６番目から第２４０番目、又は第４１７番目から第４３４番目の領域から設計することができる。本発明においては、ループプライマーを含めることができるが、そのループプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第１７８番目から第１９５番目の領域から設計することができる。
本発明において好ましいプライマーセットとしては、例えば以下の（ａ）〜（ｅ）に示される塩基配列の組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つを挙げることができる。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号５、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２で表される塩基配列の組み合わせ
（ｅ）配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（２）以下の（ａ）〜（ｅ）に示される塩基配列の組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出用プライマーセット。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号５、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２で表される塩基配列の組み合わせ
（ｅ）配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（３）上記（２）に記載のプライマーセットを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出用キット。
また、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行う場合には、サーマルサイクラー等の設備が必要でありコストと手間がかかる等の問題もあった。
本発明は上述のような問題点に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便で、特異性に優れたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用プライマーセット及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用キットを提供することを課題とする。
上記課題に鑑みてより特異性に優れた検出方法を開発するために、本発明者らは、まず４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｌｙｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８５４０，ＡＥ００７４８３，Ｍ１３８１２，ＡＦ４６７２４９）と、その他のａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする９種の菌株（Ｓ．ｍｉｔｉｓのｌｙｔＡ遺伝子（ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＪ６１７８１５，ＡＪ６１７８１６），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のｌｙｔＡ遺伝子（ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＪ２５２１９０，ＡＪ２５２１９１，ＡＪ２５２１９２，ＡＪ２５２１９３，ＡＪ２５２１９４，ＡＪ２５２１９５，ＡＪ２５２１９６））の塩基配列を比較した。その結果、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのみに共通する特異的な塩基配列を解明した。そして、これらの塩基配列からＬＡＭＰ法用プライマーを設計し、ｌｙｔＡ遺伝子を特異的に増幅することによりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列領域のうち第４０番目から第４５０番目の領域中の部分配列と同一又は相補的な塩基配列からなる１種以上のプライマーを備えたＬＡＭＰプライマーセットを用いて当該ｌｙｔＡ遺伝子を増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法。
上記検出方法において、ＬＡＭＰプライマーセットは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第４０番目から第４５０番目の領域から設計されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーからなるものを使用することができる。さらに、これらのＬＡＭＰプライマーセットには、さらにループプライマーを含めることが可能である。
ここで、ＦＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第７６番目から第１３２番目、又は第２３９番目から第３０８番目の領域から設計することができ、ＢＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第１５３番目から第２１６番目、又は第３３２番目から第４１３番目の領域から設計することができる。また、Ｆ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第４７番目から第７６番目、又は第２２１番目から第２３７番目の領域から設計することができ、Ｂ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第２２６番目から第２４０番目、又は第４１７番目から第４３４番目の領域から設計することができる。本発明においては、ループプライマーを含めることができるが、そのループプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち第１７８番目から第１９５番目の領域から設計することができる。
本発明において好ましいプライマーセットとしては、例えば以下の（ａ）〜（ｅ）に示される塩基配列の組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つを挙げることができる。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号５、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２で表される塩基配列の組み合わせ
（ｅ）配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（２）以下の（ａ）〜（ｅ）に示される塩基配列の組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出用プライマーセット。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号５、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２で表される塩基配列の組み合わせ
（ｅ）配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５で表される塩基配列の組み合わせ
（３）上記（２）に記載のプライマーセットを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出用キット。
図１は、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列、並びにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な塩基部分及び実施例１のＬＡＭＰプライマーの設計領域を示す図である。
図２は、実施例１の各ＬＡＭＰプライマーの構成及びｌｙｔＡ遺伝子上の対応位置を説明する図である。
図３は、感度試験における電気泳動結果を示す写真である。
図４は、リアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。（実施例１及び２の比較）
図５は、リアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。（実施例１及び４の比較）
図６は、実施例１についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図７は、濁度と鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数の関係を示すグラフである。
図８は、実施例４についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図９は、実施例５についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図１０は、実施例５についてスレッシュホールドタイムと鋳型ＤＮＡコピー数の常用対数との関係を示すグラフである。
図２は、実施例１の各ＬＡＭＰプライマーの構成及びｌｙｔＡ遺伝子上の対応位置を説明する図である。
図３は、感度試験における電気泳動結果を示す写真である。
図４は、リアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。（実施例１及び２の比較）
図５は、リアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。（実施例１及び４の比較）
図６は、実施例１についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図７は、濁度と鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数の関係を示すグラフである。
図８は、実施例４についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図９は、実施例５についてリアルタイム濁度測定結果を示すグラフである。
図１０は、実施例５についてスレッシュホールドタイムと鋳型ＤＮＡコピー数の常用対数との関係を示すグラフである。
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用した刊行物及び特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｌｙｔＡ遺伝子において、種特異的領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することによりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出することを可能としたものである。
ここで、「ＬＡＭＰプライマーセット」とは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による核酸増幅に用いられるプライマーセットである（参照文献：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３）。
ＬＡＭＰプライマーは、ＰＣＲ法で用いられるＰＣＲプライマーよりも多くの領域に対して設定されることから、標的の選択性も高いと考えられ、かつ本発明ではｌｙｔＡ遺伝子のうちＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な領域に対してプライマーを設定することから、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出することが可能である。
ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列の一例（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８５４０）を図１及び配列番号２６に示す。なお、図１中、「番号」と付された行は塩基の位置を、「プライマー」と付された行はＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３及びＢ３プライマー（後述）を設計するための領域の位置の一例を示す。また、「塩基」と付された行は配列番号２６と同様にｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列を左側から右側に向かって５’→３’方向となるように示しており、「共通」と付された行は「＊」により当該位置の塩基が前記４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにのみ共通することを示している。なお、図１の「プライマー」行中の矢印は実施例１のプライマーの５’→３’方向を示す。従って、左矢印で範囲指定した領域は、当該領域に相補的な領域がプライマーとされることを示す。
本発明では１種以上のプライマーが第４０番目から第４５０番目の領域の少なくとも一部分と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明においては、さらに共通塩基が多く分散して存在する第８４番目から第１８０番目の領域の全部又は一部が、増幅される領域（プライマー部分も含む）に内包されることが好ましい。
本発明のプライマーを用いた場合には、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好である。
次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
図２に示すように、ＬＡＭＰプライマーセットは、標的遺伝子（ｌｙｔＡ遺伝子）上の異なる６領域（５’末端側から順にＦ３，Ｆ２，Ｆ１，Ｂ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃ）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順にＢ３，Ｂ２，Ｂ１，Ｆ１ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ３ｃ）から設計されるプライマーを組み合わせて構成されるものである。本発明において使用されるＬＡＭＰプライマーセットは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列の５’末端側から、Ｆ１ｃ領域及びＦ２領域のヌクレオチドを連結してなるＦｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ」と略すこともある。）と、５’末端側からＢ１ｃ領域及びＢ２領域のヌクレオチドを連結してなるＢａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ」と略すこともある。）と、Ｆ３領域のヌクレオチドからなるＦ３プライマーと、Ｂ３領域のヌクレオチドからなるＢ３プライマーと、からなっている。なお、所望によりさらにループプライマー（Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ及び／またはＬｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ）を設計し、これらを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を検出してもよい。ループプライマーは、Ｂ１領域とＢ２領域との間、あるいはＦ１領域とＦ２領域との間において形成される１本鎖部分に相補的な配列をもつプライマーである。表１中、実施例５の欄には、Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ（ＬＢ）の一例を示した。
本発明においては、ＦＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列（配列番号２６）のうち第７６番目から第１３２番目（以下、「７６−１３２」のように表示することもある。他のプライマーについても同様。）、又は第２３９番目から第３０８番目の領域から設計することができ、その内訳は、例えば実施例１ではＦ２として７６−９４の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として１０８−１３１の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号１）が好ましい。ＢＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち１５３−２１６、又は３３２−４１３の領域から設計することができ、その内訳は、例えば実施例１ではＢ１ｃとして１５３−１７６（Ｂ１の１５３−１７６の相補鎖）、Ｂ２として１９６−２１６の領域から設計したもの（配列番号２）が好ましい。Ｆ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち４７−７６の領域又は２２１−２３７の領域から設計することができ、例えば実施例１では５５−７４の領域から設計したもの（配列番号３）が好ましい。Ｂ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち２２６−２４０の領域、又は４１７−４３４の領域から設計することができ、例えば実施例１では２２６−２４０の領域から設計したもの（配列番号４）が好ましい。実施例２〜５についても、各プライマーを設計するために好ましい領域として表１の実施例の欄（実２〜実５）に記載の領域を選択することができる。
さらに、本発明において、ループプライマーを使用すると、検出までの時間をさらに短縮することが可能である。したがって、ループプライマーＦ（ＬＦ）及びループプライマーＢ（ＬＢ）の一方又は両方を使用して、検出の効率化を図ることができる。
ＬＦとしては、例えばｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち９５−１１０の領域又は２５６−２８３の領域から設計することができる。
ＬＢとしては、例えばｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち１７６−１９５の領域から設計することができ、１７８−１９５の領域から設計したもの（配列番号２５）が好ましい。
本発明の一例である実施例１のＬＡＭＰプライマーセットのｌｙｔＡ遺伝子における位置を図１及び図２に、本発明の一例である実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットについてプライマーの種類と配列番号との対応を表１に示す。
表１において、「Ｆ２」、「Ｆ１」、「Ｂ１」、「Ｂ２」、「Ｆ３」及び「Ｂ３」の欄に記載の数字は、「Ｆ３」、「Ｆ２」及び「Ｆ１」については、それぞれ図２に示すセンス鎖のＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域の位置を示し、「Ｂ１」、「Ｂ２」、及び「Ｂ３」については、それぞれ図２に示すセンス鎖のＢ１ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ３ｃ領域の位置を示している。従って、例えば、実施例１におけるＦＩＰプライマーにおいて、表１の「Ｆ１」の欄に記載された領域（１０８−１３１の領域）は、ＦＩＰプライマーの構成要素の一部であるＦ１ｃの領域（Ｆ１に対して相補鎖側）であることを意味する。また、表１の「Ｂ３」の欄に記載された領域は、図２に示すセンス鎖のＢ３ｃの領域を意味する。このような領域の位置番号の意味は、他のプライマーについても同様である。
上記表１に示す各プライマーの塩基配列を以下の表２及び表３に示す。
上述のようなＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用ＬＡＭＰプライマーセットは、例えばＤＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することで調製することができる。なお、本発明においてプライマーは、前述したような所定の塩基配列を有し、他の塩基と塩基対形成が可能なオリゴヌクレオチドであって、その３’末端において相補鎖合成の基点となる−ＯＨ基を備えるものを意味する。したがって、この条件を満たす限り、そのバックボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されず、例えばＰでなくＳをバックボーンとしたホスホチオエート体やペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであってもよい。
本発明で用いることができる鋳型依存性核酸合成酵素は、鎖置換活性を有するものであれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６０〜６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
また、増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いたり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出できる。また、本発明によるプライマーは、例えばＤＮＡチップのようにそれ自身を固相に結合させておくこともできる。固相化プライマーを合成開始点とする場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、分離、検出が容易となる。
さらに、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等を添加することにより増幅を確認できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば６５０ｎｍの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。
これらのＬＡＭＰ反応に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用キットとして供給することができる。具体的には、本発明のキットは、前記Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用のＬＡＭＰプライマーセットを含むが、その他に、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液など、さらに必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類を含めることができる。また、核酸の２重鎖を不安定にするための試薬（例えばベタイン）を含めることもできる。
このように、ＬＡＭＰ法では、酵素活性を維持しうる温度で、等温のままインキュベートするだけで、増幅反応を進行させることが可能である。このため、ＰＣＲ法のような温度調節のための設備が不要であり低コストかつ簡便に検出を行うことができるとともに、温度変化に伴う時間ロスもないので迅速に検出が可能である。
なお、本明細書において引用した刊行物及び特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｌｙｔＡ遺伝子において、種特異的領域に着目してＬＡＭＰプライマーセットを設計することによりＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出することを可能としたものである。
ここで、「ＬＡＭＰプライマーセット」とは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による核酸増幅に用いられるプライマーセットである（参照文献：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３）。
ＬＡＭＰプライマーは、ＰＣＲ法で用いられるＰＣＲプライマーよりも多くの領域に対して設定されることから、標的の選択性も高いと考えられ、かつ本発明ではｌｙｔＡ遺伝子のうちＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な領域に対してプライマーを設定することから、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出することが可能である。
ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列の一例（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８５４０）を図１及び配列番号２６に示す。なお、図１中、「番号」と付された行は塩基の位置を、「プライマー」と付された行はＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３及びＢ３プライマー（後述）を設計するための領域の位置の一例を示す。また、「塩基」と付された行は配列番号２６と同様にｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列を左側から右側に向かって５’→３’方向となるように示しており、「共通」と付された行は「＊」により当該位置の塩基が前記４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにのみ共通することを示している。なお、図１の「プライマー」行中の矢印は実施例１のプライマーの５’→３’方向を示す。従って、左矢印で範囲指定した領域は、当該領域に相補的な領域がプライマーとされることを示す。
本発明では１種以上のプライマーが第４０番目から第４５０番目の領域の少なくとも一部分と同一又は相補的な塩基配列からなっている。本発明においては、さらに共通塩基が多く分散して存在する第８４番目から第１８０番目の領域の全部又は一部が、増幅される領域（プライマー部分も含む）に内包されることが好ましい。
本発明のプライマーを用いた場合には、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出において、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れると共に、さらに、増幅曲線に線形性が認められ、定量性も良好である。
次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
図２に示すように、ＬＡＭＰプライマーセットは、標的遺伝子（ｌｙｔＡ遺伝子）上の異なる６領域（５’末端側から順にＦ３，Ｆ２，Ｆ１，Ｂ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃ）及びこれに相補的な領域（５’末端側から順にＢ３，Ｂ２，Ｂ１，Ｆ１ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ３ｃ）から設計されるプライマーを組み合わせて構成されるものである。本発明において使用されるＬＡＭＰプライマーセットは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列の５’末端側から、Ｆ１ｃ領域及びＦ２領域のヌクレオチドを連結してなるＦｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＦＩＰ」と略すこともある。）と、５’末端側からＢ１ｃ領域及びＢ２領域のヌクレオチドを連結してなるＢａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（以下、「ＢＩＰ」と略すこともある。）と、Ｆ３領域のヌクレオチドからなるＦ３プライマーと、Ｂ３領域のヌクレオチドからなるＢ３プライマーと、からなっている。なお、所望によりさらにループプライマー（Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ及び／またはＬｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ）を設計し、これらを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を検出してもよい。ループプライマーは、Ｂ１領域とＢ２領域との間、あるいはＦ１領域とＦ２領域との間において形成される１本鎖部分に相補的な配列をもつプライマーである。表１中、実施例５の欄には、Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ（ＬＢ）の一例を示した。
本発明においては、ＦＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列（配列番号２６）のうち第７６番目から第１３２番目（以下、「７６−１３２」のように表示することもある。他のプライマーについても同様。）、又は第２３９番目から第３０８番目の領域から設計することができ、その内訳は、例えば実施例１ではＦ２として７６−９４の領域（Ｆ２ｃはその相補鎖領域）、Ｆ１として１０８−１３１の領域（Ｆ１ｃはその相補鎖領域）から設計したもの（配列番号１）が好ましい。ＢＩＰプライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち１５３−２１６、又は３３２−４１３の領域から設計することができ、その内訳は、例えば実施例１ではＢ１ｃとして１５３−１７６（Ｂ１の１５３−１７６の相補鎖）、Ｂ２として１９６−２１６の領域から設計したもの（配列番号２）が好ましい。Ｆ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち４７−７６の領域又は２２１−２３７の領域から設計することができ、例えば実施例１では５５−７４の領域から設計したもの（配列番号３）が好ましい。Ｂ３プライマーは、ｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち２２６−２４０の領域、又は４１７−４３４の領域から設計することができ、例えば実施例１では２２６−２４０の領域から設計したもの（配列番号４）が好ましい。実施例２〜５についても、各プライマーを設計するために好ましい領域として表１の実施例の欄（実２〜実５）に記載の領域を選択することができる。
さらに、本発明において、ループプライマーを使用すると、検出までの時間をさらに短縮することが可能である。したがって、ループプライマーＦ（ＬＦ）及びループプライマーＢ（ＬＢ）の一方又は両方を使用して、検出の効率化を図ることができる。
ＬＦとしては、例えばｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち９５−１１０の領域又は２５６−２８３の領域から設計することができる。
ＬＢとしては、例えばｌｙｔＡ遺伝子の塩基配列のうち１７６−１９５の領域から設計することができ、１７８−１９５の領域から設計したもの（配列番号２５）が好ましい。
本発明の一例である実施例１のＬＡＭＰプライマーセットのｌｙｔＡ遺伝子における位置を図１及び図２に、本発明の一例である実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットについてプライマーの種類と配列番号との対応を表１に示す。
上記表１に示す各プライマーの塩基配列を以下の表２及び表３に示す。
本発明で用いることができる鋳型依存性核酸合成酵素は、鎖置換活性を有するものであれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６０〜６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
また、増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いたり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出できる。また、本発明によるプライマーは、例えばＤＮＡチップのようにそれ自身を固相に結合させておくこともできる。固相化プライマーを合成開始点とする場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、分離、検出が容易となる。
さらに、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等を添加することにより増幅を確認できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば６５０ｎｍの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。
これらのＬＡＭＰ反応に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用キットとして供給することができる。具体的には、本発明のキットは、前記Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出用のＬＡＭＰプライマーセットを含むが、その他に、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液など、さらに必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類を含めることができる。また、核酸の２重鎖を不安定にするための試薬（例えばベタイン）を含めることもできる。
このように、ＬＡＭＰ法では、酵素活性を維持しうる温度で、等温のままインキュベートするだけで、増幅反応を進行させることが可能である。このため、ＰＣＲ法のような温度調節のための設備が不要であり低コストかつ簡便に検出を行うことができるとともに、温度変化に伴う時間ロスもないので迅速に検出が可能である。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［特異性確認試験について］
本発明に係るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法を実施し、本発明の検出方法の特異性を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの準備
まず、試験に供する各種の菌から染色体ＤＮＡを精製し、増幅反応の鋳型となるＤＮＡを準備した。
染色体ＤＮＡは、酵母用のＤｒ．ＧｅｎＴＬＥ（登録商標、タカラバイオ株式会社製）を用いて各種の菌体から抽出し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社製）を用いて精製することで得た。抽出及び精製の操作は、添付のマニュアルに従って行った。
本試験では、１０種のレンサ球菌及び７種のレンサ球菌以外の菌に分類される計３２種の菌株から染色体ＤＮＡを抽出して用いた。これら３２種の菌株を表４に示す。
（２）ＬＡＭＰ反応について
次に、実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセット（表１参照）を用いて、（１）で調整した各種の菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
ＬＡＭＰ反応液（２５μｌ）は、ＦＩＰ及びＢＩＰ各４０ｐｍｏｌ，Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー各５ｐｍｏｌ，８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製），デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各１．４ｍＭ，ベタイン０．８Ｍ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）２０ｍＭ，ＫＣｌ １０ｍＭ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ，ＭｇＳＯ４ ８ｍＭ，ツイーン２０を０．１％，及び，上記（１）のようにして生成された鋳型ＤＮＡ溶液２μｌを添加して調製した。
そして、このＬＡＭＰ反応液を、６３℃で３５分間又は６０分間インキュベートすることでＬＡＭＰ反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
増幅の有無は、反応チューブを直接目視し、ＬＡＭＰ反応液の白濁の有無を観察することで検出した。すなわち、複製配列が存在する場合には反応の副産物として複製配列の量に比例した量のピロリン酸マグネシウムが産生されるのでＬＡＭＰ反応液が白濁し、一方存在しない場合にはＬＡＭＰ反応液は透明のままであるため、その白濁を指標として増幅産物の検出を行った。
また、増幅の有無は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動によっても確認した。この際、増幅産物そのままのものと、増幅産物を制限酵素ＴａｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）により消化したものとをそれぞれ３％のアガロースゲル中で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して泳動パターンを確認した。なお、増幅産物をそのまま電気泳動した場合には、複製配列はＬＡＭＰ反応に特徴的なラダー状のパターンとして現われる。また、制限酵素により消化したものを電気泳動した場合には、複製配列は１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの断片として現われる。
（４）試験結果について
上述の試験結果を表４に示す。結果は、３５分間又は６０分間のインキュベーションにより目視によって増幅（白濁）が確認された場合を「＋」、６０分間のインキュベーション後目視によって増幅が確認できなかった場合を「−」とした。この結果、表４にも示すように、実施例１〜５のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを用いても、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを鋳型とした場合には、３５分間又は６０分間のインキュベーションにより多量の増幅産物が確認された。対照的に、他の菌種では６０分間のインキュベーションを行っても増幅産物は確認されなかった。この結果は、電気泳動の結果とも一致し、実施例１においては１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの断片が確認された。また、増幅産物のシークエンスも行ったが、ＬＡＭＰ反応により増幅された配列は期待した配列と一致した。
このことから、本発明に係るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法は、特異性に優れることが確認された。
［感度確認試験について］
次に、上記実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合の検出感度を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製
本試験では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ６３０５から特異性確認試験と同様にして染色体ＤＮＡを精製し、鋳型とした。反応液中の鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、分子サイズを２Ｍｂｐとして定量した。
（２）ＬＡＭＰ法及びＰＣＲ法について
上記（１）のように予め定量された鋳型ＤＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈して１〜１，０００，０００倍の溶液を調製し、これをＬＡＭＰ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。ＬＡＭＰ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量において前記特異性確認試験と同様であり、ＬＡＭＰ反応の条件も同様とした。
また、本発明の検出方法と比較するために、ＰＣＲ法による増幅、検出も行った（比較例１）。
ＰＣＲプライマーセットは、ａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子（ｌｙｔＡ遺伝子）を標的とするもの（ｌｙｔＡ−Ｆ、ｌｙｔＡ−Ｒ）を用いた（Ｎａｇａｉ，Ｋ．，他６名，”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ β−ｌａｃｔａｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃｏｍｍｏｎ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ”，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，２００１，ｖｏｌ．４８，ｐ．９１５−９１８）。その配列を以下に示す。
ｌｙｔＡ−Ｆ：ｃａａｃｃｇｔａｃａ ｇａａｔｇａａｇｃｇ ｇ（配列番号２７）
ｌｙｔＡ−Ｒ：ｔｔａｔｔｃｇｔｇｃ ａａｔａｃｔｃｇｔｇ ｃｇ（配列番号２８）
ＰＣＲ反応液（１０μｌ）は、デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各０．２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，ＫＣｌ ５０ｍｌ，ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ，１ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、フォワードプライマー（ｌｙｔＡ−Ｆ）及びリバースプライマー（ｌｙｔＡ−Ｒ）各０．５μＭ及び鋳型ＤＮＡ溶液１μｌを加えて調製した。
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて３０サイクル行った。各サイクルでは、９４℃１５秒間の変性、５３℃１５秒間のアニーリング、７２℃１５秒間の合成を順に行った。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、前記特異性確認試験と同様に、白濁の有無を目視により確認することにより判定した。
さらに、比較例１におけるＰＣＲによる増幅産物の有無とともに、増幅産物（２μｌ）を３％アガロースゲル中に電気泳動することで確認した。
（４）試験結果について
試験結果は、上記のように電気泳動により増幅産物が確認された場合には「＋」とし、増幅産物が確認されなかった場合は「−」とした。試験結果を、表５及び図３に示す。
表５に示すように、実施例１のＬＡＭＰプライマーを用いた検出方法では、ＬＡＭＰ反応を６０分間行うことで、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピーの場合にも検出することができた。また、実施例５のＬＡＭＰプライマーを用いた場合は、ＬＡＭＰ反応が３５分間であっても、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピーのものを検出することができた。一方、ＰＣＲ法を用いた検出においては、鋳型ＤＮＡ濃度が１０，０００コピーでなければ検出することができなかった。このため、実施例１及び５ではＬＡＭＰ反応を利用することで、検出の感度が比較例１よりも１，０００倍も優れていることが確認された。また、表５に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１，０００コピーである場合には、実施例１及び５では３５分で検出可能であり、また、実施例２及び３では６０分で検出可能であったことから、感度及び迅速性に優れることが確認された。
また、図３は、ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真である。紙面両端のレーンＭは１００ｂｐの間隔を示すためのマーカーを流したレーンであり、レーン１は鋳型ＤＮＡを１，０００，０００コピーとした場合の増幅産物、以後同様にレーン２は１００，０００コピー、レーン３は１０，０００コピー、レーン４は１，０００コピー、レーン５は１００コピー、レーン６は１０コピー、レーン７は１コピー、レーン８は０コピーを鋳型とした場合の増幅産物を流したものとなっている。
また、レーン９は、レーン１の増幅産物をＴａｓＩで消化後に泳動したレーンである。ＴａｓＩ部位は標的部位の中央部付近（Ｆ１，Ｂ１ｃの間）に存在するため、ＴａｓＩで処理すると増幅断片が標的部位の中央部付近（Ｆ１，Ｂ１ｃの間）で切断され、ループとループとの間の長さに断片化される。このため、レーン９では１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの位置にバンドが現われることが予測される。
レーン１〜６では、増幅産物がラダー状の泳動パターンを示しており、これより増幅産物が反転部分を有し、ＬＡＭＰ反応に特徴的なステム−ループ構造をとっていることが確認される。また、レーン９には１０２ｂｐ及び１１１ｂｐに切断片が現われており、標的となる部分が増幅されていることが確認された。
［臨床的な検出について］
次に、実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットを用いて臨床的な検出を行ったので説明する。
まず、健康児（５〜６歳）の口腔粘膜のサンプルを採取し、ＰＣＲ法によってｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ又はａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を有する２５種類のα溶血レンサ球菌を単離した。このａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲプライマーセットは前述の感度試験と同様のものを用いた。また、ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲプライマーセットとしては、以下のＰＣＲプライマーセット（ｐｌｙ−Ｆ及びｐｌｙ−Ｒ）を用いた（Ｓａｌｏ，Ｐ．，他２名，”Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｅｍｉｃ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｓｅｒｕｍ”，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，ｖｏｌ．１７１，ｐ．４７９−４８２）。プライマーの塩基配列を以下に示す。
ｐｌｙ−Ｆ：ａｔｔｔｃｔｇｔａａ ｃａｇｃｔａｃｃａａ ｃｇａ（配列番号２９）
ｐｌｙ−Ｒ：ｇａａｔｔｃｃｃｔｇ ｔｃｔｔｔｔｃａａａ ｇｔｃ（配列番号３０）
また、ＰＣＲ反応液の組成及び反応条件は、ａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲ反応では前記感度試験と同様であり、ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲ反応では、反応液の組成は前記感度試験と同様で、反応条件はサーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて３０サイクルを行い、各サイクルでは９４℃１分間の変性、５５℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の合成を順に行った。
単離された２５種類のα溶血レンサ球菌は、４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと、通常は肺炎球菌に見られる病原性因子のｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ又はａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を有する２１種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株（３種のＳ．ｏｒａｌｉｓ、１７種のＳ．ｍｉｔｉｓ、１種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の未識別の菌株）であった。単離された菌種を表６に示す。
次に、上記２５種の菌について、口腔内のレンサ球菌に通常適用される下記の判定基準（１）〜（３）を用いて、同定を行った。
（１）オプトヒン感受性試験を、直径６．５ｍｍ、オプトヒン含量５μｇのディスク（栄研化学株式会社製）を用いて、５％のＣＯ２存在下で行った。そして、少なくとも直径１３ｍｍの阻止円がない場合は感受性なし「−」とし、少なくとも直径１３ｍｍの阻止円が形成されている場合には感受性あり「＋」とした。
（２）胆汁溶解試験を、ＨａｗｎとＢｅｅｂｅの方法に従って行った（参照：Ｈａｗｎ Ｃ．Ｖ．Ｚ．，Ｅ．Ｂｅｅｂｅ．，“Ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｂｉｌｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６５，ｖｏｌ．９０，ｐ．５４９）。そして、胆汁溶解性の場合には「＋」、胆汁非溶解性の場合には「−」とした。
（３）商業用のキットＡＰＩ ２０ Ｓｔｒｅｐ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を用い、酵素活性及び糖発酵性等に基づいて同定を行った。
上記（１）〜（３）のそれぞれの結果、及び、（１）〜（３）より総合的に判断した識別結果を表６に示す。
さらに、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法をそれぞれ用いて、２５種の菌についてスクリーニングを行った。この際、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法の比較を行うために、鋳型ＤＮＡのコピー数が等しくなるように、反応チューブ１本当たり１０６コピーに調製した。ＰＣＲプライマーは上述したものであり、ＬＡＭＰプライマーは実施例１〜５のものを用いた。ＬＡＭＰ法における反応時間は６０分とした。
その結果、ＬＡＭＰ法では４種の菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）がポジティブ反応を示し、２１種の菌がネガティブ反応を示した。これに対し、ＰＣＲ法では、ｌｙｔＡ遺伝子に関しては８種がポジティブ反応を示し１７種がネガティブ反応を示した。また、ｐｌｙ遺伝子に関しては２１種がポジティブ反応を示し４種がネガティブ反応を示した。
このように、ＬＡＭＰ法を用いた場合には、他の２１種の菌を検出することなく、４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを完全に検出することができたのに対し、ＰＣＲ法を用いた場合には、ｌｙｔＡ遺伝子に関しては４種の菌を誤ってポジティブとして検出し、ｐｌｙ遺伝子に関しては１７種の菌を誤って検出したことになる。
従って、本発明の検出方法を用いれば、口腔咽頭において共生し、かつ、１６ＳｒＲＮＡの配列が９９％以上一致するなど最もＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと近縁なＳ．ｍｉｔｉｓ及びＳ．ｏｒａｌｉｓなどとの区別も可能であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の臨床診断にも有効であることが確認された。
［リアルタイム濁度測定試験について］
次に、実施例１、２、及び、実施例４（表２に配列を示す）のＬＡＭＰプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応についてリアルタイム濁度測定を行った。
（１）検出の迅速性について
本試験では、実施例１、２及び実施例４のＬＡＭＰプライマーセットを用い、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様とし、鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）を反応チューブ１本当たり所定コピー数となるように調製し、ＬＡＭＰ反応を６０分間行った。このＬＡＭＰ反応の間、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番ＬＡ−２００）を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取った。
結果を、図４及び図５に示す。なお、図４中、Ａは実施例１のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｂは実施例１のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｃは実施例２のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｄは実施例２のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果を示す。また、図５中、Ａは実施例１のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｂは実施例１のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｃは実施例４のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｄは実施例４のプライマーを用い、コピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果を示す。
これらの図に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が同じでもＬＡＭＰプライマーによって、濁度が立ち上がる時間（増幅効率）は異なっていたが、いずれの実施例においても検出が可能であり、実施例１のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合に最も迅速に検出可能であることが確認された。特に実施例１と実施例２とでは、プライマーの配列上の違いは微差であり（ＦＩＰのＦ１ｃ領域の５’末端の一塩基及び３’末端の二塩基）、特異性や感度の性能はほぼ互角である。
Ｆ１ｃ領域の微差により迅速性が異なるのは、ＬＡＭＰ反応特有の伸長反応起点（ループ部分）を形成するＦ１ｃ領域が、ＬＡＭＰ反応の速度を決定するのに重要な役割を果たしているためであると考えられる。中でも、実施例１及び実施例２における試験結果からＦ１ｃ領域の５’末端側で、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な三つの塩基に隣接したＣ（ｌｙｔＡ遺伝子上の１３１番目）がループ部分形成におけるＦ１ｃ／Ｆ１アニールの迅速性に重要な役割を果たしているものと推測される。
次に、反応チューブ１本当たりの鋳型ＤＮＡ濃度を０〜１０６コピーに調製し、実施例１及び実施例４のＬＡＭＰプライマーセットをそれぞれ添加してＬＡＭＰ反応を行い、この反応中に上記リアルタイム濁度測定装置を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を測定した。
実施例１におけるリアルタイム濁度測定の結果を図６に示す。
図６に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は前記感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図７には、実施例１の場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数の関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９８６と高い相関を示した。これは、２００４年森らが示すように、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する（Ｍｏｒｉ，Ｙ．，他３名，”Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５９，ｐ．１４５−１５７）。すなわち、例えば、濃度未知のサンプルについても、同様に希釈倍率の異なる希釈液を調製し、各希釈液を用いてＬＡＭＰ反応を行った場合のスレッシュホールドタイムを測定することで回帰直線を作成すれば、この回帰直線から、未知の鋳型ＤＮＡの初期濃度を特定することができる。
実施例４のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、図８に示すように濁度の立ち上がり曲線を描いた。１０，０００コピーのスレッシュホールドタイムは約８５分であったが、十分検出することができた（図８）。また、図８に示すように、得られた３つのサンプルのスレッシュホールドタイムに若干の相関性の傾向が確認された。
以上のことから、各実施例においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出することができ、中でも実施例１のプライマーセットは、検出の迅速性及び定量性に極めて優れていた。
［ループプライマーを用いたＬＡＭＰ法による検出］
染色体ＤＮＡの調製は前記と同様にし、ＬＡＭＰプライマーセットは表１の「実施例５」の欄に記載のもの（配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５）を用い、染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
結果を表１並びに図９及び１０に示す。
ループプライマーを使用したときの検出時間は１３分４２秒であり（表１）、実施例１よりもさらに迅速に検出することができた。
図９は、リアルタイム濁度測定装置を用いたＬＡＭＰ反応速度の測定結果を示すグラフである。図９に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、３０分以内に濁度が０．１以上になることが確認された。鋳型ＤＮＡの濃度が１０コピーから１０６コピーまで１０倍ごとに増加するに従い、スレッシュホールドタイムが短縮された。
図１０は、反応時間とＤＮＡ濃度との関係を示すものであり、両者は、ｒ２値が０．９９９という直線関係を示した。
［特異性確認試験について］
本発明に係るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法を実施し、本発明の検出方法の特異性を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの準備
まず、試験に供する各種の菌から染色体ＤＮＡを精製し、増幅反応の鋳型となるＤＮＡを準備した。
染色体ＤＮＡは、酵母用のＤｒ．ＧｅｎＴＬＥ（登録商標、タカラバイオ株式会社製）を用いて各種の菌体から抽出し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（キアゲン社製）を用いて精製することで得た。抽出及び精製の操作は、添付のマニュアルに従って行った。
本試験では、１０種のレンサ球菌及び７種のレンサ球菌以外の菌に分類される計３２種の菌株から染色体ＤＮＡを抽出して用いた。これら３２種の菌株を表４に示す。
次に、実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセット（表１参照）を用いて、（１）で調整した各種の菌由来の染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
ＬＡＭＰ反応液（２５μｌ）は、ＦＩＰ及びＢＩＰ各４０ｐｍｏｌ，Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー各５ｐｍｏｌ，８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製），デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各１．４ｍＭ，ベタイン０．８Ｍ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）２０ｍＭ，ＫＣｌ １０ｍＭ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ，ＭｇＳＯ４ ８ｍＭ，ツイーン２０を０．１％，及び，上記（１）のようにして生成された鋳型ＤＮＡ溶液２μｌを添加して調製した。
そして、このＬＡＭＰ反応液を、６３℃で３５分間又は６０分間インキュベートすることでＬＡＭＰ反応を進行させ、最後に８０℃で２分間加温することで反応を終了させた。
（３）増幅の有無の確認について
増幅の有無は、反応チューブを直接目視し、ＬＡＭＰ反応液の白濁の有無を観察することで検出した。すなわち、複製配列が存在する場合には反応の副産物として複製配列の量に比例した量のピロリン酸マグネシウムが産生されるのでＬＡＭＰ反応液が白濁し、一方存在しない場合にはＬＡＭＰ反応液は透明のままであるため、その白濁を指標として増幅産物の検出を行った。
また、増幅の有無は、増幅産物のアガロースゲル電気泳動によっても確認した。この際、増幅産物そのままのものと、増幅産物を制限酵素ＴａｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）により消化したものとをそれぞれ３％のアガロースゲル中で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して泳動パターンを確認した。なお、増幅産物をそのまま電気泳動した場合には、複製配列はＬＡＭＰ反応に特徴的なラダー状のパターンとして現われる。また、制限酵素により消化したものを電気泳動した場合には、複製配列は１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの断片として現われる。
（４）試験結果について
上述の試験結果を表４に示す。結果は、３５分間又は６０分間のインキュベーションにより目視によって増幅（白濁）が確認された場合を「＋」、６０分間のインキュベーション後目視によって増幅が確認できなかった場合を「−」とした。この結果、表４にも示すように、実施例１〜５のいずれのＬＡＭＰプライマーセットを用いても、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを鋳型とした場合には、３５分間又は６０分間のインキュベーションにより多量の増幅産物が確認された。対照的に、他の菌種では６０分間のインキュベーションを行っても増幅産物は確認されなかった。この結果は、電気泳動の結果とも一致し、実施例１においては１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの断片が確認された。また、増幅産物のシークエンスも行ったが、ＬＡＭＰ反応により増幅された配列は期待した配列と一致した。
このことから、本発明に係るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出方法は、特異性に優れることが確認された。
［感度確認試験について］
次に、上記実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合の検出感度を確認したので説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製
本試験では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ６３０５から特異性確認試験と同様にして染色体ＤＮＡを精製し、鋳型とした。反応液中の鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、分子サイズを２Ｍｂｐとして定量した。
（２）ＬＡＭＰ法及びＰＣＲ法について
上記（１）のように予め定量された鋳型ＤＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈して１〜１，０００，０００倍の溶液を調製し、これをＬＡＭＰ反応の鋳型ＤＮＡ溶液として用いることで、検出限界を確認した。ＬＡＭＰ反応液は、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度が異なる以外、鋳型ＤＮＡ溶液の添加量及びその他の添加物の添加量において前記特異性確認試験と同様であり、ＬＡＭＰ反応の条件も同様とした。
また、本発明の検出方法と比較するために、ＰＣＲ法による増幅、検出も行った（比較例１）。
ＰＣＲプライマーセットは、ａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子（ｌｙｔＡ遺伝子）を標的とするもの（ｌｙｔＡ−Ｆ、ｌｙｔＡ−Ｒ）を用いた（Ｎａｇａｉ，Ｋ．，他６名，”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ β−ｌａｃｔａｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃｏｍｍｏｎ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ”，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈ．，２００１，ｖｏｌ．４８，ｐ．９１５−９１８）。その配列を以下に示す。
ｌｙｔＡ−Ｆ：ｃａａｃｃｇｔａｃａ ｇａａｔｇａａｇｃｇ ｇ（配列番号２７）
ｌｙｔＡ−Ｒ：ｔｔａｔｔｃｇｔｇｃ ａａｔａｃｔｃｇｔｇ ｃｇ（配列番号２８）
ＰＣＲ反応液（１０μｌ）は、デオキシヌクレオシド トリフォスフェート各０．２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）１０ｍＭ，ＫＣｌ ５０ｍｌ，ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ，１ＵのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、フォワードプライマー（ｌｙｔＡ−Ｆ）及びリバースプライマー（ｌｙｔＡ−Ｒ）各０．５μＭ及び鋳型ＤＮＡ溶液１μｌを加えて調製した。
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて３０サイクル行った。各サイクルでは、９４℃１５秒間の変性、５３℃１５秒間のアニーリング、７２℃１５秒間の合成を順に行った。
（３）増幅の有無の確認について
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、前記特異性確認試験と同様に、白濁の有無を目視により確認することにより判定した。
さらに、比較例１におけるＰＣＲによる増幅産物の有無とともに、増幅産物（２μｌ）を３％アガロースゲル中に電気泳動することで確認した。
（４）試験結果について
試験結果は、上記のように電気泳動により増幅産物が確認された場合には「＋」とし、増幅産物が確認されなかった場合は「−」とした。試験結果を、表５及び図３に示す。
また、図３は、ＬＡＭＰ反応後の増幅産物を電気泳動したゲルを撮影した写真である。紙面両端のレーンＭは１００ｂｐの間隔を示すためのマーカーを流したレーンであり、レーン１は鋳型ＤＮＡを１，０００，０００コピーとした場合の増幅産物、以後同様にレーン２は１００，０００コピー、レーン３は１０，０００コピー、レーン４は１，０００コピー、レーン５は１００コピー、レーン６は１０コピー、レーン７は１コピー、レーン８は０コピーを鋳型とした場合の増幅産物を流したものとなっている。
また、レーン９は、レーン１の増幅産物をＴａｓＩで消化後に泳動したレーンである。ＴａｓＩ部位は標的部位の中央部付近（Ｆ１，Ｂ１ｃの間）に存在するため、ＴａｓＩで処理すると増幅断片が標的部位の中央部付近（Ｆ１，Ｂ１ｃの間）で切断され、ループとループとの間の長さに断片化される。このため、レーン９では１０２ｂｐ及び１１１ｂｐの位置にバンドが現われることが予測される。
レーン１〜６では、増幅産物がラダー状の泳動パターンを示しており、これより増幅産物が反転部分を有し、ＬＡＭＰ反応に特徴的なステム−ループ構造をとっていることが確認される。また、レーン９には１０２ｂｐ及び１１１ｂｐに切断片が現われており、標的となる部分が増幅されていることが確認された。
［臨床的な検出について］
次に、実施例１〜５のＬＡＭＰプライマーセットを用いて臨床的な検出を行ったので説明する。
まず、健康児（５〜６歳）の口腔粘膜のサンプルを採取し、ＰＣＲ法によってｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ又はａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を有する２５種類のα溶血レンサ球菌を単離した。このａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲプライマーセットは前述の感度試験と同様のものを用いた。また、ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲプライマーセットとしては、以下のＰＣＲプライマーセット（ｐｌｙ−Ｆ及びｐｌｙ−Ｒ）を用いた（Ｓａｌｏ，Ｐ．，他２名，”Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｅｍｉｃ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｓｅｒｕｍ”，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，ｖｏｌ．１７１，ｐ．４７９−４８２）。プライマーの塩基配列を以下に示す。
ｐｌｙ−Ｆ：ａｔｔｔｃｔｇｔａａ ｃａｇｃｔａｃｃａａ ｃｇａ（配列番号２９）
ｐｌｙ−Ｒ：ｇａａｔｔｃｃｃｔｇ ｔｃｔｔｔｔｃａａａ ｇｔｃ（配列番号３０）
また、ＰＣＲ反応液の組成及び反応条件は、ａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲ反応では前記感度試験と同様であり、ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を標的とするＰＣＲ反応では、反応液の組成は前記感度試験と同様で、反応条件はサーマルサイクラー（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて３０サイクルを行い、各サイクルでは９４℃１分間の変性、５５℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の合成を順に行った。
単離された２５種類のα溶血レンサ球菌は、４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと、通常は肺炎球菌に見られる病原性因子のｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ又はａｕｔｏｌｙｓｉｎをコードする遺伝子を有する２１種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株（３種のＳ．ｏｒａｌｉｓ、１７種のＳ．ｍｉｔｉｓ、１種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の未識別の菌株）であった。単離された菌種を表６に示す。
（１）オプトヒン感受性試験を、直径６．５ｍｍ、オプトヒン含量５μｇのディスク（栄研化学株式会社製）を用いて、５％のＣＯ２存在下で行った。そして、少なくとも直径１３ｍｍの阻止円がない場合は感受性なし「−」とし、少なくとも直径１３ｍｍの阻止円が形成されている場合には感受性あり「＋」とした。
（２）胆汁溶解試験を、ＨａｗｎとＢｅｅｂｅの方法に従って行った（参照：Ｈａｗｎ Ｃ．Ｖ．Ｚ．，Ｅ．Ｂｅｅｂｅ．，“Ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ ｂｉｌｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６５，ｖｏｌ．９０，ｐ．５４９）。そして、胆汁溶解性の場合には「＋」、胆汁非溶解性の場合には「−」とした。
（３）商業用のキットＡＰＩ ２０ Ｓｔｒｅｐ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を用い、酵素活性及び糖発酵性等に基づいて同定を行った。
上記（１）〜（３）のそれぞれの結果、及び、（１）〜（３）より総合的に判断した識別結果を表６に示す。
さらに、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法をそれぞれ用いて、２５種の菌についてスクリーニングを行った。この際、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法の比較を行うために、鋳型ＤＮＡのコピー数が等しくなるように、反応チューブ１本当たり１０６コピーに調製した。ＰＣＲプライマーは上述したものであり、ＬＡＭＰプライマーは実施例１〜５のものを用いた。ＬＡＭＰ法における反応時間は６０分とした。
その結果、ＬＡＭＰ法では４種の菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）がポジティブ反応を示し、２１種の菌がネガティブ反応を示した。これに対し、ＰＣＲ法では、ｌｙｔＡ遺伝子に関しては８種がポジティブ反応を示し１７種がネガティブ反応を示した。また、ｐｌｙ遺伝子に関しては２１種がポジティブ反応を示し４種がネガティブ反応を示した。
このように、ＬＡＭＰ法を用いた場合には、他の２１種の菌を検出することなく、４種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを完全に検出することができたのに対し、ＰＣＲ法を用いた場合には、ｌｙｔＡ遺伝子に関しては４種の菌を誤ってポジティブとして検出し、ｐｌｙ遺伝子に関しては１７種の菌を誤って検出したことになる。
従って、本発明の検出方法を用いれば、口腔咽頭において共生し、かつ、１６ＳｒＲＮＡの配列が９９％以上一致するなど最もＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと近縁なＳ．ｍｉｔｉｓ及びＳ．ｏｒａｌｉｓなどとの区別も可能であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の臨床診断にも有効であることが確認された。
［リアルタイム濁度測定試験について］
次に、実施例１、２、及び、実施例４（表２に配列を示す）のＬＡＭＰプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応についてリアルタイム濁度測定を行った。
（１）検出の迅速性について
本試験では、実施例１、２及び実施例４のＬＡＭＰプライマーセットを用い、ＬＡＭＰ反応液組成及びＬＡＭＰ反応条件を前述と同様とし、鋳型ＤＮＡの濃度（コピー数）を反応チューブ１本当たり所定コピー数となるように調製し、ＬＡＭＰ反応を６０分間行った。このＬＡＭＰ反応の間、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製、型番ＬＡ−２００）を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取った。
結果を、図４及び図５に示す。なお、図４中、Ａは実施例１のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｂは実施例１のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｃは実施例２のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｄは実施例２のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果を示す。また、図５中、Ａは実施例１のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｂは実施例１のプライマーを用いコピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｃは実施例４のプライマーを用いコピー数１０７のＤＮＡを鋳型とした増幅結果、Ｄは実施例４のプライマーを用い、コピー数０のＤＮＡを鋳型とした増幅結果を示す。
これらの図に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が同じでもＬＡＭＰプライマーによって、濁度が立ち上がる時間（増幅効率）は異なっていたが、いずれの実施例においても検出が可能であり、実施例１のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合に最も迅速に検出可能であることが確認された。特に実施例１と実施例２とでは、プライマーの配列上の違いは微差であり（ＦＩＰのＦ１ｃ領域の５’末端の一塩基及び３’末端の二塩基）、特異性や感度の性能はほぼ互角である。
Ｆ１ｃ領域の微差により迅速性が異なるのは、ＬＡＭＰ反応特有の伸長反応起点（ループ部分）を形成するＦ１ｃ領域が、ＬＡＭＰ反応の速度を決定するのに重要な役割を果たしているためであると考えられる。中でも、実施例１及び実施例２における試験結果からＦ１ｃ領域の５’末端側で、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な三つの塩基に隣接したＣ（ｌｙｔＡ遺伝子上の１３１番目）がループ部分形成におけるＦ１ｃ／Ｆ１アニールの迅速性に重要な役割を果たしているものと推測される。
次に、反応チューブ１本当たりの鋳型ＤＮＡ濃度を０〜１０６コピーに調製し、実施例１及び実施例４のＬＡＭＰプライマーセットをそれぞれ添加してＬＡＭＰ反応を行い、この反応中に上記リアルタイム濁度測定装置を用いて６秒毎に６５０ｎｍの吸光度を測定した。
実施例１におけるリアルタイム濁度測定の結果を図６に示す。
図６に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、６０分以内に濁度が０．１以上になることが確認され、この結果は前記感度試験における目視及び電気泳動による増幅の有無の判別結果と一致した。また、最初に用いた鋳型ＤＮＡ濃度の増加に伴い、スレッシュホールドタイム（濁度が０．１を超えるまでの時間）が短くなることが確認された。
図７には、実施例１の場合のスレッシュホールドタイム（Ｔｔ）と当初の鋳型ＤＮＡ濃度の常用対数の関係を示す。これらの間には線形性が認められ、相関係数ｒ２＝０．９８６と高い相関を示した。これは、２００４年森らが示すように、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の鋳型ＤＮＡの初期濃度が未知の場合に、その存在の有無のみでなくその濃度も定量可能であることを意味する（Ｍｏｒｉ，Ｙ．，他３名，”Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５９，ｐ．１４５−１５７）。すなわち、例えば、濃度未知のサンプルについても、同様に希釈倍率の異なる希釈液を調製し、各希釈液を用いてＬＡＭＰ反応を行った場合のスレッシュホールドタイムを測定することで回帰直線を作成すれば、この回帰直線から、未知の鋳型ＤＮＡの初期濃度を特定することができる。
実施例４のＬＡＭＰプライマーセットを用いた場合には、図８に示すように濁度の立ち上がり曲線を描いた。１０，０００コピーのスレッシュホールドタイムは約８５分であったが、十分検出することができた（図８）。また、図８に示すように、得られた３つのサンプルのスレッシュホールドタイムに若干の相関性の傾向が確認された。
以上のことから、各実施例においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出することができ、中でも実施例１のプライマーセットは、検出の迅速性及び定量性に極めて優れていた。
［ループプライマーを用いたＬＡＭＰ法による検出］
染色体ＤＮＡの調製は前記と同様にし、ＬＡＭＰプライマーセットは表１の「実施例５」の欄に記載のもの（配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号４及び配列番号２５）を用い、染色体ＤＮＡを鋳型にＬＡＭＰ反応を行った。
結果を表１並びに図９及び１０に示す。
ループプライマーを使用したときの検出時間は１３分４２秒であり（表１）、実施例１よりもさらに迅速に検出することができた。
図９は、リアルタイム濁度測定装置を用いたＬＡＭＰ反応速度の測定結果を示すグラフである。図９に示すように、鋳型ＤＮＡ濃度が１０コピー以上であれば、３０分以内に濁度が０．１以上になることが確認された。鋳型ＤＮＡの濃度が１０コピーから１０６コピーまで１０倍ごとに増加するに従い、スレッシュホールドタイムが短縮された。
図１０は、反応時間とＤＮＡ濃度との関係を示すものであり、両者は、ｒ２値が０．９９９という直線関係を示した。
本発明の検出方法によれば、従来のＰＣＲ法などと比べても特異性に優れ、検出感度が高く、かつ、迅速に検出可能であると共に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの定量も可能である。また、ＬＡＭＰ反応は等温条件下でも進行し、また結果を目視により確認することができるため、設備もシンプルで、病院の検査室等でも簡易、迅速に行うことができる。
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
Claims (3)
- プライマーセットを用いて、配列番号26で表されるStreptococcus pneumoniae由来のlytA遺伝子を増幅し、得られる増幅産物を検出するStreptococcus pneumoniaeの検出方法であって、
前記プライマーセットとして、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせからなるLAMPプライマーセット、又は、配列番号23、配列番号24、配列番号15、配列番号４及び配列番号25で表される塩基配列の組み合わせからなるLAMPプライマーセットを用いることを特徴とする、
前記検出方法。 - 配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列の組み合わせからなるLAMPプライマーセット、又は、配列番号23、配列番号24、配列番号15、配列番号４及び配列番号25で表される塩基配列の組み合わせからなるLAMPプライマーセットである、Streptococcus pneumoniaeの検出用プライマーセット。
- 請求項２記載のプライマーセットを含む、Streptococcus pneumoniaeの検出用キット。
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