BR102014008162A2 - método de identificação de espécies bacterianas e kit para o diagnóstico de bactérias - Google Patents

Abstract

método de identificação de especies bacterianas e kit para o diagnóstico de bactérias. a presente invenção demonstra o desenvolvimento de um método e um kit para o diagnóstico diterencial baseado em hrma para e identificação rápida de y. enterocolitica e y.pseudotuberculosis em amostras biológicas ou não baseado em análises diterenciais de snps presentes na sequência da subunidade do rna ribossomal, de coeficiente da sedimentação 16 (16s rrna).

Description

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES BACTERIANAS E KIT PARA O DIAGNÓSTICO DE BACTÉRIAS Campo da invenção: [1] A presente invenção descreve um método para identificar espécies bacterianas, mais especificamente, Yersinia enterocolitica e Yersinía pseudotuberculosis através de tipagem molecular de sequências especificas de ácido desoxirribonucleico, DNA, proporcionando um kit para o diagnóstico destes micro-organismos em amostras biológicas e não biológicas.

Antecedentes da invenção: [2] O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e, atualmente, é composto por 17 espécies que não fazem parte da microbiota humana, podendo ser contextualizadas como agentes agressores. De todas as espécies descritas, apenas três delas são comprovadamente patogênicas para o homem, e são Y. pestis, Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis.

[3] Como agentes infecciosos em humanos e outros mamíferos, Y. pestis causa uma infecção sistêmica grave e potencialmente fatal, conhecida como "peste" e as espécies Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis causam gastroenterite. As demais espécies, com exceção de Y. ruckeri, que causa infecções em peixes, são consideradas ambientais e, usualmente, não patogênicas. Ressalta-se que Y. enterocolitica é a espécie mais comumente relacionada com infecções humanas.

[4] A peste é, primariamente, uma doença zoonótica que afeta roedores e outros mamíferos selvagens. Usualmente, a peste é transmitida pela picada de pulgas infectadas com o micro-organismo, embora a infecção também possa ocorrer pelo contato com goticulas respiratórias de indivíduos infectados. Atualmente, a infecção humana causada por Y. pestis é rara, entretanto, a peste permanece enzoótica em partes da África, Américas do Norte e Sul e-Ásia.

[5] O tratamento das infecções causadas por ' Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis é sintomático; e a identificação de micro-organismos em amostras biológicas é feita, em grande parte, pelo isolamento, cultivo em meios de cultura apropriados e identificação através de provas bioquímicas e imunológicas. Entretanto, o diagnóstico baseado no cultivo apresenta muitas limitações, tais como o longo tempo de cultivo e identificação do micro-organismo, dificuldade no isolamento em culturas mistas, e contaminação cruzada da cultura por outros microorganismos .

[6] O diagnóstico de micro-organismos pode ser realizado por técnicas moleculares de genotipagem; tais como as técnicas de detecção de polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs - do inglês single-nucleotide polymorphisms), e, técnicas de detecção das características de dissociação de fitas de DNA complementares (HRMA - do inglês high resolution melting analysis).

[7] A literatura de patentes é rica em documentos que tratam de técnicas de detecção de Yersínia com finalidade de diagnóstico.

[8] Os documentos WO 2002070664 que descreve um método de detecção de bioagentes potenciais para bioterrorismo, dentre eles Yersinia pestis; W02009134470 que trata de um método para a detecção de regiões hipervariáveis da sequência polinucleotidica de 16S rRNA, através da utilização de sondas genéticas complementares à sequência de ácidos nucleicos ; WG 1999028500 que trata da técnica de HRMA para detecção de Y. pestls em amostras suspeitas, porém, não há descrição de tipagem genética de espécies e/ou linhagens, e a detecção é feita através de sondas genéticas; e W02004033720 descreve a utilização de uma técnica baseada na híbridização de sequências em um chip contendo sequências especificas do gene 16S rRNA disposta em locais pré-definidos para diferentes microorganismos .

[9] W02009134470 e WO2G13079513 tratam do método de detecção de regiões conservadas e variáveis presentes no gene 16S rRNA para a identificação de linhagens patogênicas de Yersinía.

[10] O documento CN101492733 trata do método para a identificação de linhagens de Y. pseudotuberculosis de origem alimentar pela amplificação de uma região de seu DNA e análise dos fragmentos amplificados por espectrometria de massa, que detecta diferentes estruturas de DNA através da relação massa/carga. Já o documento CN101748197 trata de um método para a identificação de Y. enterocolitica que utiliza pares de primers e sondas especificas para o gene ail de Y. enterocolitica. Neste método, o fragmento amplificado a partir do uso de sondas de ácidos nucléicos, que pareiam de forma complementar com os produtos de análise. Em CN101824468 tem-se um método para a detecção de Y. pestis tendo por base a técnica denominada "loop-mediated isothermal amplification" (LAMP). Já em CN102329864 tem-se um método para a identificação de Yersinia spp. por PCR tempo real, que necessita de diferentes sondas TaqMan para a identificação das diferentes espécies desta bactéria. O documento CN102534023 trata de um método que emprega a técnica de amplificação circularizada (RCA) associado à técnica de amplificação de segmentos do genoma de Y. enterocolitlca, cuja análise final dos resultados ocorre pela técnica de eletroforese em gel de agarose. Em CN1Q2899420 temos um método para a detecção de Y. enterocolitlca baseado na amplificação de um segmento de DNA utilizando técnica alternativa de amplificação (PCR).

[11] A patente RU 2486252 trata do método baseado em amplificação (PCR) do gene htrB para a identificação de Y. pseudotuberculosis e sua diferenciação de Y. pestis e Y. enterocolitlca.

[12] EP1364064 descreve a combinação das técnicas de PCR e espectrometria de massa de alta resolução para a detecção de diversos agentes biológicos. Como os autores comentam, a PCR garante especificidade e a espectroraetria de massa garante a rapidez para a técnica.

[13] A patente DS5654144 trata do método de identificação de espécies patogênicas e não patogênicas de Yersinia que utiliza o PCR para a amplificação de uma região especifica do gene 16S rRNA de Yersinia spp., seguido da divagem do fragmento gerado com enzimas de restrição.

[14] Nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um método de identificação de micro-organismos das espécies do gênero Yersinia pela análise de dissociação de alta resolução de DNA com o uso de um agente intercalante de DNA do tipo saturante, como efetuado pela técnica de HRMA.

Sumário d.a invenção: [15] A presente invenção se refere ao método para identificar espécies bacterianas consistido da análise de polimorfismos em uma sequência especifica de DNA de bactérias do gênero de Yersinia, na presença de um agente intercalante de DNA do tipo saturante; que amplia as possibilidades de ferramentas moleculares para a identificação dessas espécies de Yersinia através da utilização de uma plataforma simples, custo acessível, rápida e possível de ser realizada |para um grande número de amostras.

[16] A presente invenção se refere ainda a um kit para o diagnóstico de bactérias ; do gênero Yersinia em amostras biológicas e não biológicas.

Breve descrição das figuras: [17] A figura 1 é o esquema de uma reação de amplificação de DNA.

[18] A figura 2 é um gráfico da análise da curva de dissociação.

[19] A figura 3 é o gráfico da análise da curva de dissociação e utilizado para a diferenciação por HRMA de linhagens de Y. enterocolitica\ de linhagens de Y. pseudotuberculosis, de acordo com o método da invenção.

Descrição detalhada da invenção: [20] A presente invenção provê método para identificar espécies bacterianas consistido da análise de polimorf ismos em uma sequência específica de DNA de bactérias do gênero Yersinia, por meio de uma análise de dissociação de alta resolução na presença de um agente intercalante de DNA do tipo saturante.

[21] Com o intuito de melhor definir a presente invenção, tem-se que "ácido nucléico", "nucleotideo", "oligonucleotídeo" e "polinucleotideo" referem-se à desoxiribonucleotideos (DNA) ou ribonucleotideos (RNA) e seus polímeros, sejam na forma de fita única ou em dupla-fita . Esses termos estão relacionados aos ácidos nucléicos que contêm análogos naturais de nucleotideos, que tenham propriedades de ligação idênticas aos ácidos nucléicos de referência e que são metabolizados de maneira similar aos nucleotideos encontrados naturalmente. Ainda, o termo "ácido nucléico" é utilizado para descrever genes, DNA complementar (cDNA) e o RNA mensageiro (mRNA) transcrito de um gene. Tais termos ainda compreendem moléculas de DNA de quaisquer origens (cDNA ou genômico), moléculas de RNA ou moléculas análogas de DNA ou RNA, geradas a partir de reações com nucleotideos análogos.

[22] 0 termo "oligonucleotídeo" inclui "primer", e "iniciador" e são pequenas moléculas de oligonucleotideos sintéticas.

[23] O termo "polimorfismo" refere-se à comparação de sequências de ácidos nucléicos altamente similares, com diferenças singulares em um único nucleotídeo em uma mesma posição da sequência comparada. Já "SNP" refere-se ao polimorfismo em um único nucleotídeo.

[24] A expressão "temperatura de dissociação" refere-se a uma determinada temperatura em que um conjunto de moléculas de DNA idênticas apresenta metade de suas moléculas com a dupla-fita dissociada e a outra metade na forma de dupla-fita não dissociada, em decorrência de um aumento de temperatura, medido em graus Celsius.

[25] O termo "PCR" refere-se a uma reação de polímerização da cadeia de um ácido nucléico molde, gerando múltiplas moléculas idênticas de DNA dupla-fita. Tal reação é delimitada por oligonucleotideos que se pareiam nas extremidades do segmento copiado em fitas de DNA distintas, indicando cada inicio da polirtierização de nucleotideos para formação do segmento de DNA resultante.

[26] O termo "amplicon" refere-se ao produto de uma reação de PCR.

[27] A expressão "pares de bases" refere-se à medida de tamanho de uma molécula de DNA, onde cada nucleotideo de uma fita forma seu par complementar na fita pareada.

[28] O termo "genotipagem" refere-se a uma forma de comparar sequências de ácidos nucleicos muito similares, agrupando tais sequências conforme seu grau de similaridade, no sentido de distinguir organismos em seus reinos, classes, famílias, gêneros, espécies, subespécies e linhagens.

[29] A expressão "fragmento polipeptidico" se refere a quaisquer fragmentos resultantes da sequência polipeptídica que preserve as características estruturais fundamentais, responsáveis pelas atividades de interesse da molécula.

[30] O termo "identidade", relativo às sequências de ácidos nucléicos e proteínas, refere-se à comparação entre duas ou mais sequências polinucleot ídicas ou entre duas ou mais sequências polipeptidicas, respectivamente.

[31] O termo "HRMA" significa análise de dissociação de alta resolução, e está associada às análises comparativas de polimorfismos entre sequências de DNA muito similares, no que tange as suas diferenças no gráfico de dissociação de fitas duplas em relação ao aumento de temperatura. Tais temperaturas de dissociação devem ser medidas em equipamentos de alta resolução.

[32] O método para identificar espécies bacterianas da presente invenção é consistido de uma análise de dissociação de alta resolução na presença um agente intercalante de DNA e compreende as etapas de: (a) Coletar uma amostra; (b) Introduzir a amostra coletada em um amplificador de DNA; (c) Inserir os reagentes de amplificação; (d) Acionar o amplificador; e, (e) Analisar os dados obtidos.

[33] Na etapa (a) a amostra coletada é uma amostra biológica ou não biológica com suspeita de conter células de bactérias do gênero Yersinia, viáveis ou não, porém com seu conteúdo genômico preservado, e, inserir a amostra em um recipiente adequado. Entende-se com o recipiente adequado um microtubo plástico, tipo Eppendorf®.

[34] Entende-se por amostra biológica, uma amostra de tecidos obtidos a partir de animais tais como humanos, outros primatas, canideos, felinos, roedores, ruminantes, ovideos, caprinos, suínos, equinos, cetáceos, peixes, crustáceos, moluscos e anfíbios, mas não estão restritos a estes. Preferencialmente, a amostra biológica é uma amostra de fezes.

[35] A amostra não biológica .é um substrato natural ou sintético com suspeita de estar contaminado por micro-organismos do gênero Yersinia.

[36] Na etapa (b) a amostra coletada é inserida em um amplificador de DNA pertencente ao estado da técnica, tal como um termociclador de PCR ou um termociclador de PCR Real Time. Deve ficar evidente aos versados nesta área técnica, que qualquer modelo de termociclador produzido por qualquer um dos fornecedores de termocicladores já estabelecidos pode ser utilizado no método da presente invenção.

[37] Ainda na etapa (b) , os controles reacionais consistidos de uma fração de entre 0,5 a 10 nanogramas por microlitro (ng/pL) de DNA genômico de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosís, são preferencialmente, introduzidos em recipientes separados e independentes adequados no termociclador.

[38] Os agentes de amplificação da etapa (c) são um par único de oligonucleotideos que amplifica a sequência do gene 16S rRNA de bactérias do gênero Yersinia; um agente intercalante de DNA; tampão de amplificação; enzima polimerase para amplificação do DNA; uma fonte de ions magnésio; uma mistura de desoxinucleosídeos; e um diluente.

[39] Preferencialmente, na etapa (c) são inseridos como agentes de amplificação entre 2,0 a 20 picomoles por microlitro (pmol/uL) de um par único de oligonucleotideos consistido pelas SEQ. ID. N°: 1 e SEQ. ID. N°: 2; o agente intercalante de DNA é um fluoróforo intercalante de ácido desoxirribonucleico (DNA) do tipo saturante que apresenta fluorescência quando intercalado à fitas de DNA pareadas, e perde a fluorescência quando as fitas estão dissociadas, e são pertencentes ao grupo compreendido de: SYT09® um corante de DNA com fluorescência verde que intercala ao DNA, manufaturado pela empresa Molecular Probes, Eugene, Oregon, E.U.A.; EVAGREEN™ um corante com fluorescência verde manufaturado pela empresa Biotium, HayWard, Califórnia, E.U.A.; BOXTO um corante baseado em cianina manufaturado pela empresa TATAA Biocenter, Goteborg, Suécia; SYBR®GREEN um corante com fluorescência verde manufaturado pela empresa Molecular Probes, Eugene, Oregon, E.U.A.; e LCGREEN® fluorescência verde manufaturada pela empresa Idaho Technologies, Incorporated, Salt Lake City, Utah, E.U.A.; o tampão de amplificação é um tampão livre de ions magnésio; a enzima polimerase para amplificação do DNA é por exemplo, a Taq DNA polimerase, Pfu DNA polimerase; a fonte de ions magnésio é o cloreto de magnésio ou o sulfato de magnésio; a mistura de desoxinucleosideos é consistida de dATP, dCTP, dGTP e dTTP; e o diluente é a água destilada e livre de DNAse e RNAse.

[40] Na etapa (d) o amplificador, preferencialmente, contendo um dispositivo leitor de fluorescência é acionado para realizar um ciclo de reações de amplificação sob as seguintes condições: um ciclo único de aquecimento a temperatura de entre 92 a 97°C, por entre 5 a 15 minutos; seguidos de 25 a 45 ciclos a uma temperatura entre 92 a 97°C, por 5 a 15 segundos, seguido de resfriamento a uma temperatura entre 52 e 58°C, durante 30 a 90 segundos, com determinação do sinal de fluorescência ao final de cada ciclo.

[41] Ao final da reação de amplificação, tem inicio a etapa (e) , na qual os amplicons obtidos são submetidos à análise de dissociação da dupla-fita por HRMA, através da utilização de equipamento especifico e pertencente ao estado da técnica, que compreende uma etapa inicial de aquecimento dos amplicons de 92 a 97°C durante entre 8 a 12 segundos, e resfriamento dos mesmos entre 58 a 62°C por 30 a 90 segundos; com determinação contínua da fluorescência, variando-se as temperaturas de forma crescente, de 60°C a 95°C.

[42] A técnica de HRMA é capaz de detectar a variação de um único par de nucleotídeos em uma determinada sequência amplificada, e tais variações na sequência apresentam comportamentos termodinâmicos distintos que são comparados com os comportamentos termodinâmicos característicos dos grupos Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis, utilizados como controles. A análise de dissociação da dupla-fita por HRMA viabiliza a identificação de micro-organismos da amostra coletada, conforme pode ser observado na figura 3, que mostra a representação gráfica dos dados obtidos pelo método da invenção; indicando os diferentes perfis de amplificação característicos de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis.

[43] Neta etapa os amplicons foram aquecidos entre 92 e 97 °C de 7 a 20 segundos, preferencialmente 10 segundos, e posteriormente resfriados entre 55 a 65 °C de 15 a 90 segundos, preferencialmente de 30 a 80 segundos. As curvas de dissociação de cada amplicon são geradas a partir de um aumento gradual de temperatura, iniciando-se em 60°C, com incrementos de 1,6 graus a cada segundo, até o limite de 95 °C. Durante o periodo de aumento gradual de temperatura, a intensidade de fluorescência é medida a cada décimo de segundo. As curvas de dissociação são analisadas com auxilio de um programa de computador comercialmente disponível.

[44] A invenção trata ainda de um kit para o diagnóstico de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis em amostras biológicas e não biológicas que é consistido de: um par único de oligonucleotideos que amplifica um gene de bactérias do gênero Yersinia; e, um agente intercalante de DNA. Opcionalmente, o kit para o diagnóstico de bactérias do gênero Yersinia em amostras biológicas e não biológicas é ainda consistido de tampão de amplificação; enzima polimerase para amplificação do DNA; uma fonte de íons magnésio; uma mistura de desoxinucleosídeos; e um diluente.

[45] Neste objeto da invenção, o par único de oligonucleotideos que amplifica um gene de bactérias do gênero Yersinia é consistido pelas SEQ. ID. N°:l e SEQ. ID. 2, que servem para amplificar e reconhecer os polimorfismos dos gene 16S rRNA de bactérias do gênero Yersinia.

[46] O par único de oligonucleotideos é fornecido em uma concentração entre 0,1 e 5 nanogramas por microlitro (ng/pL) preferivelmente entre 0,5 a 5 ng/pL.

[47] O agente intercalante de DNA é um fluoróforo intercalante de ácido desoxirribonucleico (DNA) do tipo saturante e apresenta fluorescência quando as fitas estão pareadas, e perdem a fluorescência quando as fitas estão dissociadas, e são pertencentes ao grupo compreendido de: SYT09® um corante de DNA com fluorescência verde que intercala ao DNA, manufaturado pela empresa Molecular Probes, Eugene, Oregon, E.U.A.; EVAGREEN™ um corante com fluorescência verde manufaturado pela empresa Biotium, HayWard, Califórnia, E.U.A.; BOXTO um corante baseado em cianina manufaturado pela empresa TATAA Biocenter, Goteborg, Suécia; SYBR®GREEN um corante com fluorescência verde manufaturado pela empresa Molecular Probes, Eugene, Oregon, E.U.A.; e LCGREEN® fluorescência verde manufaturada pela empresa Idaho Technologies, Incorporated, Salt Lake City, Utah, E.Ü.A.

[48] Os componentes opcionais do kit de acordo com a invenção são componentes pertencentes ao estado da técnica, e podem ser obtidos de fornecedores comerciais conhecidos pelos versados na arte.

[49] Preferencialmente, os componentes opcionais do kit de acordo com a presente invenção são o tampão de amplificação é um tampão livre de íons magnésio; uma enzima polimerase como, por exemplo, a Taq DNA polimerase, e a Pfu DNA polimerase; o cloreto de magnésio ou o sulfato de magnésio como fonte de ions magnésio; e uma mistura dos desoxinucleosideos dATP, dCTP, dGTP e dTTP; e o diluente é a água destilada e livre de DNAse e RNAse.

[50] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

[51] Os exemplos que serão dados a seguir são meramente ilustrativos das concretizações da invenção, e não devem ser considerados como limitativos dos direitos dos titulares, que somente devem ser considerados em relação às reivindicações anexas.

Exemplos: Exemplo 1 - Detecção de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis em amostras gerais: [52] Para a identificação de espécies de Yersinia, foram amplificadas partes do locus denominado 16S rRNA. Tais cópias são realizadas a partir de reações de amplificação em tempo real ("PCRq", PCR quantitativa), utilizando-se oligonucleotideos descritos como SEQ ID. N ° : 1 e SEQ ID. N °:2.

[53] Para a determinação dos SNPs por HRMA, os amplicons gerados pela PCR em tempo real (PCRq) são analisados com o auxilio de um programa de computador, como exemplo o "software 7500", versão 2.0.5, da empresa "Life Technologies". Diversas reações de amplificação podem ser realizadas de uma só vez, em placas plásticas para tal finalidade, contendo até 96 cavidades.

[54] A etapa de HRMA foi realizada imediatamente após a reação de PCRq. Tais análises foram realizadas segundo o protocolo de PCRq desenvolvido no aparelho "termociclador 7500 FAST Real-Time PCR System", da empresa "Life Technologies", utilizando-se micro-organismos de referência como fonte de DNA molde, combinações de oligonucleotideos (um par por amostra), e tampão fornecido pela empresa manufatureira (Life Technologies), contemplando o agente intercalante de DNA fluorescente "SYT0 9®" .

[55] Os amplicons produzidos são aquecidos a 95 graus Celsius de 7 a 20 segundos, preferencialmente 10 segundos, e posteriormente resfriados a 60 graus Celsius de 45 a 80 segundos, preferencialmente 60 segundos. As curvas de dissociação de alta resolução de cada amplicon são geradas a partir de um aumento gradual de temperatura, iniciando-se em 60 graus, com incrementos de 1,6 graus a cada segundo, até o limite de 95 graus Celsius. Durante o período de aumento gradual de temperatura, a intensidade de fluorescência é medida a cada décimo de segundo. As curvas de dissociação são analisadas com auxilio de um programa de computador. Como exemplo, as curvas de dissociação da presente invenção foram analisadas pelo "software HRM", versão 2.0.1, da empresa "Life Technologies".

[56] Cada amplicon deve conter um polimorfismo em uma posição do segmento amplificado (SNP), gerando sutis discrepâncias em cada gráfico de dissociação, comparados sempre com condições idênticas de reação. Desse modo, o conjunto de amplicons de um mesmo micro-organismo gera um conjunto de gráficos de dissociação específico, que define o padrão de identidade do micro-organismo avaliado.

[57] A Figura 3 ilustra a análise da curva de dissociação do amplicon gerado com o par de oligonucleotídeos desenhados para a diferenciação por high-resolution melting analysis de Y. enterocolítica e Y. pseudo tubérculosis.

Exemplo 2 - Protocolo de detecção: [58] Oligonucleotídeos específicos sintéticos (Seq ID NO:l e Seq ID NO: 2), em concentrações que podem variar entre 2,5 e 20 picomoles por microlitro (pmol/uL), preferivelmente, os oligonucleotídeos são usados na concentração de 5 pmol/pL.

[59] Solução de pré-mistura fluorescente para HRMA, incluindo: (i) tampão de amplificação (PCR) ; (ii) fluoróforo intercalante de ácido desoxirribonucleico (DNA) do tipo saturante; (iii) a enzima polimerase para amplificação do DNA; (iv) os ions de magnésio bivalentes (cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio); e (v) a mistura de desoxinucleosideos dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Esta pré-mistura fluorescente pode ser adquirida no mercado, e deve ser utilizada segundo as instruções do fabricante.

[60] Água destilada ultra pura, livre das enzimas nucleoliticas DNAse e RNAse.

[61] DNA genômico purificado das amostras a serem analisadas, na concentração entre 0,5 a 10 nanogramas por microlitro (ng/pL). Variações de concentração e/ou da amostra podem ser utilizadas. Como exemplo, fezes humanas, puras ou em suspensão aquosa (água ultra pura), poderá ser utilizada. Paralelamente, amostras comparativas, contendo DNA genômico purificado para uso como controle, são realizadas para os grupos de: (i) Y. enterocolitica I, na concentração de 1 nanograma por microlitro (ng/pL). Variações de concentração podem ser utilizadas. (ii) Y. enterocolitica II, na concentração de 1 ng/pL. Variações de concentração podem ser utilizadas. (iii) Y. pseudotuherculosis, na concentração de 1 ng/pL. Variações de concentração podem ser utilizadas.

[62] As misturas acima são submetidas a reações de amplificação de DNA (PCR), em volumes que podem variar de 10 a 100 microlitros, em aparelho termociclador com dispositivo de leitura de fluorescência, sob as seguintes condições: (i) um ciclo único de aquecimento a temperatura de 95°C, por 10 minutos; (ii) de 25 a 45 ciclos, com cada ciclo sendo constituído de etapas de manutenção da temperatura a 95°C, por 15 segundos, e posterior manutenção da temperatura a 55°C, por 1 minuto. Determinações do sinal de fluorescência são realizadas ao final de cada ciclo, em temperaturas de 95°C por 10 segundos, e 60°C por 1 minuto. À conclusão dos ciclos e da reação de amplificação, realiza-se a determinação continua da fluorescência, variando-se as temperaturas de forma crescente, de 60°C a 95 °C.

[63] Todos os reagentes do kit estão em soluções líquidas e podem ser utilizados diretamente na reação. Todos os elementos do kit devem ser conservados à temperatura negativa de 20°C (~20°C), com validade estimada de 1 ano. O transporte deverá ser realizado em ambiente refrigerado, em temperatura entre 4°C a 8°C, não ultrapassando o período de 72 horas.

[64] No momento de preparação das amostras para a reação de amplificação (PCR), os reagentes do kit devem permanecer em temperatura entre 20°C a 25°C.

[65] As amostras submetidas à análise, contendo uma ou mais espécies bacterianas não identificadas, deverão ser submetidas preferencialmente à extração de DNA por método que possibilite a obtenção de ácido nucléico com elevada pureza. A concentração de DNA de cada amostra poderá variar, sendo preferivelmente utilizado na concentração final de 1 ng/pL.

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1 . Método para identificar espécies bacterianas consistido da análise de polimorfismos em uma sequência especifica de DNA de bactérias do gênero Yersinia, caracterizado pelo fato de ser consistido de um par de oligonucleotideos; um agente intercalante de DNA do tipo saturante e compreende as etapas de: (a) Coletar uma amostra; (b) Introduzir a amostra coletada em um amplificador de DNA; (c) Inserir os reagentes de amplificação; (d) Acionar o amplificador; e, (e) Analisar os dados obtidos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa (a) a amostra coletada ser uma amostra biológica ou não biológica com suspeita de conter células de bactérias do gênero Yersinia, viáveis ou não, porém com seu conteúdo genômico preservado, e, inserir a amostra em um recipiente adequado.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de na etapa (a) a amostra biológica ser uma amostra de tecidos obtidos a partir de animais tais como humanos, outros primatas, canideos, felinos, roedores, ruminantes, ovideos, caprinos, suínos, equinos, cetáceos, peixes, crustáceos, moluscos e anfíbios, mas não estão restritos a estes; e a amostra não biológica é um substrato natural ou sintético com suspeita de estar contaminado por microrganismos do gênero Yersinia.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa (b) a amostra coletada ser inserida em um termociclador, em conjunto com os controles reacionais consistidos de uma fração de entre 0,5 a 10 ng/pL de DNA genômico de Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosís.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa (c) os agentes de amplificação serem um par único de oligonucleotideos que amplifica a sequência do gene 16S rRNA de bactérias do gênero Yersinia; um agente intercalante de DNA; tampão de amplificação; enzima poli me rase para amplificação do DNA; uma fonte de ions magnésio; uma mistura de desoxinucleosídeos; e um diluente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de serem inseridos entre 2,0 a 20 pmol/pL do par único de oligonucleotideos consistido pelas SEQ. ID. N° : 1 e SEQ. ID. N°: 2; o agente intercalante de DNA ser um fluoróforo intercalante de DNA do tipo saturante; o tampão de amplificação ser um tampão livre de ions magnésio; a enzima polimerase para amplificação do DNA; a fonte de ions magnésio ser o cloreto de magnésio ou o sulfato de magnésio; a mistura de desoxinucleosídeos ser consistida de dATP, dCTP, dGTP e dTTP; e o diluente ser a água destilada e livre de DNAse e RNAse.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ao final da etapa de amplificação os amplicons obtidos serem submetidos à análises de dissociação da dupla-fita por HRMA (high resolution melting analysis).

8 . Kit para o diagnóstico de bactérias do gênero Yersinia em amostras biológicas e não biológicas caracterizado por ser consistido de: um par único de oligonucleotideos que amplificam um gene de bactérias do gênero Yersinia; e, um agente intercalante de DNA do tipo saturante.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por opcionalmente, ser ainda consistido de tampão de amplificação; enzima poliraerase para amplificação do DNA; uma fonte de ions magnésio; uma mistura de desoxinucleosideos; e um diluente.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o par único de oligonucleotideos que amplifica o gene bactérias do gênero Yersinia ser consistida pela SEQ. ID. N°:l e SEQ. ID. 2.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser para amplificar e reconhecer os polimor f ismos dos gene 16S rRNA de bactérias do gênero Yersinia.

12. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 10, ou 11 caracterizado pelo fato do par único de oligonucleotideos ser fornecido em uma concentração entre 0,1 e 5 ηρ/μΕ preferivelmente entre 0,5 a 5 ng/pL.