CN116745434A - 基因组序列的改进的检测及其探针分子 - Google Patents
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Abstract
利用虚拟探针鉴定可能存在于样品中的同源基因组序列的方法、用于区分同源基因组序列的阵列、用于区分同源基因组序列的系统以及在本公开的方法、阵列和系统中有用的探针分子。
Description
1.相关申请的交叉引用
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2.序列表
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3.技术背景
传染病病原体的鉴定在确定个体的正确诊断和治疗过程中通常是至关重要的。对感染因子的错误鉴定可导致不适当的或无效的治疗过程。测序技术的改进有助于确定一些致病细菌的部分或完全基因组的序列。密切相关的细菌种通常包含共享高度序列同一性的基因组序列。区分密切相关的物种需要检测两个或更多个同源基因组序列之间的差异的敏感和准确的方法。使用单一寡核苷酸探针分子区分同源基因组序列在某些情况下即使不是不可能，也是不切实际的。
因此，需要新的方法来准确区分密切相关的微生物物种。
4.发明内容
本公开提供了鉴定基因组序列和/或区分可能存在于样品中的同源基因组序列的改进方法。所述方法利用了探针分子的组合，所述探针分子不能单独地但可以共同地区分来自密切相关的微生物物种的同源基因组序列，并且还可鉴定可能存在于样品中的基因组序列。为方便起见，探针分子的此类组合在本文中被称为“虚拟探针”。
虚拟探针可包含多种(例如，两种、三种或超过三种)单独的探针分子。如果不测序，基因组DNA(或从基因组DNA扩增的PCR产物)与单种探针分子的杂交可能不足以将基因组DNA与可能存在于同一样品中的遗传上相关的物种的同源基因组DNA区分开，特别是当使用靶向相关种中的保守序列的通用引物来扩增基因组DNA时。然而，当用包含两种或更多种探针分子的虚拟探针探测基因组DNA或相应的PCR扩增子时，虚拟探针杂交模式的差异可以区分来自两种相关种的基因组DNA或由其扩增的同源扩增子。
因此，由于包含多种探针分子(例如，具有可区分信号的探针分子)，本发明的虚拟探针可以组合区分基因组序列与同源基因组序列(或由其制备的扩增子)，并鉴定生物样品中存在的微生物物种。例如，根据本公开的方法，两种或三种寡核苷酸探针分子的组合可以组合形成虚拟探针，所述虚拟探针区分来自诸如凝固酶阴性葡萄球菌属种(Staphylococcus sp.)(例如,人葡萄球菌(S.hominis))和凝固酶阳性葡萄球菌属种(例如，金黄色葡萄球菌(S.Aureus))等相关种的扩增子。因此，当样品例如在PCR反应中用作模板DNA的来源时，任何所得PCR产物与虚拟探针的杂交可以确定样品中存在两种属种中的哪一种。
使用本文公开的虚拟探针鉴定同源基因组序列的方法是在认识到使用来自细菌16S rRNA基因的序列设计的物种特异性寡核苷酸探针分子在不同种之间表现出交叉反应性之后开发的。由于基因组这一区域的序列间的低可变性，无法设计种特异性探针分子。然而，发现不同的物种仍然可以通过分析来自与虚拟探针杂交的信号来区分，所述虚拟探针组合了多种寡核苷酸探针分子，所述寡核苷酸探针分子本身单独不能区分不同的物种。
还发现，当使用虚拟探针时，可通过在虚拟探针中包括能够与来自多个密切相关种(例如，凝固酶阴性葡萄球菌属种和凝固酶阳性葡萄球菌属种)的同源基因组序列杂交的探针，使得来自探针的信号可以测量样品中同源基因组序列的相对量，来提高微生物鉴定的准确性。为了方便起见，此类探针在本文中被称为“计量探针(meter probe)”。例如，当计量探针的信号处于或高于阈值时，可使用第一式来分析虚拟探针的探针的杂交信号，而当计量探针的信号低于阈值时，可以使用第二式。通过使用考虑相对样品浓度的不同微生物鉴定式而不是用于所有样品的单一式，可以提高微生物鉴定的准确性。
当使用具有在虚拟探针的一种或多种其它探针分子之前达到饱和的探针分子的虚拟探针时，计量探针对于提高微生物鉴定的准确性特别有用。当虚拟探针的一种探针分子在一种或多种其它探针分子之前达到饱和时，探测样品时获得的信号模式可以根据样品中靶序列的浓度而变化。知道了测试样品中靶序列的相对量，可使用特定于靶序列相对浓度的式来分析针对测试样品所获得的信号模式，例如，如果相对浓度高(例如，当计量探针的信号高于阈值时)，可使用第一式来分析杂交模式，如果相对浓度低(例如，当计量探针的信号低于阈值时)，可使用第二式来分析杂交模式。实施例6举例说明了使用计量探针来提高将样品鉴定为含有凝固酶阴性葡萄球菌属种或凝固酶阳性金黄色葡萄球菌的准确性。由计量探针提供的微生物鉴定的准确性的提高代表了对不使用计量探针的现有微生物检测方法的显著改进。
在一些方面，本公开提供了检测样品中是否存在第一微生物体(或相应的第一基因组)和/或第二微生物体(或相应的第二基因组)的方法。在特定实施方案中，样品是血液样品。通过允许从血样中进行检测，本公开的方法代表了相对于需要使用临床分离物的检测方法的显著改进，所述临床分离物需要额外的时间和费用来制备。
本公开的方法可包括用第一生物体和第二生物体的虚拟探针探测样品，以确定对应于第一基因组或第二基因组的一种或多种靶核酸的存在或不存在。靶核酸可以是例如在DNA扩增反应诸如PCR中产生的基因组片段或扩增子。虚拟探针包含两种或更多种探针分子，其中的每一种探针分子都能够与对应于第一基因组的一种或多种靶核酸和/或对应于第二基因组的一种或多种同源靶核酸特异性杂交。因为探针分子与对应于第一基因组和第二基因组的靶核酸非等同地杂交，所以虚拟探针可以区分对应于第一基因组的靶核酸与对应于第二基因组的靶核酸。虚拟探针优选包括计量探针。
示例性方法包括以下步骤：
(a)使用一对或多对PCR引物对样品进行聚合酶链式反应(PCR)扩增反应，所述PCR引物能够与样品中的第一基因组和第二基因组(如果存在的话)杂交，并从所述第一基因组和第二基因组启动PCR扩增。每组引物产生扩增子组，所述扩增子组优选对样品中可能存在的每种生物是独特的。因此，如果样品中存在第一基因组，则扩增产生第一扩增子组，如果样品中存在第二基因组，则扩增产生第二不同的扩增子组。如果仅使用单对PCR引物，每个扩增子组仅包含单一扩增子，并且当使用多个PCR引物对时，扩增子组可包含两种或更多种扩增子(例如，多种单一扩增子)。
(b)在步骤(a)之后，用虚拟探针探测任何所得的PCR扩增产物，以确定第一扩增子组和第二扩增子组的存在或不存在。因为虚拟探针包含两种或更多种能够以不同的方式与第一扩增子组和第二扩增子组特异性杂交的探针分子(例如，两种或更多种寡核苷酸探针分子)，所以虚拟探针可区分第一扩增子组与第二扩增子组。每种虚拟探针内的探针分子可通过具有不同的标记(例如荧光标记，例如用不同荧光标记物标记的分子信标)或位于阵列上的离散位置来区分。
因此，PCR反应的PCR扩增产物与虚拟探针的杂交可区分第一基因与第二基因组，从而鉴定样品中第一和/或第二生物体的存在。如本文中所用，提及样品中生物体的存在并不意味着样品具有活的生物体，仅意味着样品中存在足够的来自生物体的基因组DNA以供检测或用作扩增反应诸如PCR反应的模板。同样，提及样品中基因组的存在并不意味着样品具有完整的基因组，仅仅意味着样品中存在足够的基因组DNA以供检测或作为扩增反应诸如PCR反应的模板。
例如当在PCR扩增反应中使用单组引物时，第一扩增子组和第二扩增子组可以各自包含一种扩增子(分别称为“第一扩增子”和“第二扩增子”)。或者，例如当在PCR扩增反应中使用不止一组引物时，第一扩增子组和/或第二扩增子组可包含不止一种扩增子(第一扩增子组中的每种扩增子被称为“第一扩增子”，第二扩增子组中的每种扩增子被称为“第二扩增子”)。用于区分来自同源基因组序列的同源扩增子的其它示例性方法描述于下文的第6.2节和编号的实施方案1至98、142至147和151中。
本公开还提供了用于区分同源基因组序列的阵列、用于区分同源基因组序列的系统和用于例如本公开的方法、阵列和系统中的寡核苷酸探针分子。
一方面，本公开提供了用于区分来自第一基因组的第一基因组序列和来自第二基因组的第二同源基因组序列的可寻址阵列。本公开的可寻址阵列可用于例如本文所述的方法中。本公开的可寻址阵列可包含一组位置可寻址的寡核苷酸探针分子，每个探针分子位于阵列上的离散位置，其中寡核苷酸探针分子组中的每种探针分子包含与第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列。可寻址阵列通常包含一种或多种计量探针，并且还可任选地包含一种或多种对照探针分子。
本公开的示例性可寻址阵列描述于下文的第6.3节以及编号的实施方案99至141和173至175中。
在一些方面，本公开的方法的一个或多个步骤是计算机实施的。示例性的计算机实施的方法描述于下文的第6.4节和编号的实施方案97、98、146和147中。
另一方面，本公开提供了用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列(如果存在于样品中的话)的系统。示例性系统可包括：
(a)光学读取器，其用于生成本公开的阵列的每个探针分子位置的信号数据；和
(b)至少一个处理器，其：
(i)被配置成从光学读取器接收信号数据；
(ii)被配置成分析一种或多种虚拟探针(例如，具有本文所述特征的虚拟探针)的信号数据；以及
(iii)具有到存储或显示设备或网络的接口，用于输出分析结果。
下文第6.5节和编号的实施方案148至150中描述了示例性系统。
另一方面，本公开提供了适用于虚拟探针的示例性寡核苷酸探针分子和包含两种或更多种此类寡核苷酸探针分子的试剂盒。本公开的寡核苷酸探针分子可包含在本公开的可寻址阵列上和/或用于本公开的方法中。示例性的寡核苷酸探针分子和虚拟探针描述于下文的第6.2.4节和编号的实施方案156-172中。在下文的第6.6节和编号的实施方案176至187中描述了示例性的试剂盒。
5.附图说明
图1A-图1B是根据从GenBank获得的几个葡萄球菌属种的16SrRNA基因制备的树状图(在图1A与图1B之间分开)。使用CLC sequence viewer软件和bootstrap分析构建该树，以显示数据的置信度。葡萄球菌属菌群的每一个种都有两个序列代表，所述两个序列由GenBank登录号显示。树的每个节点处的自展值(bootstrap values)(以整数表示)定义了重复间数据的置信度百分比。自展值越高，相应分类群的数据越有支持性。各个种的水平线称为分支，代表该种中的遗传变化量。分支长度的单位显示为改变或取代的数量除以序列的长度。
图2A-图2B表示由16s rRNA和16s-23s rRNA基因序列的多重比对创建的来自绿色链球菌群(Streptococcus viridians group)的种的树状图(在图2A与图2B之间分开)。I–牛链球菌群(Streptococcus bovis group)，II–咽峡炎链球菌群(Streptococcusanginosus group)，III–唾液链球菌群(Streptococcus salivarius group)，IV–缓症链球菌群(Streptococcus mitis group)，V–变异链球菌群(Streptococcus mutans group)。数字代表自展值，其指示数据集中的置信度百分比。根据比对模式及其致病重要性，所述种被分为三群-I、II和III。
图3是16S rRNA和16S-23S rRNA ITS基因组序列以及16S正向(16S Fw)引物、16S反向(16S Rv)引物、ITS正向(ITS Fw)引物和ITS反向(ITS Rv)引物的示意图。
图4说明了可用于第6.2.3.4节中描述的不对称PCR方法的引物对，其包括未延伸引物(其可以是对称PCR方法中使用的常规引物)和延伸引物(其由“A”区、“B”区和任选的“C”区组成，所述“A”区与靶核酸互补，所述“B”区包括“A”区的至少一部分的正向重复序列或反向重复序列，所述“C”区可包括间隔序列和/或所有限制性内切核酸酶识别位点的一部分)。
图5A-图5C.图5A说明了当“B”区含有“A”区的至少一部分的反向重复序列时发生的延伸引物的分子间杂交。图5B说明了当“B”区含有“A”区的至少一部分的正向重复序列时发生的延伸引物的分子间杂交。图5C说明了当“B”区含有“A”区的至少一部分的反向重复时发生的延伸引物的分子内杂交。优选地,“A”区与“B”区之间的互补区位于“A”区的5’端或在其附近。
图6说明了在第6.2.3.4节中描述的不对称PCR反应中的变性步骤。在变性步骤中，将PCR反应混合物(通常包含含有或有可能含有靶核酸、不对称引物对、热稳定性DNA聚合酶和PCR试剂的生物样品)加热至高于靶核酸的熔点(mel ting point)，导致靶核酸(如果存在的话)与不对称引物对中的延伸引物变性，从而形成单链。
图7说明了在第6.2.3.4节中描述的不对称PCR反应的指数期的退火步骤，其在低于未延伸引物的解链温度下发生。不对称引物对中的未延伸引物和延伸引物都与其各自的互补链杂交。图7显示了与靶DNA的退火(也称为杂交或结合),这发生在PCR的初始循环中，但在随后的循环中，退火可能发生在引物与PCR产物中的互补序列之间。由于延伸引物中的“B”和任选的“C”区，PCR产物将具有那些序列或其互补序列，如图8B和图9所示的。
图8A-图8B：图8A和图8B说明了在第6.2.3.4节中描述的不对称PCR反应的指数期的延伸步骤，在此期间，热稳定性DNA聚合酶使用互补DNA作为模板延伸引物DNA。延伸的区域用虚线表示。图8A中的模板是靶DNA的链，图8B中的模板是使用不对称引物对和靶DNA产生的PCR产物的链。
图9说明了使用PCR产物链2作为模板进行的第6.2.3.4节中描述的不对称PCR反应的线性阶段的同时退火和延伸步骤，所述步骤在高于未延伸引物的解链温度并低于延伸引物的解链温度下发生。这导致PCR产物链2的不对称扩增，导致到PCR反应结束时PCR产物链2分子相对于PCR产物链1分子的过量。
图10A-图10B说明了如何将两种(图10A)或三种(图10B)探针分子用于凝固酶阴性葡萄球菌属(CNS)的虚拟探针。来自PCR扩增产物与两种或三种探针分子杂交的信号可以使用布尔运算符组合，以确定样品中是否存在CNS。
图11A-图11B显示了各种寡核苷酸探针分子在与来自缓症链球菌(图11A)和肺炎链球菌(图11B)的16S rRNA扩增子结合时的信号。
图12显示了各种寡核苷酸探针分子在与来自肺炎链球菌、缓症链球菌和口腔链球菌(Streptococcus oralis)的PCR扩增子结合时的信号强度。
图13显示了各种寡核苷酸探针分子在与来自肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)和大肠杆菌(Escherichia coli)的PCR扩增子结合时的信号强度。
图14显示了各种寡核苷酸探针分子在与来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的PCR扩增子结合时的信号强度。
图15显示了各种寡核苷酸探针分子在与来自阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)和霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)的PCR扩增子结合时的信号强度。
图16A-图16B显示了凝固酶阴性葡萄球菌属(人链球菌)和凝固酶阳性金黄色葡萄球菌的浓度(CFU/ml)递增时的Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率(Y轴)。图16A显示了绘制在线性Y轴上的比率，图16B显示了绘制在对数型Y轴上的比率。
图17显示了含有凝固酶阳性金黄色葡萄球菌的样品的Al lStaph-146abp信号比率(X轴)和Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率(Y轴)。
6.具体实施方式
6.1.定义
扩增子：扩增子是由PCR扩增反应产生的核酸分子。
不对称引物对：由延伸引物和未延伸引物组成的引物对。
对应：关于共享序列同一性或互补的不同长度的两条核酸链，术语“对应”是指如上下文所规定的存在于两条链中的序列重叠或互补的区域。
正向重复序列：在延伸引物的“B”区域的上下文中，“正向重复序列”意指与“A”区域的一部分正向互补的核苷酸序列(即，具有相同的5’至3’顺序的互补序列)。
延伸引物：一种PCR引物，其包含：(a)其3’末端处的“A”区域，其与靶链1的相应区域具有至少75％的序列同一性或与靶链2的相应区域具有至少75％的序列互补性；(b)其5’末端处的“B”区域，其包含与“A”区域的至少一部分互补的序列；和(c)位于“A”与“B”区域之间的任选的“C”区域。
同源基因组序列：同源基因组序列是在具有共同祖先但核苷酸序列不相同的不同种或菌株中发现的基因组序列。示例性的同源基因组序列包括16S rRNA基因、23S rRNA基因和16S–23S内部转录间隔区(ITS)序列。
反向重复序列：在延伸引物的“B”区域的上下文中，“反向重复序列”意指与“A”区域的一部分反向互补的核苷酸序列(即，具有相反的5’至3’顺序的互补序列)。
解链温度(Tm)：一半DNA双链体解离成单链时的温度。通常通过“百分比GC”方法(PCR PROTOCOLS,a Guide to Methods and Appl icat ions,Innis等人编辑，AcademicPress(San Diego,Cal if.(USA)1990)或“2(A+T)+4(G+C)”法(Wallace等人，1979,NucleicAcids Res.6(11):3543-3557)或“最近邻”法(Santa Lucia,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1460-1465；Allawi和Santa Lucia,1997,Biochem.36:10581-10594)计算由脱氧核糖核苷酸(DNA)组成的线性引物的Tm。出于权利要求的目的，根据“最近邻”法计算DNA的Tm，非天然存在的碱基(例如，2-脱氧肌苷)被当作腺嘌呤处理。
PCR产物链1：PCR产物链1是指由靶核酸和不对称引物对产生的双链PCR产物中与不对称引物对的未延伸引物互补的链。
PCR产物链2：PCR产物链1是指由靶核酸和不对称引物对产生的双链PCR产物中与不对称引物对的延伸引物互补的链。
PCR试剂：除非上下文另有说明，否则术语“PCR试剂”是指除模板核酸、热稳定聚合酶和引物外的PCR反应组分。PCR试剂通常包括dNTP(除了未标记的dNTP以外，还可包括标记的，例如荧光标记的dNTP)、缓冲液和含有二价阳离子的盐(例如，MgCl2)。
引物：一种至少具有12个核苷酸的DNA寡核苷酸，其在其3’末端具有游离羟基。引物可包括天然和非天然存在的核苷酸(例如，含有诸如3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或2-脱氧肌苷(2-脱氧肌苷是优选的)等通用碱基的核苷酸)。除非上下文另有说明，否则术语“引物”也指当混合碱基被包括在引物设计和构建中以允许它们与靶核酸分子中的变体序列杂交时产生的引物分子混合物。靶序列变体可以是种间或种内变体。混合碱的标准命名如表1所示：
优选地，每种引物在与靶核酸互补的区域包含不超过三个混合碱基。在一些实施方案中，引物在与靶核酸互补的区域中包含零个、一个、两个或三个混合碱基。
引物对：正向和反向引物对(其中的每一种可以是具有序列变异的引物的混合物，以考虑靶序列中可能的变异),其能够在少于5,000个碱基对的区域内与相同核酸分子的不同链杂交并从其启动DNA聚合反应。在某些实施方案中，引物对能够在少于2,500个碱基对或少于1,500个碱基对的区域内与来自相同核酸分子的不同链杂交并从其启动DNA聚合反应。
样品：本文使用的术语“样品”是指含有或怀疑含有目的核酸(例如基因组、基因组片段、对应于基因组区域的扩增子或另一种靶核酸)的任何样品。样品可经历一个或多个过程，但仍被视为“样品”例如，经历PCR扩增反应的样品在PCR扩增反应后仍然是“样品”。
单一扩增子：本文使用的术语“单一扩增子”是指用单一引物对通过PCR扩增反应从单个生物体产生的核酸分子或核酸分子的组。通常,“单一扩增子”是指具有独特序列的PCR产物，但也可以指例如在生物体对于被扩增的序列是杂合的时具有一组(例如一对)独特序列的PCR产物。
特异性的：本文使用的关于探针分子与扩增子的结合的术语“特异性的”意指探针分子对其靶扩增子的亲和力大于对于其它非同源扩增子的亲和力(通常具有大得多的亲和力)，但不要求探针分子对其靶标具有绝对特异性。因此，探针分子可以例如能够与包含第一基因组序列的扩增子和包含第二同源基因组序列的扩增子杂交，所述第二同源基因组序列与第一基因组序列相异于一个或多个核苷酸。
靶链1：靶链1是指双链靶核酸中与不对称引物对中的未延伸引物互补的链。
靶链2：靶链2是指双链靶核酸中与不对称引物对中的延伸引物中的“A”区域互补的链。
未延伸引物：一种PCR引物，其基本上由与靶链2中相应区域具有至少75％序列同一性或与靶链1中相应区域具有至少75％序列互补性的核苷酸序列组成。关于未延伸引物，术语“基本上由......组成”意指核苷酸序列在与靶序列互补(至少75％)的区域的5’可含有不超过3个额外的核苷酸。
6.2.使用虚拟探针区分同源基因组序列的方法
本公开提供了区分来自第一生物体的第一基因组序列与来自第二生物体的第二同源基因组序列的方法。该方法允许使用虚拟探针鉴定样品中存在的生物体。基因组序列的虚拟探针通常包含两种或更多种探针分子，所述探针分子可以例如通过它们在可寻址阵列上的离散位置，或者通过例如利用不同荧光部分的差异标记来区分。为方便起见，虚拟探针内单种探针分子的读出在本文中有时被称为“信号”。为了清楚起见，探针分子不需要被标记来产生“信号”。例如，不存在与荧光标记的扩增子的杂交可以构成“信号”。
基因组序列的每种虚拟探针包含(组成虚拟探针的多种探针分子的)至少一种探针分子，其能够与对应于基因组序列的靶核酸(例如，扩增子)特异性杂交。在一些情况下，虚拟探针中的两种或更多种探针分子能够与对应于基因组序列的靶核酸(例如，扩增子)杂交。虚拟探针中的探针分子与来自相关基因组序列的不同靶核酸(例如，扩增子)的杂交模式足够不同，从而可以区分来自相关基因组序列的靶核酸，例如区分来自第一基因组的第一扩增子组与来自具有同源基因组序列的第二基因组的第二扩增子组。所述方法可用于例如直接(例如，当样品直接用于PCR时)或间接(例如，通过中间纯化或富集步骤，诸如第6.2.1节中描述的蛋白珠法(bead beat ing method))确定从其扩增探测的扩增子的样品中细菌的特定种或菌株的存在。本文公开的各种实施方案描述了用虚拟探针探测DNA扩增反应诸如PCR反应的产物；然而，应该理解，可以可选地使用能够检测非扩增的基因组DNA的方法进行探测。用于检测非扩增的基因组DNA的示例性方法描述于Detection of Non-Amplified Genomic DNA,2012,Spoto和Corradini(编辑)doi.org/10.1007/978-94-007-1226-3中，所述文献的内容通过引用以其整体并入。这些方法包括光学检测方法(参见，例如，Li和Fan，2012，Detection of Non-Amplified Genomic DNA中的“Optical Detectionof Non-amplified Genomic DNA”，第153-183页)、电化学检测方法(参见，例如，Marin和merkoci，2012，Detection of Non-Amplified Genomic DNA中的“ElectrochemicalDetection of DNA Using Nanomaterials Based Sensors”，第185-201页)、压电传感方法(参见，例如，Minunni，2012，Detection of Non-Amplified Genomic DNA中的“Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA”，第203-233页)、基于表面等离体共振的方法(参见，例如，D'Agata和Spoto，2012，Detection of Non-AmplifiedGenomic DNA中的“Surface Plasmon Resonance-Based Methods”，第235-261页)，以及平行光学和电化学方法(参见，例如，Knoll等人，2012，Detection of Non-AmplifiedGenomic DNA中的“Parallel Optical and Electrochemical DNA Detection”，第263-278页)。因此，在一些实施方案中，在DNA扩增步骤不存在的情况下(例如，当样品含有或怀疑含有作为基因组片段的靶核酸时)进行样品的探测。
确定来自第一生物体的第一基因组或来自第二生物体的第二基因组的存在(如果任一者存在于样品中的话)的方法，可包括使用能够与第一基因组和第二基因组杂交并从第一基因组和第二基因组启动PCR扩增来进行PCR扩增反应(例如，如第6.2.3节中所述)的步骤。如果样品中存在来自第一基因组的扩增，则产生第一扩增子组。如果样品中存在来自第二基因组的扩增，则产生第二扩增子组。可用虚拟探针探测PCR扩增产物，以确定第一扩增子组和第二扩增子组的存在或不存在。可在PCR扩增反应期间(例如，当使用实时PCR时，例如如第6.2.3.5节中所述)或在PCR扩增反应之后(例如，通过使用包含寡核苷酸探针分子的阵列，例如如第6.3节中所述)进行探测。当在PCR反应后例如在阵列上进行探测时，在PCR混合物中包含荧光标记的核苷酸以标记所得的PCR扩增子是有用的。荧光标记在可寻址阵列上的位置以及在某些情况下其强度可以构成组成虚拟探针的探针分子的信号。
如果确定存在第一扩增子组，则可以推断样品包含第一基因组。同样，如果确定存在第二扩增子组，则可推断样品包含第二基因组。虚拟探针可用于区分从相关微生物制备的第一扩增子组和第二扩增子组，所述相关微生物是例如凝固酶阴性和凝固酶阳性葡萄球菌属物种(例如，如第6.2.5.1节中所述)、戈登链球菌(S.Gordonii)和咽峡炎链球菌(S.anginosus)(例如，如第6.2.5.2节所述)、或缓症链球菌(S.mitis)和肺炎链球菌(S.Pneumoniae)(例如，如第6.2.5.3节中所述)。
样品可以是例如生物样品、环境样品或食品。在一些实施方案中，样品被一种或多种微生物感染，或有被一种或多种微生物感染的风险。第6.2.1节中描述了示例性样品。
预期使用本公开的方法来区分任何同源基因组序列(和对应于同源基因组序列的扩增子)。当确定细菌的种或细菌的相关种是否可能存在于样品中时，可使用能够区分对应于编码rRNA(例如，16S rRNA或23S rRNA)的基因组序列的靶核酸(例如，扩增子)或rRNA基因之间的基因间间隔区(例如16S rRNA–23S rRNA基因间间隔区)的虚拟探针。第6.2.2节描述了可通过本公开的方法区分的示例性同源基因组序列的特征。
根据本公开的方法用虚拟探针进行探测的扩增子可使用PCR引物，通过对含有或怀疑含有或有可能含第一生物体和/或第二生物体的样品进行PCR扩增反应来产生，所述PCR引物能够与第一生物体的基因组和第二生物体的基因组杂交，并从其启动PCR扩增。可用单组引物(当样品中存在第一和第二生物体时，其应该分别产生第一扩增子和第二扩增子)进行PCR扩增反应。或者，当样品中分别存在第一和第二生物体时，可用不止一组引物进行PCR扩增反应，以产生对应于第一基因组的多种扩增子和对应于第二基因组的多种扩增子。第6.2.3节描述了可用于本公开的方法的示例性PCR扩增反应。除PCR之外的核酸扩增技术(例如，等温扩增技术)，诸如环介导的等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和滚环扩增(RCA)，也可用于制备扩增子(参见，例如，Fakruddin等人，2013,J Pharm Bioallied Sci.5(4)：245–252)。因此，应该理解，本文描述的适用于PCR扩增产物的实施方案同样适用于使用替代扩增方法产生的扩增产物。
第6.2.4节和第6.2.5节分别描述了可用于虚拟探针的探针分子的示例性特征和虚拟探针的示例性特征。
在一些实施方案中，PCR扩增产物的探测包括如下步骤：将PCR扩增产物与阵列接触(例如，如第6.3节所述)，从阵列上洗去未结合的核酸分子，以及测量阵列上每个探针分子位置处的标记(例如，荧光标记)的信号强度。优选地，阵列包含一种或多种计量探针。
在其它实施方案中，PCR扩增产物的探测包括测量来自实时PCR反应中使用的寡核苷酸探针分子的信号。
第6.4节描述了可用于执行本公开的方法的系统。
第6.6节描述了可用于本公开的方法的试剂盒。
6.2.1.样品
本公开的方法中使用的样品可以是任何类型或形式的样品，所述样品含有处于适合PCR扩增的条件下或者可被制备成处于适合PCR扩增的条件下的基因组DNA。在某些实施方案中，样品有被一种或多种微生物，例如微生物的一个或多个物种感染的风险。在其它实施方案中，怀疑样品感染了一种或多种微生物，例如微生物的一个或多个物种。例如，样品可以是生物样品、环境样品或食品。
样品的实例包括各种流体样品。在一些情况下，样品可以是来自受试者的体液样品。样品可包括从受试者收集的组织。样品可包括受试者的体液、分泌物和/或组织。样本可以是生物样品。生物样品可以是体液、分泌物和/或组织样品。生物样品的实例包括但不限于血液、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、眼泪、粪便、精液、阴道液、源自肿瘤组织的间质液、眼液、汗液、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼吸液、脊髓液、头发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脑脊液、组织、咽拭子、伤口拭子、活检物、胎盘液、羊水、脐带血、强压液(emphat ic fluids)、体腔液(cavi ty fluids)、痰、脓或其它伤口渗出物、通过伤口清创术或切除取样的感染组织、脑脊液、灌洗液、白细胞生成标本、腹膜透析液、乳汁和/或其他排泄物。
受试者可以提供样品，和/或可以从受试者收集样品。受试者可以是人或非人动物。可从活的或死的受试者采集样品。动物可以是哺乳动物，诸如农场动物(例如牛、猪、绵羊)、运动动物(例如，马)或宠物(如狗或猫)。受试者可以是患者、临床受试者或临床前受试者。受试者可以正在接受诊断、治疗和/或疾病管理或生活方式或预防性护理。受试者可能在也可能不在健康护理专业人员的护理下。
在一些实施方案中，样品可以是环境样品。环境样品的实例包括空气样品、水样品(例如，地下水、地表水或废水)、土壤样品和植物样品。
其它样品包括食品、饮料、制造材料、纺织品、化学品和疗法。
在一些实施方案中，样品是含有或怀疑含有病原体的样品，所述病原体是例如以下病原体中的一种或多种：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林敏感和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、嗜麦芽葡萄球菌(Staphylococcus maltophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfuluezae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属种(Acinetobactersp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、诺卡氏菌属种(Nocardia sp.)、放线菌属种(Actinomyces sp.)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、军团菌属种(Legionellaspecies)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、甲型流感病毒(influenza A virus)、巨细胞病毒、鼻病毒、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CI 4413、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、马链球菌(Streptococcus equi)、白色念珠菌(Candida albicans)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、嗜麦芽(黄单胞菌属(Xanthomonas))窄食单胞菌(Stenotrophomonas(Xanthomonas)maltophilia)和沙门氏菌属种。在一些实施方案中，样品是含有或怀疑含有肠杆菌科菌群细菌诸如产气肠杆菌、阿氏肠杆菌或霍氏肠杆菌的样品。
可在进行PCR扩增之前对样品进行预处理。因此，在本公开的方法中进行PCR扩增的样品可以是例如从本节或本公开的其它地方描述的任何类型的样品中加工、提取或分级分离的样品(例如，从尿、痰、伤口拭子、血液或腹膜透析液中加工、提取或分级分离的样品)。
可使用的预处理步骤的实例包括过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的灭活、试剂的添加等，如本文所讨论的或否则如本领域已知的。
在PCR之前，从生物样品中去除不想要的细胞类型和颗粒物质以最大化从目的细胞类型中回收基因组DNA可以是特别有利的。
如果目的是检测生物样品中的细菌，那么可以希望通过过滤器对生物样品进行预处理，使得颗粒和非细菌细胞保留在过滤器上，而细菌细胞(如果需要，包括它们的孢子)通过过滤器。如本文中所用，“过滤器”是允许颗粒和分子基于尺寸有差别地通过的膜或装置。通常，这是通过在过滤器中具有特定标称尺寸的孔来实现的。例如，对于细菌检测应用特别有益的过滤器具有足够大的孔以允许细菌通过，但又足够小以阻止目的样品中存在的真核细胞通过。通常，细菌细胞的直径范围为0.2μm至2μm(微米(micrometers)或微米(micron))，大多数真菌细胞的直径范围为1μm至10μm，血小板的直径约为3μm，大多数有核哺乳动物细胞的直径通常为10μm至200μm。因此，如果打算检测细菌，小于2μm或小于1μm的过滤器孔径特别适合于从生物样品中去除非细菌细胞。
除了过滤步骤之外或者代替过滤步骤，可对生物样品进行离心以从样品中去除细胞和碎片。沉淀真核细胞而非细菌细胞的离心参数是本领域已知的。如果需要，然后可过滤上清液。
可使用本领域已知的用于制备包含用于PCR的基因组DNA的样品的各种方法中的任一种来制备用于PCR扩增的样品(例如，在上述一个或多个预处理步骤之后)。在一些实施方案中，可使用商购可得的DNA提取试剂、试剂盒和/或仪器，例如QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen)、MagMAXTMDNA Multi-Sample试剂盒(ThermoFisher Scientific)、RSC仪器(Promega)等。
在一些实施方案中，通过包括蛋白珠法的过程制备用于PCR的样品，例如如美国专利第10,036,054号中所述，所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。血液可在被收集到商购可得的血液收集管中之后，直接进行珠状打浆(bead beating)，例如通过将珠状打浆珠粒添加到收集管中，并对收集管进行搅拌。可用于采集血液样品的商购可得的采集管的实例包括含有EDTA的淡紫色顶端管(lavender-toptube)、含有柠檬酸钠的浅蓝色顶端管、含有草酸钾的灰色顶端管或含有肝素的绿色顶端管。
6.2.2.同源基因组序列
本公开的方法可用于鉴定和/或区分第一与第二同源基因组序列(以及靶核酸，诸如对应于第一和第二同源基因组序列的扩增子)。同源基因组序列是在具有共享祖先但核苷酸序列不相同的种或菌株中发现的基因组序列。因此，例如，在密切相关的细菌物种或菌株中存在同源基因组序列。
第一基因组序列和第二基因组序列通常是来自第一微生物和第二微生物(例如，细菌、病毒或真菌)的基因组序列。第一和/或第二微生物可以是例如人病原体和/或动物病原体。微生物可来自同一目、同一科、同一属、同一群或甚至同一种。在优选实施方案中，第一和第二微生物是细菌。
测序技术的进步使得许多公共数据库(诸如国家生物技术信息中心(NCBI)、欧洲分子生物学实验室(EMBL)和日本DNA数据库(DDBJ))中可获得的完整细菌基因组序列的数量显著增加，并且此类数据库可用于鉴定同源基因组序列。
密切相关的微生物中的同源基因组序列经常存在于编码rRNA的基因和编码rRNA的基因之间的基因间间隔区中。使用16S核糖体RNA(16S rRNA)的基因进行细菌物种的序列比较已经有很长时间了。16S核糖体RNA基因编码细菌核糖体(一种负责蛋白质生产的蛋白质/RNA复合物)的30S小亚单位的16S RNA组分。基因包含其间散布着九个高变区(V1-V9)的高度保守的序列的区域。高变区中的序列变异允许密切相关的种之间存在大多数可观察到的差异。由于在这些基因间观察到的序列进化速度缓慢，16S rRNA序列已被用于构建许多细菌物种的系统发生树。图1显示了从GenBank获得的几种葡萄球菌属种的16S rRNA基因制备的示例性系统发生树。
细菌基因组包含第二核糖体rRNA基因，即23S rRNA基因。16S rRNA和23S rRNA基因被称为16S–23S内部转录间隔区(ITS)或16S–23S基因间间隔区的间隔区彼此分开。16S–23S rRNA ITS区包含高变区，所述高变区包含可用于区分和鉴定特定细菌物种的物种特异性序列和物种间特异性序列(K.Okamura等人，2012)。图2显示了根据16s rRNA和16s-23srRNA基因组序列的多重比对创建的绿色链球菌群的示例性种系发生树。
在本公开的方法的一些实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含编码rRNA的基因的核苷酸序列。在其它实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
在其中微生物是细菌的实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列可以各自包含例如16S rRNA基因或23S rRNA基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含16S rRNA基因的核苷酸序列。在其它实施方案中，第一基因组序列和第二基因组序列各自包含23S rRNA基因的核苷酸序列。在其它实施方案中，基因组序列包含在16S-23S基因间间隔区中发现的核苷酸序列。
在某些特定的实施方案中，第一基因组序列和/或第二同源基因组序列是来自可在人的血液、尿液或腹膜液中发现的病原体(例如细菌、病毒或真菌)的基因组序列。此类病原体的实例包括但不限于结核分枝杆菌、禽分枝杆菌副结核亚种、金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林敏感和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌、嗜麦芽葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属种、百日咳博德特氏菌、脑膜炎奈瑟菌、炭疽杆菌、诺卡氏菌属种、放线菌属种、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌属种、耶氏肺孢子虫、甲型流感病毒、巨细胞病毒、鼻病毒、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌CI 4413、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、马链球菌、白色念珠菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌、嗜麦芽(黄单胞菌属)窄食单胞菌和沙门氏菌属种。
6.2.3.PCR扩增
在本公开的方法的一些实施方案中，使用能够与可能存在于样品中的基因组杂交并从其启动PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增。PCR扩增反应可以是“对称”PCR反应，也就是说，该反应通过利用被设计成具有彼此相等或相差几℃的“解链温度”或“Tm”的正向引物和反向引物来产生模板DNA的双链拷贝。用于引物设计的常用计算机软件程序警告用户避免高Tm差异，并具有自动Tm匹配特征。还可使用能够产生单链DNA扩增子的“不对称”PCR反应。还可使用实时PCR反应。在PCR扩增反应的情况下，通过该反应扩增的基因组序列可被称为“靶”核酸、“模板”核酸等。
PCR扩增反应可以使用单个引物组或多个引物组(例如，当PCR扩增是多重PCR时)。多重PCR可用于例如产生对应于第一基因组序列(例如，16S rRNA基因)的扩增子和/或对应于第二基因组序列(例如，23SrRNA基因)的不同扩增子。作为多重PCR的替代方法，可将用不同引物组进行的单独的PCR扩增反应产生的扩增子合并起来用于后续分析。有利的是，单个引物组可用于制备对应于在多个菌株或种(例如2、3、4个或超过4个种)的基因组中发现的同源基因组序列的扩增子，所述菌株或种可以是例如相同属的成员。
可以选择PCR扩增条件(无论是对称还是不对称、单重还是多重)，例如，使得DNA扩增产物的长度为100至1000个核苷酸。在一些实施方案中，选择PCR反应，使得DNA扩增产物长度为300至800个核苷酸。在其它实施方案中，选择PCR条件，使得DNA扩增产物的长度为400至600个核苷酸。
在一些实施方案中，在本公开的方法中使用的PCR扩增反应将产生可测量信号的标记物掺入到反应产生的任何扩增子中。所述标记物可以是例如荧光标记物、电化学标记物或化学发光标记物。荧光标记可以通过在PCR过程中掺入荧光标记的核苷酸和/或通过使用标记的引物进行PCR来实现。电化学标记可以通过在PCR期间掺入氧化还原活性标记的核苷酸和/或通过使用氧化还原活性标记的引物进行PCR来实现(参见，例如，Hocek和Foj ta，2011,Chem.Soc.Rev.,40:5802-5814；Foj ta,2016,Redox Label ing of Nucleic Acidsfor Electrochemical Analysis of Nucleotide Sequences and DNA Damage.In：Nikolelis D.,Nikoleli GP.(编辑)Biosensors for Security and BioterrorismApplications.Advanced Sciences and Technologies for SecurityApplications.Springer,Cham)。化学发光标记可以例如通过如下过程来实现：使用生物素标记的引物进行PCR，结合链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物，然后与化学发光的1,2-二氧杂环丁烷(1,2-dioxetane)底物一起孵育。
合适的荧光部分的实例包括FITC、EDANS、德克萨斯红、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPYTMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、R110、TAMRA、德克萨斯红和x-罗丹明。
荧光部分可以连接到dNTP上，特别是那些含有胞嘧啶作为碱基的dNTP(胞苷酸、胞苷5′-磷酸、胞苷5′-二磷酸、胞苷5′-三磷酸或其聚合物，或含有胞苷酸的聚合物)。
dNTP标记的位置可以是在碱基(氨基)、磷酸基团(OH基团)或脱氧核糖部分(2′-或3′-OH基团)上。优选位置在碱基上。
像其它核苷酸一样，荧光标记的dNTP可以在随机位点(通常是dC位点)掺入PCR扩增子的两条链中，并通过DNA聚合酶延伸。
荧光dNTP可以以高度浓缩的形式商购获得，并且可被加入到PCR反应混合物中，而无需调节每种未标记的dNTP的浓度。对于大多数PCR扩增，dNTP与荧光dNTP的典型比例介于100∶1与1000∶1之间。因此，荧光标记的dNTP可以以未标记的dNTP的0.1％至1％(摩尔)的量包含在PCR试剂中。
荧光标记的PCR产物的检测可通过与探针分子(例如与微阵列结合的探针分子)杂交来实现。合适的微阵列系统利用三维交联的聚合物网络，如美国专利第9,738,926号中所述，所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。
6.2.3.1.引物
PCR反应中使用的引物被设计成识别一种或多种给定的核酸模板的序列(例如一种或多种靶基因组序列)，并与之杂交。引物和靶核酸模板的序列的错配可导致PCR反应的效率降低和/或除所需序列外的序列扩增。成功的引物设计的参数是本领域公知的(参见例如Dieffenbach等人，1993)，包括引物长度、解链温度、GC含量等。PCR引物不需要与给定的靶核酸模板共享100％的序列同一性，与靶序列具有至少75％(例如80％，例如85％，例如90％，例如95％，例如96％，例如97％，例如98％，例如99％或99.5％)的同一性的PCR引物可以起到与靶序列杂交并允许靶序列扩增的作用。
本公开提供了适用于制备具有高特异性和良好扩增效率的独特引物系统的额外参数。引物的长度通常为18至24个碱基，但可以更长，例如长度为25至50个碱基，例如长度为25至45个碱基，例如长度为30至45个碱基，例如长度为35至45个碱基，例如长度为40至45个碱基，或例如长度为40至50个碱基。PCR扩增中使用的引物通常成对设计，其中一种引物称为“正向”引物，一种引物称为“反向”引物。本公开的正向引物可被设计为在3’末端具有G和/或C残基，以提供“GC-夹钳”。G和C核苷酸对比A-T核苷酸对显示出更强的氢键；因此，引物3’末端处的GC-夹钳有助于增强序列特异性，增加杂交的可能性，并增加PCR反应的总效率。
一组引物可被设计成扩增两个基因组区域，例如，一组引物可包括对16S rRNA基因特异的一个引物对和对16S-23S rRNA ITS区域特异的第二引物对(见图3)。此类引物组可用于例如在单个PCR反应中产生多种扩增子。
PCR引物对可被设计成扩增在许多种间保守的序列，例如，以扩增多种细菌种的16S rRNA基因。因此，可使用单个PCR引物对产生对应于同源基因组序列的扩增子，这在对含有或怀疑含有多种可能生物体之一的样品进行PCR时是有利的。设计用于扩增保守序列的引物的参数可包括鉴定各种种间的保守区域，任选地将保守区域中的任何序列差异验证为正确的(例如，如果存在公布的序列是否正确的不确定性)，以及选择在序列间至少75％(例如80％，例如85％，例如90％，例如95％，例如96％，例如97％，例如98％，例如99％，或甚至100％)保守的序列。表现出低于100％的序列同一性的引物可能仅含有一个或多个与给定的模板不同的单核苷酸碱基，也就是说，制剂中的所有引物彼此含有相同的序列。或者，可以制备引物，使其在序列的特定位置含有替代核苷酸残基。例如，用于扩增几个物种的16S区域的反向引物可包含寡核苷酸库，其中一定百分比(例如50％)的寡核苷酸在引物中的某一位置含有第一核苷酸，而一定百分比(例如50％)的寡核苷酸在该位置含有第二核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的方法中使用的引物用可检测标记物(例如，荧光标记物)标记。例如，在一些实施方案中，至少一种引物是5’荧光标记的。在其它实施方案中，不止一种引物被5’荧光标记。适用于标记引物的荧光标记物是本领域已知的，包括Cy5、FAM、JOE、ROX和TAMRA。
6.2.3.2.对称PCR扩增
可用于本公开的方法的典型三步PCR方案(参见PCR PROTOCOLS,aGuide toMethods and Appl icat ions,Innis等人编辑，Academic Press(San Diego,Cal if.(USA)1990，第1章)可包括在93-95℃进行变性或解链超过5秒，在55-65℃进行引物退火10-60秒，以及在聚合酶具有高活性的温度(例如对于Taq DNA聚合酶为72℃)下进行引物延伸15-120秒。典型的两步PCR方案的不同之处可在于引物退火的温度与引物延伸的温度相同，例如为60℃或72℃。对于三步PCR或两步PCR，扩增包括使反应混合物多次循环通过上述一系列步骤，通常为25-40次。在反应过程中，反应中各个步骤的时间和温度可以在不同的循环中保持不变，或者它们可以在反应过程中的一个或多个点改变，以提高效率或增强选择性。
除了引物对和靶核酸以外，PCR反应混合物通常含有四种脱氧核糖核苷酸5’三磷酸(dNTP)中的每一种(通常为等摩尔浓度)、热稳定性聚合酶、二价阳离子(通常为Mg2+)和缓冲剂。此类反应的体积通常为20-100μl。可在同一个反应中扩增多种靶序列。特定PCR扩增的循环次数取决于几个因素，包括：a)起始材料的量，b)反应的效率，和c)产物的检测或后续分析的方法和灵敏度。用于典型循环扩增反应的循环条件、试剂浓度、引物设计和合适的装置在本领域是公知的(参见，例如，Ausubel,F.Current Protocols in MolecularBiology(1988)第15章：“The Polymerase Chain Reaction,”J.Wiley(New York,N.Y.(USA))。
6.2.3.3.不对称PCR扩增
示例性的不对称PCR方法描述于Gyllensten和Erlich，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7652-7656(1988)以及Gyllensten和Erlich，1991，美国专利第5,066,584号中。常规不对称PCR与对称PCR相异在于将引物之一以有限量(通常为另一引物浓度的1/100至1/5)加入。双链扩增子在早期温度循环中积累(如在对称PCR中一样)，但取决于起始模板的数量，一种引物通常在15-25个PCR循环后被耗尽。一条链的线性扩增发生在利用未耗尽的引物的后续循环期间。文献中报道的用于不对称PCR反应的引物通常与已知用于对称PCR的引物相同。Poddar(Poddar,2000,Mol.Cell Probes 14：25-32)通过包括40个热循环的终点测定比较了用于扩增腺病毒底物的对称PCR和不对称PCR。他报道了50:1的引物比是最佳的，并且不对称PCR测定具有更好的灵敏度，然而，对于假定包含更少数量的靶分子的稀释底物溶液，灵敏度显著下降。
6.2.3.4.改进的不对称PCR扩增
在美国专利第10,513,730号中描述了改进的不对称PCR方法，所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。改进的不对称PCR方法包括指数期和线性期。在指数期期间，靶核酸的两条链都被扩增。在线性期期间，只有一条链被扩增，导致靶核酸的单链过量。
改进的不对称PCR方法通过使用具有不同长度和解链温度的引物对实现了单链的过量，其中较长的引物称为“延伸引物”，较短的引物称为“未延伸引物”。延伸引物具有比未延伸引物高的解链温度，并可用于使用PCR循环来选择性扩增靶核酸的单链，其中退火步骤在高于未延伸引物的解链温度但低于延伸引物的解链温度的温度下进行。选择性扩增产生富含靶链的PCR产物混合物，可在随后的检测测定中探测所述靶链。
延伸引物除了含有与靶核酸互补的序列以外，还含有5’延伸，该延伸含有与同一引物的靶结合部分互补的序列。不受理论的束缚，据信5’延伸的使用允许延伸引物分子的分子内或分子间杂交，并防止这些较长引物在PCR反应开始时与PCR反应中存在的DNA分子任意或非特异性结合。这反过来防止了非特异性DNA扩增，并防止了PCR产物中的“噪声”,当扩增生物样品中少量存在的靶标时，这可以是个问题。
初始PCR反应混合物包含
·核酸样品；
·不对称引物对；
·热稳定性DNA聚合酶；和
·PCR试剂。
PCR反应中延伸引物和未延伸引物的初始浓度可以各自在200nM至8μM的范围内。延伸引物和未延伸引物可以以等摩尔量包含在初始PCR反应中，例如各自的浓度范围在约200nM与1μM之间，例如各自的浓度为500nM。或者，可以以非等摩尔量将延伸引物和未延伸引物包含在最初的PCR反应中。在某些实施方案中，延伸引物的初始浓度优选超过未延伸引物的浓度，例如约2-30倍摩尔过量。因此，在某些方面，延伸引物的浓度范围在约1μM与8μM之间，未延伸引物的浓度范围在约50nM与200nM之间。
不对称引物对可被设计成扩增来自任何来源的核酸，对于诊断应用，不对称引物对可被设计成扩增来自病原体诸如第6.2.1节中鉴定的那些病原体的DNA。
不对称引物对可被设计成能够同时扩增存在于许多物种中的同源核酸序列，例如细菌中高度保守的16S核糖体序列。
热稳定性DNA聚合酶：可用于本公开的不对称PCR反应的热稳定性聚合酶包括但不限于Vent(Tli/嗜热热球菌(Thermoccus Literalis))、Vent exo-Taq、Deep Vent Taq、Deep Vent exo-Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus))、热启动Taq、热启动Ex Taq、热启动LA Taq、DreamTaqTM、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaqTM、SuperTaqTM、Stoffel片段、DiscoveraseTMdHPLC、9°Nm、LongAmp Taq、LongAmp、热启动Taq、OneTaq、热启动Flex、Crimson Taq、Hemo KlenTaq、KlenTaq、Phire、热启动II、DyNAzyme I、DyNAzyme II、M-MulV Reverse Transcript、/>Tth((嗜热栖热菌HB-8(Thermos termophilus HB-8))、Tfl、AmlithermTM、芽孢杆菌属DNA(Bacillus DNA)、DisplaceAceTM、Pfu(激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))、Pfu Turbot、Pfunds、ReproFast、PyroBes tTM、VeraSeq、Mako、Manta、Pwo(沃氏热球菌(pyrococcus woesei))、ExactRun、KOD(thermococcus kodakkaraensis)、Pfx、ReproHot、Sac(嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))、Sso(硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))、Tru((Thermus ruber),Pfx50TM(齐利热球菌(Thermococcus zilligi))、AccuPrimeTMGC-Rich(Pyrolobus fumarius)、火球菌属(Pyrococcus)种GB-D、Tfi(丝状栖热菌(Thermusfiliformis))、Tfi exo-、ThermalAceTM、Tac(嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum))、Mth(嗜热自养甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum))、Pab(深海热球菌(Pyrococcusabyssi))、Pho(堀越氏火球菌(Pyrococcus horikosihi))、B103(小短尾噬菌体(Picovirinae Bacteriophage)B103)、Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus))、Bst大片段、Bst 2.0、Bst 2.0WarmStart、Bsu、TherminatorTM、TherminatorTMII、TherminatorTMIII和TherminatorTMT。在优选实施方案中，DNA聚合酶是Taq聚合酶，诸如Taq、热启动Taq、热启动Ex Taq、热启动LA Taq、DreamTaqTM、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaqTM或SuperTaqTM。
用于改进的不对称方法的一组示例性不对称循环如表2所示。
表2中所示的循环次数范围可用于任何不对称引物对，最佳循环次数将取决于初始PCR混合物中靶DNA的拷贝数：初始拷贝数越大，在指数期产生足够量的PCR产物作为线性期的模板所需的循环次数就越少。循环次数的优化对于本领域技术人员来说是常规的。
在延伸引物的Tm高于72℃(例如，75-80℃)且未延伸引物的Tm高于58℃但低于72℃(例如，60-62℃)时以及当热稳定性DNA聚合酶在72℃下具有活性时，表2中所示的温度特别有用。
循环时间，特别是延伸时间，可以根据引物的解链温度和PCR产物的长度而变化，较长的PCR产物需要较长的延伸时间。经验法则是，延伸步骤应该是每1,000个扩增子的碱基至少60秒。延伸步骤可以在线性期延伸，以提供额外的退火时间。
6.2.3.4.1.延伸引物
延伸引物的“A”区与靶链1中的相应区域具有至少75％的序列同一性。在某些实施方案中，引物的“A”区与靶链1中的相应区域具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在其它实施方案中，引物的“A”区与靶链1的相应区域具有100％的序列同一性。
换句话说，在各种实施方案中，延伸引物的“A”区与靶链2中相应区域的互补序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或100％的序列同一性。通常，引物序列与靶序列之间的5’任何错配越多，它们在PCR反应过程中就越可能被容忍。本领域技术人员可以容易地设计与靶链具有小于100％的序列同一性但仍能高效扩增靶DNA的引物序列。
与“A”区的至少一部分互补的“B”区中的序列可以是正向重复序列或反向重复序列。当“B”区含有“A”区一部分的正向重复序列时，不同的延伸引物分子可以相互分子间杂交，如图5B所示。当“B”区含有“A”区一部分的反向重复序列时，延伸引物分子可以在分子内杂交，如图5C所示，或者在分子间相互杂交，如图5A所示。
“A”区的与“B”区中的序列互补的部分优选位于“A”区的5’末端或在其附近(例如，相距1、2或3个核苷酸内)，即，位于“A”区与“B”区(或当“C”区存在时，为“C”区)邻接的地方或在其附近。
延伸引物的“B”区长度优选为6至12个核苷酸，即其长度优选为6、7、8、9、10、11或12个核苷酸。在具体实施方案中，延伸引物的“B”区长度为8至10个核苷酸，即其长度为8、9或10个核苷酸。
当“C”区存在于延伸引物中时，其长度优选为1至6个核苷酸，即其长度优选为1、2、3、4、5或6个核苷酸。
延伸引物的Tm优选(但非必须)介于约68℃与约80℃之间。在特定实施方案中，未延伸引物的Tm介于约72℃与约78℃之间，例如为约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃或约78℃。
位于“A”区与“B”区之间的任选的“C”区可以作为“A”区与“B”区之间的间隔区，以允许延伸引物形成发夹环和/或将限制性核酸内切酶序列(优选6-切割子序列(6-cut tersequence))引入PCR产物。限制性核酸内切酶序列可以全部位于“C”区内，或者由“C”区的全部或一部分与分别位于“B”区和“A”区侧翼的5’和/或3’序列一起形成。为了最小化对与靶核酸的杂交的干扰，“C”区优选不与靶链1或靶链2互补。
延伸引物的Tm优选比未延伸引物的Tm高至少约6℃。优选地，延伸引物的Tm比未延伸引物的Tm高约15℃至30℃。
延伸引物的“A”区的Tm优选比与靶标互补的未延伸引物的一部分(至少75％)(不包括任何5’延伸)的Tm高或低不超过约3℃，即，正向引物中与靶标杂交的区域的Tm优选比反向引物中与靶标杂交的区域的Tm高或低不超过约3℃,反之亦然。
延伸引物的“A”区的长度优选为至少12个核苷酸，优选范围为12-30个核苷酸，更优选为14-25个核苷酸。在某些实施方案中，延伸引物的“A”区的长度为14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
6.2.3.4.2.未延伸引物
未延伸引物具有与靶链2中的相应区域具有至少75％的序列同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，未延伸引物具有与靶链2中的相应区域具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在其它实施方案中，未延伸引物具有与靶链2的相应区域具有100％的序列同一性的核苷酸序列。
换句话说，在各种实施方案中，未延伸引物具有与靶链2中相应的1区的互补序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或100％的序列同一性的核苷酸序列。通常，引物序列与靶序列之间的5’任何错配越多，它们在PCR反应过程中就越可能被容忍。本领域技术人员可以容易地设计与靶链具有小于100％的序列同一性但仍能高效扩增靶DNA的引物序列。
未延伸引物还可具有1、2或3个核苷酸的5’尾。
未延伸引物的Tm优选(但非必须)介于约50℃与约62℃之间。在特定实施方案中，未延伸引物的Tm介于约59℃与约62℃之间，例如为约59℃、约60℃、约61℃或约62℃。
未延伸引物的Tm优选比延伸引物的Tm低至少约6℃。优选地，未延伸引物的Tm具有比延伸引物的Tm低至少约15℃至30℃的Tm。
与靶标互补的未延伸引物的区域(至少75％)(不包括任何5’延伸)的Tm优选比延伸引物的“A”区的Tm高或低不超过约3℃,即，正向引物中与靶标杂交的区域的Tm优选比反向引物中与靶标杂交的区域的Tm高或低不超过约3℃,反之亦然。
未延伸引物的长度优选为至少12个核苷酸，优选范围为12-30个核苷酸，更优为选14-25个核苷酸。在某些实施方案中，未延伸引物的长度为14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
6.2.3.4.3.属引物
在一些不对称PCR方法中，例如如美国专利第8,735,067B2号中所描述的，除了正向和反向引物对之外，还使用第三“属”引物，其具有与添加到引物之一的5’寡核苷酸尾相似的序列。属引物旨在参与初始PCR循环后的扩增反应，以“平衡”多重扩增反应中不同靶标的扩增效率。
不受理论的束缚，据信包含美国专利第8,735,067号中所述的属引物(所述属引物，在改进的不对称PCR方法的情况下，将具有基本上由延伸引物的“B”区序列组成的序列(此类属引物在本文中称为“属引物”))将降低使用本文所述的不对称引物对的扩增效率。因此，本文所述的改进的不对称DNA扩增方法优选在属引物不存在的情况下进行。
在相关实施方案中，本文所述的改进的不对称DNA扩增方法可以每个靶区域利用单个不对称引物对，即，不包括任何额外的引物，认识到单个引物可以是具有密切相关序列的引物分子的混合物，所述密切相关序列是由于在引物中的某些位置处包含混合碱基而产生的。为了清楚和避免疑问，该实施方案不排除在多重扩增反应中使用多个不对称引物对，只要每个扩增子使用单一不对称引物对。
实时PCR扩增
本公开的方法中使用的PCR扩增反应可以是实时PCR扩增反应。
实时PCR是指一套不断发展的技术，其中随着反应的进行，可以测量扩增的DNA产物的积累，通常每个PCR循环测量一次。监测产物随时间的积累可允许确定反应的效率，以及估计DNA模板分子的初始浓度。关于实时PCR的一般细节，参见Real-Time PCR：AnEssential Guide,K.Edwards等人，编辑，Hor izon Bioscience,Norwich,U.K.(2004)。
现在存在几种不同的实时检测化学方法来指示扩增DNA的存在。其中大部分依赖于由于PCR过程而改变性质的荧光示剂。在这些检测化学物质中，DNA结合染料(例如Green)在与双链DNA结合时提高荧光效率。其它实时检测化学物质利用荧光共振能量转移(FRET)(一种染料的荧光效率强烈依赖于其与另一种光吸收部分或淬灭剂的接近度的现象)。这些染料和淬灭剂通常附接于DNA序列特异性探针或引物。基于FRET的检测化学物质包括水解探针和构象探针。水解探针(诸如/>探针)使用聚合酶将报道染料分子从附接于寡核苷酸探针的淬灭染料分子上切割下来。构象探针(诸如分子信标)利用附接于寡核苷酸的染料，其荧光发射随着与靶DNA杂交的寡核苷酸的构象变化而变化(参见，例如，Tyagi S等人，1996,Molecular beacons：probes that fluoresce upon hybridizat ion.Nat Biotechnol 14,303-308)。
实时PCR可以是对称的或不对称的，例如，利用第6.2.3.3节或第6.2.3.4节中描述的对称或不对称PCR扩增反应的反应混合物中的水解探针分子来进行。
存在许多可用于进行实时PCR的商业仪器。可用仪器的实例包括Appl ied Biosystems PRISM 7500、Bio-Rad iCylcer和Roche Diagnos t ics LightCycler 2.0。
6.2.4.探针分子
本公开提供了适用于PCR反应中产生的扩增子的序列特异性检测的探针分子，例如寡核苷酸探针分子。
成功的寡核苷酸探针分子设计的参数是本领域公知的，包括但不限于探针分子长度、交叉杂交效率、解链温度、GC含量、自退火和形成二级结构的能力。本公开提供了寡核苷酸探针分子在微阵列(例如可寻址阵列)中的用途，其中探针分子被锚定在基底(例如膜，例如玻璃基底，例如塑料基底，例如聚合物基质基底)上，并在允许寡核苷酸探针分子与具有相似到相同的序列(例如，所述序列共享至少75％，例如80％，例如85％，例如90％，例如95％，例如96％，例如97％，例如98％，例如99％或甚至100％的相似性或同一性)的扩增子杂交的条件下与核酸接触。
在一些实施方案中，用于本公开的方法的寡核苷酸探针分子包含与第一基因组序列和/或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补(例如，90％至95％或95％至100％互补)的核苷酸序列。
示例性的寡核苷酸探针分子描述于实施例中，包括含有SEQ ID NO：1-7)的核苷酸序列的探针分子。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子存在于阵列上。每个探针分子可位于阵列上的离散位置上，并且可以通过其在阵列上的位置来区分，使得寡核苷酸探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子包含多聚胸苷尾，例如，包含多达10个核苷酸的多聚胸苷尾，或例如，包含多达15个核苷酸的多聚胸苷尾，或例如，包含多达20个核苷酸的多聚胸苷尾。在一个实施方案中，多聚胸苷尾包含10至20个核苷酸，例如15个核苷酸。当探针分子附接于阵列上时，多聚胸苷尾是有用的，其中多聚胸苷尾作为阵列基底与探针分子区域之间的间隔区，所述探针分子区域与一种或多种靶序列部分或完全互补。
寡核苷酸探针分子可以是标记的或未标记的。在一些实施方案中，寡核苷酸探针分子是标记的。在其它实施方案中，寡核苷酸探针分子是未标记的。寡核苷酸探针分子可以例如用荧光报道分子标记，所述报道分子可以是荧光染料，诸如第6.2.3节或第6.2.3.1节中描述的那些。标记的寡核苷酸探针分子可用于例如实时PCR反应中。用于实时PCR的标记的寡核苷酸探针分子可在探针分子的一端包含荧光报道分子，在探针分子的另一端包含淬灭报道分子荧光的淬灭剂部分。在PCR过程中，探针分子可以在退火阶段与其靶序列杂交，并且一旦聚合酶在延伸阶段到达探针分子，其5’-3’-核酸外切酶降解探针，将荧光报道分子与淬灭剂物理分离，导致可以测量的荧光增加。
荧光标记物和淬灭剂部分在探针分子上的位置可以使得FRET可在这两个部分之间发生。荧光标记物可位于例如探针分子的5’末端或其附近，淬灭剂部分可以在探针的3’末端或其附近。在一些实施方案中，荧光标记物与淬灭剂之间的分离距离为约14至约22个核苷酸，尽管可以使用其它距离，例如约6、约8、约10或约12个核苷酸。可使用的其它距离包括约14、约16、约18、约20或约22个核苷酸。
可用于实时PCR的寡核苷酸探针分子的示例性荧光标记物是FAM或6-FAM，代表性淬灭剂部分是MGB。报道部分的其它非限制性实例包括荧光素、HEX、TET、TAM、ROX、Cy3、Alexa和德克萨斯红，而淬灭剂或受体荧光部分的非限制性实例包括TAMRA、BHQ(黑洞淬灭剂)、LC RED 640和花青染料诸如CY5。正如本领域技术人员所理解的，可使用任何一对报道分子和猝灭剂/受体部分，只要它们是可相容的，使得可以发生从供体到淬灭剂/受体的传递。此外，合适的供体和淬灭剂/受体对是本领域已知的，并在本文中提供。可通过本领域已知的任何方式来选择一对。定制的实时PCR探针分子是商购可得的，例如从ThermoFisherScientific、Sigma-Aldrich等公司获得。
6.2.5.虚拟探针
为方便起见，本节(以及本公开的其它节)提及可用虚拟探针探测的扩增子和扩增子组。然而，应该理解，虚拟探针同样可用于探测含有或怀疑含有非扩增的靶核酸诸如基因组片段的样品。
第一扩增子组(包含对应于第一基因组中的一个区域的单种第一扩增子或对应于第一基因组中的不同区域的多种第一扩增子)与第二扩增子组(包含对应于第二基因组中的一个区域的单种第二扩增子或对应于第二基因组中的不同区域的多种第二扩增子)之间的核苷酸错配数量可能相对较小，并且单种寡核苷酸探针分子可能无法单独区分第一扩增子组与第二扩增子组。本发明人意外地发现，在这种情况下，通过使用虚拟探针，仍然可以区分第一扩增子组与第二扩增子组。虚拟探针的探针分子不能单独地，但可以借助于当用虚拟探针的探针分子探测第一和第二扩增子组时观察到的不同杂交模式，共同区分两个扩增子组。
本发明人还发现，在虚拟探针中包括计量探针有助于提高物种鉴定的准确性。可与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的同源扩增子杂交的计量探针可用于测量样品中此类扩增子的相对浓度。根据来自计量探针的信号，可以使用第一式或第二式来分析虚拟探针的所有探针分子的观察到的杂交模式。例如，当来自计量探针的信号处于或高于预定阈值水平(表明样品中扩增子的浓度相对较高)时，第一式可用于分析杂交模式，而当来自计量探针的信号低于阈值水平(表明样品中扩增子的浓度相对较低)时，第二式可用于分析杂交模式。阈值水平可以例如根据含有已知或未知浓度的微生物的一系列样品中获得的信号数据凭经验来确定(参见例如实施例6)。可将寡核苷酸探针的信号数据绘图，并检查图的模式或趋势，根据观察到的模式或趋势选择阈值，例如，如实施例6中所述。例如，图可在X轴上包含第一寡核苷酸探针的信号数据以及在Y轴上包含信号比率数据(例如，第一寡核苷酸探针的信号与第二寡核苷酸探针的信号的比率)。如果该图显示了一种模式或趋势，例如，当第一寡核苷酸探针的信号小于值X时，信号比率相对较高，而当第一寡核苷酸探针的信号大于值X时，信号比率相对较低，则可以选择值X作为阈值。
在一些实施方案中，虚拟探针中使用的计量探针是通用探针，例如，可用于将微生物鉴定为属成员，但其本身不能将该属的单个种与该属的另一个种鉴别开来的探针。用于葡萄球菌属的虚拟探针的示例性计量探针包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
第一扩增子和第二扩增子的核苷酸序列应该在能够被虚拟探针中使用的探针分子结合的扩增的区域中具有至少1个(例如，1个，至少2个，2个，至少3个，或3个)核苷酸错配，使得当探针分子与第一扩增子组杂交时和当探针分子与第二扩增子组杂交时(例如，在阵列上或在实时PCR反应期间)，组成虚拟探针的两种或更多种探针分子的信号模式存在差异。信号模式的差异可用于鉴定和/或区分第一扩增子组与第二扩增子组。当通过使用虚拟探针确定第一扩增子组存在时，可以推断从其产生第一扩增子组的样品包含对应于第一扩增子组的基因组(和，通过推延，其基因组包含在样品中的生物体)。同样，当通过使用虚拟探针确定第二扩增子组存在时，可以推断从其产生第二扩增子组的样品包含对应于第二扩增子组的基因组(和，通过推延，其基因组包含在样品中的生物体)。
当与PCR扩增产物杂交时，可以例如通过一个或多个布尔运算符、一个或多个关系运算符、一个或多个信号比率(例如，第一探针的信号可除以第二探针的信号)、或上述的任意组合来组合虚拟探针的单个探针分子的信号(例如，可通过其在阵列上的位置来区分的信号或对应于不同荧光标记物的信号)，以区分第一扩增子组与第二扩增子组。在一些实施方案中，通过一个或多个布尔运算符来组合信号。在其它实施方案中，通过一个或多个关系运算符来组合信号。在其它实施方案中，来一个或多个布尔运算符和一个或多个关系运算符来组合信号。在其它实施方案中，通过信号比率来组合信号。
在一些情况下，布尔运算符“与”、“或”和“非”可用于组合来自虚拟探针的单个探针分子的信号，以区分第一扩增子组与第二扩增子组。例如，两个同源扩增子(本例中为“扩增子A”和“扩增子B”)的虚拟探针由两种探针分子(本例中为“探针1”和“探针2”)组成。探针1和探针2都能够与扩增子A特异性杂交，而探针1但非探针2，能够与扩增子B特异性杂交。当用虚拟探针探测PCR扩增产物并且来自探针1与扩增产物杂交的信号和来自探针2与PCR扩增产物杂交的信号都为阳性(其可用布尔运算符“与”表示为“探针1与探针2”)时，可以确定扩增子A存在于PCR扩增产物中。当用虚拟探针探测PCR扩增产物，并且探针1与PCR产物杂交的信号为阳性，而探针2与PCR产物杂交的信号为非阳性时(这可使用布尔运算符“非”表示为“探针1非探针2”)，可以确定扩增子B存在于PCR扩增产物中。例如，如果杂交信号高于背景水平，则可以认为杂交信号是阳性的。例如，当未观察到信号或者观察到的信号不高于背景水平时，杂交信号可被认为不是阳性的。
在一些情况下，关系运算符“大于”(“>”)、“大于或等于”(“≥”)、“小于”(“<”)和“小于或等于”(“≤”)可用于组合来自虚拟探针的单个探针分子的信号，以区分第一扩增子组与第二扩增子组。例如，两种同源扩增子的虚拟探针(本例中为“扩增子C”和“扩增子D”)由两种探针分子(本例中为“探针3”和“探针4”)组成。探针3和探针4都能够与扩增子C和扩增子D特异性杂交。当探针3和探针4与扩增子C杂交时，探针3的信号大于探针4的信号(这可使用“大于”关系运算符表示为“探针3>探针4”)。另一方面，当探针3和探针4与扩增子D杂交时，探针3的信号小于探针4的信号(这可使用“小于”关系运算符表示为“探针3<探针4”)。因此，当用虚拟探针探测PCR扩增产物并且探针3的信号大于探针4的信号时，可以确定扩增子C存在于PCR扩增产物中，并且当探针3的信号小于探针4的信号时，可以确定扩增子D存在于PCR扩增产物中。
在一些情况下，可通过信号比率(例如探针1的信号除以探针2的信号，反之亦然)组合来自单个探针分子的信号。在一些实施方案中，可将信号比率与预定的截止值进行比较，以确定样品或从其制备测试样品的初始样品中是否存在微生物。
当组合杂交信号时，信号可以是，例如，绝对信号、归一化的信号或分数信号(例如，虚拟探针中使用的探针分子的信号值可使用预定的函数来缩放，例如如实施例3中所述)。例如，当探针分子的信号高于预定的截止值时，其可被认为是阳性的。例如，可将截止值设置为对于给定探针分子观察到的背景信号(例如，由于非特异性杂交而产生的背景信号)或高于该背景信号。因此，例如，如果观察到探针分子的信号，但是该信号不高于背景水平，则该信号可以被认为不是阳性的。
在一个实施方案中，虚拟探针包含两种或更多种寡核苷酸探针分子(例如，2种寡核苷酸探针分子)。在另一个实施方案中，虚拟探针包含三种或更多种寡核苷酸探针分子(例如，3种寡核苷酸探针分子或4种寡核苷酸探针分子)。
在一些实施方案中，用于第一生物体和第二生物体的虚拟探针由两种探针分子组成。在一个实施方案中，两种探针分子包含第一探针分子和第二探针分子，所述第一探针分子能够与第一扩增子组(对应于第一生物体)中的第一扩增子和第二扩增子组(对应于第二生物体)中的第二扩增子特异性杂交，所述第二探针分子能够与第二扩增子组中的扩增子特异性杂交但不与第一扩增子组中的扩增子特异性杂交。在这样的实施方案中，当探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果第一探针分子的信号为阳性而第二探针分子的信号不为阳性，则可以确定样品中存在第一生物体。另一方面，如果在探测PCR扩增产物时，第一探针分子的信号为阳性且第二探针分子的信号为阳性，则可以确定样品中存在第二生物体。
在一些实施方案中，第一生物体和第二生物体的虚拟探针由三种探针分子组成。在一个实施方案中，三种探针分子包含第一探针分子、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与第一扩增子组(对应于第一生物体)中的第一扩增子和第二扩增子组(对应于第二生物体)中的第二扩增子特异性杂交，所述第二探针能够与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子特异性杂交并且不同于第一探针，所述第三探针能够与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子特异性杂交，并且不同于第一探针分子和第二探针分子。在此类实施方案中，在探测PCR扩增产物时观察到的三种探针分子的相对信号可用于确定用于制备PCR扩增产物的样品是否含有第一生物体或第二生物体。
因为虚拟探针可用于区分同源基因组序列，所以虚拟探针可用于区分密切相关的生物体，例如密切相关的微生物。例如，虚拟探针可用于区分来自同一目、同一科、同一属、同一群或甚至同一种(例如，同一种的不同菌株)的微生物。例如，虚拟探针可用于区分乳酸杆菌属(Lactobacillus)种与李斯特菌属(Listeria)种，区分棒状杆菌属(Corynebacterium)种与丙酸杆菌属(Propionibactium)种，区分微球菌属(Micrococcus)种与考克氏菌属(Kocuria)种，区分巴氏杆菌属(Pasturella)种和嗜血杆菌属(Haemophillus)种，区分凝固酶阴性葡萄球菌属种与凝固酶阳性葡萄球菌属种，区分链球菌属种(例如，咽峡炎链球菌、戈登链球菌、缓症链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、嗜没食子酸链球菌(S.Gallolyticus)、婴儿链球菌(S.infantarius)、前庭链球菌(S.Vestibularis)、唾液)、唾液链球菌(S.Salivarius)、猪肠链球菌(S.hyointestinalis)、星座链球菌(S.constellatus)、中间链球菌(S.intermedius)、口腔链球菌(S.oralis)、血链球菌(S.sanguinis)、副鳗链球菌(S.Parasanguinis))，区分葡萄球菌属(Staphylococcus)种(例如，路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis))，区分肠球菌属(Enterococcus)种(例如，希拉肠球菌(E.fecalis)、粪肠球菌(E.Faecium))，区分梭菌属(Clostridium)种(例如产气荚膜梭菌(C.perfringens)、梭状梭菌(C.Clostridiiforme)、无害梭菌(C.Innocuum))，区分芽孢杆菌属(Bacillus)种(例如，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、凝结芽孢杆菌(B.Coagulans))，区分假单胞菌属(Pseudomonas)种(例如，铜绿色假单胞菌、恶臭假单胞菌(P.putida)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、曼多辛假单胞菌(P.Mendocina))和区分不动杆菌属(Acinetobacter)种(例如，鲍曼不动杆菌、洛菲氏不动杆菌(A.lwoffii)、乌尔新不动杆菌(A.ursingii)、溶血性不动杆菌(A.haemolyticus)、琼氏不动杆菌(A.Junii))。
第6.2.5.1节至第6.2.5.3节和第7节中的实施例1-5描述了用于鉴定和/或区分不同类型的密切相关细菌的示例性虚拟探针。
6.2.5.1.凝固酶阴性葡萄球菌属种的虚拟探针。
本公开提供了虚拟探针，其可用于确定凝固酶阴性葡萄球菌属种是否存在于样品中，并且可用于区分包含凝固酶阴性葡萄球菌属种的样品与包含凝固酶阳性葡萄球菌属种的样品。可用于凝固酶阴性葡萄球菌属种的虚拟探针的第一示例性探针分子包含核苷酸序列CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)或由所述核苷酸序列组成。可用于凝固酶阴性葡萄球菌属种的虚拟探针的第二种示例性探针分子包含核苷酸序列GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)或由所述核苷酸序列组成。SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的核苷酸序列被设计成探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的探针分子可用于探测由使用引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子，引物被设计成扩增凝固酶阴性葡萄球菌属种的16S rRNA基因组序列。例如，探针分子可以包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果第一寡核苷酸探针(“探针1”)的信号是阳性的，而第二寡核苷酸探针(“探针2”)的信号不是阳性的(这可用“非”运算符表示为“探针1非探针2”)，则可以确定样品含有凝固酶阴性葡萄球菌属种。
或者，可使用探针1和探针2的信号比率。例如，当探针1的信号除以探针2的信号大于或等于预定的截止值时，可以确定样品含有凝固酶阴性葡萄球菌属种。当来自计量探针的信号指示样品中靶核酸的量相对较高或相对较低时，可以使用具有不同截止值的不同式。探针1是属探针，可用作计量探针。因此，例如，当来自计量探针的信号指示相对高浓度的靶核酸时(例如，当信号处于或高于预定阈值时)，可以使用具有第一截止值的第一式，而当来自计量探针的信号指示相对低浓度的靶核酸时(例如，当计量探针的信号低于预定阈值时)，可以使用具有第二截止值的第二式。使用第一和第二式可以提高凝固酶阴性葡萄球菌属种和凝固酶阳性葡萄球菌属种的鉴定的准确性，例如，如实施例6中所述。
凝固酶阴性葡萄球菌属种的示例性虚拟探针进一步描述于实施例1和6中。
6.2.5.2.戈登链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针
本公开提供了虚拟探针，其可用于确定样品中是否存在戈登链球菌或咽峡炎链球菌，并且可用于区分包含戈登链球菌的样品与包含咽峡炎链球菌的样品。可用于戈登链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针的第一示例性探针分子包核苷酸序列CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)或由所述核苷酸序列组成。可用于戈登链球菌和咽峡炎链球菌的虚拟探针的第二示例性探针分子包核苷酸序列TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)或由所述核苷酸序列组成。SEQ ID NO:3和SEQID NO:4的核苷酸序列被设计成探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列的寡核苷酸探针分子可用于探测由使用引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子，所述引物被设计成扩增来自戈登链球菌和咽峡炎链球菌的16SrRNA基因组序列。例如，探针分子可以包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果第一探针(“探针1”)的信号是阳性的，而第二探针(“探针2”)的信号不是阳性的(这可用“非”运算符表示为“探针1非探针2”)，则可以确定样品含有戈登链球菌。在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果探针1的信号是阳性的且探针2的信号也是阳性的(这可用“与”运算符表示为“探针1与探针2”)，则可以确定样品含有咽峡炎链球菌。在实施例2中进一步描述了戈登链球菌和咽峡炎链球菌的示例性虚拟探针。
6.2.5.3.缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针
本公开虚拟探针可用于确定样品中是否存在缓症链球菌或肺炎链球菌，并且可用于区分包含缓症链球菌的样品与包含肺炎链球菌的样品。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针的第一示例性探针分子包含核苷酸序列AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ IDNO:5)或由所述核苷酸序列组成。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针的第二示例性探针分子包含核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)或由所述核苷酸序列组成。可用于缓症链球菌和肺炎链球菌的虚拟探针的第三示例性探针分子包含核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)或由所述核苷酸序列组成。SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列被设计成探测16S RNA扩增子。因此，具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列的探针分子可用于探测由使用引物进行的PCR扩增反应产生的扩增子，所述引物被设计成扩增缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA基因组序列。例如，探针分子可以包括在阵列上或用于实时PCR反应中。
在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果第二探针(“探针2”)和/或第三探针(“探针3”)的信号小于第一探针(“探针1”)的缩放信号，则可以确定样品含有缓减链球菌。用于确定样品是否含有缓减链球菌的信号之间的关系可以使用布尔和关系运算符表示为“(探针2或探针3)<(探针1)/n”，其中n是用于缩放探针1信号的预定值。在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果探针2和/或探针3的信号大于探针1的缩放信号，则可以确定样品含有肺炎链球菌。用于确定样品是否含有肺炎链球菌的信号之间的关系可使用布尔和关系运算符表示为“(探针2或探针3)>(探针1)/n”。“n”的合适值可以例如通过探测从已知含有缓症链球菌的样品中产生的PCR产物和探测从已知含有肺炎链球菌的样品产生的PCR产物来确定。
或者，在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果探针3的信号除以探针1的信号小于预定值“n”,则可以确定样品含有缓减链球菌。在探测从样品制备的PCR扩增产物时，如果探针3的信号除以探针1的信号大于“n”，则可以确定样品含有肺炎链球菌。“n”的合适值可以例如通过探测从已知含有缓症链球菌的样品中产生的PCR产物和探测从已知含有肺炎链球菌的样品产生的PCR产物来确定。
在实施例3中进一步描述了缓症链球菌和肺炎链球菌的示例性虚拟探针。
6.3.阵列
本公开提供了包含一种或多种虚拟探针的可寻址阵列，每种虚拟探针可用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列。
本公开的可寻址阵列可用于本文所述的方法中。本公开的可寻址阵列可包含一组位置可寻址的寡核苷酸探针分子，每个探针分子位于阵列上的离散位置。在一些实施方案中，组成虚拟探针的寡核苷酸探针分子组(通常是两种或三种不同的探针分子)中的每种探针分子，包含与虚拟探针想要区分的第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸(例如，15至20个、15至30个、20至40个、20至30个或30至40个连续核苷酸)90％至100％(例如，90％至95％或95％至100％)互补的核苷酸序列。
可寻址阵列还可任选地包含一种或多种对照探针分子(例如，用于评估DNA提取和扩增步骤的效率的提取和扩增对照和/或用于评估DNA与阵列杂交的效率的杂交对照)。
在一些实施方案中，阵列的探针分子包含多聚胸苷尾，例如，包含多达10个核苷酸的多聚胸苷尾，或例如，包含多达15个核苷酸的多聚胸苷尾，或例如，包含多达20个核苷酸的多聚胸苷尾。在一些实施方案中，多聚胸苷尾是10聚体至20聚体，例如15聚体。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含12种或更多种探针分子，例如，12至100种探针分子，或例如，12至50种探针分子，或例如，25至75种探针分子，或例如，50至100种探针分子。在一些实施方案中，可寻址阵列包含12种探针分子。在其它实施方案中，可寻址阵列包含14种探针分子。在其它实施方案中，可寻址阵列包含84种探针分子。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含用于至少2种虚拟探针，例如，用于至少3种虚拟探针，或例如，至少5种虚拟探针，或例如至少10种虚拟探针的寡核苷酸探针，或者例如，可寻址阵列包含用于多达10种或多达15种虚拟探针的寡核苷酸探针。
虚拟探针可以重叠，使得探针分子可以是两种或更多种虚拟探针的组分。虚拟探针也可以是非重叠的。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含能够区分至少5种不同类型的微生物(例如细菌)的虚拟探针。在其它实施方案中，可寻址阵列包含能够区分至少10种不同类型，例如至少20种不同类型，例如至少30种不同类型，例如至少40种不同类型，或者例如多达50种不同类型的微生物(例如细菌)的虚拟探针。
在一些实施方案中，可寻址阵列包含至少5种虚拟探针，例如至少10种虚拟探针，例如至少15种虚拟探针，或者例如至少20种虚拟探针，其每一种能够鉴定不同类型的微生物，例如细菌，例如可能存在于样品中的不同细菌菌株或细菌种。
在一些实施方案中，本公开的可寻址阵列包含一种或多种虚拟探针，用于区分真细菌物种的基因组序列与非真细菌物种的微生物的基因组序列。在一些实施方案中，可寻址阵列包含适于区分革兰阳性细菌的基因组序列与革兰阴性细菌的基因组序列的一种或多种虚拟探针。在一些实施方案中，可寻址阵列包含一种或多种虚拟探针，适于区分来自不同目的微生物的基因组序列。在一些实施方案中，虚拟探针适于区分来自不同科的微生物的基因组序列。在一些实施方案中，虚拟探针适于区分来自不同属、不同群和/或不同种的微生物的基因组序列。
美国专利第9,738,926号和美国专利申请公布第2018/0362719A1号(它们的内容通过引用以其整体并入本文)中描述了可用于制造本公开的阵列的合适的微阵列系统。美国专利第9,738,926号和美国专利申请公布第2018/0362719A1号中描述的微阵列系统利用了三维交联聚合物网络。因此，在一些实施方案中，本公开的阵列包括如美国专利第9,738,926号中所述的阵列，其中该阵列的探针分子包括如本文所述的一组寡核苷酸探针分子。在其它实施方案中，本公开的阵列包括如美国专利申请公布第2018/0362719A1号中所述的阵列，其中该阵列的探针分子包括如本文所述的一组寡核苷酸探针分子。
在本公开的一个方面，本公开提供了使用本公开的阵列来确定样品中是否存在第一生物体或第二生物体的方法。示例性方法包括以下步骤：
当第一基因组和第二基因组存在于样品中时，使用能够与第一生物的基因组(“第一基因组”)和第二生物的基因组(“第二基因组”)杂交并从其启动PCR扩增的PCR引物对样品进行PCR扩增反应，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组，并且其中PCR扩增反应将产生可测量信号的标记物掺入到由反应产生的任何PCR扩增产物中；
将PCR扩增产物与具有一种或多种虚拟探针的本公开的阵列接触，所述虚拟探针包含两种或更多种寡核苷酸探针分子，其中的每一种寡核苷酸探针分子能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中两种或更多种寡核苷酸探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子非等同地杂交，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可以区分第一扩增子组与第二扩增子组；
从阵列中洗去未结合的核酸分子；以及
测量阵列上每个探针分子位置的标记信号；以及
如果信号表明与探针分子杂交的PCR扩增产物是由PCR扩增反应产生的，则如本文所述分析信号以确定第一扩增子组或第二扩增子组是否由PCR扩增反应产生；或者如果信号表明PCR扩增反应没有产生与该组探针分子杂交的PCR扩增产物，则确定该样品不含第一生物体或第二生物体，从而确定样品中是否存在第一生物体或第二生物体。
6.4.计算机实施
本公开的方法的许多方面可由计算机实施。
因此，本公开提供了用于检测测试样品或从其制备测试样品的初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的相同属的第二微生物的计算机实施的方法。
该方法通常包括在具有一个或多个处理器的计算机系统中执行一个或多个计算机可读指令，所述处理器耦合存储由所述一个或多个处理器执行的一个或多个计算机可读指令的存储器，所述计算机可读指令包括用于以下的指令：(a)接收来自探针分子与测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号数据，以及(d)根据一个或多个式分析信号数据，以确定测试样品或从其制备测试样品的初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的第二微生物。所述一个或多个式可包括，例如，如果来自计量探针的信号处于或高于预定阈值，则使用第一式分析信号数据，以及如果来自计量探针的信号数据小于预定阈值，则使用第二式分析信号数据。
计算机实施的方法可包括向用户提供通知，例如关于样品中微生物的身份和/或关于样品中不存在目的微生物的通知。
6.5.系统
本公开提供了用于例如确定样品中是否存在生物体的系统。该系统可以包括例如：(i)光学读取器，其用于为具有寡核苷酸探针分子的阵列(例如，本公开的阵列)的每个探针分子位置产生信号数据；和(i i)至少一个处理器，其被配置成从光学读取器接收信号数据，并且被配置成使用虚拟探针(例如，具有如本文所述的特征的虚拟探针)来分析信号数据，并且具有到存储或显示设备或网络的接口，用于输出分析结果。
可用于本公开的系统中的光学读取器包括商购可得的微孔板读取器(例如，Discover(Promega),ArrayPixTM(Arrayit),VarioskanTM LUX(Thermo Scientific),/>200PRO(Tecan))。
该系统还可包括(作为光学读取器的组件或作为独立组件)能够激发阵列上的荧光标记的分子(例如，探针分子和/或与其杂交的扩增子)的光源。
该系统可包括非瞬态存储介质(例如，硬盘、闪存驱动器、CD或DVD)，包括用于实施信号数据分析的处理器可执行指令。
该系统可包括通用或专用计算系统环境或配置。可与本公开的系统一起使用的公知的计算系统、环境和/或配置的实例包括但不限于个人计算机、服务器计算机、智能手机、平板电脑、手持或膝上型设备、多处理器系统、基于微处理器的系统、网络PC、小型机、大型计算机、包括任何上述系统或设备的分布式计算环境等。
本公开的系统可执行计算机可执行指令，诸如程序模块。通常，程序模块包括例程、程序、对象、组件、数据结构等，它们执行特定的任务或实现特定的抽象数据类型。也可以在分布式计算环境中实施一些实施方案，其中任务由通过通信网络链接的远程处理设备执行。这些分布式系统可以是所谓的企业计算系统，或者在一些实施方案中，可以是“云”计算系统。在分布式计算环境中，程序模块可位于包括存储器存储设备在内的本地和/或远程计算机存储介质中。
计算环境可包括一个或多个输入/输出设备。一些此类输入/输出设备可提供用户接口。用户可通过输入设备诸如键盘和定点设备诸如鼠标向计算机输入命令和信息。然而，可使用其它形式的定点设备，包括轨迹球、触摸板或触摸屏。
本公开的系统可包括一个或多个输出设备，包括可形成用户界面的一部分的输出设备，例如监视器。
本公开的系统可使用到一个或多个远程计算机的逻辑连接在网络化环境中操作。远程计算机可以是个人计算机、服务器、路由器、网络PC、对等设备或其它常见的网络节点。逻辑连接包括局域网(LAN)和广域网(WAN)，但也可以包括其它网络。此类网络环境在办公室、企业范围的计算机网络、内部网和因特网中很常见。可选地或另外地，WAN可包括蜂窝网络。
当在LAN网络环境中使用时，本公开的系统可通过网络接口或适配器连接到LAN。当在WAN网络环境中使用时，系统可包括调制解调器或用于通过WAN(诸如因特网)建立通信的其它装置。
在网络环境中，使用虚拟探针分析信号数据的程序模块可以存储在远程存储器存储设备(例如，硬盘驱动器或闪存驱动器)中。
本公开的系统还可包括平板处理机器人，其能够将PCR扩增反应的产物添加到阵列中，并且能够从阵列中洗去未结合的核酸分子。许多平板处理机器人是商购可得的，并且此类机器人可用于本公开的系统中(例如，Tecan MSP 9000,MSP 9250或MSP 9500、TecanOmni Flex、Tr icont inent Tr iTon(XYZ)或Aurora VersaTM)。
6.6.试剂盒
本发明提供了适用于本发明方法的试剂盒。
试剂盒可包含例如一组两种或更多种标记的探针分子(例如，2至20种探针分子、2至10种探针分子、2至5种探针分子、5至10种探针分子或10至20种探针分子)，其适用于本文所述的实时PCR反应。例如，试剂盒可包含(1)其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的探针分子；(2)其核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的探针分子；或(3)其核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的探针分子。在一些实施方案中，试剂盒包含(1)和(2)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(1)和(3)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(2)和(3)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(1)、(2)和(3)的探针分子的组合。
在其它实施方案中，试剂盒可包含，例如，一组两种或更多种适用于本文所述阵列上的探针分子(例如，2至20种探针分子、2至5种探针分子、5至10种探针分子或10至20种探针分子)(例如，未标记的探针分子)。例如，试剂盒可包含(1)其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的探针分子；(2)其核苷酸序列包含SEQ IDNO:3的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的探针分子；或(3)其核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的探针分子，其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的探针分子。在一些实施方案中，试剂盒包含(1)和(2)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(1)和(3)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(2)和(3)的探针分子的组合。在其它实施方案中，试剂盒包含(1)、(2)和(3)的探针分子的组合。
在其它实施方案中，试剂盒可包含本文所述的阵列。
本文所述的试剂盒还可包括一种或多种用于进行PCR反应的试剂，例如一种或多种(例如两种)用于扩增同源基因组序列的引物，和/或一种或多种用于进行杂交反应的试剂，例如洗涤缓冲液。
本文所述的试剂盒还可包括用于制备PCR扩增反应的样品的一种或多种试剂和/或一种或多种装置，例如裂解缓冲液或珠状打浆系统。
本文所述的试剂盒还可包括使用试剂盒的组分进行本文所述方法的部分或全部步骤的一个或多个容器和/或说明书。
7.实施例
7.1.实施例1：凝固酶阴性葡萄球菌属(CNS)的虚拟探针
金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性种，并且是身体微生物群的正常成员。然而，金黄色葡萄球菌可以成为机会病原体，引起皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒。因此，临床上需要能够在临床样品中区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌属种的测试。还有一些其它凝固酶阳性葡萄球菌，但它们通常在疾病中不起主要作用，因此对于大多数分析目的而言可以被忽略。
制备寡核苷酸探针“Al lStaph-146abp”(具有核苷酸序列CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1))，其可用于非特异性鉴定葡萄球菌属种。换句话说，Al lStaph-146abp是属探针分子，其本身不能区分样品中的金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性种。在实施例中使用的探针分子名称中所示的数字是指用于制备可用探针分子探测的扩增子的正向PCR引物与探针起点之间的以核苷酸数量表示的距离。第二寡核苷酸探针“Sau-71p”(具有核苷酸序列GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2))是16S rRNA探针分子，其对来自金黄色葡萄球菌的扩增子提供阳性信号，但不对来自凝固酶阴性葡萄球菌属的扩增子提供阳性信号。因此，当唯一临床相关的凝固酶阳性葡萄球菌属种是金黄色葡萄球菌时，凝固酶阴性葡萄球菌属种的示例性虚拟探针可以由Al lStaph-146abp和Sau-71p组成。当用虚拟探针探测PCR扩增产物并且Al lStaph-146abp的信号为阳性而Sau-71p的信号不为阳性(这可表示为“AllStaph-146-abp非Sau-71p”)时，可以确定从其制备PCR扩增产物的样品包含凝固酶阴性葡萄球菌种(参见，图10A)。在更多种相关的情况下，虚拟探针可包括附加探针分子。例如，当可在牛、马和猪中引起皮肤病的猪葡萄球菌(S.Hyicus)相关时，当特异于猪葡萄球菌的探针也不呈阳性时(这可表示为“Al lStaph-146abp非Sau71P非猪葡萄球菌”)，可确定样品含有凝固酶阴性葡萄球菌种(参见，图10B)。
7.2.实施例2：用于区分咽峡炎链球菌与戈登链球菌的虚拟探针
戈登链球菌是通常在人口腔中发现的细菌。戈登链球菌在口腔中通常是无害的，但进入血液后会导致急性细菌性心内膜炎。戈登链球菌也是人微生物群中的成员，已知会在免疫受损的个体中引起感染。
已经制备了两种寡核苷酸探针分子，它们可用于虚拟探针，以用于区分样品中的咽峡炎链球菌与戈登链球菌。具有核苷酸序列CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ IDNO:3)的寡核苷酸探针分子“Stango 85p”是16S rRNA探针分子，当样品中存在咽峡炎链球菌和戈登链球菌中的任一种时，其都能给出阳性信号。另一方面，具有核苷酸序列TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的寡核苷酸探针分子“Sang 156p”对来自于咽峡炎链球菌的扩增子提供阳性信号，而不对来自于戈登链球菌的扩增子提供阳性信号。戈登链球菌和咽峡炎链球菌的示例性虚拟探针由Stango85p和Sang156p组成。当用虚拟探针探测PCR扩增产物并且Stango85p的信号为阳性而San156p的信号不为阳性(这可表示为“Stango85p非Sang156p”)时，可以确定用于制备PCR扩增产物的样品含有戈登链球菌，而如果Stango85p的信号为阳性并且San156p的信号为阳性(这可以表示为“Stango85p与Sang156p”)，则可以确定样品含有咽峡炎链球菌。
7.3.实施例3：区分缓症链球菌与肺炎链球菌的虚拟探针
缓症链球菌和肺炎链球菌都是致病性的，它们的16S rRNA几乎相同，因此很难使用16S rRNA的单一寡核苷酸探针分子来区分这两个种。
已经制备了三种寡核苷酸探针分子，它们可用于用以区分缓症链球菌与肺炎链球菌的虚拟探针。第一探针“Al lStrep-261p”，具有核苷酸序列AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)，是不能区分不同链球菌属种的属探针分子。第二探针“Spneu-229p”，具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)，尽管包含来自肺炎链球菌的基因组序列，但其本身不能用于区分缓症链球菌与肺炎链球菌。第三探针“Spneu-229bp”，具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)，与Spneu-229p相异仅一个核苷酸，以解释肺炎链球菌中的SNP。
当来自缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA扩增子与包含三种探针分子的阵列结合时，观察到三种探针分子中的每一种的阳性信号(图11A-图11B)。因此，这三种探针分子不能单独用于区分缓症链球菌与肺炎链球菌。然而，当用三种探针探测来自缓症链球菌和肺炎链球菌的16S rRNA扩增子时，可以通过评估信号模式来区分来自缓症链球菌的扩增子与来自肺炎链球菌的扩增子。具体而言，探测从含有缓症链球菌的样品中产生的PCR扩增产物产生了可表示为“(Spneu-229p或Spneu-229bp)<(Al lStrep-261p)/3”的信号模式，而探测从含有肺炎链球菌的样品中产生的PCR扩增产物产生了可表示为“(Spneu-229p与Spneu-229bp)>(Al lStrep-261p)/3”的信号模式。
根据对来自含有缓症链球菌和肺炎链球菌的样品的杂交数据的进一步分析，确定了为“(Spneu-229bp/Al lStrep-261p)≤0.39”的Spneu-229bp和Al lStrep-261p探针的信号模式表明缓症链球菌的存在，而为“(Spneu-229bp/Al lStrep-261p)>0.39”的Spneu-229bp和Al lStrep-261p探针的信号模式表明肺炎链球菌的存在。
因此，本实施例验证了虚拟探测器的概念。
7.4.实施例4：用于检测绿色链球菌群的虚拟探针
绿色链球菌群(VGS)是临床相关的革兰阳性细菌的主要菌群之一，具有超过24个种，它们被分为五个亚群：牛链球菌群、咽峡炎链球菌群、唾液链球菌群、缓症链球菌群和变形链球菌(Streptococcus mutans)群。VGS群细菌可在免疫受损患者中导致肺炎和败血症。
VGS种作为一个群在遗传上呈现异质性，表明可以用单一探针检测不同的种。针对不同的VGS群细菌设计了多种探针，但一些种显示出与其它VGS亚群的探针的交叉反应性(参见，图12，其显示肺炎链球菌与缓症链球菌探针Smi t-79p的交叉反应性，并且其显示缓症链球菌和口腔链球菌与肺炎链球菌探针Spneu-229p和Spneu-229bp的交叉反应性)。考虑到交叉反应性，设计了可区分肺炎链球菌与缓症链球菌/口腔链球菌的缓症链球菌群细菌的虚拟探针：
缓症链球菌亚群＝(Spar-205p与Al lStrep-261p)或(Smi t-79p与Al lStrep-261p与非Shyo-193p)或(Ssang-193p与Al lStrep-261p与非Stmu-86p)或(Stango-85p与非Sang-156p与Al lStrep-261p>0.01)与如果Smi t-79p则(Spneu-229bp/Al lStrep-261p)/Al lStrep-261p≤3。
7.5.实施例5：用于检测来自肠杆菌科菌群的种的虚拟探针
肠杆菌科是革兰阴性细菌的大家族，其包括致病和非致病种。致病家族成员包括克雷伯氏菌属种、肠杆菌属种、埃希氏菌属种、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)种、沙雷氏菌属种和沙门氏菌属种。
该家族成员的16s rRNA区域在种之间具有最小的遗传序列变异，使得难以设计能够区分种的16S探针。然而，考虑到16S序列的相似性，设计了通用探针“Entb-132p”，除可被探针“Entb-299p”鉴定的泛菌属(Pantoea)种外，所述探针可以将大多数家族成员鉴定为肠杆菌科。
根据来自肠杆菌科种的种在16S rRNA基因组区域中的聚类模式设计了两组探针。来自肠杆菌属和克雷伯氏菌属的种可以通过探针“Enklspss-95p”来鉴定，来自柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属和埃希氏菌属的种可以通过探针“SaEsCi-91p”来鉴定。由于难以设计能够区分肠杆菌科种的单一探针，因此16S rRNA探针与ITS探针的组合被设计(参见图13和图14)用于肠杆菌科种的分层鉴定和区分。
16s-23s ITS区的使用使得区分阴沟肠杆菌复合体的种成为可能，所述阴沟肠杆菌复合体包括阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌和霍氏肠杆菌。联合使用的三种探针“Encl-1871p,”“Encl-1659p”和“ECC3-1729p”可允许对不同的阴沟肠杆菌复合菌种进行特异性鉴定(参见图15)。
阴沟肠杆菌＝Encl-1659p NOT(Encl-1871p OR ECC3-1729p)
阿氏肠杆菌＝Encl 01871p NOT(Encl-1659p OR ECC3-1729p)
霍氏肠杆菌＝(Encl-1871p AND ECC3-1729p)NOT Encl-1659p
7.6.实施例6:利用虚拟探针进行的凝固酶阴性葡萄球菌属(CNS)的改进的检测
本实施例描述了使用包含实施例1中描述的Al lStaph-146abp和Sau-71p探针的虚拟探针来区分和鉴定CNS与凝固酶阳性金黄色葡萄球菌的改进的式。
Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率可用于区分含有CNS的样品与含有金黄色葡萄球菌的样品。例如，发现为2的信号比率截止值可用于以良好的准确度区分含有CNS的样品与含有金黄色葡萄球菌的样品(例如，当Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率>2时，将样品鉴定为含有CNS，当Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率<2时，将样品鉴定为含有金黄色葡萄球菌)(数据未显示)。
然而，发现，对于含有高浓度CNS的样品，的截止值为2有时会导致不正确的鉴定，因为在高浓度下，Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率会降至约2。参见，图16A-图16B。当探测含有高浓度靶核酸的样品时，寡核苷酸探针会变得饱和，并且发现Al lStaph-146abp和Sau-71p探针在不同的样品浓度下达到饱和。例如，图16A-图16B显示，随着样品中CNS(人葡萄球菌)和金黄色葡萄球菌的浓度增加，对于含有人葡萄球菌或金黄色葡萄球菌的样品，观察到的Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率不保持恒定，而是随着样品浓度增加而降低。这表明Al lStaph-146abp探针(一种属探针)在比Sau-71p更低的浓度下达到饱和。因此，可以在低样品浓度下准确区分CNS与金黄色葡萄球菌的Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率截止值(例如，2)可能导致在高样品浓度下的不正确鉴定。
虽然观察到Al lStaph-146abp/Sau-71p信号比率随着样品浓度的增加而降低，但也观察到，在所有研究浓度下，对于CNS的Al lStaph-146abp/Sau-71p比率仍高于对于金黄色葡萄球菌的Al lStaph-146abp/Sau-71p比率。因此，在知道样品中靶序列的相对浓度的情况下，Al ls taph-146abp/Sau-71p信号比率的合适截止值可用于区分CNS与金黄色葡萄球菌，即使在高样品浓度下亦如此。发现属探针Al lStaph-146abp可用作计量探针以提供靶核酸浓度的相对测量。设计了用于鉴定CNS和金黄色葡萄球菌的规则，其说明了靶核酸浓度的相对测量：
用于CNS确定的规则：
(((Al lStaph-146abp≥0.2与Al lStaph-146abp/Sau-71p≥1.5))
或
((Al lStaph-146abp<0.2与Al lStaph-146abp/Sau-71p>3))
在上面述规则中，0.2的原始Al lStaph-146abp信号是阈值(其根据原始信号数据凭经验确定；参见，图17)。图17将含有金黄色葡萄球菌的样品的Al lStaph-146abp信号数据标绘在X轴上，Al lStaph-146abp/Sau-71信号比率标绘在Y轴上。选择阈值0.2，因为当AllStaph-146abp信号低于0.2时，观察到Al lStaph-146abp/Sau-71信号比率通常相对较高，而当Al lStaph-146abp信号高于0.2时，观察到Al lStaph-146abp/Sau-71信号比率相对较低。一旦选择了阈值0.2，指示CNS或金黄色葡萄球菌存在的Al lStaph-146abp/Sau-71信号比率的截止值就被选择在Al lStaph-146abp信号水平处于或高于0.2时使用，以及在AllStaph-146abp信号水平低于0.2时使用。选择截止值1.5(当Al lStaph-146abp信号大于或等于0.2时使用)和3(当Al lStaph-146信号小于0.2时使用)。用于选择阈值和截止值的数据如表3A-表3B所示。
在上述规则中，当来自Al lStaph-146abp的信号大于或等于阈值0.2(指示相对高浓度的靶核酸)时，当Al ls taph-146abp/Sau-71p的原始信号的比率大于或等于1.5时，确定存在CNS如果该比值小于1.5，则确定存在金黄色葡萄球菌。当来自Al lStaph-146abp的信号小于0.2(表明靶核酸的浓度相对较低)时，当AllStaph-146abp/Sau-71p的原始信号的比率大于3时，确定样品中存在CNS；如果该比率小于或等于3，则确定存在金黄色葡萄球菌。
因此，上述式代表第一式(AllStaph-146abp/Sau-71p≥1.5)与第二式(AllStaph-146abp/Sau-71p>3)的组合，其中AllStaph-146abp的信号(具体地说，信号与阈值比较的方式)决定使用哪个式来鉴定含有CNS或金黄色葡萄球菌的样品。与仅基于单一AllStaph-146abp/Sau-71p信号比率截止值的式相比，使用说明样品中靶核酸的相对浓度的式可以提高CNS和金黄色葡萄球菌鉴定的准确性。
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8.具体实施方案
本公开通过下面的具体实施方案来举例说明。
1.一种检测具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的同属第二微生物是否存在于测试样品中或从其制备测试样品的初始样品中的方法，其包括：
(a)用包含多种探针分子的虚拟探针探测测试样品，其中：
(i)所述虚拟探针包含至少两种探针分子，每种探针分子能够与对应于所述第一基因组的一种或多种靶核酸和/或对应于所述第二基因组的一种或多种同源靶核酸特异性杂交，
(ii)至少一种所述探针分子是计量探针，所述计量探针能够与对应于所述第一基因组的靶核酸和对应于所述第二基因组的同源靶核酸杂交，使得所述计量探针与此类靶核酸的杂交可以测量所述测试样品中靶核酸的相对量，
(iii)所述虚拟探针的探针分子不能单独区分对应于所述第一基因组和所述第二基因组的靶核酸，并且
(iv)所述探针分子与对应于第一基因组和第二基因组的靶核酸非等同地杂交，使得探针分子与对应于第一基因组和第二基因组的靶核酸的杂交可以区分对应于第一基因组与第二基因组的靶核酸；
(b)检测和/或定量来自虚拟探针中的探针分子与测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号；以及
(c)如果检测到探针分子与测试样品中的核酸杂交，则：
(i)如果来自计量探针与样品中核酸杂交的信号大于或等于阈值，则根据第一式分析步骤(b)中检测和/或定量的信号，以及
(ii)如果来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号小于阈值，则根据第二式分析步骤(b)中检测和/或定量的信号。
2.实施方案1的方法，其中来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号是原始信号。
3.实施方案1的方法，其中来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号是归一化的信号。
4.实施方案1至3中任一项的方法，其中计量探针是属探针。
5.实施方案1至4中任一项的方法，其中对应于第一基因组的一种或多种靶核酸是第一扩增子组，对应于第二基因组的一种或多种靶核酸是第二扩增子组，并且其中虚拟探针中的每种探针分子能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子非等同地杂交，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可以区分所述第一扩增子组与所述第二扩增子组。
6.实施方案5的方法，其还包括通过使用能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增的PCR引物对初始样品进行PCR扩增反应来制备测试样品，当第一基因组和第二基因组存在于初始样品中时，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组。
7.实施方案6的方法，其中PCR引物包含不止一个引物对，并且其中第一扩增子组包含多种第一扩增子和/或第二扩增子组包含多种第二扩增子。
8.实施方案5的方法，其还包括通过以下步骤制备测试样品：(a)使用第一组PCR引物对初始样品进行第一PCR扩增反应，所述第一组PCR引物能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，(b)使用第二组PCR引物对初始样品进行第二PCR扩增反应，所述第二组PCR引物不同于第一组PCR引物，并且能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，以及(c)当第一基因组和第二基因组存在于初始样品中时，组合在第一和第二PCR反应中产生的扩增子，分别产生包含多种第一扩增子的第一扩增子组和包含多种第二扩增子的第二扩增子组。
9.实施方案7或实施方案8的方法，其中多种第一扩增子对应于第一基因组中的不同区域，和/或多种第二扩增子对应于第二基因组中的不同区域。
10.实施方案6的方法，其中PCR引物包含单个引物对，并且第一扩增子组由单个第一扩增子组成，第二扩增子组由单个第二扩增子组成。
11.实施方案10的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列和第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子的区域中具有至少1个核苷酸错配。
12.实施方案10的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列和第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子区域中具有至少2个核苷酸错配。
13.实施方案10的方法，其中第一扩增子的核苷酸序列和第二扩增子的核苷酸序列在能够与虚拟探针中的至少一种探针分子杂交的扩增子区域中具有至少3个核苷酸错配。
14.实施方案6至13中任一项的方法，其中所述PCR扩增反应将产生可测量信号的标记物掺入由所述反应产生的任何扩增子中。
15.实施方案6至14中任一项的方法，其中引物被标记。
16.实施方案15的方法，其中至少一种引物被5’荧光标记。
17.实施方案15的方法，其中不止一种引物被5’荧光标记。
18.实施方案6至17中任一项的方法，其中PCR反应包括荧光标记的脱氧核苷酸。
19.实施方案1至18中任一项的方法，其中每种探针分子包含与第一基因组和/或第二基因组中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列。
20.实施方案1至19中任一项的方法，其中虚拟探针包含彼此相对具有1个或多个核苷酸错配的两种探针分子。
21.实施方案20的方法，其中虚拟探针包含彼此相对具有1个核苷酸错配的两种探针分子。
22.实施方案20的方法，其中虚拟探针包含彼此相对具有2个核苷酸错配的探针分子。
23.实施方案1至22中任一项的方法，其中虚拟探针的探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子，各自位于阵列上的离散位置。
24.实施方案23的方法，其中检测和/或定量来自虚拟探针中的探针分子与测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号包括检测和/或定量虚拟探针中的探针分子位置处的标记。
25.实施方案23或实施方案24的方法，其中步骤(b)包括：
(i)将PCR扩增产物与阵列接触；
(ii)从阵列中洗去未结合的核酸分子；以及
(iii)测量阵列上每个探针分子位置处标记的信号强度。
26.实施方案23至25中任一项的方法，其中阵列包含一种或多种对照探针分子。
27.实施方案23至26中任一项的方法，其中探针分子是寡核苷酸探针分子。
28.实施方案27的方法，其中一种或多种探针分子具有多聚胸苷尾。
29.实施方案27的方法，其中多聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
30.实施方案29的方法，其中多聚胸苷尾是15聚体。
31.实施方案6至22中任一项的方法，PCR扩增反应是实时PCR扩增反应。
32.实施方案31的方法，其中：
(a)每种探针分子包含可区分的标记物和淬灭剂部分，当标记物和淬灭剂部分都附接于探针时，淬灭剂部分抑制标记物的检测；
(b)在实时PCR扩增反应过程中，当探针分子被切割时，标记物产生可测量的信号；以及
(c)每种标记物彼此是可区分的。
33.实施例32的方法，其中标记物是荧光标记物。
34.实施方案5至33中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
35.实施方案5至34中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
36.实施方案1至35中任一项的方法，其中第一微生物和第二微生物是同一组的成员。
37.实施方案1至36中任一项的方法，其中一种或多种微生物是人病原体或动物病原体。
38.实施方案36至37中任一项的方法，其中微生物是细菌、病毒或真菌。
39.实施例36至38中任一项的方法，其中微生物是细菌。
40.实施方案39的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16SrRNA基因的核苷酸序列和/或对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
41.实施方案40的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16SrRNA基因的核苷酸序列。
42.实施方案40或实施方案41的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
43.实施方案39至42中任一项的方法，其中第一扩增子组和第二扩增子组各自包含对应于16S-23S基因间间隔区的核苷酸序列。
44.实施方案1至43中任一项的方法，其中第一式通过(i)一个或多个布尔运算符、(ii)一个或多个关系运算符、(iii)一个或多个信号比率或(iv)(i)-(iii)的任意组合来组合来自探针分子与靶核酸杂交的信号。
45.实施方案1至44中任一项的方法，其中第二式通过(i)一个或多个布尔运算符、(ii)一个或多个关系运算符、(iii)一个或多个信号比率或(iv)(i)-(iii)的任意组合来组合来自探针分子与靶核酸杂交的信号。
46.实施方案44或实施方案45的方法，其中每个布尔运算符独立地选自“与”、“或”和“非”。
47.实施方案44至46中任一项的方法，其中每个关系运算符独立地选自“大于”(“>”)、“小于”(“<”)、“大于或等于”(“≥”)和“小于或等于”(“≤”)。
48.实施方案44至46中任一项的方法，其中在第一式和/或第二式中，通过一个或多个布尔运算符组合信号。
49.实施方案44至48中任一项的方法，其中在第一式和/或第二式中，通过一个或多个关系运算符组合信号。
50.实施方案44至49中任一项的方法，其中在第一式和/或第二式中，通过一个或多个信号比率来组合信号。
51.实施方案1至50中任一项的方法，其中虚拟探针包含两种探针分子或由两种探针分子组成。
52.实施方案51的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第一扩增子组中的第一扩增子)和第二靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子，和(i i)能够与第二靶核酸但非第一靶核酸特异性杂交的第二探针分子。
53.实施方案52的方法，其中第一探针是计量探针。
54.实施方案51的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第一扩增子组中的第一扩增子)和第二靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子，和(i i)能够与第一靶核酸和第二靶核酸特异性杂交的第二探针分子。
55.实施方案54的方法，其中第一探针是计量探针。
56.实施方案1至55中任一项的方法，其中虚拟探针包含第一探针和第二探针，并且其中第一式和第二式以信号比率组合来自第一探针和第二探针的信号。
57.实施方案56的方法，其中第一式和第二式各自将信号比率与预定截止值进行比较，其中第一式的截止值和第二式的截止值不同。
58.实施方案1至57中任一项的方法，其中所述第一微生物是凝固酶阴性葡萄球菌属种(CNS)，第二微生物是凝固酶阳性葡萄球菌属种(CPS)。
59.实施方案58的方法，其中第二微生物是金黄色葡萄球菌。
60.实施方案58或实施方案59中任一项的方法，其中虚拟探针包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列的探针分子。
61.实施方案60的方法，其中具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列的探针分子是计量探针。
62.实施方案61所述的方法，其中阈值是0.2。
63.实施方案58至62中任一项的方法，其中虚拟探针包含具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列的探针分子。
64.实施方案63的方法，其中虚拟探针包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列的第一探针分子和具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ IDNO:2)的核苷酸序列的第二探针分子，其中第一式和第二式以信号比率组合来自第一探针和第二探针的信号。
65.实施方案64的方法，其中信号比率是第一探针的信号除以第二探针的信号。
66.实施方案64或实施方案65的方法，其中第一式和第二式各自将信号比率与预定截止值进行比较，其中第一式的截止值与第二式的截止值不同。
67.实施方案66的方法，其包括当来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号大于或等于阈值时，当信号比率大于或等于第一式的截止值时，确定样品中存在CNS。
68.实施方案66或实施方案67的方法，其包括当来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号小于阈值时，当信号比率大于第二式的截止值时，确定样品中存在CNS。
69.实施方案66至68中任一项的方法，其包括当来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号大于或等于阈值时，当信号比率小于第一式的截止值时，确定样品中存在CPS。
70.实施方案66至69中任一项的方法，其包括当来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号小于阈值时，当信号比率小于或等于第二式的截止值时，确定样品中存在CPS。
71.实施方案66至70中任一项的方法，其中第一式的截止值是1.5，第二式的截止值是3。
72.实施方案1至57中任一项的方法，其中第一微生物是戈登链球菌，第二种微生物是咽峡炎链球菌。
73.实施方案72的方法，其中虚拟探针包含具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列的探针分子。
74.实施方案73的方法，其中具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ IDNO:3)的核苷酸序列的探针分子是计量探针。
75.实施方案72至74中任一项的方法，其中虚拟探针包含具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列的探针分子。
76.实施方案1至57中任一项的方法，其中第一和第二微生物是肠杆菌科细菌。
77.实施方案76的方法，其中第一和第二微生物选自产气肠杆菌、阿氏肠杆菌和霍氏肠杆菌。
78.实施方案1至57中任一项的方法，其中第一微生物是缓症链球菌，第二微生物是肺炎链球菌
79.实施方案78的方法，其中虚拟探针包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列的探针分子。
80.实施方案78至79中任一项的方法，其中虚拟探针包含具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列的探针分子。
81.实施方案80的方法，其中具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列的探针分子是计量探针。
82.实施方案1至57中任一项的方法，其中虚拟探针包含三种探针分子或由三种探针分子组成。
83.实施方案82的方法，其中虚拟探针包含(i)能够与第一靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第一扩增子组中的第一扩增子)和第二靶核酸(例如，当靶核酸是PCR产物时为第二扩增子组中的第二扩增子)特异性杂交的第一探针分子，(ii)不同于第一探针分子并能与第一和第二靶核酸特异性杂交的第二探针分子，和(iii)不同于第一和第二探针分子并能与第一和第二靶核酸特异性杂交的第三探针分子。
84.实施方案78至83中任一项的方法，其中第一微生物是缓症链球菌，第二微生物是肺炎链球菌。
85.实施方案84的方法，其中虚拟探针包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列的探针分子。
86.实施方案84或实施方案85的方法，其中虚拟探针包含具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列的探针分子。
87.实施方案84至86中任一项的方法，其中虚拟探针包含具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列的探针分子。
88.实施方案87的方法，其中具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列的探针分子是计量探针。
89.实施方案6至88中任一项的方法，其中选择PCR条件，使得PCR扩增产物的长度为300至800个核苷酸。
90.实施方案89的方法，其中选择PCR条件，使得PCR扩增产物的长度为400至600个核苷酸。
91.实施方案36至90中任一项的方法，其中初始样品或测试样品有被一种或多种微生物感染的风险。
92.实施方案36至91中任一项的方法，其中初始样品或测试样品被怀疑感染了一种或多种微生物。
93.实施方案1至92中任一项的方法，其中初始样品或测试样品是生物样品、环境样品或食品。
94.实施方案93的方法，其中初始样品或测试样品是选自以下的生物样品：血液、血清、唾液、尿、胃液、消化液、眼泪、粪便、精液、阴道液、间质液、源自肿瘤组织的液体、眼液、汗液、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼吸、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、获自鼻拭子的液体、获自鼻咽洗液的液体、脑脊液、组织样品、获自咽拭子的液体或组织、获自伤口拭子的液体或组织、活检组织、胎盘液、羊水、腹膜透析液、脐带血、淋巴液、体腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、母乳或从前述任何物质中加工、提取或分级分离的样品。
95.实施方案94的方法，其中生物样品是：
(a)尿液、痰或从尿液中加工、提取或分级分离的样品；
(b)痰或从痰中加工、提取或分级分离的样品；
(c)伤口拭子或从伤口拭子处理、提取或分级分离的样品；
(d)血液或从血液中加工、提取或分级分离的样品；或
(e)腹膜透析液或从腹膜透析液中加工、提取或分级分离的样品。
96.实施方案93的方法，其中初始样品或测试样品是选自土壤、地下水、地表水、废水的环境样品，或从任何前述物质中加工、提取或分级分离的样品。
97.实施方案1至96中任一项的方法，其中步骤(c)是计算机实施的，并且其中步骤(c)包括在具有一个或多个处理器的计算机系统中执行一个或多个计算机可读指令，所述一个或多个处理器耦合到存储由所述一个或多个处理器执行的所述一个或多个计算机可读指令的存储器，所述计算机可读指令包括用于以下的指令：(i)接收来自虚拟探针中的探针分子与测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号数据，以及(i i)如果来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号数据大于或等于阈值，则根据所述第一式分析信号数据，以及如果来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号小于阈值，则根据所述第二式分析信号数据。
98.实施方案97的方法，还包括向用户提供通知，其中该通知任选地涉及测试样品中第一微生物和/或第二微生物的存在或不存在。
99.一种可寻址阵列，其包括：
(a)用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列的一种或多种虚拟探针，每种虚拟探针包含一组位置可寻址的寡核苷酸探针分子，每个探针分子位于阵列上的离散位置，其中一种或多种虚拟探针中的每种探针分子包含与第一基因组序列或第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列，其中一种或多种所述寡核苷酸探针分子是计量探针；和
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
100.实施方案99的可寻址阵列，其中一种或多种计量探针是属探针。
101.实施方案99或实施方案100的可寻址阵列，其包含至少两种虚拟探针。
102.实施方案99或实施方案100的可寻址阵列，其包含至少三种虚拟探针。
103.实施方案99或实施方案100的可寻址阵列，其包含至少四种虚拟探针。
104.实施方案99或实施方案100的可寻址阵列，其包含至少五种虚拟探针。
105.实施方案99或实施方案100的可寻址阵列，其包含至少十种虚拟探针。
106.实施方案99至104中任一项的可寻址阵列，其包含多达十种虚拟探针。
107.实施方案99至105中任一项的可寻址阵列，其包含多达十五种虚拟探针。
108.实施方案99至107中任一项的可寻址阵列，其中每种虚拟探针包含计量探针。
109.实施方案99至108中任一项的可寻址阵列，其中每种虚拟探针包含2-4种寡核苷酸探针分子。
110.实施方案109的可寻址阵列，其中每种虚拟探针包含2-3种寡核苷酸探针分子。
111.实施方案99至110中任一项的可寻址阵列，其包含12种或更多种探针分子。
112.实施方案111的可寻址阵列，其包含12至100种探针分子。
113.实施方案111的可寻址阵列，其包含12至50种探针分子。
114.实施方案111的可寻址阵列，其包含25至75种探针分子。
115.实施方案111的可寻址阵列，其包含50至100种探针分子。
116.实施方案111的可寻址阵列，其包含12种探针分子。
117.实施方案111的可寻址阵列，其包含14种探针分子。
118.实施方案111的可寻址阵列，其包含84种探针分子。
119.实施方案99至118中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列分别是来自第一微生物和第二微生物的基因组序列。
120.实施方案119的可寻址阵列，其中微生物是相同属的成员。
121.实施方案120的可寻址阵列，其中微生物是同一群的成员。
122.实施方案99至121中任一项的可寻址阵列，其中一种或多种探针分子包含多聚胸苷尾。
123.实施方案122的可寻址阵列，其中多聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
124.实施方案123的可寻址阵列，其中多聚胸苷尾是15聚体。
125.实施方案99至124中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
126.实施方案125的可寻址阵列，其中编码rRNA的基因是16SrRNA基因或23S rRNA基因。
127.实施方案99至124中任一项的可寻址阵列，其中第一基因组序列和第二基因组序列各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
128.实施方案99至127中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分真细菌物种的基因组序列与非真细菌物种的微生物的基因组序列的探针分子。
129.实施方案99至128中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自革兰阳性细菌的基因组序列与来自革兰阴性细菌的基因组序列的探针分子。
130.实施方案99至129中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自不同目的微生物的基因组序列的探针分子。
131.实施方案99至130中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自不同科的微生物的基因组序列的探针分子。
132.实施方案99至131中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自不同属的微生物的基因组序列的探针分子。
133.实施方案99至132中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自不同群的微生物的基因组序列的探针分子。
134.实施方案99至133中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含用于区分来自不同种的微生物的基因组序列的探针分子。
135.实施方案99至134中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的探针分子。
136.实施方案99至135中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的探针分子。
137.实施方案99至136中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的探针分子。
138.实施方案99至137中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的探针分子。
139.实施方案99至138中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的探针分子。
140.实施方案99至139中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的探针分子。
141.实施方案99至140中任一项的可寻址阵列，其中至少一种虚拟探针包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQ ID NO:7)的探针分子。
142.一种检测测试样品或所述测试样品所源自的初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的相同属的第二微生物的方法，所述方法包括：
(a)用实施方案99至141中任一项的阵列探测测试样品，所述阵列包含含有两种或更多种探针分子的虚拟探针，其中：
(i)每种探针分子能够与一种或多种对应于第一基因组的靶核酸和/或一种或多种对应于所述第二基因组的同源靶核酸特异性杂交，
(ii)虚拟探针的至少一种探针分子是计量探针，其能够与对应于第一基因组的靶核酸和对应于第二基因组的同源靶核酸杂交，使得计量探针与此类靶核酸的杂交可以测量测试样品中靶核酸的相对量，
(iii)虚拟探针的探针分子不能单独区分对应于第一基因组和第二基因组的靶核酸；以及
(iv)探针分子与对应于第一基因组和第二基因组的靶核酸非等同地杂交，使得探针分子与对应于第一基因组和第二基因组的一种或多种靶核酸的杂交可以区分对应于第一基因组的靶核酸与对应于第二基因组的靶核酸；
(b)从阵列中洗去未结合的核酸分子；
(c)检测和/或定量阵列上每个探针分子位置处的信号；以及
(d)如果信号表明：
(i)与阵列的探针分子杂交的靶核酸存在于测试样品中，则分析信号以确定样品中是否存在对应于第一基因组的靶核酸或对应于第二基因组的靶核酸，从而确定第一生物体或第二生物体是否存在于初始样品或测试样品中；或者
(ii)在步骤(a)中没有产生与虚拟探针的探针分子杂交的靶产物，确定该初始样品或测试样品不包含第一生物体或第二生物体。
143.实施方案142的方法，其中步骤(d)的分析(i)包括(i)如果来自计量探针的信号大于或等于阈值，则根据第一式分析步骤(c)中检测和/或定量的信号，以及(i i)如果来自计量探针的信号小于阈值，则根据第二式分析步骤(c)中检测和/或定量的信号。
144.实施方案142或实施方案143的方法，其中对应于第一基因组的一种或多种靶核酸是第一扩增子组，对应于第二基因组的一种或多种靶核酸是第二扩增子组，并且其中虚拟探针中的每种探针分子能够与第一扩增子组和/或第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中探针分子与第一扩增子组中的扩增子和第二扩增子组中的扩增子非等同地杂交，使得探针分子与第一扩增子组和第二扩增子组中的扩增子的杂交可以区分所述第一扩增子组与所述第二扩增子组。
145.实施方案144的方法，其还包括通过使用PCR引物对初始样品进行PCR扩增反应来制备测试样品，所述PCR引物能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，当样品中存在第一基因组和第二基因组时，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组。
146.实施方案142至145中任一项的方法，其中步骤(d)是计算机实施的，并且其中步骤(d)包括在具有一个或多个处理器的计算机系统中执行一个或多个计算机可读指令，所述一个或多个处理器耦合到存储由所述一个或多个处理器执行的所述一个或多个计算机可读指令的存储器，所述计算机可读指令包括用于以下的指令：(i)接收来自虚拟探针中的探针分子与测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号数据，以及(i i)如果来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号数据大于或等于阈值，则根据所述第一式分析信号数据，以及如果来自计量探针与样品中的核酸杂交的信号小于阈值，则根据所述第二式分析信号数据。
147.实施方案146的方法，还包括向用户提供通知，其中该通知任选地涉及测试样品中第一微生物和/或第二微生物的存在或不存在。
148.一种系统，其包括：
(a)光学读取器，其用于为实施方案99至141中任一项的阵列的每个探针分子位置产生信号数据；和
(b)一个或多个处理器，其中：
(i)至少一个处理器被配置成从光学读取器接收信号数据；
(ii)至少一个处理器被配置为分析一种或多种虚拟探针的信号数据，所述信号数据是在虚拟探针中的探针分子与测试样品中的核酸分子(如果存在的话)杂交之后产生的，任选地，其中所述分析包括确定测试样品是否包含第一基因组序列和/或第二基因组序列；和
(iii)至少一个处理器具有到存储或显示设备或网络的接口，用于输出所述分析的结果。
149.实施方案148的系统，其包括能够激发阵列上的荧光标记分子的光源。
150.实施方案148或实施方案149的系统，其还包括能够将PCR扩增反应的产物添加到阵列中且能够从所述阵列中洗去未结合的核酸分子的平板搬运机器人。
151.实施方案1至98和142至147中任一项的方法，其使用实施方案148至150中任一项的系统来执行。
152.一种用于制备用于检测初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的相同属的第二微生物的测试样品的方法，其包括：
(a)使用PCR引物对初始样品进行PCR扩增反应，所述PCR引物能够与第一基因组和第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，当第一基因组和第二基因组存在于所述初始样品中时，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组；
(b)将步骤(a)的PCR扩增产物与根据实施方案99至141中任一项的阵列接触，所述阵列包含用于区分第一微生物的第一基因组序列与第二微生物的第二同源基因组序列的虚拟探针，其中虚拟探针包含计量探针；以及
(c)从所述阵列中洗去未结合的核酸分子。
153.实施方案152的方法，其还包括
(d)检测和/或定量阵列上每个探针分子位置处的信号；以及
(e)如果检测到探针分子与测试样品中的核酸杂交，则：
(i)如果来自计量探针的信号大于或等于阈值，则根据第一式分析在步骤(d)中检测和/或定量的信号，以及
(i i)如果来自计量探针的信号小于阈值，则根据第二式分析在步骤(d)中检测和/或量化的信号。
154.实施方案152至153中任一项的方法，其中选择PCR条件，使得PCR扩增产物的长度为300至800个核苷酸。
155.实施方案154的方法，其中选择PCR条件，使得PCR扩增产物的长度为400至600个核苷酸。
156.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)。
157.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ IDNO:2)。
158.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)。
159.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQID NO:4)。
160.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQID NO:5)。
161.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQID NO:6)。
162.一种寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQID NO:7)。
163.实施方案156至162中任一项的寡核苷酸探针分子，其包含多聚胸苷尾。
164.实施方案163的寡核苷酸探针分子，其中多聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
165.实施方案164的寡核苷酸探针分子，其中多聚胸苷尾是15聚体。
166.实施方案156至165中任一项的寡核苷酸探针分子，其包含标记物。
167.一种包含多种寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，并且虚拟探针中的另一种寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列。
168.一种包含多种寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列，并且虚拟探针中的另一种寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列。
169.一种包含多种寡核苷酸探针分子的虚拟探针，其中虚拟探针中的至少一种寡核苷酸探针分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列，虚拟探针中的另一种寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列，以及虚拟探针中的另一种寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA(SEQID NO:7)的核苷酸序列。
170.实施方案167至169中任一项的虚拟探针，其中每种寡核苷酸探针分子包含多聚胸苷尾。
171.实施方案170的虚拟探针，其中多聚胸苷尾是10聚体至20聚体。
172.实施方案171的虚拟探针，其中多聚胸苷尾是15聚体。
173.一种可寻址阵列，其包括：
(a)一组位置可寻址的探针分子，每个探针分子位于阵列上的离散位置，其中该组探针分子包含实施方案156至166中任一项的寡核苷酸探针分子；和
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
174.包含实施方案167至172中任一项的虚拟探针的可寻址阵列，其中虚拟探针中的每种探针分子位于阵列中的离散位置。
175.实施方案174的可寻址阵列，其还包含一种或多种对照探针分子。
176.包含两种或更多种探针分子的试剂盒，所述探针分子选自其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQID NO:7的探针分子。
177.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸探针分子。
178.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸探针分子。
179.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的寡核苷酸探针分子，其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸探针分子，和其核苷酸序列包含SEQ IDNO:7的寡核苷酸探针分子。
180.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ IDNO:3的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸探针分子。
181.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸探针分子。
182.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ IDNO:5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸探针分子。
183.实施方案176的试剂盒，其包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ IDNO:3的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的寡核苷酸探针分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸探针分子和其核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的寡核苷酸探针分子。
184.实施方案176至183中任一项的试剂盒，其中探针分子被标记。
185.实施方案184的试剂盒，其中探针分子用荧光标记物进行标记。
186.实施方案176至183中任一项的试剂盒，其中探针分子未被标记。
187.实施方案176至186中任一项的试剂盒，其还包含能够扩增第一基因组序列和第二同源基因组序列的一个或多个PCR引物对。
9.参考文献的引用
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的据此通过引用以其整体并入，在此全部引入作为参考，其程度如同每个单独出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的单独地表示为通过引用并入。在并入本文的一个或多个参考文献的教导与本公开内容之间存在不一致的情况下，则打算使用本说明书的教导。
序列表
<110> 保障生物系统控股有限公司
<120> 基因组序列的改进的检测及其探针分子
<130> SGB-009WO
<150> 63/139,643
<151> 2021-01-20
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AllStaph-146abp
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ccagtcttat aggtaggtta yccacg 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sau-71p
<400> 2
gcttctcgtc cgttcgctcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Stango 85p
<400> 3
cagtctatgg tgtagcaagc tacggtat 28
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 4
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gatgcaagtg caccttttaa gcaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Spneu-229bp
<400> 7
gatgcaagtg caccttttaa gtaa 24
Claims (46)
1.一种检测具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的同属第二微生物是否存在于测试样品中或从其制备测试样品的初始样品中的方法，其包括：
(a)用包含多种探针分子的虚拟探针探测所述测试样品，其中：
(i)所述虚拟探针包含至少两种探针分子，每种探针分子能够与对应于所述第一基因组的一种或多种靶核酸和/或对应于所述第二基因组的一种或多种同源靶核酸特异性杂交，
(ii)至少一种所述探针分子是计量探针，所述计量探针能够与对应于所述第一基因组的靶核酸和对应于所述第二基因组的同源靶核酸杂交，使得所述计量探针与此类靶核酸的杂交可以提供在所述测试样品中靶核酸的相对量的测量，
(iii)所述虚拟探针的探针分子不能单独区分对应于所述第一基因组和所述第二基因组的靶核酸，并且
(iv)所述探针分子与对应于所述第一基因组和所述第二基因组的靶核酸非等同地杂交，使得所述探针分子与对应于所述第一基因组和所述第二基因组的所述靶核酸的杂交可以区分对应于所述第一基因组与所述第二基因组的所述靶核酸；
(b)检测和/或定量来自所述虚拟探针中的所述探针分子与所述测试样品中如果存在的核酸杂交的信号；以及
(c)如果检测到所述探针分子与所述测试样品中的核酸的杂交，则：
(i)如果来自所述计量探针与所述样品中核酸杂交的信号大于或等于阈值，则根据第一式分析步骤(b)中检测和/或定量的信号，以及
(ii)如果来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号小于所述阈值，则根据第二式分析步骤(b)中检测和/或定量的信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号是原始信号。
3.如权利要求1所述的方法，其中来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号是归一化的信号。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述计量探针是属探针。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中对应于所述第一基因组的所述一种或多种靶核酸是第一扩增子组，对应于所述第二基因组的所述一种或多种靶核酸是第二扩增子组，并且其中所述虚拟探针中的每种探针分子能够与所述第一扩增子组和/或所述第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中所述探针分子与所述第一扩增子组中的扩增子和所述第二扩增子组中的扩增子非等同地杂交，使得所述探针分子与所述第一扩增子组和所述第二扩增子组中的扩增子的杂交可以区分所述第一扩增子组与所述第二扩增子组。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括通过使用能够与所述第一基因组和所述第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增的PCR引物对所述初始样品进行PCR扩增反应来制备所述测试样品，当所述第一基因组和所述第二基因组存在于所述初始样品中时，分别产生所述第一扩增子组和所述第二扩增子组。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述虚拟探针的探针分子是存在于阵列上的位置可寻址的探针分子，每个探针分子位于所述阵列上的离散位置。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤(b)包括：
(i)将PCR扩增产物与所述阵列接触；
(ii)从所述阵列中洗去未结合的核酸分子；以及
(iii)测量所述阵列上每个探针分子位置处标记的信号强度。
9.如权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于编码rRNA的基因的核苷酸序列。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于rRNA基因之间的基因间间隔区的核苷酸序列。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一微生物和所述第二微生物是相同群的成员。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中一种或多种所述微生物是人病原体或动物病原体。
13.如权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌、病毒或真菌。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于16S rRNA基因的核苷酸序列和/或对应于23S rRNA基因的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述第一扩增子组和所述第二扩增子组各自包含对应于16S rRNA基因的核苷酸序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一式通过(i)一个或多个布尔运算符、(ii)一个或多个关系运算符、(iii)一个或多个信号比率或(iv)(i)-(iii)的任意组合来组合来自所述探针分子与靶核酸杂交的信号。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第二式通过(i)一个或多个布尔运算符、(ii)一个或多个关系运算符、(iii)一个或多个信号比率或(iv)(i)-(iii)的任意组合来组合来自所述探针分子与靶核酸杂交的信号。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述虚拟探针包含两种探针分子或由两种探针分子组成。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述第一微生物是凝固酶阴性葡萄球菌属种(CNS)并且所述第二微生物是凝固酶阳性葡萄球菌属种(CPS)。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第二微生物是金黄色葡萄球菌。
22.如权利要求20或权利要求21中任一项所述的方法，其中所述虚拟探针包含探针分子，所述探针分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ IDNO:1)的核苷酸序列的所述探针分子是计量探针。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述虚拟探针包含具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列的探针分子。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述虚拟探针包含具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列的第一探针分子和具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列的第二探针分子，其中所述第一式和所述第二式以信号比率组合来自所述第一探针和所述第二探针的信号。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一式和所述第二式各自将所述信号比率与预定截止值进行比较，其中所述第一式的截止值和所述第二式的截止值不同。
27.如权利要求26所述的方法，其包括当来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号大于或等于所述阈值时，当所述信号比率大于或等于所述第一式的截止值时，确定所述样品中存在CNS。
28.如权利要求26或27所述的方法，其包括当来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号小于所述阈值时，当所述信号比率大于所述第二式的截止值时，确定所述样品中存在CNS。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其包括当来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号大于或等于所述阈值时，当所述信号比率小于所述第一式的截止值时，确定所述样品中存在CPS。
30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其包括当来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号小于所述阈值时，当所述信号比率小于或等于所述第二式的截止值时，确定所述样品中存在CPS。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述初始样品或测试样品是生物样品、环境样品或食品。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述样品是血液或从血液中加工、提取或分级分离的样品。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中步骤(c)是计算机实施的，并且其中步骤(c)包括在具有一个或多个处理器的计算机系统中执行一个或多个计算机可读指令，所述一个或多个处理器耦合到存储由所述一个或多个处理器执行的所述一个或多个计算机可读指令的存储器，所述计算机可读指令包括用于以下的指令：(i)接收来自所述虚拟探针中的探针分子与所述测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号数据，以及(ii)如果来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号数据大于或等于阈值，则根据所述第一式分析所述信号数据，以及如果来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号小于所述阈值，则根据所述第二式分析所述信号数据。
34.如权利要求33所述的方法，所述方法还包括向用户提供通知，其中所述通知任选地涉及所述测试样品中存在或不存在所述第一微生物和/或所述第二微生物。
35.一种可寻址阵列，其包括：
(a)用于区分第一基因组序列与第二同源基因组序列的一种或多种虚拟探针，每种虚拟探针包含一组位置可寻址的寡核苷酸探针分子，每个探针分子位于所述阵列上的离散位置，其中所述一种或多种虚拟探针中的每种探针分子包含与所述第一基因组序列或所述第二基因组序列中的15至40个连续核苷酸90％至100％互补的核苷酸序列，其中一种或多种所述寡核苷酸探针分子是计量探针；和
(b)任选地，一种或多种对照探针分子。
36.一种检测测试样品或所述测试样品所源自的初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的相同属的第二微生物的方法，所述方法包括：
(a)用根据权利要求35的阵列探测所述测试样品，所述阵列包含含有两种或更多种探针分子的虚拟探针，其中：
(i)每种探针分子能够与对应于所述第一基因组的一种或多种靶核酸和/或对应于所述第二基因组的一种或多种同源靶核酸特异性杂交，
(ii)所述虚拟探针的至少一种探针分子是计量探针，其能够与对应于所述第一基因组的靶核酸和对应于所述第二基因组的同源靶核酸杂交，使得所述计量探针与此类靶核酸的杂交可以测量所述测试样品中靶核酸的相对量，
(iii)虚拟探针的探针分子不能单独区分对应于所述第一基因组和所述第二基因组的靶核酸；以及
(iv)所述探针分子与对应于所述第一基因组和所述第二基因组的靶核酸非等同地杂交，使得所述探针分子与对应于所述第一基因组和所述第二基因组的所述一种或多种靶核酸的杂交可以区分对应于所述第一基因组的靶核酸与对应于所述第二基因组的靶核酸；
(b)从所述阵列中洗去未结合的核酸分子；
(c)检测和/或定量所述阵列上每个探针分子位置处的信号；以及
(d)如果所述信号表明：
(i)与所述阵列的探针分子杂交的靶核酸存在于所述测试样品中，则分析所述信号以确定所述样品中是否存在对应于所述第一基因组的靶核酸或对应于所述第二基因组的靶核酸，从而确定所述第一生物体或所述第二生物体是否存在于所述初始样品或所述测试样品中；或者
(ii)在步骤(a)中没有产生与所述虚拟探针的探针分子杂交的靶产物，确定该初始样品或测试样品不包含所述第一生物体或所述第二生物体。
37.如权利要求36所述的方法，其中步骤(d)的分析(i)包括(i)如果来自所述计量探针的信号大于或等于所述阈值，则根据第一式分析步骤(c)中检测和/或定量的信号，以及(ii)如果来自所述计量探针的信号小于所述阈值，则根据第二式分析步骤(c)中检测和/或定量的信号。
38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中对应于所述第一基因组的所述一种或多种靶核酸是第一扩增子组，对应于所述第二基因组的所述一种或多种靶核酸是第二扩增子组，并且其中所述虚拟探针中的每种探针分子能够与所述第一扩增子组和/或所述第二扩增子组中的一种或多种扩增子特异性杂交，并且其中所述探针分子与所述第一扩增子组中的扩增子和所述第二扩增子组中的扩增子非同等地杂交，使得所述探针分子与所述第一扩增子组中的扩增子和所述第二扩增子组中的扩增子的杂交可以区分所述第一扩增子组与所述第二扩增子组。
39.如权利要求38所述的方法，其还包括通过使用PCR引物对所述初始样品进行PCR扩增反应来制备所述测试样品，所述PCR引物能够与所述第一基因组和所述第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，当所述样品中存在所述第一基因组和所述第二基因组时，分别产生所述第一扩增子组和所述第二扩增子组。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中步骤(d)是计算机实施的，并且其中步骤(d)包括在具有一个或多个处理器的计算机系统中执行一个或多个计算机可读指令，所述一个或多个处理器耦合到存储由所述一个或多个处理器执行的所述一个或多个计算机可读指令的存储器，所述计算机可读指令包括用于以下的指令：(i)接收来自所述虚拟探针中的探针分子与所述测试样品中的核酸(如果有的话)杂交的信号数据，以及(ii)如果来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号数据大于或等于阈值，则根据所述第一式分析所述信号数据，以及如果来自所述计量探针与所述样品中的核酸杂交的信号小于所述阈值，则根据所述第二式分析所述信号数据。
41.如权利要求40所述的方法，所述方法还包括向用户提供通知，其中所述通知任选地涉及所述测试样品中存在或不存在所述第一微生物和/或所述第二微生物。
42.一种系统，其包括：
(a)光学读取器，其用于为权利要求35的阵列的每个探针分子位置产生信号数据；和
(b)一个或多个处理器，其中：
(i)至少一个所述处理器被配置成从所述光学读取器接收信号数据；
(ii)至少一个所述处理器被配置为分析所述一种或多种虚拟探针的信号数据，所述信号数据是在所述虚拟探针中的探针分子与所述测试样品中的核酸分子(如果存在的话)杂交之后产生的，任选地，其中所述分析包括确定所述测试样品是否包含所述第一基因组序列和/或所述第二基因组序列；和
(iii)至少一个所述处理器具有到存储或显示设备或网络的接口，用于输出所述分析的结果。
43.如权利要求42所述的系统，其包括能够激发所述阵列上的荧光标记分子的光源。
44.如权利要求42或权利要求43所述的系统，其还包括能够将PCR扩增反应的产物添加到所述阵列中且能够从所述阵列中洗去未结合的核酸分子的平板搬运机器人。
45.一种用于制备用于检测初始样品中是否存在具有第一基因组的第一微生物或具有第二基因组的相同属的第二微生物的测试样品的方法，其包括：
(a)使用PCR引物对所述初始样品进行PCR扩增反应，所述PCR引物能够与所述第一基因组和所述第二基因组两者杂交并从其启动PCR扩增，当所述第一基因组和所述第二基因组存在于所述初始样品中时，分别产生第一扩增子组和第二扩增子组；
(b)将步骤(a)的PCR扩增产物与根据权利要求35的阵列接触，所述阵列包含用于区分所述第一微生物的第一基因组序列与所述第二微生物的第二同源基因组序列的虚拟探针，其中所述虚拟探针包含计量探针；以及
(c)从所述阵列中洗去未结合的核酸分子。
46.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括
(f)检测和/或定量所述阵列上每个探针分子位置处的信号；以及
(g)如果检测到所述探针分子与所述测试样品中的核酸杂交，则：
(i)如果来自所述计量探针的信号大于或等于阈值，则根据第一式分析在步骤(d)中检测和/或定量的信号，以及
(ii)如果来自所述计量探针的信号小于所述阈值，则根据第二式分析在步骤(d)中检测和/或量化的信号。
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