JP2024504966A - 改善されたゲノム配列検出およびそのためのプローブ分子 - Google Patents
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Abstract
仮想プローブ、相同ゲノム配列を区別するためのアレイ、相同ゲノム配列を区別するためのシステム、ならびに本開示の方法、アレイおよびシステムにおいて有用なプローブ分子を利用して、試料中に存在し得る相同ゲノム配列を同定する方法。
Description
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２０日に出願された米国仮出願第６３／１３９，６４３号の優先権利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月２０日に出願された米国仮出願第６３／１３９，６４３号の優先権利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１月１８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＧＢ－００９ＷＯ＿ＳＴ２５と名付けられ、サイズが１，５５０バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１月１８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＳＧＢ－００９ＷＯ＿ＳＴ２５と名付けられ、サイズが１，５５０バイトである。
３．背景技術
感染性病原体の同定は、個体の適切な診断および治療過程を決定する上で重要であることが多い。感染病原体を誤認すると、不適切または無効な治療過程につながり得る。配列決定技術の改善は、いくつかの疾患原因細菌のゲノムの配列の部分的または全体的な決定に役立ってきた。密接に関連する細菌種は、非常に高度の配列同一性を共有するゲノム配列を含むことが多い。密接に関連する種を区別するには、２つ以上の相同ゲノム配列間の差異を検出する高感度で正確な方法が必要である。単一のオリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して相同ゲノム配列を区別することは、不可能ではないにしても、場合によっては非現実的であり得る。
感染性病原体の同定は、個体の適切な診断および治療過程を決定する上で重要であることが多い。感染病原体を誤認すると、不適切または無効な治療過程につながり得る。配列決定技術の改善は、いくつかの疾患原因細菌のゲノムの配列の部分的または全体的な決定に役立ってきた。密接に関連する細菌種は、非常に高度の配列同一性を共有するゲノム配列を含むことが多い。密接に関連する種を区別するには、２つ以上の相同ゲノム配列間の差異を検出する高感度で正確な方法が必要である。単一のオリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して相同ゲノム配列を区別することは、不可能ではないにしても、場合によっては非現実的であり得る。
したがって、密接に関連する微生物の種を正確に区別するための新しい方法が必要とされている。
４．発明の概要
本開示は、ゲノム配列を同定する、および／または試料中に存在し得る相同ゲノム配列を区別する改善された方法を提供する。方法は、単独ではできないが、集合して密接に関連した微生物の種から相同ゲノム配列を区別することができ、試料中に存在する可能性が高いゲノム配列を同定することもできるプローブ分子の組み合わせを利用する。プローブ分子のこのような組み合わせは、便宜上、本明細書では「仮想プローブ」と呼ばれる。
本開示は、ゲノム配列を同定する、および／または試料中に存在し得る相同ゲノム配列を区別する改善された方法を提供する。方法は、単独ではできないが、集合して密接に関連した微生物の種から相同ゲノム配列を区別することができ、試料中に存在する可能性が高いゲノム配列を同定することもできるプローブ分子の組み合わせを利用する。プローブ分子のこのような組み合わせは、便宜上、本明細書では「仮想プローブ」と呼ばれる。
仮想プローブは、複数（例えば、２、３、または４つ以上）の個々のプローブ分子を含むことができる。ゲノムＤＮＡ（またはゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物）と個々のプローブ分子とのハイブリダイゼーションは、配列決定しないと、特に関連種の保存された配列を標的とするユニバーサルプライマーを使用してゲノムＤＮＡを増幅する場合、同じ試料中に存在し得る遺伝的に関連した種の相同ゲノムＤＮＡからゲノムＤＮＡを区別するのに不十分であり得る。しかしながら、ゲノムＤＮＡまたは対応するＰＣＲアンプリコンが２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブでプロービングされる場合、仮想プローブに対するハイブリダイゼーションパターンの差異が、２つの関連種またはそこから増幅された相同アンプリコンからゲノムＤＮＡを識別することができる。
したがって、複数のプローブ分子（例えば、識別可能なシグナルを有するプローブ分子）を含むことにより、本開示の仮想プローブは、組み合わせでゲノム配列を相同ゲノム配列（またはそれから調製されたアンプリコン）から区別し、生物学的試料中に存在する微生物種を識別することができる。例えば、本開示の方法によれば、２つまたは３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子の組み合わせは、関連する種、例えばコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種（例えば、Ｓ．ホミニス）およびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種（例えば、黄色ブドウ球菌）からのアンプリコンを区別する仮想プローブを組み合わせて形成することができる。したがって、例えばＰＣＲ反応において試料が鋳型ＤＮＡの供給源として使用される場合、任意の得られるＰＣＲ産物の仮想プローブへのハイブリダイゼーションにより、２つの種のうちのどれが試料中に存在するかを決定することができる。
本明細書に開示される仮想プローブを使用して相同ゲノム配列を識別する方法は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来の配列を使用して設計された種特異的オリゴヌクレオチドプローブ分子が、異なる種間で交差反応性を示すことを実現させてから開発された。ゲノムのこの領域の配列間の変動が少ないため、種特異的プローブ分子を設計することができなかった。しかしながら、それにもかかわらず、単独では異なる種を区別することができない、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を組み合わせる仮想プローブへのハイブリダイゼーションからのシグナルを分析することによって、異なる種を区別することができることが発見された。
さらに、プローブからのシグナルが試料中の相同ゲノム配列の相対量の尺度を提供することができるように、複数の密接に関連する種（例えば、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種およびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種）からの相同ゲノム配列にハイブリダイズすることができるプローブを仮想プローブに含めることによって、仮想プローブを使用する場合の微生物同定の精度が改善され得ることが発見された。そのようなプローブは、便宜上、本明細書では「計量プローブ」と呼ばれる。計量プローブに対するシグナルが閾値以上である場合、例えば、第１の式を使用して仮想プローブのプローブに対するハイブリダイゼーションシグナルを分析することができ、計量プローブに対するシグナルが閾値未満である場合、第２の式を使用することができる。すべての試料に対して単一の式ではなく、相対的な試料濃度を説明する、微生物同定のための種々の式を使用することによって微生物同定の精度を向上させることができる。
計量プローブは、仮想プローブの他の１つ以上のプローブ分子より先に飽和に達するプローブ分子を有する仮想プローブを使用する場合、微生物同定の精度を向上させるのに特に有用であり得る。仮想プローブの１つのプローブ分子が他の１つ以上のプローブ分子より先に飽和に達すると、試料をプロービングするときに得られるシグナルパターンは、試料中の標的配列の濃度に応じて変化し得る。試験試料中の標的配列の相対量が分かっていると、試験試料について得られたシグナルパターンは、標的配列の相対濃度に特異的な式を使用して分析することがでる。例えば、ハイブリダイゼーションパターンは、相対濃度が高い場合（例えば、計量プローブのシグナルが閾値を超える場合）、第１の式を使用して分析することができ、相対濃度が低い場合（例えば、計量プローブのシグナルが閾値未満である場合）、第２の式を使用して分析することができる。実施例６は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種またはコアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌を含有する試料を同定する精度を高めるための計量プローブの使用を例示する。計量プローブによって提供される微生物同定の向上した精度は、計量プローブを利用しない既存の微生物検出方法を上回る著しい改善を意味する。
いくつかの態様では、本開示は、第１の微生物（または対応する第１のゲノム）および／または第２の微生物（または対応する第２のゲノム）が試料中に存在するかどうかを検出する方法を提供する。特定の実施形態では、試料は血液試料である。血液試料からの検出を可能にすることによって、本開示の方法は、調製に余計な時間および費用を必要とする臨床分離物の使用を必要とする検出方法よりも大幅に改善される。
本開示の方法は、試料を第１の生物および第２の生物について仮想プローブを用いてプロービングして、第１のゲノムまたは第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸の有無を決定することを含み得る。標的核酸は、例えば、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅反応で生成されるゲノムフラグメントまたはアンプリコンであり得る。仮想プローブは、２つ以上のプローブ分子を含み、その各々は、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブ分子は、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に同様にハイブリダイズしないので、仮想プローブは、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる。仮想プローブは、好ましくは計量プローブを含む。
例示的な方法は、以下の工程を含む：
（ａ）試料において、第１および第２のゲノムにハイブリダイズし（試料中に存在する場合）、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーの１つ以上の対を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を実施する工程。各プライマーセットは、試料中に存在し得る各生物に好ましくは固有のアンプリコンセットを生じさせる。したがって、増幅は、第１のゲノムが存在する場合には第１のアンプリコンセットをもたらし、第２のゲノムが試料中に存在する場合には第２の異なるアンプリコンセットをもたらす。単一のＰＣＲプライマー対のみを使用する場合、各アンプリコンセットは単一のアンプリコンのみを含み、複数のＰＣＲプライマー対を使用する場合、アンプリコンセットは２つ以上のアンプリコン（例えば、複数の単一アンプリコン）を含み得る。
（ｂ）工程（ａ）に続いて、得られたＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングして、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を判定する。仮想プローブは、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットに別個の様式で特異的にハイブリダイズすることができる２つ以上のプローブ分子（例えば、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含むので、仮想プローブは、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。各仮想プローブ内のプローブ分子は、異なる標識（例えば、蛍光標識、例えば、異なる蛍光標識で標識された分子ビーコン）を有すること、またはアレイ上の分散した位置に配置されることによって区別され得る。
（ａ）試料において、第１および第２のゲノムにハイブリダイズし（試料中に存在する場合）、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーの１つ以上の対を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を実施する工程。各プライマーセットは、試料中に存在し得る各生物に好ましくは固有のアンプリコンセットを生じさせる。したがって、増幅は、第１のゲノムが存在する場合には第１のアンプリコンセットをもたらし、第２のゲノムが試料中に存在する場合には第２の異なるアンプリコンセットをもたらす。単一のＰＣＲプライマー対のみを使用する場合、各アンプリコンセットは単一のアンプリコンのみを含み、複数のＰＣＲプライマー対を使用する場合、アンプリコンセットは２つ以上のアンプリコン（例えば、複数の単一アンプリコン）を含み得る。
（ｂ）工程（ａ）に続いて、得られたＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングして、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を判定する。仮想プローブは、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットに別個の様式で特異的にハイブリダイズすることができる２つ以上のプローブ分子（例えば、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含むので、仮想プローブは、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。各仮想プローブ内のプローブ分子は、異なる標識（例えば、蛍光標識、例えば、異なる蛍光標識で標識された分子ビーコン）を有すること、またはアレイ上の分散した位置に配置されることによって区別され得る。
したがって、ＰＣＲ反応のＰＣＲ増幅産物の仮想プローブへのハイブリダイゼーションは、第１のゲノムと第２のゲノムとを区別することができ、それによって試料中の第１および／または第２の生物の存在を同定することができる。本明細書で使用される場合、試料中の生物の存在への言及は、試料が生きている生物を有することではなく、検出される、またはＰＣＲ反応などの増幅反応のための鋳型としての役割を果たすのに十分な、生物由来のゲノムＤＮＡが試料中に存在することを意味するだけである。同様に、試料中のゲノムの存在への言及は、試料がインタクトなゲノムを有することではなく、検出される、またはＰＣＲ反応などの増幅反応のための鋳型としての役割を果たすのに十分な、ゲノム由来のＤＮＡが試料中に存在することを意味するだけである。
第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットは、例えば単一のプライマーセットがＰＣＲ増幅反応で使用される場合、それぞれ１つのアンプリコン（それぞれ「第１のアンプリコン」および「第２のアンプリコン」と呼ばれる）を含むことができる。あるいは、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットは、例えばＰＣＲ増幅反応において複数セットのプライマーが使用される場合、複数のアンプリコン（第１のアンプリコンセットの各アンプリコンは「第１のアンプリコン」と呼ばれ、第２のアンプリコンセットの各アンプリコンは「第２のアンプリコン」と呼ばれる）を含み得る。相同アンプリコンを相同ゲノム配列から区別するためのさらなる例示的な方法は、下記のセクション６．２ならびに番号付けされた実施形態１～９８、１４２～１４７および１５１に記載されている。
本開示はさらに、相同ゲノム配列を区別するためのアレイ、相同ゲノム配列を区別するためのシステム、ならびに、例えば本開示の方法、アレイおよびシステムにおいて有用なオリゴヌクレオチドプローブ分子を提供する。
一態様において、本開示は、第１のゲノムからの第１のゲノム配列と、第２のゲノムからの第２の相同ゲノム配列とを区別するためのアドレサブルアレイを提供する。本開示のアドレサブルアレイは、例えば、本明細書に記載の方法で使用することができる。本開示のアドレサブルアレイは、位置的にアドレサブルなオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含むことができ、各々はアレイ上の分散した位置にあり、オリゴヌクレオチドプローブ分子の群中の各プローブ分子は、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０の連続ヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。アドレサブルアレイは、典型的には、１つ以上の計量プローブを含み、場合により１つ以上の制御プローブ分子をさらに含んでもよい。
本開示の例示的なアドレサブルアレイは、以下のセクション６．３、ならびに番号付けされた実施形態９９～１４１および１７３～１７５に記載されている。
いくつかの態様では、本開示の方法の１つ以上の工程は、コンピュータ実装される。例示的なコンピュータ実装方法は、以下のセクション６．４、ならびに番号付けされた実施形態９７、９８、１４６、および１４７に記載されている。
別の態様において、本開示は、第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを（試料中に存在する場合）区別するためのシステムを提供する。例示的なシステムは、以下を含み得る：
（ａ）本開示のアレイの各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダ；および
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブ（例えば、本明細書に記載の特徴を有する仮想プローブ）についてのシグナルデータを分析するように構成され、
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置またはネットワークへのインターフェースを有するプロセッサ。
（ａ）本開示のアレイの各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダ；および
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブ（例えば、本明細書に記載の特徴を有する仮想プローブ）についてのシグナルデータを分析するように構成され、
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置またはネットワークへのインターフェースを有するプロセッサ。
例示的なシステムは、以下のセクション６．５、ならびに番号付けされた実施形態１４８～１５０に記載されている。
別の態様では、本開示は、仮想プローブでの使用に適した例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびそのようなオリゴヌクレオチドプローブ分子を２つ以上含むキットを提供する。本開示のオリゴヌクレオチドプローブ分子は、本開示のアドレサブルアレイに含めることができ、かつ／または本開示の方法で使用することができる。例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子および仮想プローブは、以下のセクション６．２．４および番号付けされた実施形態１５６～１７２に記載されている。例示的なキットは、以下のセクション６．６および番号付けされた実施形態１７６～１８７に記載されている。
５．図面の簡単な説明
図１Ａは、ＧｅｎＢａｎｋから入手したいくつかのブドウ球菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から調製したデンドログラムである（図１Ａと図１Ｂとの間で分割）。データの信頼性を示すために、ブートストラップ解析を備えたＣＬＣシーケンスビューアソフトウェアを使用してツリーを構築した。ブドウ球菌群の各種は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセッション番号によって示される２つの配列で表される。ツリーの各ノードのブートストラップ値（整数）は、複製全体のデータの信頼性のパーセンテージを定義する。ブートストラップ値が高いほど、各分類群のデータがより支持される。それぞれの種の横線は分枝と呼ばれ、その種における遺伝的変化の量を表す。分枝長の単位は、配列の長さで割った、変化または置換の数として示される。
図１Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋから入手したいくつかのブドウ球菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から調製したデンドログラムである（図１Ａと図１Ｂとの間で分割）。データの信頼性を示すために、ブートストラップ解析を備えたＣＬＣシーケンスビューアソフトウェアを使用してツリーを構築した。ブドウ球菌群の各種は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセッション番号によって示される２つの配列で表される。ツリーの各ノードのブートストラップ値（整数）は、複製全体のデータの信頼性のパーセンテージを定義する。ブートストラップ値が高いほど、各分類群のデータがより支持される。それぞれの種の横線は分枝と呼ばれ、その種における遺伝的変化の量を表す。分枝長の単位は、配列の長さで割った、変化または置換の数として示される。
図２Ａは、１６ｓ ｒＲＮＡおよび１６ｓ～２３ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の多重アラインメントから作成された、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄｉａｎｓ群由来の種のデンドログラムを表す（図２Ａと図２Ｂとの間で分割）。Ｉ－ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）群、ＩＩ－ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）群、ＩＩＩ－ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）群、ＩＶ－ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）群、およびＶ－ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）群。数字はブートストラップ値を表し、それはデータセットにおける信頼性のパーセンテージを示す。アラインメントパターンおよびそれらの病原的重要性に応じて、種は３つの群、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして扱われる。
図２Ｂは、１６ｓ ｒＲＮＡおよび１６ｓ～２３ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の多重アラインメントから作成された、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄｉａｎｓ群由来の種のデンドログラムを表す（図２Ａと図２Ｂとの間で分割）。Ｉ－ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）群、ＩＩ－ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）群、ＩＩＩ－ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）群、ＩＶ－ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）群、およびＶ－ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）群。数字はブートストラップ値を表し、それはデータセットにおける信頼性のパーセンテージを示す。アラインメントパターンおよびそれらの病原的重要性に応じて、種は３つの群、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして扱われる。
図３は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳゲノム配列、ならびに１６Ｓフォワード（１６Ｓ Ｆｗ）、１６Ｓリバース（１６Ｓ Ｒｖ）、ＩＴＳフォワード（ＩＴＳ Ｆｗ）およびＩＴＳリバース（ＩＴＳ Ｒｖ）プライマーの図である。
図４は、非伸長プライマー（対称ＰＣＲプロセスで使用される伝統的なプライマーであり得る）、ならびに標的核酸に相補的な「Ａ」領域、「Ａ」領域の少なくとも一部の定方向反復または逆方向反復を含む「Ｂ」領域、および任意選択で、スペーサー配列および／または全部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一部を含み得る任意の「Ｃ」領域から構成される伸長プライマーを含む、セクション６．２．３．４に記載の非対称ＰＣＲ法に有用なプライマー対を示す。
図５Ａは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子間ハイブリダイゼーションを示す。好ましくは、「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性の領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近傍である。
図５Ｂは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の定方向反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子間ハイブリダイゼーションを示す。好ましくは、「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性の領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近傍である。
図５Ｃは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子内ハイブリダイゼーションを示す。好ましくは、「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性の領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近傍である。
図６は、セクション６．２．３．４に記載されている非対称ＰＣＲ反応における変性工程を示す。変性工程では、ＰＣＲ反応混合物（典型的には、標的核酸を含有するか、または含有するリスクがある生物学的試料、非対称プライマー対、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬を含有する）を標的核酸の融点より高温に加熱し、非対称プライマー対中の標的核酸（存在する場合）および伸長プライマーを変性させて一本鎖を形成させる。
図７は、非伸長プライマーの融解温度未満で起こる、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的位相のアニーリング工程を示す。非対称プライマー対中の非伸長プライマーおよび伸長プライマーの両方が、それぞれの相補鎖にハイブリダイズする。図７は、ＰＣＲの最初のサイクルで起こるような標的ＤＮＡへのアニーリング（ハイブリダイゼーションまたは結合とも呼ばれる）を示すが、その後のサイクルでは、プライマーとＰＣＲ産物中の相補配列との間でアニーリングが起こりやすい。伸長プライマーにおける「Ｂ」領域および任意の「Ｃ」領域によって、ＰＣＲ産物は、図８Ｂおよび図９に示されるように、それらの配列またはそれらの相補体を有するであろう。
図８Ａは、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的位相の伸長工程を示し、この間に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として使用してプライマーＤＮＡを伸長する。伸長領域は破線で示されている。図８Ａの鋳型は標的ＤＮＡの鎖である。
図８Ｂは、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的位相の伸長工程を示し、この間に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として使用してプライマーＤＮＡを伸長する。伸長領域は破線で示されている。図８Ｂの鋳型は、非対称プライマー対および標的ＤＮＡを用いて作製されたＰＣＲ産物の鎖である。
図９は、セクション６．２．３．４に記載される、ＰＣＲ産物鎖２を鋳型として使用する、非対称ＰＣＲ反応の線形位相の同時アニーリングおよび伸長工程を示し、これは、非伸長プライマーの融解温度より高く、かつ伸長プライマーの融解温度より低い場合に起こる。これにより、ＰＣＲ産物鎖２の非対称増幅が起こり、ＰＣＲ反応の終了までに、ＰＣＲ産物鎖１分子に対して過剰なＰＣＲ産物鎖２分子が生じる。
図１０Ａは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）のための仮想プローブにおいて２つのプローブ分子がどのように使用され得るかを示す。ＰＣＲ増幅産物のハイブリダイゼーションからの２つのプローブ分子へのシグナルを、ブール演算子を使用して組み合わせて、ＣＮＳが試料中に存在するかどうかを決定することができる。
図１０Ｂは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）のための仮想プローブにおいて３つのプローブ分子がどのように使用され得るかを示す。ＰＣＲ増幅産物のハイブリダイゼーションからの３つのプローブ分子へのシグナルを、ブール演算子を使用して組み合わせて、ＣＮＳが試料中に存在するかどうかを決定することができる。
図１１Ａは、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）由来の１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナルを示す。
図１１Ｂは、肺炎レンサ球菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナルを示す。
肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）およびストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）由来のＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す。
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）および大腸菌由来のＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す。
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）由来のＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す。
エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アスブリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ）、およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）由来のＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す。
図１６Ａは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）およびコアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌の濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を増加させた場合のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比（Ｙ軸）を示す。図１６Ａは、直線Ｙ軸にプロットされた比率を示す。
図１６Ｂは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）およびコアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌の濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を増加させた場合のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比（Ｙ軸）を示す。図１６Ｂは、対数Ｙ軸にプロットされた比率を示す。
コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌を含有する試料についてのＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナル比（Ｘ軸）およびＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比（Ｙ軸）を示す。
６．発明を実施するための形態
６．１．定義
アンプリコン：アンプリコンは、ＰＣＲ増幅反応によって生成される核酸分子である。
６．１．定義
アンプリコン：アンプリコンは、ＰＣＲ増幅反応によって生成される核酸分子である。
非対称プライマー対：伸長プライマーと非伸長プライマーからなるプライマー対。
対応する：配列同一性または相補性を共有する異なる長さの２つの核酸鎖に関して、「対応する」という用語は、文脈が指示するように、両方の鎖に存在する配列共通部分の領域または相補性を指す。
定方向反復：伸長プライマーの「Ｂ」領域の文脈において、「定方向反復」は、「Ａ」領域の一部の定方向補足体である（すなわち、同じ５’から３’の順序の相補配列を有する）ヌクレオチド配列を意味する。
伸長プライマー：ＰＣＲプライマーであり、（ａ）その３’末端における、対応する領域の標的鎖１と少なくとも７５％の配列同一性または標的鎖２中の対応する領域と少なくとも７５％の配列相補性を有する「Ａ」領域；（ｂ）その５’末端における、「Ａ」領域の少なくとも一部に相補的な配列を含む「Ｂ」領域；および場合により（ｃ）「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間に配置された「Ｃ」領域を含有する。
相同ゲノム配列：相同ゲノム配列は、祖先を共有するがヌクレオチド配列が同一ではない異なる種または株に見られるゲノム配列である。例示的な相同ゲノム配列には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、および１６Ｓ－２３Ｓ内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ）配列が含まれる。
逆方向反復：伸長プライマーの「Ｂ」領域の文脈において、「逆方向反復」は、「Ａ」領域の一部の逆相補体である（すなわち、反対側の５’から３’の順序の相補配列を有する）ヌクレオチド配列を意味する。
融解温度（Ｔｍ）：ＤＮＡ二重鎖の半分が解離して一本鎖になる温度。デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）で構成される直鎖プライマーのＴｍは、一般に「パーセントＧＣ」法（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（ＵＳＡ）１９９０）または「２（Ａ＋Ｔ）プラス４（Ｇ＋Ｃ）」法（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６（１１）：３５４３－３５５７）または「最近傍」法（Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６０－１４６５；Ａｌｌａｗｉ ａｎｄ Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１０５８１－１０５９４）によって計算されている。特許請求の範囲のために、ＤＮＡのＴｍは「最近傍」法に従って計算され、天然に存在しない塩基（例えば、２－デオキシイノシン）はアデニンとして扱われる。
ＰＣＲ産物鎖１：ＰＣＲ産物鎖１は、標的核酸、および非対称プライマー対の非伸長プライマーに相補的な非対称プライマー対から生成された二本鎖ＰＣＲ産物中の鎖を指す。
ＰＣＲ産物鎖２：ＰＣＲ産物鎖１は、標的核酸、および非対称プライマー対の伸長プライマーに相補的な非対称プライマー対から生成された二本鎖ＰＣＲ産物中の鎖を指す。
ＰＣＲ試薬：文脈が特に指示しない限り、「ＰＣＲ試薬」という用語は、鋳型核酸、熱安定性ポリメラーゼおよびプライマー以外のＰＣＲ反応の成分を指す。ＰＣＲ試薬は、典型的には、ｄＮＴＰ（非標識ｄＮＴＰに加えて、標識、例えば蛍光標識ｄＮＴＰを含み得る）、緩衝液、および二価カチオンを含有する塩（例えば、ＭｇＣｌ２）を含む。
プライマー：３’末端に遊離ヒドロキシル基を有する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチド。プライマーは、天然および非天然ヌクレオチド（例えば、ユニバーサル塩基を含有するヌクレオチド、例えば３－ニトロピロール、５－ニトロインドールまたは２－デオキシイノシン、好ましくは２－デオキシイノシン）を含むことができる。文脈がそうでないことを指示しない限り、用語「プライマー」はまた、プライマー分子の混合物を指し、それは混合塩基をプライマー設計および構築に含めて、それらを標的核酸分子中のバリアント配列にハイブリダイズさせると生成される。標的配列バリアントは、種間または種内バリアントであり得る。混合塩基の標準的な命名法を表１に示す：
好ましくは、各プライマーは、標的核酸に対する相補性の領域に３つ以下の混合塩基を含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、標的核酸に対する相補性の領域において、０、１、２または３個の混合塩基を含む。
プライマー対：フォワードおよびリバースプライマー対（それぞれが、標的配列の可能な変異を説明する配列変異を含むプライマーの混合物であり得る）であり、５，０００塩基対未満の領域内の同じ核酸分子の異なる鎖とハイブリダイズし、そこからＤＮＡ重合反応を開始することができる。特定の実施形態では、プライマー対は、２，５００塩基対未満または１，５００塩基対未満の領域内の同じ核酸分子の異なる鎖とハイブリダイズし、そこからＤＮＡ重合反応を開始することすることができる。
試料：本明細書で使用される「試料」という用語は、目的の核酸、例えばゲノム、ゲノムフラグメント、ゲノムの領域に対応するアンプリコン、または別の標的核酸を含むかまたは含むと疑われる任意の試料を指す。試料は、１つ以上のプロセスに供することができ、それでも「試料」と見なすことができる。例えば、ＰＣＲ増幅反応に供された試料は、ＰＣＲ増幅反応後も「試料」のままである。
単一アンプリコン：本明細書で使用される「単一アンプリコン」という用語は、単一のプライマー対を有する単一の生物からＰＣＲ増幅反応によって作製される核酸分子または核酸分子の群を指す。典型的には、「単一アンプリコン」は、固有の配列を有するＰＣＲ産物を指すが、例えば生物が増幅される配列についてヘテロ接合性である場合、固有配列の群、例えば対を有するＰＣＲ産物を指すこともできる。
特異的：アンプリコンへのプローブ分子の結合に関して本明細書で使用される「特異的」という用語は、プローブ分子がその標的アンプリコンに対して他の非相同アンプリコンよりも大きい親和性、典型的にははるかに大きい親和性を有することを意味するが、プローブ分子がその標的に絶対的に特異的であることを必要としない。したがって、プローブ分子は、例えば、第１のゲノム配列を含むアンプリコン、および１つ以上のヌクレオチドが第１のゲノム配列とは異なる第２の相同ゲノム配列を含むアンプリコンにハイブリダイズすることができる。
標的鎖１：標的鎖１は、非対称プライマー対の非伸長プライマーが相補的である、二本鎖標的核酸中の鎖を指す。
標的鎖２：標的鎖２は、非対称プライマー対の伸長プライマーの「Ａ」領域が相補的である、二本鎖標的核酸中の鎖を指す。
非伸長プライマー：ＰＣＲプライマーであって、標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性、または標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列相補性を有するヌクレオチド配列から本質的になる。非伸長プライマーに関して「から本質的になる」という用語は、ヌクレオチド配列が、標的配列に（少なくとも７５％）相補性な領域に対して３個以下のさらなるヌクレオチド５’を含み得ることを意味する。
６．２．仮想プローブを用いた相同ゲノム配列を区別する方法
本開示は、第１の生物からの第１のゲノム配列と、第２の生物からの第２の相同ゲノム配列とを区別するための方法を提供する。方法は、仮想プローブを使用して試料中に存在する生物の同定を可能にする。ゲノム配列のための仮想プローブは、一般に、例えば、アドレサブルアレイ上のそれらの離散した位置によって、または例えば、異なる蛍光部分による示差的標識によって区別され得る２つ以上のプローブ分子を含む。便宜上、仮想プローブ内の個々のプローブ分子からの読み出しは、本明細書では「シグナル」と呼ばれることがある。明確性のために、プローブ分子を標識して「シグナル」を生成する必要はない。例えば、蛍光標識されたアンプリコンへのハイブリダイゼーションが無いと、「シグナル」を構成することができる。
本開示は、第１の生物からの第１のゲノム配列と、第２の生物からの第２の相同ゲノム配列とを区別するための方法を提供する。方法は、仮想プローブを使用して試料中に存在する生物の同定を可能にする。ゲノム配列のための仮想プローブは、一般に、例えば、アドレサブルアレイ上のそれらの離散した位置によって、または例えば、異なる蛍光部分による示差的標識によって区別され得る２つ以上のプローブ分子を含む。便宜上、仮想プローブ内の個々のプローブ分子からの読み出しは、本明細書では「シグナル」と呼ばれることがある。明確性のために、プローブ分子を標識して「シグナル」を生成する必要はない。例えば、蛍光標識されたアンプリコンへのハイブリダイゼーションが無いと、「シグナル」を構成することができる。
ゲノム配列のための各仮想プローブは、ゲノム配列に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる（仮想プローブを構成する複数のプローブ分子のうちの）少なくとも１つのプローブ分子を含む。いくつかの例では、仮想プローブ中の２つ以上のプローブ分子は、ゲノム配列に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）にハイブリダイズすることができる。関連するゲノム配列からの異なる標的核酸（例えば、アンプリコン）に対する仮想プローブ中のプローブ分子のハイブリダイゼーションパターンは、標的核酸を関連するゲノム配列から区別するための、例えば第１のゲノムからの第１のアンプリコンセットと、相同ゲノム配列を有する第２のゲノムからの第２のアンプリコンセットとを区別するための十分な相違がある。方法を使用して、例えば、プロービングされるアンプリコンが増幅された試料中に細菌の特定の種または株が存在するかを、直接的に（例えば、試料がＰＣＲに直接利用される場合）または間接的に（例えば中間精製または濃縮工程、例えば、セクション６．２．１に記載のビーズビーティング法を介して）決定することができる。本明細書に開示される様々な実施形態は、仮想プローブを用いて、ＰＣＲ反応などのＤＮＡ増幅反応の産物のプロービングを記載する。しかしながら、プロービングは、代わりとして非増幅ゲノムＤＮＡを検出することができる方法を使用して行うことができることを理解されたい。非増幅ゲノムＤＮＡを検出するための例示的な方法は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，２０１２，Ｓｐｏｔｏ ａｎｄ Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ（ｅｄｓ）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－９４－００７－１２２６－３に記載されており、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。そのような方法には、光学的検出方法（例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのｐｐ．１５３－１８３、Ｌｉ ａｎｄ Ｆａｎ，２０１２、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」を参照）、電気化学的検出方法（例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのｐｐ．１８５－２０１、Ｍａｒｉｎ ａｎｄ Ｍｅｒｋｏｃｉ，２０１２，「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｂａｓｅｄ Ｓｅｎｓｏｒｓ」を参照）、圧電感知方法（例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのｐｐ．２０３－２３３、Ｍｉｎｕｎｎｉ、２０１２、「Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ」を参照）、表面プラズモン共鳴ベースの方法（例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのｐｐ．２３５－２６１、Ｄ’Ａｇａｔａ ａｎｄ Ｓｐｏｔｏ、２０１２、「Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照）、ならびに並列光学および電気化学的方法（例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのｐｐ．２６３－２７８、Ｋｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，「Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｏｐｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」を参照）が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、試料のプロービングは、ＤＮＡ増幅工程無しで行われる（例えば、試料が、ゲノムフラグメントである標的核酸を含有するか、または含有すると疑われる場合）。
試料中に第１の生物由来の第１のゲノムまたは第２の生物由来の第２のゲノムのいずれかが存在する場合、それらの存在を決定する方法は、第１のゲノムおよび第２のゲノムにハイブリダイズして、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、（例えば、セクション６．２．３に記載されているように）試料に対してＰＣＲ増幅反応を実施する工程を含み得る。試料中に存在する場合、第１のゲノムからの増幅は、第１のアンプリコンセットをもたらす。試料中に存在する場合、第２のゲノムからの増幅は、第２のアンプリコンセットをもたらす。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングして、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を判定することができる。プロービングは、ＰＣＲ増幅反応中（例えば、リアルタイムＰＣＲを使用する場合、例えばセクション６．２．３．５に記載のように）またはＰＣＲ増幅反応後（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ分子を含むアレイを使用することによって、例えばセクション６．３に記載のように）に行うことができる。プロービングがＰＣＲ反応後に、例えばアレイ上で行われる場合、得られるＰＣＲアンプリコンを標識するためにＰＣＲ混合物中に蛍光標識ヌクレオチドを含めることが有用である。アドレサブルアレイ上の蛍光標識の位置、および場合によってはその強度は、仮想プローブを構成するプローブ分子のシグナルを構成し得る。
第１のアンプリコンセットが存在すると決定されれば、試料は第１のゲノムを含むと結論付けることができる。同様に、第２のアンプリコンセットが存在すると決定されれば、試料は第２のゲノムを含むと結論付けることができる。仮想プローブを使用して、例えばコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種およびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種（例えば、セクション６．２．５．１に記載されるように）、Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、セクション６．２．５．２項に記載されているように）、またはＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌（例えば、６．２．５．３に記載されているように）など、関連する微生物から調製された第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。
試料は、例えば、生物学的試料、環境的試料、または食品であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、１つ以上の微生物に感染しているか、または感染のリスクがある。例示的な試料は、セクション６．２．１に記載されている。
任意の相同ゲノム配列（および相同ゲノム配列に対応するアンプリコン）を区別するための本開示の方法の使用が企図される。細菌の種または細菌の関連種が試料中に存在する可能性があるかどうかを判定する場合、ｒＲＮＡ（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡまたは２３Ｓ ｒＲＮＡ）をコード化するゲノム配列に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）、またはｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ－２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間スペーサー領域）を区別することができる仮想プローブを使用することができる。本開示の方法によって区別することができる例示的な相同ゲノム配列の特徴は、セクション６．２．２に記載されている。
本開示の方法による仮想プローブでプロービングするためのアンプリコンは、第１の生物および／または第２の生物を含有するか、または含有することが疑われるか、または含有するリスクがある試料に対して、第１の生物のゲノムおよび第２の生物のゲノムにハイブリダイズし、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅反応を行うことによって作製することができる。ＰＣＲ増幅反応は、１組のプライマーを用いて行うことができる（第１および第２の生物が試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンを作製するはずである）。あるいは、ＰＣＲ増幅反応は、第１および第２の生物がそれぞれ試料中に存在する場合、第１のゲノムに対応する複数のアンプリコンおよび第２のゲノムに対応する複数のアンプリコンを作製するために、プライマーの複数のセットを用いて行うことができる。本開示の方法で使用することができる例示的なＰＣＲ増幅反応は、セクション６．２．３に記載されている。ＰＣＲ（例えば、等温増幅技術）以外の核酸増幅技術、例えばループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）もアンプリコンを調製するために使用することができる（例えば、Ｆａｋｒｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉ．５（４）：２４５－２５２を参照されたい）。したがって、ＰＣＲ増幅産物に適用可能であるとして本明細書に記載される実施形態は、代替の増幅方法を使用して作製される増幅産物にも同様に適用可能であることを理解されたい。
仮想プローブで使用することができるプローブ分子の例示的な特徴、および仮想プローブの例示的な特徴は、それぞれセクション６．２．４および６．２．５に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅産物のプロービングは、例えばセクション６．３に記載されているように、ＰＣＲ増幅産物をアレイと接触させる工程、アレイから未結合核酸分子を洗浄する工程、およびアレイ上の各プローブ分子位置で標識（例えば、蛍光標識）のシグナル強度を測定する工程を含む。好ましくは、アレイは、１つ以上の計量プローブを含む。
他の実施形態では、ＰＣＲ増幅産物のプロービングは、リアルタイムＰＣＲ反応で使用されるオリゴヌクレオチドプローブ分子からのシグナルを測定することを含む。
本開示の方法を実行するために使用することができるシステムは、セクション６．４に記載されている。
本開示の方法で使用することができるキットは、セクション６．６に記載されている。
６．２．１．試料
本開示の方法で使用される試料は、ＰＣＲ増幅に適した状態にある、またはその状態にあるように調製することができるゲノムＤＮＡを含有する任意のタイプまたは形態の試料であり得る。特定の実施形態では、試料は、１つ以上の微生物、例えば微生物の１つ以上の種による感染のリスクがある。別の実施形態では、試料は、１つ以上の微生物、例えば微生物の１つ以上の種による感染を有すると疑われる。試料は、例えば、生物学的試料、環境的試料、または食品であり得る。
本開示の方法で使用される試料は、ＰＣＲ増幅に適した状態にある、またはその状態にあるように調製することができるゲノムＤＮＡを含有する任意のタイプまたは形態の試料であり得る。特定の実施形態では、試料は、１つ以上の微生物、例えば微生物の１つ以上の種による感染のリスクがある。別の実施形態では、試料は、１つ以上の微生物、例えば微生物の１つ以上の種による感染を有すると疑われる。試料は、例えば、生物学的試料、環境的試料、または食品であり得る。
試料の例としては、各種の流体試料が挙げられる。いくつかの例では、試料は、対象からの体液試料であり得る。試料は、対象から採取された組織を含み得る。試料は、対象の体液、分泌物、および／または組織を含むことができる。試料は、生物学的試料であり得る。生物学的試料は、体液、分泌物、および／または組織試料であり得る。生物学的試料の例としては、限定されないが、血液、血清、唾液、尿、胃および消化液、涙、便、精液、膣液、腫瘍組織からの間質液、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、手指爪、皮膚細胞、血漿、鼻スワブまたは鼻咽頭洗浄液、髄液、脳脊髄液、組織、喉スワブ、創傷スワブ、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、腹水、空洞液、痰、膿または他の創傷滲出液、創傷デブリードマンもしくは切除によってサンプリングされた感染組織、脳脊髄液、洗浄液、白血病標本、腹膜透析液、乳および／または他の排泄物が挙げられる。
対象は試料を提供することができ、かつ／または試料は対象から収集することができる。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。試料は、生きている、または死んだ対象から収集することができる。動物は、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ）、スポーツ動物（例えば、ウマ）、またはペット（例えば、イヌまたはネコ）などの哺乳動物であり得る。対象は、患者、臨床対象または前臨床対象であり得る。対象は、診断、治療、および／または疾患管理もしくは生活様式もしくは予防ケアを受けている場合がある。対象は、医療専門家の管理下にあってもなくてもよい。
いくつかの実施形態では、試料は環境的試料であり得る。環境的試料の例としては、空気試料、水試料（例えば、地下水、地表水、または廃水）、土壌試料、植物試料が挙げられる。
さらなる試料には、食品、飲料、製造材料、織物、化学物質、および療法が含まれる。
いくつかの実施形態では、試料は、病原体、例えば、結核菌、ヨーネ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、黄色ブドウ球菌（メチシリン感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む）、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、モラキセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、クレブシエラ肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター属菌、百日咳菌、髄膜炎菌、炭疽菌、ノカルジア属菌、アクチノミセス属菌、肺炎マイコプラズマ、クラミジア肺炎、レジオネラ属種、ニューモシスチス・イロベチイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ）、インフルエンザＡウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、コリネバクテリウム・アミコラタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＩ ４４１３、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ステノトロフォモナス（キサントモナス属）・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、およびサルモネラ属菌の１つ以上を含有するか、または含有すると疑われる試料である。いくつかの実施形態では、試料は、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・アスブリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ）、またはエンテロバクター・ホルメシェイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）などの腸内細菌科群細菌を含有するか、または含有する疑いがある試料である。
ＰＣＲ増幅を行う前に試料を前処理することができる。したがって、本開示の方法においてＰＣＲ増幅に供される試料は、例えば、本開示の本セクションまたは他の箇所に記載される任意のタイプの試料から加工、抽出または分別される試料であり得る（例えば、尿、痰、創傷スワブ、血液または腹膜透析液から加工、抽出または分別された試料）。
使用され得る前処理工程の例としては、本明細書で論じられるような、または当技術分野で公知のような、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などが挙げられる。
ＰＣＲの前に生物学的試料から望ましくない細胞型および粒子状物質を除去して、目的の細胞型からのゲノムＤＮＡの回収を最大化することが特に有利であり得る。
生物学的試料中の細菌を検出することを目的とする場合、生物学的試料をフィルターによって、細菌細胞（必要に応じてそれらの胞子を含む）を通過させながら微粒子および非細菌細胞がフィルター上に保留されるように前処理することが望ましい場合がある。本明細書で使用される「フィルター」は、サイズに基づいて粒子および分子を差別的に通過させる膜または装置である。典型的には、これは、特定の公称サイズのフィルターに孔を開けることによって達成される。例えば、細菌検出用途の特定の目的のフィルターは、細菌を通過させるのに十分大きいが、目的の試料中に存在する真核細胞の通過を防止するのに十分小さい孔を有する。一般に、細菌細胞は直径０．２～２μｍ（マイクロメートルまたはミクロン）の範囲であり、ほとんどの真菌細胞は直径１～１０μｍの範囲であり、血小板は直径約３μｍであり、ほとんどの有核哺乳動物細胞は典型的には直径１０～２００μｍである。したがって、細菌の検出を目的とする場合、２μｍ未満または１μｍ未満のフィルター孔径は、生物学的試料から非細菌細胞を除去するのに特に適している。
濾過工程に加えて、またはその代わりに、生物学的試料を遠心分離に供して、試料から細胞および残屑を除去することができる。真核生物細胞を沈殿させるが細菌細胞を沈殿させない遠心分離パラメータは、当技術分野で公知である。所望であれば、次いで上清を濾過することができる。
試料は、当技術分野で公知のＰＣＲ用のゲノムＤＮＡを含む試料を調製するための、様々なプロセスのいずれかを使用してＰＣＲ増幅のために調製することができる（例えば、上記の前処理工程の１つ以上の後に）。いくつかの実施形態では、市販のＤＮＡ抽出試薬、キットおよび／または機器、例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを使用することができる。
いくつかの実施形態では、試料は、ビーズビーティングを含むプロセスによって、例えば米国特許第１０，０３６，０５４号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようにＰＣＲ用に調製される。血液は市販の採血管に採取された後、例えば、採取管にビーズビーティングビーズを添加して採取管を撹拌することにより、直ちにビーズビーティングに供され得る。血液試料を採取するために使用され得る市販の採取管の例としては、ＥＤＴＡを含有するラベンダートップ管、クエン酸ナトリウムを含有するライトブルートップ管、シュウ酸カリウムを含有するグレートップ管、またはヘパリンを含有するグリーントップ管が挙げられる。
６．２．２．相同ゲノム配列
本開示の方法は、第１および第２の相同ゲノム配列（ならびに標的核酸、例えば第１および第２の相同ゲノム配列に対応するアンプリコン）を同定および／または区別するために使用することができる。相同ゲノム配列は、祖先を共有するがヌクレオチド配列が同一ではない種または株に見られるゲノム配列である。したがって、例えば、相同ゲノム配列は、細菌の密接に関連した種または株において見出される。
本開示の方法は、第１および第２の相同ゲノム配列（ならびに標的核酸、例えば第１および第２の相同ゲノム配列に対応するアンプリコン）を同定および／または区別するために使用することができる。相同ゲノム配列は、祖先を共有するがヌクレオチド配列が同一ではない種または株に見られるゲノム配列である。したがって、例えば、相同ゲノム配列は、細菌の密接に関連した種または株において見出される。
第１のゲノム配列および第２のゲノム配列は、一般に、第１の微生物および第２の微生物（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）由来のゲノム配列である。第１および／または第２の微生物は、例えば、ヒト病原体および／または動物病原体であり得る。微生物は、同じ目、同じ科、同じ属、同じ群、または同じ種であってもよい。好ましい実施形態では、第１および第２の微生物は細菌である。
配列決定技術の進歩により、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）など、多くの公開データベースリポジトリで利用可能な全細菌ゲノム配列の数が大幅に増加し、そのようなデータベースを使用して相同ゲノム配列を同定することができる。
密接に関連する微生物における相同ゲノム配列は、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子、およびｒＲＮＡをコード化する遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に見られることが多い。細菌種の配列比較は、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の遺伝子を使用して長い間行われてきた。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、タンパク質産生を担うタンパク質／ＲＮＡ複合体である細菌リボソームの３０Ｓ小サブユニットの１６Ｓ ＲＮＡ成分をコード化する。遺伝子は、９つの超可変領域（Ｖ１～Ｖ９）が散在する高度に保存された配列の領域を含む。超可変領域の配列変異は、密接に関連する種間の観察可能な差異のほとんどを可能にする。これらの遺伝子の中で観察される配列進化の速度が遅いため、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、多くの細菌種についての系統樹を構築するのに使用されてきた。ＧｅｎＢａｎｋから入手したいくつかのブドウ球菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から調製した例示的系統樹を図１に示す。
細菌ゲノムは、第２のリボソームｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、１６Ｓ－２３Ｓ内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ）または１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域として知られるスペーサー領域によって互いに分離されている。１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域は、特定の細菌種を区別および同定するために使用することができる種および種間特異的配列を含む超可変領域を含む（Ｋ．Ｏｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．、２０１２）。１６ｓ ｒＲＮＡおよび１６ｓ－２３ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の多重アラインメントから作成されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄｉａｎｓ群の例示的系統樹を図２に示す。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域のヌクレオチド配列を含む。
微生物が細菌である実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ゲノム配列は、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に見出されるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のゲノム配列および／または第２の相同ゲノム配列は、ヒトの血液、尿または腹水中に見られ得る病原体、例えば細菌、ウイルスまたは真菌由来のゲノム配列である。そのような病原体の例には、限定されないが、結核菌、ヨーネ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、黄色ブドウ球菌（メチシリン感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む）、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、モラキセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、クレブシエラ肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター属菌、百日咳菌、髄膜炎菌、炭疽菌、ノカルジア属菌、アクチノミセス属菌、肺炎マイコプラズマ、クラミジア肺炎、レジオネラ属種、ニューモシスチス・イロベチイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ）、インフルエンザＡウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、コリネバクテリウム・アミコラタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＣＩ ４４１３、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ステノトロフォモナス（キサントモナス属）・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、およびサルモネラ属菌が含まれる。
６．２．３．ＰＣＲ増幅
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、試料中に存在し得るゲノムにハイブリダイズし、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、試料に対して行われる。ＰＣＲ増幅反応は、「対称」ＰＣＲ反応であり得る、すなわち、反応は、互いに等しい、または数℃範囲内にある「融解温度」または「Ｔｍ」を有するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することによって鋳型ＤＮＡの二本鎖コピーを作成する。プライマー設計のために一般的に使用されるコンピュータソフトウェアプログラムは、高いＴｍ差を回避するようにユーザに警告し、自動Ｔｍマッチング機能を有する。一本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製することができる「非対称」ＰＣＲ反応も使用することができる。リアルタイムＰＣＲ反応も使用することができる。ＰＣＲ増幅反応の文脈において、反応によって増幅されたゲノム配列は、「標的」核酸、「鋳型」核酸などと呼ぶことができる。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、試料中に存在し得るゲノムにハイブリダイズし、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、試料に対して行われる。ＰＣＲ増幅反応は、「対称」ＰＣＲ反応であり得る、すなわち、反応は、互いに等しい、または数℃範囲内にある「融解温度」または「Ｔｍ」を有するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することによって鋳型ＤＮＡの二本鎖コピーを作成する。プライマー設計のために一般的に使用されるコンピュータソフトウェアプログラムは、高いＴｍ差を回避するようにユーザに警告し、自動Ｔｍマッチング機能を有する。一本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製することができる「非対称」ＰＣＲ反応も使用することができる。リアルタイムＰＣＲ反応も使用することができる。ＰＣＲ増幅反応の文脈において、反応によって増幅されたゲノム配列は、「標的」核酸、「鋳型」核酸などと呼ぶことができる。
ＰＣＲ増幅反応は、単一のプライマーセットまたは複数のプライマーセット（例えば、ＰＣＲ増幅がマルチプレックスＰＣＲである場合）を使用することができる。マルチプレックスＰＣＲは、例えば、第１のゲノム配列（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）に対応するアンプリコンおよび／または第２のゲノム配列（例えば、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）に対応する異なるアンプリコンを作製するのに有用であり得る。マルチプレックスＰＣＲの代替として、異なるプライマーセットを用いて実施された別々のＰＣＲ増幅反応によって作製されたアンプリコンを、その後の分析のためにプールすることができる。有利には、単一のプライマーセットを使用して、複数の株または種、例えば、同じ属のメンバーであり得る２、３、４または４を超える種のゲノムに見られる相同ゲノム配列に対応するアンプリコンを作製することができる。
ＰＣＲ増幅条件は、例えば、ＤＮＡ増幅産物が１００～１０００ヌクレオチド長になるように選択（対称または非対称、シングルプレックスまたはマルチプレックス）することができる。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長になるように選択される。別の実施形態において、ＰＣＲ条件は、ＤＮＡ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長になるように選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用されるＰＣＲ増幅反応は、反応によって作製される任意のアンプリコン中に測定可能なシグナルを生成する標識を組み入れる。標識は、例えば、蛍光標識、電気化学標識または化学発光標識であり得る。蛍光標識は、ＰＣＲ中の蛍光標識ヌクレオチド取り込みおよび／またはＰＣＲのための標識プライマーの使用によって達成することができる。電気化学的標識は、ＰＣＲ中の酸化還元活性標識ヌクレオチド取り込みによって、および／またはＰＣＲのための酸化還元活性標識プライマーの使用によって達成することができる（例えば、Ｈｏｃｅｋ ａｎｄ Ｆｏｊｔａ，２０１１，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，４０：５８０２－５８１４；Ｆｏｊｔａ，２０１６，Ｒｅｄｏｘ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ．Ｉｎ：Ｎｉｋｏｌｅｌｉｓ Ｄ．，Ｎｉｋｏｌｅｌｉ ＧＰ．（ｅｄｓ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍを参照されたい）。化学発光標識は、例えば、ＰＣＲ用のビオチン標識プライマーの使用、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲートの結合、次いで化学発光１，２－ジオキセタン基質とのインキュベートによって達成することができる。
適切な蛍光部分の例としては、ＦＩＴＣ、ＥＤＡＮＳ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、６－ｊｏｅ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ａｌｅｘａ ５３２、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５６４、ＢＯＤＩＰＹ ５８１、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄおよびｘ－ローダミンが挙げられる。
蛍光部分は、ｄＮＴＰ、特に塩基としてシトシンを含有するもの（シチジル酸、シチジン５’－ホスフェート、シチジン５’－ジホスフェート、シチジン５’－トリホスフェート、またはそのポリマー、またはシチジル酸を含むポリマー）に結合することができる。
ｄＮＴＰ標識は、塩基（アミノ基）、ホスフェート基（ＯＨ基）またはデオキシリボース部分（２’－または３’－ＯＨ基）に配置され得る。好ましくは塩基に配置される。
他のヌクレオチドと同様に、蛍光標識されたｄＮＴＰは、ランダムな部位、典型的にはｄＣ部位でＰＣＲアンプリコンの両方の鎖に組み込まれ、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。
蛍光ｄＮＴＰは高濃度の形態で市販されており、各非標識ｄＮＴＰの濃度を調整することなくＰＣＲ反応混合物に添加することができる。ほとんどのＰＣＲ増幅では、ｄＮＴＰ対蛍光ｄＮＴＰの典型的な比は、１００：１～１０００：１である。したがって、蛍光標識されたｄＮＴＰを、非標識ｄＮＴＰの（モル）量の０．１％～１％でＰＣＲ試薬の中に含めることができる。
蛍光標識ＰＣＲ産物の検出は、プローブ分子、例えばマイクロアレイに結合したプローブ分子へのハイブリダイゼーションによって達成することができる。適切なマイクロアレイシステムは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７３８，９２６号に記載されているような三次元架橋ポリマーネットワークを利用する。
６．２．３．１．プライマー
ＰＣＲ反応で利用されるプライマーは、所与の核酸鋳型の配列、例えば標的ゲノム配列を認識し、それにハイブリダイズするように設計される。プライマーおよび標的核酸鋳型の配列におけるミスマッチは、ＰＣＲ反応の効率の低下および／または所望の配列以外の配列の増幅をもたらし得る。プライマー設計を成功させるためのパラメータは当技術分野で周知であり（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９３を参照）、プライマー長、融解温度、ＧＣ含有量などを含む。ＰＣＲプライマーは、所与の標的核酸鋳型と１００％の配列同一性を共有する必要はなく、標的配列と少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％または９９．５％の同一性を有するＰＣＲプライマーは、標的配列にハイブリダイズし、その増幅を可能にするように機能し得る。
ＰＣＲ反応で利用されるプライマーは、所与の核酸鋳型の配列、例えば標的ゲノム配列を認識し、それにハイブリダイズするように設計される。プライマーおよび標的核酸鋳型の配列におけるミスマッチは、ＰＣＲ反応の効率の低下および／または所望の配列以外の配列の増幅をもたらし得る。プライマー設計を成功させるためのパラメータは当技術分野で周知であり（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９３を参照）、プライマー長、融解温度、ＧＣ含有量などを含む。ＰＣＲプライマーは、所与の標的核酸鋳型と１００％の配列同一性を共有する必要はなく、標的配列と少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％または９９．５％の同一性を有するＰＣＲプライマーは、標的配列にハイブリダイズし、その増幅を可能にするように機能し得る。
本開示は、高い特異性および良好な増幅効率を有する独特のプライマーシステムを調製するのに適した、追加のパラメータを提供する。プライマーは、典型的には１８～２４塩基長であるが、さらに長くてもよく、例えば２５～５０塩基長、例えば２５～４５塩基長、例えば３０～４５塩基長、例えば３５～４５塩基長、例えば４０～４５塩基長、または例えば４０～５０塩基長であってもよい。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、対で設計されることが多く、１つのプライマーは「フォワード」プライマーと呼ばれ、１つのプライマーは「リバース」プライマーと呼ばれる。本開示のフォワードプライマーは、「ＧＣ－クランプ」を提供するように、３’末端にＧおよび／またはＣ残基を有するように設計することができる。ＧおよびＣヌクレオチド対は、Ａ－Ｔヌクレオチド対よりも強い水素結合を示す；したがって、プライマーの３’末端におけるＧＣ－クランプは、配列特異性の増加、ハイブリダイゼーションの可能性の増加、およびＰＣＲ反応の全体的な効率の増加に役立ち得る。
プライマーのセットは、２つのゲノム領域を増幅するように設計することができ、例えば、プライマーのセットは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な１つのプライマー対および１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域に特異的な第２のプライマー対を含むことができる（図３参照）。そのようなプライマーセットを使用して、例えば、単一のＰＣＲ反応で複数のアンプリコンを作製することができる。
ＰＣＲプライマー対は、多数の種にわたって保存された配列を増幅するように、例えば、複数の細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するように設計することができる。したがって、単一のＰＣＲプライマー対を使用して相同ゲノム配列に対応するアンプリコンを生成することが可能であり得、これは、多数の可能性のある生物のうちの１つを含むかまたは含むと疑われる試料に対してＰＣＲを行う場合に有利である。保存された配列を増幅するように設計されたプライマーのパラメータは、様々な種にわたって保存された領域を同定すること、場合により、保存された領域における任意の配列の差異を適正として検証すること（例えば、公開された配列の正確さが確実でない場合）、および配列全体で少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％、またはさらには１００％保存されている配列を選択することを含み得る。１００％未満の配列同一性を示すプライマーは、単に所与の鋳型とは異なる１つ以上の単一ヌクレオチド塩基を含有してもよく、すなわち、調製物中のすべてのプライマーは互いに同じ配列を含有する。あるいは、プライマーは、配列中の特定の位置に代替ヌクレオチド残基を含有するように調製することができる。例えば、いくつかの種の１６Ｓ領域の増幅のためのリバースプライマーは、オリゴヌクレオチドのプールを含むことができ、そのパーセンテージ、例えば５０％は、プライマー中のある位置に第１のヌクレオチドを含み、そのパーセンテージ、例えば５０％は、その位置に第２のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で利用されるプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識される。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプライマーは、５’蛍光標識されている。他の実施形態では、複数のプライマーが５’蛍光標識される。標識プライマーに適した蛍光標識は当技術分野で公知であり、Ｃｙ５、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡが挙げられる。
６．２．３．２．対称ＰＣＲ増幅
本開示の方法において使用され得る典型的な３段階ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（ＵＳＡ）１９９０，Ｃｈａｐｔｅｒ １を参照）は、９３～９５℃で５秒間超の変性または鎖融解、５５～６５℃で１０～６０秒間のプライマーアニーリング、およびポリメラーゼが高活性である温度、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは７２℃で１５～１２０秒間のプライマー伸長を含み得る。典型的な２段階ＰＣＲプロトコルは、プライマー伸長と同じプライマーアニーリング温度、例えば６０℃または７２℃を有することによって異なり得る。３段階ＰＣＲまたは２段階ＰＣＲのいずれかの場合、増幅は、反応混合物を前述の一連の工程を通して何度も、典型的には２５～４０回循環させることを含む。反応の過程の間、反応の個々の工程の時間および温度は、サイクルごとに不変のままであってもよく、または効率の促進または選択性の向上のために反応の過程の１つ以上の時点で変更されてもよい。
本開示の方法において使用され得る典型的な３段階ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（ＵＳＡ）１９９０，Ｃｈａｐｔｅｒ １を参照）は、９３～９５℃で５秒間超の変性または鎖融解、５５～６５℃で１０～６０秒間のプライマーアニーリング、およびポリメラーゼが高活性である温度、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは７２℃で１５～１２０秒間のプライマー伸長を含み得る。典型的な２段階ＰＣＲプロトコルは、プライマー伸長と同じプライマーアニーリング温度、例えば６０℃または７２℃を有することによって異なり得る。３段階ＰＣＲまたは２段階ＰＣＲのいずれかの場合、増幅は、反応混合物を前述の一連の工程を通して何度も、典型的には２５～４０回循環させることを含む。反応の過程の間、反応の個々の工程の時間および温度は、サイクルごとに不変のままであってもよく、または効率の促進または選択性の向上のために反応の過程の１つ以上の時点で変更されてもよい。
ＰＣＲ反応混合物は、プライマー対および標的核酸に加えて、典型的に等モル濃度の４つのデオキシリボヌクレオチド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）のそれぞれ、熱安定性ポリメラーゼ、二価カチオン（典型的にはＭｇ２＋）および緩衝剤を典型的に含む。そのような反応物の体積は、典型的には２０～１００μｌである。複数の標的配列を同じ反応で増幅することができる。特定のＰＣＲ増幅のサイクル数は、ａ）出発物質の量、ｂ）反応の効率、およびｃ）検出の方法および感度、またはその後の産物の分析を含むいくつかの要因に依存する。典型的な循環増幅反応のためのサイクル条件、試薬濃度、プライマー設計、および適切な装置は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８）Ｃｈａｐｔｅｒ １５：「Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（米国）を参照されたい））。
６．２．３．３．非対称ＰＣＲ増幅
例示的な非対称ＰＣＲ法は、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８５：７６５２－７６５６（１９８８）；およびＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，１９９１、米国特許第５，０６６，５８４号に記載されている。伝統的な非対称ＰＣＲは、一方のプライマーが制限された量で、典型的には他方のプライマーの１／１００～１／５の濃度で添加されるという点で対称ＰＣＲとは異なる。二本鎖アンプリコンは、対称ＰＣＲの場合と同じく、初期温度サイクル中に蓄積するが、開始鋳型の数に応じて、典型的には１５～２５回のＰＣＲサイクル後に１つのプライマーが枯渇する。１つの鎖の線形増幅は、枯渇していないプライマーを利用してその後のサイクル中に起こる。文献に報告されている非対称ＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、多くの場合、対称ＰＣＲでの使用が知られているものと同じプライマーである。Ｐｏｄｄａｒ（Ｐｏｄｄａｒ，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ１４：２５～３２）は、４０回の熱サイクルを含むエンドポイントアッセイによって、アデノウイルス基質を増幅するための対称ＰＣＲと非対称ＰＣＲを比較した。彼は、５０：１のプライマー比が最適であり、非対称ＰＣＲアッセイの感度はより良好であったが、標的分子の含有がおそらくは減少した希釈基質溶液では著しく低下したことを報告した。
例示的な非対称ＰＣＲ法は、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８５：７６５２－７６５６（１９８８）；およびＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ，１９９１、米国特許第５，０６６，５８４号に記載されている。伝統的な非対称ＰＣＲは、一方のプライマーが制限された量で、典型的には他方のプライマーの１／１００～１／５の濃度で添加されるという点で対称ＰＣＲとは異なる。二本鎖アンプリコンは、対称ＰＣＲの場合と同じく、初期温度サイクル中に蓄積するが、開始鋳型の数に応じて、典型的には１５～２５回のＰＣＲサイクル後に１つのプライマーが枯渇する。１つの鎖の線形増幅は、枯渇していないプライマーを利用してその後のサイクル中に起こる。文献に報告されている非対称ＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、多くの場合、対称ＰＣＲでの使用が知られているものと同じプライマーである。Ｐｏｄｄａｒ（Ｐｏｄｄａｒ，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ１４：２５～３２）は、４０回の熱サイクルを含むエンドポイントアッセイによって、アデノウイルス基質を増幅するための対称ＰＣＲと非対称ＰＣＲを比較した。彼は、５０：１のプライマー比が最適であり、非対称ＰＣＲアッセイの感度はより良好であったが、標的分子の含有がおそらくは減少した希釈基質溶液では著しく低下したことを報告した。
６．２．３．４．非対称ＰＣＲ増幅の改善
改善された非対称ＰＣＲ法は、米国特許第１０，５１３，７３０号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。改善された非対称ＰＣＲ法は、指数関数的位相および線形位相の両方を含む。指数関数的位相の間、標的核酸の両方の鎖が増幅される。線形位相の間、鎖の一方のみが増幅され、一本鎖の標的核酸の過多が生じる。
改善された非対称ＰＣＲ法は、米国特許第１０，５１３，７３０号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。改善された非対称ＰＣＲ法は、指数関数的位相および線形位相の両方を含む。指数関数的位相の間、標的核酸の両方の鎖が増幅される。線形位相の間、鎖の一方のみが増幅され、一本鎖の標的核酸の過多が生じる。
改善された非対称ＰＣＲ法は、「伸長プライマー」と呼ばれる長い方のプライマーおよび「非伸長プライマー」と呼ばれる短い方のプライマーを含む、異なる長さおよび融解温度のプライマー対の使用を通して一本鎖の過多を達成する。伸長プライマーは、非伸長プライマーよりも融解温度が高く、非伸長プライマーの融解温度よりも高いが伸長プライマーの融解温度よりも低い温度でアニーリング工程を行うＰＣＲサイクルを用いて、標的核酸の一本鎖を選択的に増幅するために使用され得る。選択的増幅により、標的鎖が濃縮されたＰＣＲ産物混合物が得られ、これをその後の検出アッセイでプロービングすることができる。
伸長プライマーは、標的核酸に相補的な配列に加えて、同じプライマーの標的結合部分に相補的な配列を含む５’伸長を含む。理論に束縛されるものではないが、５’伸長の使用は、伸長プライマー分子の分子内または分子間ハイブリダイゼーションを可能にし、これらのより長いプライマーが、ＰＣＲ反応の開始時にＰＣＲ反応に存在するＤＮＡ分子へ恣意的または非特異的に結合するのを防止すると考えられる。これにより、順次、非特異的なＤＮＡ増幅が防止され、生物学的試料中に少量存在する標的を増幅する場合に問題となり得る、ＰＣＲ産物の「ノイズ」が防止される。
初期ＰＣＲ反応混合物は、
・核酸試料；
・非対称プライマー対；
・熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；および
・ＰＣＲ試薬、を含む。
・核酸試料；
・非対称プライマー対；
・熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；および
・ＰＣＲ試薬、を含む。
ＰＣＲ反応における伸長プライマーおよび非伸長プライマーの初期濃度は、それぞれ２００ｎＭ～８μＭの範囲であり得る。伸長プライマーおよび非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において等モル量で、例えば、それぞれ約２００ｎＭ～１μＭの範囲の濃度で、例えば、それぞれ５００ｎＭの濃度で含まれ得る。あるいは、伸長プライマーおよび非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において非等モル量で含まれ得る。特定の実施形態において、伸長プライマーの初期濃度は、好ましくは、非伸長プライマーの濃度より高く、例えば、約２倍～３０倍モル過剰である。したがって、ある特定の態様において、伸長プライマーの濃度は約１μＭ～８μＭの範囲であり、非伸長プライマーの濃度は約５０ｎＭ～２００ｎＭの範囲である。
非対称プライマー対は、任意の供給源からの核酸を増幅するように設計することができ、診断用途の場合、非対称プライマー対は、セクション６．２．１で特定されたものなどの病原体由来のＤＮＡを増幅するように設計することができる。
非対称プライマー対は、多くの種に存在する相同核酸配列、例えば細菌における高度に保存された１６Ｓリボソーム配列を同時に増幅することができるように設計することができる。
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：本開示の非対称ＰＣＲ反応に使用することができる熱安定性ポリメラーゼには、これらに限定されないが、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）、ＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒａｓｅ（商標）ｄＨＰＬＣ、９° Ｎｍ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、ＯｎｅＴａｑ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ Ｉ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ、Ｍ－ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏｓ ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ－８）、Ｔｆｌ、Ａｍｌｉｔｈｅｒｍ（商標）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）、Ｐｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏｔ、Ｐｆｕｎｄｓ、ＲｅｐｒｏＦａｓｔ、ＰｙｒｏＢｅｓｔ（商標）、ＶｅｒａＳｅｑ、Ｍａｋｏ、Ｍａｎｔａ、Ｐｗｏ（ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｗｏｅｓｅｉ）、ＥｘａｃｔＲｕｎ、ＫＯＤ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋｋａｒａｅｎｓｉｓ）、Ｐｆｘ、ＲｅｐｒｏＨｏｔ、Ｓａｃ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｓｓｏ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｔｒｕ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｆｘ５０（商標）（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉ）、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ＧＣ－Ｒｉｃｈ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＧＢ－Ｄ、Ｔｆｉ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｔｆｉ ｅｘｏ－、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）、Ｔａｃ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、（Ｍｔｈ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、Ｐａｂ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、Ｐｈｏ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｉｈｉ、Ｂ１０３（Ｐｉｃｏｖｉｒｉｎａｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｂ１０３）、Ｂｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂｓｔ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ２．０、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ、Ｂｓｕ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｔが含まれる。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ、例えばＴａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）またはＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）である。
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：本開示の非対称ＰＣＲ反応に使用することができる熱安定性ポリメラーゼには、これらに限定されないが、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）、ＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒａｓｅ（商標）ｄＨＰＬＣ、９° Ｎｍ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、ＯｎｅＴａｑ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ Ｉ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ、Ｍ－ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏｓ ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ－８）、Ｔｆｌ、Ａｍｌｉｔｈｅｒｍ（商標）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）、Ｐｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏｔ、Ｐｆｕｎｄｓ、ＲｅｐｒｏＦａｓｔ、ＰｙｒｏＢｅｓｔ（商標）、ＶｅｒａＳｅｑ、Ｍａｋｏ、Ｍａｎｔａ、Ｐｗｏ（ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｗｏｅｓｅｉ）、ＥｘａｃｔＲｕｎ、ＫＯＤ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋｋａｒａｅｎｓｉｓ）、Ｐｆｘ、ＲｅｐｒｏＨｏｔ、Ｓａｃ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｓｓｏ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｔｒｕ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｆｘ５０（商標）（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉ）、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ＧＣ－Ｒｉｃｈ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＧＢ－Ｄ、Ｔｆｉ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｔｆｉ ｅｘｏ－、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）、Ｔａｃ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、（Ｍｔｈ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、Ｐａｂ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、Ｐｈｏ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｉｈｉ、Ｂ１０３（Ｐｉｃｏｖｉｒｉｎａｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｂ１０３）、Ｂｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂｓｔ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ２．０、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ、Ｂｓｕ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｔが含まれる。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼ、例えばＴａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）またはＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）である。
改善された非対称方法で使用するための非対称サイクルの例示的なセットを表２に示す。
表２に示すサイクル数の範囲を任意の非対称プライマー対に使用することができ、最適なサイクル数は初期ＰＣＲ混合物中の標的ＤＮＡのコピー数に依存する。初期コピー数が多いほど、線形位相の鋳型として機能するのに十分な量のＰＣＲ産物を製造するために、指数関数的位相において必要なサイクル数が少なくなる。サイクル数の最適化は、当業者にとって慣例である。
表２に示される温度は、伸長プライマーのＴｍが７２℃超（例えば、７５～８０℃）であり、非伸長プライマーのＴｍが５８℃を超えるが７２℃未満（例えば、６０～６２℃）である場合、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが７２℃で活性である場合に特に有用である。
サイクル時間、特に伸長時間は、プライマーの融解温度およびＰＣＲ産物の長さに応じて変えることができ、ＰＣＲ産物が長くなるほど、必要な伸長時間が長くなる。経験則として、伸長工程は、アンプリコンの１，０００塩基あたり少なくとも６０秒であるべきである。伸長工程を線形位相で延長して、アニーリングのための追加の時間を与えることができる。
６．２．３．４．１．伸長プライマー
伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と少なくとも７５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。さらに他の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と１００％の配列同一性を有する。
伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と少なくとも７５％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。さらに他の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域と１００％の配列同一性を有する。
別の言い方をすれば、様々な実施形態において、伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖２における対応する領域の相補体と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％もしくは１００％の配列同一性を有する。典型的には、プライマー配列と標的配列との間の何らかの５’ミスマッチが多く位置するほど、それらはＰＣＲ反応中に許容される可能性がより高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、標的ＤＮＡを依然として効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計することができる。
「Ａ」領域の少なくとも一部に相補的な「Ｂ」領域の配列は、定方向反復または逆方向反復であり得る。「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部分の定方向反復を含有する場合、異なる伸長プライマー分子は、図５Ｂに示されるように、互いに分子間でハイブリダイズすることができる。「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部分の逆方向反復を含有する場合、伸長プライマー分子は、図５Ｃに示されるように分子内で、または図５Ａに示されるように互いに分子間でハイブリダイズすることができる。
「Ｂ」領域内の配列が相補的である「Ａ」領域の一部分は、好ましくは「Ａ」領域の５’末端、またはその近傍（例えば、そこから１、２、または３ヌクレオチド以内）、すなわち「Ａ」領域が「Ｂ」領域（または「Ｃ」領域が存在する場合には「Ｃ」領域）に隣接する場所またはその近傍にある。
伸長プライマーの「Ｂ」領域は、好ましくは６～１２ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、伸長プライマーの「Ｂ」領域は、８～１０ヌクレオチド長であり、すなわち、８、９または１０ヌクレオチド長である。
「Ｃ」領域は、伸長プライマー中に存在する場合、好ましくは１～６ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは１、２、３、４、５または６ヌクレオチド長である。
伸長プライマーのＴｍは、好ましくは（必ずしもそうとは限らないが）約６８℃～約８０℃である。特定の実施形態において、非伸長プライマーのＴｍは、約７２℃～約７８℃、例えば、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃または約７８℃である。
領域「Ａ」と「Ｂ」との間に位置する任意選択の領域「Ｃ」は、「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間のスペーサーとして作用して、伸長プライマーにヘアピンループを形成すること、および／または制限エンドヌクレアーゼ配列（好ましくは６カッター配列）をＰＣＲ産物に導入することを可能にし得る。制限エンドヌクレアーゼ配列は、その全体が「Ｃ」領域内にあり得るか、または「Ｃ」領域の全部もしくは一部から、それぞれ「Ｂ」および「Ａ」領域由来の隣接する５’配列および／または３’配列と共に形成され得る。標的核酸へのハイブリダイゼーションとの干渉を最小限に抑えるために、「Ｃ」領域は、好ましくは、標的鎖１または標的鎖２と相補的ではない。
伸長プライマーのＴｍは、好ましくは、非伸長プライマーのＴｍよりも少なくともおよそ６℃高い。好ましくは、伸長プライマーは、非伸長プライマーのＴｍよりも約１５℃～３０℃高いＴｍを有する。
伸長プライマーの「Ａ」領域のＴｍは、標的（あらゆる５’伸長を除く）に相補的な非伸長プライマーの部分（少なくとも７５％）のＴｍよりも約３℃以内の差で高い、または低いことが望ましい、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマー中の領域のＴｍは、標的にハイブリダイズするリバースプライマー中の領域のＴｍよりも約３℃以内の差で高い、または低いことが望ましく、逆もまた同様である。
伸長プライマーの「Ａ」領域は、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長であり、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１４～２５ヌクレオチドの範囲である。特定の実施形態において、伸長プライマーの「Ａ」領域は、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
６．２．３．４．２．非伸長プライマー
非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域と少なくとも７５％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域と１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域と少なくとも７５％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域と１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
別の言い方をすれば、様々な実施形態において、非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する領域の相補体と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。典型的には、プライマー配列と標的配列との間の何らかの５’ミスマッチが多く位置するほど、それらはＰＣＲ反応中に許容される可能性がより高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、標的ＤＮＡを依然として効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計することができる。
非伸長プライマーは、１、２または３つのヌクレオチドの５’尾部をさらに有し得る。
非伸長プライマーのＴｍは、好ましくは（必ずしもそうとは限らないが）約５０℃～約６２℃である。特定の実施形態において、非伸長プライマーのＴｍは、約５９℃～約６２℃、例えば、約５９℃、約６０℃、約６１℃、または約６２℃である。
非伸長プライマーのＴｍは、好ましくは、伸長プライマーのＴｍよりも少なくともおよそ６℃低い。好ましくは、非伸長プライマーは、伸長プライマーのＴｍよりも約１５℃～３０℃低いＴｍを有する。
標的（あらゆる５’伸長を除く）に相補的な非伸長プライマーの部分（少なくとも７５％）のＴｍは、伸長プライマーの「Ａ」領域のＴｍよりも約３℃以内の差で高い、または低いことが望ましい、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマー中の領域のＴｍは、標的にハイブリダイズするリバースプライマー中の領域のＴｍよりも約３℃以内の差で高い、または低いことが望ましく、逆もまた同様である。
非伸長プライマーは、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長であり、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１４～２５ヌクレオチドの範囲である。特定の実施形態において、非伸長プライマーは、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
６．２．３．４．３．汎用プライマー
いくつかの非対称ＰＣＲ法では、例えば米国特許第８，７３５，０６７Ｂ２号に記載されているように、フォワードおよびリバースプライマー対に加えて、プライマーの一方に付加された、５’オリゴヌクレオチド尾部に類似する配列を有する第３の「汎用」プライマーが使用される。汎用プライマーは、最初のＰＣＲサイクルの後に増幅反応に関与して、マルチプレックス増幅反応における種々の標的の増幅効率の「バランスをとる」ことを意図している。
いくつかの非対称ＰＣＲ法では、例えば米国特許第８，７３５，０６７Ｂ２号に記載されているように、フォワードおよびリバースプライマー対に加えて、プライマーの一方に付加された、５’オリゴヌクレオチド尾部に類似する配列を有する第３の「汎用」プライマーが使用される。汎用プライマーは、最初のＰＣＲサイクルの後に増幅反応に関与して、マルチプレックス増幅反応における種々の標的の増幅効率の「バランスをとる」ことを意図している。
理論に束縛されるものではないが、改善された非対称ＰＣＲ法の文脈において伸長プライマーの「Ｂ」領域の配列から本質的になる配列を有するであろう、米国特許第８，７３５，０６７号に記載されているような汎用プライマー（そのような汎用プライマーを本明細書において「汎用プライマー」と呼ぶ）を含めると、本明細書に記載の非対称プライマー対を使用する増幅効率が低下するであろうと考えられる。したがって、本明細書中に記載される改善された非対称ＤＮＡ増幅法は、好ましくは、汎用プライマーの非存在下で行われる。
関連する実施形態において、本明細書中に記載される改善された非対称ＤＮＡ増幅法は、標的領域ごとに単一の非対称プライマー対を利用することができ、すなわち、いかなる追加のプライマーも含まず、個々のプライマーが、プライマー中の特定の位置に混合塩基を含めることから生じる、密接に関連する配列を有するプライマー分子の混合物であり得ることを認識している。明瞭化および疑念回避のために、この実施形態は、各アンプリコンに対して単一の非対称プライマー対が使用されるという条件で、マルチプレックス増幅反応における複数の非対称プライマー対の使用を排除しない。
６．２．３．５．リアルタイムＰＣＲ増幅
本開示の方法で使用されるＰＣＲ増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ増幅反応であり得る。
本開示の方法で使用されるＰＣＲ増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ増幅反応であり得る。
リアルタイムＰＣＲとは、反応が進行するにつれて、典型的にはＰＣＲサイクルごとに１回、増幅されたＤＮＡ産物の蓄積を測定することができる技術の発展セットを指す。産物の蓄積を経時的にモニタリングすることにより、反応の効率の判定、ならびにＤＮＡ鋳型分子の初期濃度の推定が可能になる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
現在、増幅されたＤＮＡの存在を示すための、いくつかの異なるリアルタイム検出化学が存在する。これらの大部分は、ＰＣＲプロセスの結果として特性を変化させる蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学の中には、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光効率を高めるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学は、色素の蛍光効率が別の光吸収部分またはクエンチャーへの近接度に強く依存する現象である、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する。これらの色素およびクエンチャーは、典型的には、ＤＮＡ配列特異的プローブまたはプライマーに結合している。ＦＲＥＴベースの検出化学の中には、加水分解プローブおよび立体配座プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなど）は、ポリメラーゼ酵素を使用して、オリゴヌクレオチドプローブに結合したクエンチャー色素分子からレポーター色素分子を切断する。立体配座プローブ（分子ビーコンなど）は、オリゴヌクレオチドに結合した色素を利用し、その蛍光発光は、標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの立体配座変化に応じて変化する（例えば、Ｔｙａｇｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０３－３０８を参照されたい）。
リアルタイムＰＣＲは、対称または非対称であり得、例えば、セクション６．２．３．３または６．２．３．４に記載されている対称または非対称ＰＣＲ増幅反応の反応混合物において、加水分解プローブ分子を用いて実施され得る。
リアルタイムＰＣＲを行うために使用され得る、いくつかの市販の機器が存在する。利用可能な機器の例には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ７５００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｌｃｅｒ、およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０が含まれる。
６．２．４．プローブ分子
本開示は、ＰＣＲ反応で作製されたアンプリコンの配列特異的検出に適したプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブ分子を提供する。
本開示は、ＰＣＲ反応で作製されたアンプリコンの配列特異的検出に適したプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブ分子を提供する。
オリゴヌクレオチドプローブ分子設計の成功ためのパラメータは当技術分野で周知であり、プローブ分子長、クロスハイブリダイゼーション効率、融解温度、ＧＣ含有量、自己アニーリング、および二次構造を形成する能力を含むが、これらに限定されない。本開示は、マイクロアレイ、例えばアドレサブルアレイにおけるオリゴヌクレオチドプローブ分子の使用を提供し、そこでは、プローブ分子は、基材、例えば膜、例えばガラス基材、例えばプラスチック基材、例えばポリマーマトリックス基材に固定され、オリゴヌクレオチドプローブ分子の、同様、同一の配列、例えば配列が少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％またはさらには１００％の類似性または同一性を有するアンプリコンとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で核酸に曝露される。
いくつかの実施形態において、本開示の方法において使用されるオリゴヌクレオチドプローブ分子は、第１のゲノム配列および／または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに対して９０％～１００％相補的（例えば、９０％～９５％または９５％～１００％）であるヌクレオチド配列を含む。
例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子は実施例に記載されており、配列番号１～７のヌクレオチド配列を含むプローブ分子が含まれる。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ分子は、アレイ上に存在する。各プローブ分子は、オリゴヌクレオチドプローブ分子がアレイ上に存在する位置的にアドレサブルなプローブ分子であるように、アレイ上の離散した位置にあり、アレイ上のその位置によって識別することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ分子は、ポリチミジン尾部、例えば最大１０ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部、または例えば最大１５ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部、または例えば最大２０ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部を含む。一実施形態では、ポリチミジン尾部は、１０～２０ヌクレオチド、例えば１５ヌクレオチドを含む。ポリチミジン尾部は、プローブ分子がアレイに結合している場合に有用であり得、ポリチミジン尾部は、アレイ基材と、標的配列に対して部分的または完全な相補性を有するプローブ分子の領域との間のスペーサーとして作用する。
オリゴヌクレオチドプローブ分子は、標識されてもまたはされなくてもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ分子は標識される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ分子は標識されない。オリゴヌクレオチドプローブ分子は、例えば、蛍光色素、例えばセクション６．２．３または６．２．３．１に記載されているものであり得る蛍光レポーターで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドプローブ分子は、例えばリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。リアルタイムＰＣＲのための標識オリゴヌクレオチドプローブ分子は、プローブ分子の一端に蛍光レポーターを含み、プローブ分子の他端にレポーターの蛍光を消光するクエンチャー部分を含むことができる。ＰＣＲ中、プローブ分子はアニーリング段階中にその標的配列にハイブリダイズすることができ、伸長段階中にポリメラーゼがプローブ分子に到達すると、その５’－３’－エキソヌクレアーゼはプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離し、蛍光の増加をもたらし、これを測定することができる。
プローブ分子上の蛍光標識およびクエンチャー部分の位置は、２つの部分の間にＦＲＥＴが生じ得るような位置であり得る。蛍光標識は、例えば、プローブ分子の５’末端またはその近傍に、クエンチャー部分はプローブの３’末端またはその近傍にあり得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識とクエンチャーとの間の分離距離は約１４～約２２ヌクレオチドであるが、他の距離、例えば約６、約８、約１０または約１２ヌクレオチドが使用されてもよい。使用され得るさらなる距離としては、約１４、約１６、約１８、約２０または約２２ヌクレオチドが挙げられる。
リアルタイムＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプローブ分子に使用することができる例示的な蛍光標識はＦＡＭまたは６－ＦＡＭであり、代表的なクエンチャー部分はＭＧＢである。レポーター部分の他の非限定的な例としては、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる一方、クエンチャーまたはアクセプター蛍光部分の非限定的な例としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（ブラックホールクエンチャー）、ＬＣ ＲＥＤ ６４０、およびシアニン色素、例えばＣＹ５が挙げられる。当業者によって理解されるように、レポーター部分およびクエンチャー／アクセプター部分のいかなる対も、それらが適合性があり、その結果ドナーからクエンチャー／アクセプターへの伝送が起こり得る限り、使用することができる。さらに、適切なドナーおよびクエンチャー／アクセプターの対は当技術分野で公知であり、本明細書に提供される。対の選択は、当技術分野で公知の任意の手段によって行うことができる。慣例のリアルタイムＰＣＲプローブ分子は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどから市販されている。
６．２．５．仮想プローブ
便宜上、本セクション（および本開示の他のセクション）は、仮想プローブでプロービングされ得るアンプリコンおよびアンプリコンセットに言及する。しかしながら、仮想プローブを同様に使用して、ゲノムフラグメントなどの非増幅標的核酸を含むか、または含むと疑われる試料をプロービングすることができることを理解されたい。
便宜上、本セクション（および本開示の他のセクション）は、仮想プローブでプロービングされ得るアンプリコンおよびアンプリコンセットに言及する。しかしながら、仮想プローブを同様に使用して、ゲノムフラグメントなどの非増幅標的核酸を含むか、または含むと疑われる試料をプロービングすることができることを理解されたい。
第１のアンプリコンセット（第１のゲノム内の領域に対応する単一の第１のアンプリコンまたは第１のゲノム内の異なる領域に対応する複数の第１のアンプリコンを含む）と第２のアンプリコンセット（第２のゲノム内の領域に対応する単一の第２のアンプリコンまたは第２のゲノム内の異なる領域に対応する複数の第２のアンプリコンを含む）との間のヌクレオチドミスマッチの数は比較的少ない可能性があり、個々のオリゴヌクレオチドプローブ分子は、単独で第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができない場合がある。本発明者らは、それにもかかわらず、仮想プローブを使用することによって、そのような状況において第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することが可能であることを予想外に発見した。仮想プローブのプローブ分子は、２つのアンプリコンセット間を単独では区別することができないが、集合的には、第１および第２のアンプリコンセットを仮想プローブのプローブ分子でプロービングした場合に観察される異なるハイブリダイゼーションパターンによって区別することができる。
本発明者らは、仮想プローブに計量プローブを含めることが種同定の精度を向上させるのに役立ち得ることをさらに発見した。第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中の相同アンプリコンとハイブリダイズすることができる計量プローブを使用して、試料中のそのようなアンプリコンの相対濃度の尺度を提供することができる。計量プローブからのシグナルに応じて、第１の式または第２の式を使用して、仮想プローブのすべてのプローブ分子について観察されたハイブリダイゼーションパターンを分析することができる。例えば、計量プローブからのシグナルが所定の閾値レベル以上である場合（試料中のアンプリコンの比較的高い濃度を示す）、第１の式を使用してハイブリダイゼーションパターンを分析することができ、計量プローブからのシグナルが閾値レベル未満である場合（試料中のアンプリコンの比較的低い濃度を示す）、第２の式を使用してハイブリダイゼーションパターンを分析することができる。閾値レベルは、例えば、既知または未知の濃度の微生物を含有する一連の試料から得られたシグナルデータから経験的に決定することができる（例えば、実施例６を参照のこと）。オリゴヌクレオチドプローブのシグナルデータをプロットし、プロットをパターンまたは傾向について調べ、閾値を、例えば実施例６に記載されるように、観察されたパターンまたは傾向に基づいて選択することができる。例えば、プロットは、Ｘ軸に第１のオリゴヌクレオチドプローブのシグナルデータを含み、Ｙ軸にシグナル比データ（例えば、第２のオリゴヌクレオチドプローブのシグナルに対する第１のオリゴヌクレオチドプローブのシグナルの比）を含み得る。プロットが、パターンまたは傾向、例えば、第１のオリゴヌクレオチドプローブのシグナルが値Ｘ未満である場合にシグナル比が比較的高く、第１のオリゴヌクレオチドプローブのシグナルが値Ｘより大きい場合にシグナル比が比較的低いことを示せば、値Ｘを閾値として選択することができる。
いくつかの実施形態では、仮想プローブで使用される計量プローブは、属プローブ、例えば、属のメンバーとしての微生物を同定するために使用することができるが、それ自体では属の個々の種を属の別の種から識別することができないプローブである。ブドウ球菌用の仮想プローブにおいて有用な例示的な計量プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンのヌクレオチド配列は、プローブ分子が第１のアンプリコンセットにハイブリダイズしたとき、およびプローブ分子が第２のアンプリコンセットにハイブリダイズしたときに（例えば、アレイ上で、またはリアルタイムＰＣＲ反応中に）、仮想プローブを構成する２つ以上のプローブ分子のシグナルパターンに差があるように、仮想プローブに使用されるプローブ分子によって結合され得るアンプリコンの領域に少なくとも１つ（例えば、１、少なくとも２、２、少なくとも３、または３）のヌクレオチドミスマッチを有するべきである。シグナルパターンの差を使用して、第１および第２のアンプリコンセットを同定および／または区別することができる。仮想プローブの使用によって第１のアンプリコンセットが存在すると決定された場合、第１のアンプリコンセットが作製された試料は、第１のアンプリコンセットに対応するゲノム（ひいては、試料にそのゲノムが含まれている生物）を含むと結論付けることができる。同様に、仮想プローブの使用によって第２のアンプリコンセットが存在すると決定された場合、第２のアンプリコンセットが作製された試料は、第２のアンプリコンセットに対応するゲノム（ひいては、試料にそのゲノムが含まれている生物）を含むと結論付けることができる。
仮想プローブの個々のプローブ分子のシグナル（例えば、アレイ上での位置によって識別可能であるか、または異なる蛍光標識に対応するシグナル）は、ＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズされると、例えば、１つ以上のブール演算子によって、１つ以上の関係演算子によって、１つ以上のシグナル比によって（例えば、第１のプローブのシグナルを第２のプローブのシグナルで除することができる）、または上記のいずれかによって、任意の組み合わせで組み合わされて第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。いくつかの実施形態では、シグナルは、１つ以上のブール演算子によって組み合わされる。いくつかの実施形態では、シグナルは、１つ以上の関係演算子によって組み合わされる。さらに他の実施形態では、シグナルは、１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わされる。さらに他の実施形態では、シグナルは、シグナル比によって組み合わされる。
いくつかの例では、ブール演算子「ＡＮＤ」、「ＯＲ」および「ＮＯＴ」を使用して、仮想プローブの個々のプローブ分子からのシグナルを組み合わせて、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。一例として、２つの相同アンプリコン（この例では「Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ａ」および「Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｂ」）用の仮想プローブは、２つのプローブ分子（この例では「Ｐｒｏｂｅ１」および「Ｐｒｏｂｅ２」）からなる。Ｐｒｏｂｅ１およびＰｒｏｂｅ２は両方ともＡｍｐｌｉｃｏｎ Ａに特異的にハイブリダイズすることができる一方、Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｂには、Ｐｒｏｂｅ１は特異的にハイブリダイズすることができるがＰｒｏｂｅ２はできない。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングし、ＰＣＲ増幅産物への、Ｐｒｏｂｅ１のハイブリダイゼーションからのシグナルおよびＰｒｏｂｅ２のハイブリダイゼーションからのシグナルが両方とも陽性である場合（ブール演算子「ＡＮＤ」を使用して「Ｐｒｏｂｅ１ ＡＮＤ Ｐｒｏｂｅ２」として表すことができる）、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＡがＰＣＲ増幅産物中に存在すると決定することができる。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングし、Ｐｒｏｂｅ１のＰＣＲ産物へのハイブリダイゼーションからのシグナルが陽性であるが、Ｐｒｏｂｅ２のＰＣＲ産物へのハイブリダイゼーションからのシグナルが陽性でない場合（ブール演算子「ＮＯＴ」を用いて「Ｐｒｏｂｅ１ ＮＯＴ Ｐｒｏｂｅ２」として表すことができる）、ＰＣＲ増幅産物中にＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｂが存在すると決定することができる。ハイブリダイゼーションシグナルは、例えば、ハイブリダイゼーションシグナルがバックグラウンドレベルを上回る場合、陽性と見なすことができる。ハイブリダイゼーションシグナルは、例えば、シグナルが観察されないか、または観察されたシグナルがバックグラウンドレベル以下である場合、陽性でないと見なすことができる。
いくつかの例では、関係演算子「超」（「＞」）、「以上」（「≧」）、「未満」（「＜」）および「以下」（「≦」）を使用して、仮想プローブの個々のプローブ分子からのシグナルを組み合わせて、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。一例として、２つの相同アンプリコン（この例では「Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃ」および「Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｄ」）用の仮想プローブは、２つのプローブ分子（この例では「Ｐｒｏｂｅ３」および「Ｐｒｏｂｅ４」）からなる。Ｐｒｏｂｅ３およびＰｒｏｂｅ４は両方とも、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＣおよびＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｄに特異的にハイブリダイズすることができる。Ｐｒｏｂｅ３およびＰｒｏｂｅ４がＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｃにハイブリダイズすると、Ｐｒｏｂｅ３のシグナルはＰｒｏｂｅ４のシグナルより大きい（「超」の関係演算子を使用して「Ｐｒｏｂｅ３＞Ｐｒｏｂｅ４」として表すことができる）。一方、Ｐｒｏｂｅ３およびＰｒｏｂｅ４をＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｄにハイブリダイズさせた場合、Ｐｒｏｂｅ３のシグナルはＰｒｏｂｅ４のシグナルよりも小さい（「未満」の関係演算子を用いて「Ｐｒｏｂｅ３＜Ｐｒｏｂｅ４」として表すことができる）。したがって、ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプロービングし、Ｐｒｏｂｅ３のシグナルがＰｒｏｂｅ４のシグナルよりも大きい場合、ＰＣＲ増幅産物中にＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｃが存在すると判断でき、Ｐｒｏｂｅ３のシグナルがＰｒｏｂｅ４のシグナルよりも小さい場合には、ＰＣＲ増幅産物中にＡｍｐｌｉｃｏｎ Ｄが存在すると判断できる。
いくつかの例では、個々のプローブ分子からのシグナルは、シグナル比、例えば、Ｐｒｏｂｅ２のシグナルで割ったＰｒｏｂｅ１のシグナル、またはその逆で組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、シグナル比を所定のカットオフ値と比較して、試料、または試験試料が調製された初期試料中の微生物の有無を判定することができる。
ハイブリダイゼーションシグナルを組み合わせる場合、シグナルは、例えば、絶対シグナル、正規化シグナル、または部分的シグナルであり得る（例えば、仮想プローブで使用されるプローブ分子のシグナルの値は、例えば実施例３に記載されているように、所定の関数を使用して基準化することができる）。プローブ分子のシグナルは、例えば、所定のカットオフを上回る場合に陽性と見なすことができる。カットオフは、例えば、所与のプローブ分子について観察されるバックグラウンドシグナル（例えば、非特異的ハイブリダイズに起因するバックグラウンドシグナル）以上に設定することができる。したがって、例えば、プローブ分子のシグナルが観察されるが、そのシグナルがバックグラウンドレベル以下である場合、そのシグナルは陽性ではないと考えることができる。
一実施形態において、仮想プローブは、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子（例えば、２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含む。別の実施形態において、仮想プローブは、３つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子（例えば、３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子または４つのオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の生物および第２の生物用の仮想プローブは、２つのプローブ分子からなる。一実施形態では、２つのプローブ分子は、第１のアンプリコンセット（第１の生物に対応する）中の第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット（第２の生物に対応する）中の第２のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるが、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンにはできない第２のプローブ分子とを含む。そのような実施形態では、試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングした場合、第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、第２のプローブ分子のシグナルが陽性でなければ、第１の生物が試料中に存在すると判定することができる。他方では、ＰＣＲ増幅産物をプロービングした場合に第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、第２のプローブ分子のシグナルが陽性であれば、第２の生物が試料中に存在すると判定することができる。
いくつかの実施形態では、第１の生物および第２の生物用の仮想プローブは、３つのプローブ分子からなる。一実施形態では、３つのプローブ分子は、第１のアンプリコンセット（第１の生物に対応する）中の第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット（第２の生物に対応する）中の第２のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、第１のプローブとは異なる第２のプローブ分子と、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、第１および第２のプローブ分子とは異なる第３のプローブ分子とを含む。そのような実施形態では、ＰＣＲ増幅産物をプロービングする際に観察される３つのプローブ分子の相対シグナルを使用して、ＰＣＲ増幅産物を調製するために使用される試料が第１の生物または第２の生物を含むかどうかを決定することができる。
仮想プローブを使用して相同ゲノム配列を区別することができるので、仮想プローブを使用して密接に関連する生物、例えば密接に関連する微生物を区別することができる。例えば、仮想プローブを使用して、微生物を同じ目、同じ科、同じ属、同じ群、または同じ種（例えば、同じ種の異なる株）からさえ区別することができる。例えば、仮想プローブを使用して、ラクトバシラス菌種とリステリア菌種とを区別し、コリネバクテリウム菌種とプロピオニバクテリウム菌種とを区別し、ミクロコッカス菌種とコクリア菌種とを区別し、パスツレラ菌種とヘモフィルス菌種とを区別し、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種とコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種とを区別し、ストレプトコッカス菌種（例えば、Ｓ．アンギノーサス、Ｓ．ゴルドニ、Ｓ．ミティス、肺炎レンサ球菌、Ｓ．アガラクティエ、化膿レンサ球菌、Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓ．ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｓ．サリバリウス、Ｓ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．オラリス、Ｓ．サングイニス、Ｓ．パラサングイニス）を区別し、ブドウ球菌種（例えば、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、表皮ブドウ球菌）を区別し、エンテロコッカス菌種（例えば、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム）を区別し、クロストリジウム菌種（例えば、ウェルシュ菌、Ｃ．ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｉｆｏｒｍｅ、Ｃ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ）を区別し、バシラス菌種（例えば、セレウス菌、Ｂ．コアグランス）を区別し、シュードモナス菌種（例えば、緑膿菌、Ｐ．プチダ、Ｐ．スタッツェリ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．メンドシナ）を区別し、アシネトバクター菌種（例えば、Ａ．バウマニ、Ａ．ｌｗｏｆｆｉｉ、Ａ．ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａ．ｊｕｎｉｉ）を区別することができる。
セクション６．２．５．１～６．２．５．３およびセクション７の実施例１～５は、密接に関連した細菌の異なる種類を同定および／または識別するための例示的な仮想プローブを記載している。
６．２．５．１．コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の仮想プローブ
本開示は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含む試料を、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌種を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むか、またはそれからなる。配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を有するプローブ分子を使用して、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって製造されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
本開示は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含む試料を、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌種を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むか、またはそれからなる。配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を有するプローブ分子を使用して、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって製造されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（「Ｐｒｏｂｅ１」）のシグナルが陽性であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（「Ｐｒｏｂｅ２」）のシグナルが陽性でなければ（「ＮＯＴ」演算子を用いて「Ｐｒｏｂｅ１ ＮＯＴ Ｐｒｏｂｅ２」として表すことができる）、試料がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含有すると決定することができる。
あるいは、Ｐｒｏｂｅ１およびＰｒｏｂｅ２のシグナル比を使用することができる。例えば、Ｐｒｏｂｅ２のシグナルで除したＰｒｏｂｅ１のシグナルが所定のカットオフ値以上であれば、試料がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含有すると決定することができる。計量プローブからのシグナルが、試料中の標的核酸の量が比較的高い、または比較的低いことを示す場合、異なるカットオフ値を有する異なる式を使用することができる。Ｐｒｏｂｅ１は属プローブであり、計量プローブとして使用され得る。したがって、例えば、計量プローブからのシグナルが比較的高濃度の標的核酸を示す場合（例えば、シグナルが所定の閾値以上である場合）、第１のカットオフを有する第１の式を使用することができ、計量プローブからのシグナルが比較的低濃度の標的核酸を示す場合（例えば、計量プローブのシグナルが所定の閾値を下回る場合）、第２のカットオフを有する第２の式を使用することができる。第１および第２の式を使用すると、例えば、実施例６に記載されているような、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種およびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種同定の精度を高めることができる。
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の例示的な仮想プローブは、実施例１および６にさらに記載されている。
６．２．５．２．ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の仮想プローブ
ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）またはストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を含む試料をストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して、Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって作製されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）またはストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を含む試料をストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して、Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって作製されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、第１のプローブ（「Ｐｒｏｂｅ１」）のシグナルが陽性であり、第２のプローブ（「Ｐｒｏｂｅ２」）のシグナルが陽性でなければ（「ＮＯＴ」演算子を用いて「Ｐｒｏｂｅ１ ＮＯＴ Ｐｒｏｂｅ２」として表すことができる）、試料がＳ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を含有すると決定することができる。試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、Ｐｒｏｂｅ１のシグナルが陽性であり、Ｐｒｏｂｅ２のシグナルも陽性であれば（「ＡＮＤ」演算子を用いて「Ｐｒｏｂｅ１ ＡＮＤ Ｐｒｏｂｅ２」として表すことができる）、試料がＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）を含有すると決定することができる。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の例示的な仮想プローブは、実施例２にさらに記載されている。
６．２．５．３．ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブ
ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）または肺炎レンサ球菌が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）を含む試料を肺炎レンサ球菌を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを開示する。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第３の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。配列番号５、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号５、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブ分子を使用して、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって製造されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）または肺炎レンサ球菌が試料中に存在するかどうかを判定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）を含む試料を肺炎レンサ球菌を含む試料から区別するために使用することができる仮想プローブを開示する。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の仮想プローブにおいて使用され得る第３の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。配列番号５、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプロービングするように設計されている。したがって、配列番号５、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブ分子を使用して、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施される、ＰＣＲ増幅反応によって製造されるアンプリコンをプロービングすることができる。プローブ分子は、例えば、アレイに含めることができ、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、第２のプローブ（「Ｐｒｏｂｅ２」）および／または第３のプローブ（「Ｐｒｏｂｅ３」）のシグナルが第１のプローブ（「Ｐｒｏｂｅ１」）の基準化されたシグナルよりも小さければ、試料がＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含有すると決定することができる。試料がＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含むかどうかを決定するためのシグナル間の関係は、ブール演算子および関係演算子を使用して「（Ｐｒｏｂｅ２ ＯＲ Ｐｒｏｂｅ３）＜（Ｐｒｏｂｅ１）／ｎ」として表すことができ、ｎはＰｒｏｂｅ１シグナルを基準化するために使用される所定の値である。試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、Ｐｒｏｂｅ２および／またはＰｒｏｂｅ３のシグナルがＰｒｏｂｅ１の基準化されたシグナルよりも大きければ、試料が肺炎レンサ球菌を含有すると決定することができる。試料が肺炎レンサ球菌を含むかどうかを決定するためのシグナル間の関係は、ブール演算子および関係演算子を使用して「（Ｐｒｏｂｅ２ ＯＲ Ｐｒｏｂｅ３）＞（Ｐｒｏｂｅ１）／ｎ」として表すことができる。「ｎ」の適切な値は、例えば、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含有することが知られている試料から作製されたＰＣＲ産物をプロービングすること、および肺炎レンサ球菌を含有することが知られている試料由来のＰＣＲ産物をプロービングすることによって決定することができる。
あるいは、試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、Ｐｒｏｂｅ１のシグナルで割ったＰｒｏｂｅ３のシグナルが所定の値「ｎ」よりも小さければ、試料がＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含有すると決定することができる。試料から調製されたＰＣＲ増幅産物をプロービングする場合、Ｐｒｏｂｅ１のシグナルで割ったＰｒｏｂｅ３のシグナルが所定の値「ｎ」よりも大きければ、試料が肺炎レンサ球菌を含有すると決定することができる。「ｎ」の適切な値は、例えば、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含有することが知られている試料から作製されたＰＣＲ産物をプロービングすること、および肺炎レンサ球菌を含有することが知られている試料由来のＰＣＲ産物をプロービングすることによって決定することができる。
Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌用の例示的な仮想プローブは、実施例３にさらに記載されている。
６．３．アレイ
本開示は、それぞれが第１のゲノム配列を第２の相同ゲノム配列から区別するために有用であり得る、１つ以上の仮想プローブを含むアドレサブルアレイを提供する。
本開示は、それぞれが第１のゲノム配列を第２の相同ゲノム配列から区別するために有用であり得る、１つ以上の仮想プローブを含むアドレサブルアレイを提供する。
本開示のアドレサブルアレイは、本明細書に記載の方法で使用することができる。本開示のアドレサブルアレイは、それぞれがアレイ上の離散した位置にある、位置的にアドレサブルなオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含むことができる。いくつかの実施形態において、仮想プローブを構成するオリゴヌクレオチドプローブ分子の群における各プローブ分子（典型的には、２つまたは３つの異なるプローブ分子）は、仮想プローブが区別しようとする第１のゲノム配列または第２のゲノム配列における１５～４０個の連続するヌクレオチド（例えば、１５～２０、１５～３０、２０～４０、２０～３０、または３０～４０個の連続するヌクレオチド）に９０％～１００％（例えば、９０％～９５％または９５％～１００％）相補的なヌクレオチド配列を含む。
アドレサブルアレイは、場合により１つ以上の制御プローブ分子（例えば、ＤＮＡ抽出および増幅工程の効率を評価するのに有用な抽出および増幅制御、および／またはアレイへのＤＮＡハイブリダイゼーションの効率を評価するのに有用なハイブリダイゼーション制御）をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、アレイのプローブ分子は、ポリチミジン尾部、例えば最大１０ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部、または例えば最大１５ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部、または例えば最大２０ヌクレオチドを含むポリチミジン尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリチミジン尾部は、１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒ、例えば１５ｍｅｒである。
いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、１２個以上のプローブ分子、例えば１２～１００個のプローブ分子、または例えば１２～５０個のプローブ分子、または例えば２５～７５個のプローブ分子、または例えば５０～１００個のプローブ分子を含む。いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、１２個のプローブ分子を含む。他の実施形態では、アドレサブルアレイは、１４個のプローブ分子を含む。さらに他の実施形態では、アドレサブルアレイは、８４個のプローブ分子を含む。
いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、少なくとも２つの仮想プローブ、例えば少なくとも３つの仮想プローブ、または例えば少なくとも５つの仮想プローブ、または例えば少なくとも１０個の仮想プローブ用のオリゴヌクレオチドプローブを含むか、または例えば、アドレサブルアレイは、最大１０個または最大１５個の仮想プローブ用のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
仮想プローブは、プローブ分子が２つ以上の仮想プローブの構成要素となり得るように重複させることができる。仮想プローブは、重複させなくてもよい。
いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、少なくとも５つの異なる種類の微生物、例えば細菌を区別することができる仮想プローブを含む。他の実施形態では、アドレサブルアレイは、少なくとも１０の異なる種類、例えば少なくとも２０の異なる種類、例えば少なくとも３０の異なる種類、例えば少なくとも４０の異なる種類、または例えば最大５０の異なる種類の微生物、例えば細菌を区別することができる仮想プローブを含む。
いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、少なくとも５個の仮想プローブ、例えば少なくとも１０個の仮想プローブ、例えば少なくとも１５個の仮想プローブ、または例えば少なくとも２０個の仮想プローブを含み、その各々が異なる種類の微生物、例えば細菌、例えば試料中に存在し得る細菌の異なる株または種を識別することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のアドレサブルアレイは、真正細菌の種由来のゲノム配列を、真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列から区別するための１つ以上の仮想プローブを含む。いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、グラム陽性細菌由来のゲノム配列とグラム陰性細菌由来のゲノム配列とを区別するのに適した１つ以上の仮想プローブを含む。いくつかの実施形態では、アドレサブルアレイは、異なる目の微生物由来のゲノム配列を区別するのに適した１つ以上の仮想プローブを含む。いくつかの実施形態では、仮想プローブは、異なる科の微生物由来のゲノム配列を区別するのに適している。いくつかの実施形態では、仮想プローブは、異なる属、異なる群、および／または異なる種の微生物由来のゲノム配列を区別するのに適している。
本開示のアレイを作製するために使用され得る適切なマイクロアレイシステムは、米国特許第９，７３８，９２６号および米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９Ａ１号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第９，７３８，９２６号および米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９Ａ１号に記載されているマイクロアレイシステムは、三次元架橋ポリマーネットワークを利用する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のアレイは、米国特許第９，７３８，９２６号に記載のアレイを含み、アレイのプローブ分子は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含む。他の実施形態では、本開示のアレイは、米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９Ａ１号に記載のアレイを含み、アレイのプローブ分子は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含む。
本開示の一態様では、本開示は、本開示のアレイを使用して、第１の生物または第２の生物が試料中に存在するかどうかを判定する方法を提供する。例示的な方法は、以下を含む：
第１の生物のゲノム（「第１のゲノム」）および第２の生物のゲノム（「第２のゲノム」）の両方にハイブリダイズし、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して試料に対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットを得、ＰＣＲ増幅反応によって、反応で作製される任意のＰＣＲ増幅産物中に測定可能なシグナルを生成する標識を組み込む工程；
ＰＣＲ増幅産物を、各々が第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子であって、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む１つ以上の仮想プローブを有する本開示のアレイに接触させる工程；
アレイからの未結合核酸分子を洗浄する工程；および
アレイ上の各プローブ分子位置における標識のシグナルを測定する工程；および
シグナルが、プローブ分子にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって作製されることを示す場合、本明細書に記載されるようにシグナルを分析して、第１のアンプリコンセットまたは第２のアンプリコンセットがＰＣＲ増幅反応によって作製されるかどうかを判定するか、またはシグナルが、プローブ分子の群にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって作製されないことを示す場合、その試料が第１の生物または第２の生物を含まないと判定する工程、
したがって、第１の生物または第２の生物が試料中に存在するかどうかを判定する工程。
第１の生物のゲノム（「第１のゲノム」）および第２の生物のゲノム（「第２のゲノム」）の両方にハイブリダイズし、そこからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して試料に対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットを得、ＰＣＲ増幅反応によって、反応で作製される任意のＰＣＲ増幅産物中に測定可能なシグナルを生成する標識を組み込む工程；
ＰＣＲ増幅産物を、各々が第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができる、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子であって、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む１つ以上の仮想プローブを有する本開示のアレイに接触させる工程；
アレイからの未結合核酸分子を洗浄する工程；および
アレイ上の各プローブ分子位置における標識のシグナルを測定する工程；および
シグナルが、プローブ分子にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって作製されることを示す場合、本明細書に記載されるようにシグナルを分析して、第１のアンプリコンセットまたは第２のアンプリコンセットがＰＣＲ増幅反応によって作製されるかどうかを判定するか、またはシグナルが、プローブ分子の群にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって作製されないことを示す場合、その試料が第１の生物または第２の生物を含まないと判定する工程、
したがって、第１の生物または第２の生物が試料中に存在するかどうかを判定する工程。
６．４．コンピュータ実装
本開示の方法の多くの態様は、コンピュータによって実装することができる。
本開示の方法の多くの態様は、コンピュータによって実装することができる。
したがって、本開示は、第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が調製された初期試料中に存在するかどうかを検出するためのコンピュータ実装方法を提供する。
本方法は、典型的には、１つ以上のプロセッサによって実行するための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された、１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、１つ以上のコンピュータ可読命令は、（ａ）プローブ分子と試験試料中の核酸（存在する場合）とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するための命令、および（ｄ）１つ以上の式に従ってシグナルデータを分析して、第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する第２の微生物が試験試料または試験試料が調製された初期試料中に存在するかどうかを判定するための命令を含む。１つ以上の式は、例えば、計量プローブからのシグナルが所定の閾値以上である場合にシグナルデータを分析するために使用される第１の式と、計量プローブからのシグナルデータが所定の閾値未満である場合にシグナルデータを分析するために使用される第２の式とを含むことができる。
コンピュータ実装方法は、例えば、試料中の微生物の同一性および／または試料中の目的の微生物の不在に関する通知をユーザに提供することを含むことができる。
６．５．システム
本開示は、例えば、生物が試料中に存在するかどうかを決定するために有用なシステムを提供する。システムは、例えば、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ分子を有するアレイ（例えば、本開示のアレイ）の各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダ；および（ｉｉ）光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、仮想プローブ（例えば、本明細書に記載の特徴を有する仮想プローブ）を使用してシグナルデータを分析するように構成され、分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置またはネットワークへのインターフェースを有する少なくとも１つのプロセッサを含むことができる。
本開示は、例えば、生物が試料中に存在するかどうかを決定するために有用なシステムを提供する。システムは、例えば、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ分子を有するアレイ（例えば、本開示のアレイ）の各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダ；および（ｉｉ）光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、仮想プローブ（例えば、本明細書に記載の特徴を有する仮想プローブ）を使用してシグナルデータを分析するように構成され、分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置またはネットワークへのインターフェースを有する少なくとも１つのプロセッサを含むことができる。
本開示のシステムで使用することができる光学リーダには、市販のマイクロプレートリーダ（例えば、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡｒｒａｙＰｉｘ（商標）（Ａｒｒａｙｉｔ）、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ））が含まれる。
システムは、アレイ上の蛍光標識分子（例えば、プローブ分子および／またはそれにハイブリダイズしたアンプリコン）を励起することができる光源光源を（光学リーダの構成要素として、または別個の構成要素として）さらに含むことができる。
システムは、シグナルデータの分析を実施するためのプロセッサ実行可能命令を含む、非一時的記憶媒体（例えば、ハードディスク、フラッシュドライブ、ＣＤまたはＤＶＤ）を含むことができる。
システムは、汎用または専用のコンピューティングシステム環境または構成を含むことができる。本開示のシステムと共に使用することができる周知のコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、スマートフォン、タブレット、ハンドヘルドまたはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースのシステム、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記のシステムまたは装置のいずれかを含む分散コンピューティング環境などが含まれるが、これらに限定されない。
本開示のシステムは、プログラムモジュールなどのコンピュータ実行可能命令を実行することができる。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実現するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。いくつかの実施形態はまた、通信ネットワークを介してリンクされたリモート処理装置によってタスクが実行される分散コンピューティング環境で実施されてもよい。これらの分散システムは、企業コンピューティングシステムとして知られているものであってもよく、またはいくつかの実施形態では、「クラウド」コンピューティングシステムであってもよい。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、メモリ記憶装置を含むローカルおよび／またはリモートコンピュータ記憶媒体の両方に配置することができる。
コンピューティング環境は、１つまたは複数の入力／出力装置を含むことができる。いくつかのそのような入力／出力装置は、ユーザインターフェースを提供することができる。ユーザは、キーボードなどの入力装置およびマウスなどのポインティング装置を介して、コンピュータにコマンドおよび情報を入力することができる。しかしながら、トラックボール、タッチパッドまたはタッチスクリーンを含む他の形態のポインティング装置が使用されてもよい。
本開示のシステムは、ユーザインターフェースの一部を形成することができる出力装置、例えばモニタを含む、１つ以上の出力装置を含むことができる。
本開示のシステムは、１つ以上のリモートコンピュータへの論理接続を使用してネットワーク環境で動作することができる。リモートコンピュータは、パーソナルコンピュータ、サーバ、ルータ、ネットワークＰＣ、ピアデバイス、または他の共通ネットワークノードであってもよい。論理接続は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）およびワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むが、他のネットワークも含むことができる。そのようなネットワーキング環境は、オフィス、企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネット、およびインターネットにおいて一般的である。これに代えて、またはこれに加えて、ＷＡＮはセルラネットワークを含んでもよい。
ＬＡＮネットワーキング環境で使用される場合、本開示のシステムは、ネットワークインターフェースまたはアダプタを介してＬＡＮに接続することができる。ＷＡＮネットワーキング環境で使用される場合、システムは、モデム、またはインターネットなどのＷＡＮにわたる通信を確立するための他の手段を含むことができる。
ネットワーク環境では、仮想プローブを使用してシグナルデータを分析するためのプログラムモジュールをリモートメモリ記憶装置（例えば、ハードドライブまたはフラッシュドライブ）に記憶することができる。
本開示のシステムは、ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、未結合核酸分子をアレイから洗浄することができるプレートハンドリングロボットをさらに含むことができる。多数のプレートハンドリングロボットが市販されており、そのようなロボットを本開示のシステムで使用することができる（例えば、Ｔｅｃａｎ ＭＳＰ ９０００、ＭＳＰ ９２５０もしくはＭＳＰ ９５００、Ｔｅｃａｎ Ｃａｖｒｏ（登録商標）Ｏｍｎｉ Ｆｌｅｘ、Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ ＴｒｉＴｏｎ（ＸＹＺ）、またはＡｕｒｏｒａ Ｖｅｒｓａ（商標））。
６．６．キット
本開示は、本開示の方法における使用に適したキットを提供する。
本開示は、本開示の方法における使用に適したキットを提供する。
キットは、例えば、本明細書に記載のリアルタイムＰＣＲ反応での使用に適した２つ以上の標識プローブ分子（例えば、２～２０個のプローブ分子、２～１０個のプローブ分子、２～５個のプローブ分子、５～１０個のプローブ分子、または１０～２０個のプローブ分子）のセットを含むことができる。例えば、キットは、（１）ヌクレオチド配列が配列番号１を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むプローブ分子；（２）ヌクレオチド配列が配列番号３を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むプローブ分子；または（３）ヌクレオチド配列が配列番号５を含むプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むプローブ分子、を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、（１）および（２）のプローブ分子の組み合わせを含む。他の実施形態では、キットは、（１）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。他の実施形態では、キットは、（２）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、キットは、（１）、（２）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。
他の実施形態では、キットは、例えば、本明細書に記載のアレイ上での使用に適した２つ以上のプローブ分子（例えば、２～２０個のプローブ分子、２～１０個のプローブ分子、２～５個のプローブ分子、５～１０個のプローブ分子、または１０～２０個のプローブ分子）のセットを含むことができる（例えば、非標識プローブ分子）。例えば、キットは、（１）ヌクレオチド配列が配列番号１を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むプローブ分子；（２）ヌクレオチド配列が配列番号３を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むプローブ分子；または（３）ヌクレオチド配列が配列番号５を含むプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むプローブ分子、を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、（１）および（２）のプローブ分子の組み合わせを含む。他の実施形態では、キットは、（１）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。他の実施形態では、キットは、（２）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、キットは、（１）、（２）および（３）のプローブ分子の組み合わせを含む。
他の実施形態では、キットは、本明細書に記載のアレイを含むことができる。
本明細書に記載のキットは、ＰＣＲ反応を実施するための１つ以上の試薬、例えば相同ゲノム配列を増幅するための１つ以上（例えば、２つ）のプライマー、および／またはハイブリダイゼーション反応を実施するための１つ以上の試薬、例えば洗浄緩衝液をさらに含むことができる。
本明細書に記載のキットは、１つ以上の試薬、および／またはＰＣＲ増幅反応のための試料を調製するための１つ以上の装置、例えば溶解緩衝液またはビーズビーティングシステムをさらに含むことができる。
本明細書に記載のキットは、キットの構成要素を使用して本明細書に記載の方法の工程の一部または全部を実施するための、１つ以上の容器および／または説明書をさらに含むことができる。
７．実施例
７．１．実施例１：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）用の仮想プローブ
黄色ブドウ球菌はコアグラーゼ陽性種であり、身体の微生物叢の正常なメンバーである。しかしながら、黄色ブドウ球菌は、皮膚感染症、呼吸器感染症、および食中毒を引き起こす、日和見性病原体になり得る。したがって、臨床試料において黄色ブドウ球菌と他のブドウ球菌種とを区別することができる試験が臨床的に必要とされている。他にもコアグラーゼ陽性ブドウ球菌はいくつかあるが、通常は疾患における重大な役割を果たさず、したがってほとんどの分析目的では無視することができる。
７．１．実施例１：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）用の仮想プローブ
黄色ブドウ球菌はコアグラーゼ陽性種であり、身体の微生物叢の正常なメンバーである。しかしながら、黄色ブドウ球菌は、皮膚感染症、呼吸器感染症、および食中毒を引き起こす、日和見性病原体になり得る。したがって、臨床試料において黄色ブドウ球菌と他のブドウ球菌種とを区別することができる試験が臨床的に必要とされている。他にもコアグラーゼ陽性ブドウ球菌はいくつかあるが、通常は疾患における重大な役割を果たさず、したがってほとんどの分析目的では無視することができる。
ブドウ球菌種を非特異的に同定するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブ、「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ」（ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を有する）を作製した。換言すれば、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐは、属プローブ分子であり、それ自体では、試料中のコアグラーゼ陰性種から黄色ブドウ球菌を区別することができない。実施例で用いたプローブ分子名に存在する数字は、プローブ分子でプロービング可能なアンプリコンを作製するためのフォワードＰＣＲプライマーと、プローブの出発との間のヌクレオチド数での距離を指す。第２のオリゴヌクレオチドプローブ、「Ｓａｕ－７１ｐ」（ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を有する）は、黄色ブドウ球菌由来のアンプリコンで陽性シグナルを提供するが、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来のアンプリコンで陽性シグナルを提供しない１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ分子である。したがって、臨床的に関連する唯一のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種が黄色ブドウ球菌である場合、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種用の例示的な仮想プローブは、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐおよびＳａｕ－７１ｐからなり得る。仮想プローブでＰＣＲ増幅産物をプロービングし、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐのシグナルが陽性であり、Ｓａｕ－７１ｐのシグナルが陽性でない場合（「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６－ａｂｐ ＮＯＴ Ｓａｕ－７１ｐ」と表すことができる）、ＰＣＲ増幅産物へと作製された試料がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含む、と決定することができる（図１０Ａを参照されたい）。より多くの種が関連する状況では、仮想プローブは追加のプローブ分子を含むことができる。例えば、ウシ、ウマおよびブタにおいて皮膚疾患を引き起こし得るＳ．ハイカス（ｈｙｉｃｕｓ）が関連する場合、Ｓ．ハイカス（ｈｙｉｃｕｓ）に特異的なプローブも陽性でなければ（「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ ＮＯＴ Ｓａｕ７１Ｐ ＮＯＴ Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ」と表すことができる）、試料はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種を含有する、と決定することができる（図１０Ｂを参照されたい）。
７．２．実施例２：ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）およびストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を区別するための仮想プローブ
ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、ヒトの口中に一般的に見られる細菌である。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、口の中では通常無害であるが、血流に入ると急性細菌性心内膜炎を引き起こす可能性がある。ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）もヒト微生物叢のメンバーであり、免疫無防備状態の個体において感染症を引き起こすことが知られている。
ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、ヒトの口中に一般的に見られる細菌である。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）は、口の中では通常無害であるが、血流に入ると急性細菌性心内膜炎を引き起こす可能性がある。ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）もヒト微生物叢のメンバーであり、免疫無防備状態の個体において感染症を引き起こすことが知られている。
試料中のＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）およびＳ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を区別するための仮想プローブに使用され得る、２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が作製されている。ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子「Ｓｔａｎｇｏ ８５ｐ」は、Ｓ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）およびＳ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）のいずれかが試料中に存在する場合に陽性シグナルをもたらすことができる１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ分子である。一方、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子「Ｓａｎｇ １５６ｐ」は、Ｓ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来のアンプリコンで陽性シグナルをもたらし、Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）由来のアンプリコンで陽性シグナルをもたらさない。Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）およびＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）用の例示的な仮想プローブは、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐおよびＳａｎｇ１５６ｐからなる。仮想プローブでＰＣＲ増幅産物をプロービングし、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐについてのシグナルが陽性であり、Ｓａｎ１５６ｐについてのシグナルが陽性でない場合（「Ｓｔａｎｇｏ８５ｐ ＮＯＴ Ｓａｎｇ１５６ｐ」と表すことができる）、ＰＣＲ増幅産物を調製するために使用された試料がＳ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）を含有する、と決定することができ、一方、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐについてのシグナルが陽性であり、Ｓａｎ１５６ｐについてのシグナルが陽性である場合（「Ｓｔａｎｇｏ８５ｐ ＡＮＤ Ｓａｎｇ１５６ｐ」と表すことができる）、試料がＳ．アンギノーサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）を含有すると決定することができる。
７．３．実施例３：ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌を区別するための仮想プローブ
ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌は、両方とも病原性であり得、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡにおいてほぼ同一であり、それにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ用の単一オリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して２つの種を区別することを困難にする。
ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌は、両方とも病原性であり得、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡにおいてほぼ同一であり、それにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ用の単一オリゴヌクレオチドプローブ分子を使用して２つの種を区別することを困難にする。
Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）と肺炎レンサ球菌とを区別するための仮想プローブに使用され得る、３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が作製されている。ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を有する第１のプローブ「ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ」は、様々なレンサ球菌種を区別することができない属プローブ分子である。ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を有する第２のプローブ「Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ」は、肺炎レンサ球菌由来のゲノム配列を含むが、それ自体を使用してＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）と肺炎レンサ球菌とを区別することはできない。ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を有する第３のプローブ「Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ」は、肺炎レンサ球菌におけるＳＮＰを説明する単一ヌクレオチドでＳｐｎｅｕ－２２９ｐとは異なる。
Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンが３つのプローブ分子を含むアレイに結合した場合、３つのプローブ分子のそれぞれについて陽性シグナルが観察された（図１１Ａ～図１１Ｂ）。したがって、３つのプローブ分子を個別に使用して、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）と肺炎レンサ球菌とを区別することはできない。しかしながら、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌由来のアンプリコンは、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンを３つのプローブでプロービングする場合のシグナルパターンを評価することによって区別することができた。具体的には、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）を含む試料から作製したＰＣＲ増幅産物をプロービングすると、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ ＯＲ Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ）＜（ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／３」と表すことができるシグナルパターンが得られ、肺炎レンサ球菌を含む試料から作製したＰＣＲ増幅産物をプロービングすると、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ ＡＮＤ Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ）＞（ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／３」と表すことができるシグナルパターンが得られた。
Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）および肺炎レンサ球菌含有試料からのハイブリダイゼーションデータのさらなる分析から、Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐおよびＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐプローブのシグナルパターン、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）≦０．３９」はＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）の存在を示し、Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐおよびＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐプローブのシグナルパターン、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）＞０．３９」は肺炎レンサ球菌の存在を示すことが決定された。
このように、この例は、仮想プローブの概念を検証する。
７．４．実施例４：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄｉａｎｓ群を検出するための仮想プローブ
ｖｉｒｉｄｉａｎｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ群（ＶＧＳ）は、臨床的に関連するグラム陽性細菌の主要な群の１つであり、２４を超える種を含み、それらはストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）群、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）群、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）群およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）群の５つの下位群に配置されている。ＶＧＳ群細菌は、免疫無防備状態の患者において肺炎および敗血症を引き起こす可能性がある。
ｖｉｒｉｄｉａｎｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ群（ＶＧＳ）は、臨床的に関連するグラム陽性細菌の主要な群の１つであり、２４を超える種を含み、それらはストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）群、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）群、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）群およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）群の５つの下位群に配置されている。ＶＧＳ群細菌は、免疫無防備状態の患者において肺炎および敗血症を引き起こす可能性がある。
群としてのＶＧＳ種は遺伝的に異種起源であるように見え、単一のプローブで様々な種を検出できることを示唆している。様々なＶＧＳ群細菌用の複数のプローブを設計したが、種のうちの少数は、他のＶＧＳ下位群用のプローブとの交差反応性を示した（図１２を参照されたい。そこでは肺炎レンサ球菌のＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）プローブＳｍｉｔ－７９ｐとの交差反応性が示され、Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）およびＳ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）の肺炎レンサ球菌プローブＳｐｎｅｕ－２２９ｐおよびＳｐｎｅｕ－２２９ｂｐとの交差反応性が示されている）。交差反応性を考慮して、肺炎レンサ球菌とＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）／Ｓ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）とを区別することができるＳ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）群細菌用の仮想プローブを設計した：
Ｓ．ミティス（ｍｉｔｉｓ）下位群＝（Ｓｐａｒ－２０５ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）ＯＲ（Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｈｙｏ－１９３ｐ）ＯＲ（Ｓｓａｎｇ－１９３ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｔｍｕ－８６ｐ）ＯＲ（Ｓｔａｎｇｏ－８５ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓａｎｇ－１５６ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ＞０．０１）ＡＮＤ ＩＦ Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＴＨＥＮ（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ≦３
７．５．実施例５：腸内細菌科群からの種を検出するための仮想プローブ
腸内細菌科は、病原性種と非病原性種の両方を含むグラム陰性細菌の大きな科である。病原性の科のメンバーには、クレブシエラ種、エンテロバクター種、エシェリヒア種、シトロバクター種、セラチア種およびサルモネラ種が含まれる。
腸内細菌科は、病原性種と非病原性種の両方を含むグラム陰性細菌の大きな科である。病原性の科のメンバーには、クレブシエラ種、エンテロバクター種、エシェリヒア種、シトロバクター種、セラチア種およびサルモネラ種が含まれる。
科のメンバーの１６ｓ ｒＲＮＡ領域は、種間で最小限の遺伝子配列変異を有し、種間を区別することができる１６ Ｓプローブの設計を困難にする。しかしながら、１６Ｓ配列の類似性を考慮して、共通のプローブ「Ｅｎｔｂ－１３２ｐ」が設計され、これはプローブ「Ｅｎｔｂ－２９９ｐ」で同定され得るパントエア種を除いて、ほとんどの科のメンバーをＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ科として同定することができる。
１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム領域におけるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ種由来の種のクラスタリングパターンに従って、２つのグループプローブを設計した。エンテロバクター属およびクレブシエラ属由来の種はプローブ「Ｅｎｋｌｓｐｓ－９５ｐ」によって同定することができ、シトロバクター属、サルモネラ属およびエシェリヒア属由来の種はプローブ「ＳａＥｓＣｉ－９１ｐ」によって同定することができる。腸内細菌種間を区別することができる単一プローブを設計することは困難であるため、腸内細菌種の階層的同定および識別のために、１６Ｓ ｒＲＮＡとＩＴＳプローブとの組み合わせを設計した（図１３および図１４参照）。
１６ｓ－２３ｓ ＩＴＳ領域の使用により、Ｅ．クロアカ、Ｅ．アズブリア、およびＥ．ホルメシェイを含むエンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）複合体の種を区別することが可能になった。組み合わせて使用される３つのプローブ「Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ」、「Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ」および「ＥＣＣ３－１７２９ｐ」によって、異なるエンテロバクター・クロアカ複合種の特異的同定が可能になった（図１５参照）。
Ｅ．クロアカ＝Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．アズブリア＝Ｅｎｃｌ０１８７１ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．ホルメシェイ＝（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＡＮＤ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）ＮＯＴ Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ
Ｅ．クロアカ＝Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．アズブリア＝Ｅｎｃｌ０１８７１ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．ホルメシェイ＝（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＡＮＤ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）ＮＯＴ Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ
７．６．実施例６：仮想プローブによるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）の検出の改善
この実施例は、実施例１に記載のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐおよびＳａｕ－７１ｐプローブを含む仮想プローブを使用してＣＮＳおよびコアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌を区別および同定するための改善された方式を記載する。
この実施例は、実施例１に記載のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐおよびＳａｕ－７１ｐプローブを含む仮想プローブを使用してＣＮＳおよびコアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌を区別および同定するための改善された方式を記載する。
ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比を使用して、ＣＮＳを含有する試料を黄色ブドウ球菌を含有する試料から区別することができる。例えば、シグナル比カットオフ値２を使用して、ＣＮＳを含有する試料を黄色ブドウ球菌を含有する試料から良好な精度で区別できることが分かった（例えば、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比が＞２である場合、試料をＣＮＳを含有するものとして同定し、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比が＜２である場合、黄色ブドウ球菌を含有する試料と同定する）（データは示さず）。
しかしながら、高濃度のＣＮＳを含有する試料では、高濃度ではＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比が約２に低下したため、カットオフ値２が、時として不正確な同定をもたらし得ることが発見された。図１６Ａ～図１６Ｂを参照されたい。オリゴヌクレオチドプローブは、高濃度の標的核酸を含有する試料をプロービングする場合に飽和する可能性があり、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐおよびＳａｕ－７１ｐプローブが異なる試料濃度で飽和に達することが発見された。例えば、図１６Ａ～１６Ｂは、試料中のＣＮＳ（Ｓ．ホミニス）および黄色ブドウ球菌の濃度が増加すると、Ｓ．ホミニスまたは黄色ブドウ球菌を含有する試料について観察されたＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比が一定のままではなく、試料濃度が増加するにつれて減少したことを示す。これは、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐプローブ（属プローブ）がＳａｕ－７１ｐよりも低い濃度で飽和に達したことを示している。したがって、低い試料濃度のＣＮＳと黄色ブドウ球菌とを正確に区別し得るＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比カットオフ値（例えば、２）は、高い試料濃度では不正確な識別をもたらし得る。
ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比は、試料濃度が増加するにつれて低下することが観察されたが、すべての試験濃度について、黄色ブドウ球菌のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ比がＣＮＳより高いままであることも観察された。したがって、試料中の標的配列の相対濃度の知識により、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比の適切なカットオフ値を使用して、試料濃度が高くても、ＣＮＳと黄色ブドウ球菌とを区別することができる。属プローブＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐを計量プローブに使用して、標的核酸濃度の相対的尺度を提供できることが発見された。標的核酸濃度のこの相対的尺度を説明するＣＮＳおよび黄色ブドウ球菌を識別するための式を設計した：
ＣＮＳ判定のための式：
（（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ≧０．２ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ≧１．５））
ＯＲ
（（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ＜０．２ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ＞３））
ＣＮＳ判定のための式：
（（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ≧０．２ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ≧１．５））
ＯＲ
（（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ＜０．２ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ＞３））
上記の式では、生のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナル０．２が閾値である（生シグナルデータから経験的に決定された。図１７参照）。図１７は、黄色ブドウ球菌を含有する試料についてＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルデータをＸ軸上に、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１シグナル比をＹ軸にプロットする。閾値０．２を選択したのは、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１シグナル比が、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルが０．２未満であると一般に比較的高く、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルが０．２を超えると比較的低いことが観察されたからである。閾値０．２が選択されたら、ＣＮＳまたは黄色ブドウ球菌の存在を示すＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１シグナル比のカットオフ値を、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルレベルが０．２以上である場合の使用およびＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルレベルが０．２未満である場合の使用のために選択した。カットオフ値を１．５（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐシグナルが０．２以上である場合に使用するため）、および３（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６シグナルが０．２未満である場合に使用するため）に選択した。閾値およびカットオフ値の選択に使用したデータを表３Ａ～３Ｂに示す。
上記の式において、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐからのシグナルが閾値の０．２以上である場合（標的核酸の濃度が比較的高いことを示す）、Ａｌｌｓｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐの生シグナルの比が１．５以上であると、ＣＮＳが存在すると判定され、比が１．５未満であると、黄色ブドウ球菌が存在すると判定される。ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐからのシグナルが０．２未満である場合（標的核酸の濃度が比較的低いことを示す）、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐの生シグナルの比が３を超えると、試料中にＣＮＳが存在すると判定され、比が３以下であると、黄色ブドウ球菌が存在すると判定される。
したがって、上記の式は、第１の式（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ≧１．５）および第２の式（ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐ＞３）の組み合わせを表し、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐのシグナル（具体的には、シグナルがどの程度閾値に匹敵しているか）が、どの式を使用してＣＮＳまたは黄色ブドウ球菌を含有する試料を同定するかを決定する。試料中の標的核酸の相対濃度を説明する式を使用すると、単一のＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ／Ｓａｕ－７１ｐシグナル比カットオフのみに基づく式と比較して、ＣＮＳおよび黄色ブドウ球菌の同定の精度を高めることができる。
８．特定の実施形態
本開示は、以下の特定の実施形態によって例示される。
１．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が調製された初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）複数のプローブ分子を含む仮想プローブで試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）仮想プローブが少なくとも２つのプローブ分子を含み、それぞれが第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）プローブ分子の少なくとも１つは、第１のゲノムに対応する標的核酸および第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）仮想プローブのプローブ分子は、単独で第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）プローブ分子は、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションによって、第１のゲノムおよび第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｃ）プローブ分子の試験試料中の核酸へのハイブリダイゼーションが検出された場合、
（ｉ）計量プローブの試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量されたシグナルを第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）計量プローブの試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量されたシグナルを第２の式に従って分析する工程を含む、方法。
２．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが生シグナルである、実施形態１の方法。
３．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが正規化シグナルである、実施形態１の方法。
４．計量プローブが属プローブである、実施形態１～３のいずれか１つの方法。
５．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、プローブ分子が、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１～４のいずれか１つの方法。
６．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって試験試料を調製することをさらに含み、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、実施形態５の方法。
７．ＰＣＲプライマーが複数のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが複数の第１のアンプリコンを含み、かつ／または第２のアンプリコンセットが複数の第２のアンプリコンを含む、実施形態６の方法。
８．（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができる第１のＰＣＲプライマーのセットを使用して、初期試料に対して第１のＰＣＲ増幅反応を行うこと、（ｂ）第１のＰＣＲプライマーのセットとは異なる、第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができる第２のＰＣＲプライマーのセットを使用して、初期試料に対して第２のＰＣＲ増幅反応を行うこと、および（ｃ）第１および第２のＰＣＲ反応で生成されたアンプリコンを組み合わせ、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、複数の第１のアンプリコンを含む第１のアンプリコンセットおよび複数の第２のアンプリコンを含む第２のアンプリコンセットをそれぞれもたらすことによって試験試料を調製することをさらに含む、実施形態５の方法。
９．複数の第１のアンプリコンが第１ゲノム中の種々の領域に対応し、かつ／または複数の第２のアンプリコンが第２のゲノム中の種々の領域に対応する、実施形態７または実施形態８の方法。
１０．ＰＣＲプライマーが単一のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが単一の第１のアンプリコンからなり、第２のアンプリコンセットが単一の第２のアンプリコンからなる、実施形態６の方法。
１１．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１２．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１３．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも３つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１４．ＰＣＲ増幅反応が、反応によって生成される任意のアンプリコン中に測定可能なシグナルを生成する標識を組み入れる、実施形態６～１３のいずれか１つの方法。
１５．プライマーが標識されている、実施形態６～１４のいずれか１つの方法。
１６．少なくとも１つのプライマーが５’蛍光標識されている、実施形態１５の方法。
１７．複数のプライマーが５’蛍光標識されている、実施形態１５の方法。
１８．ＰＣＲ反応が、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドを含む、実施形態６～１７のいずれか１つの方法。
１９．各プローブ分子が、第１のゲノムおよび／または第２のゲノム中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。
２０．仮想プローブが、互いに対して１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。
２１．仮想プローブが、互いに対して１つのヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態２０の方法。
２２．仮想プローブが、互いに対して２つのヌクレオチドミスマッチを有するプローブ分子を含む、実施形態２０の方法。
２３．仮想プローブのプローブ分子が、アレイ上に存在する位置的にアドレサブルなプローブ分子であり、各々アレイ上の離散した位置にある、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
２４．仮想プローブ中のプローブ分子と試験試料中の核酸（存在する場合）とのハイブリダイゼーションからのシグナルを検出および／または定量することが、仮想プローブ中のプローブ分子の位置で標識を検出および／または定量することを含む、実施形態２３の方法。
２５．工程（ｂ）が、
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物をアレイと接触させること；
（ｉｉ）アレイからの未結合核酸分子を洗浄すること；および
（ｉｉｉ）アレイ上の各プローブ分子位置における標識のシグナル強度を測定することを含む、実施形態２３または実施形態２４の方法。
２６．アレイが１つ以上の制御プローブ分子を含む、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法。
２７．プローブ分子がオリゴヌクレオチドプローブ分子である、実施形態２３～２６のいずれか１つの方法。
２８．プローブ分子のうちの１つ以上がポリチミジン尾部を有する、実施形態２７の方法。
２９．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態２７の方法。
３０．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態２９の方法。
３１．ＰＣＲ増幅反応がリアルタイムＰＣＲ増幅反応である、実施形態６～２２のいずれか１つの方法。
３２．（ａ）各プローブ分子が、識別可能な標識と、標識およびクエンチャー部分の両方がプローブに結合している場合に標識の検出を阻害するクエンチャー部分とを含み；
（ｂ）標識が、リアルタイムＰＣＲ増幅反応中にプローブ分子の切断と同時に測定可能なシグナルを生成し；
（ｃ）各標識が、他の各標識と識別可能である、
実施形態３１の方法。
３３．標識が蛍光標識である、実施形態３２の方法。
３４．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態５～３３のいずれか１つの方法。
３５．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態５～３４のいずれか１つの方法。
３６．第１および第２の微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
３７．微生物の１つ以上がヒト病原体または動物病原体である、実施形態１～３６のいずれか１つの方法。
３８．微生物が細菌、ウイルス、または真菌である、実施形態３６～３７のいずれか１つの方法。
３９．微生物が細菌である、実施形態３６～３８のいずれか１つの方法。
４０．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態３９の方法。
４１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態４０の方法。
４２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態４０または実施形態４１の方法。
４３．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態３９～４２のいずれか１つの方法。
４４．第１の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、実施形態１～４３のいずれか１つの方法。
４５．第２の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、実施形態１～４４のいずれか１つの方法。
４６．各ブール演算子が、「ＡＮＤ」、「ＯＲ」、および「ＮＯＴ」から独立して選択される、実施形態４４または実施形態４５の方法。
４７．各関係演算子が、「より大きい」（「＞」）、「より小さい」（「＜」）、「以上」（「≧」）および「以下」（「≦」）から独立して選択される、実施形態４４～４６のいずれか１つの方法。
４８．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上のブール演算子によって組み合わされる、実施形態４４～４６のいずれか１つの方法。
４９．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上の関係演算子によって組み合わされる、実施形態４４～４８のいずれか１つの方法。
５０．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上のシグナル比によって組み合わされる、実施形態４４～４９のいずれか１つの方法。
５１．仮想プローブが２つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１～５０のいずれか１つの方法。
５２．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるが、第１の標的核酸にはできない第２のプローブ分子とを含む、実施形態５１の方法。
５３．第１のプローブが計量プローブである、実施形態５２の方法。
５４．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１の標的核酸および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる第２のプローブ分子とを含む、実施形態５１の方法。
５５．第１のプローブが計量プローブである、実施形態５４の方法。
５６．仮想プローブが第１のプローブおよび第２のプローブを含み、第１の式および第２の式が、第１のプローブおよび第２のプローブからのシグナルをシグナル比で組み合わせる、実施形態１～５５のいずれか１つの方法。
５７．第１の式および第２の式が各々、シグナル比を所定のカットオフ値と比較し、第１の式のカットオフ値と第２の式のカットオフ値とが異なる、実施形態５６の方法。
５８．第１の微生物がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種（ＣＮＳ）であり、第２の微生物がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種（ＣＰＳ）である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
５９．第２の微生物が黄色ブドウ球菌である、実施形態５８の方法。
６０．仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態５８または実施形態５９のいずれか１つの方法。
６１．ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態６０に記載の方法。
６２．閾値が０．２である、実施形態６１の方法。
６３．仮想プローブが、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態５８～６２のいずれか１つの方法。
６４．仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する第１のプローブ分子と、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する第２のプローブ分子とを含み、第１の式および第２の式が、第１のプローブおよび第２のプローブからのシグナルをシグナル比で組み合わせる、実施形態６３の方法。
６５．シグナル比が、第１のプローブのシグナルを第２のプローブのシグナルで割ったものである、実施形態６４の方法。
６６．第１の式および第２の式が各々、シグナル比を所定のカットオフ値と比較し、第１の式のカットオフ値と第２の式のカットオフ値とが異なる、実施形態６４または実施形態６５の方法。
６７．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合にシグナル比が第１の式のカットオフ値以上である場合、ＣＮＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６の方法。
６８．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合にシグナル比が第２の式のカットオフ値を超える場合、ＣＮＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６または実施形態６７の方法。
６９．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合にシグナル比が第１の式のカットオフ値未満である場合、ＣＰＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６～６８のいずれか１つの方法。
７０．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合にシグナル比が第２の式のカットオフ値以下である場合、ＣＰＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６～６９のいずれか１つの方法。
７１．第１の式のカットオフ値が１．５であり、第２の式のカットオフ値が３である、実施形態６６～７０のいずれか一つの方法。
７２．第１の微生物がストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７３．仮想プローブが、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７２の方法。
７４．ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態７３の方法。
７５．仮想プローブが、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７２～７４のいずれの１つの方法。
７６．第１および第２の微生物が腸内細菌科細菌である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７７．第１および第２の微生物が、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・アスブリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ）およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）から選択される、実施形態７６の方法。
７８．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）であり、第２の微生物が肺炎レンサ球菌である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７９．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７８の方法。
８０．仮想プローブが、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７８～７９のいずれの１つの方法。
８１．ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態８０に記載の方法。
８２．仮想プローブが３つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
８３．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、第１のプローブ分子とは異なる第２のプローブ分子と、（ｉｉｉ）第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、第１および第２のプローブ分子とは異なる第３のプローブ分子とを含む、実施形態８２の方法。
８４．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）であり、第２の微生物が肺炎レンサ球菌である、実施形態７８～８３のいずれか１つの方法。
８５．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４の方法。
８６．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４または実施形態８５の方法。
８７．仮想プローブが、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４～８６のいずれの１つの方法。
８８．ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態８７に記載の方法。
８９．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態６～８８のいずれの１つの方法。
９０．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態８９の方法。
９１．初期試料または試験試料が、微生物の１つ以上による感染のリスクがある、実施形態３６～９０のいずれか１つの方法。
９２．初期試料または試験試料が、微生物の１つ以上による感染を有すると疑われる、実施形態３６～９１のいずれか１つの方法。
９３．初期試料または試験試料が、生物学的試料、環境的試料または食品である、実施形態１～９２のいずれか１つの方法。
９４．初期試料または試験試料が、血液、血清、唾液、尿、胃液、消化液、涙、便、精液、膣液、間質液、腫瘍組織に由来する液、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、指の爪、皮膚細胞、血漿、鼻スワブから得られた液、鼻咽頭洗浄液から得られた液、脳脊髄液、組織試料、喉スワブから得られた液もしくは組織、創傷スワブから得られた液もしくは組織、生検組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帯血、リンパ液、空洞液、痰、膿、微生物叢、メコニウム、母乳、または前述のいずれかから加工、抽出もしくは分別された試料から選択される生物学的試料である、実施形態９３の方法。
９５．生物学的試料が、
（ａ）尿、痰、または尿から加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｂ）痰、または痰から加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｃ）創傷スワブ、または創傷スワブから加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｄ）血液、または血液から加工、抽出もしくは分別された試料；または
（ｅ）腹膜透析液、または腹膜透析液から加工、抽出もしくは分別された試料である、実施形態９４の方法。
９６．初期試料または試験試料が、土壌、地下水、地表水、廃水、または上記のいずれかから加工、抽出もしくは分別された試料から選択される環境的試料である、実施形態９３の方法。
９７．工程（ｃ）がコンピュータ実装され、工程（ｃ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータが閾値以上である場合、第１の式に従ってシグナルデータを分析し、計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従ってシグナルデータを分析するための命令を含む、実施形態１～９６のいずれか１つの方法。
９８．ユーザに通知を提供することをさらに含み、通知が、場合により試験試料中の第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、実施形態９７の方法。
９９．以下を含むアドレサブルアレイ：
（ａ）第１のゲノム配列を第２の相同ゲノム配列から区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、位置的にアドレサブルなオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、それぞれがアレイ上の離散した位置にあり、１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブ分子の１つ以上が計量プローブである、仮想プローブ；および
（ｂ）場合により、１つ以上の制御プローブ分子。
１００．計量プローブの１つ以上が属プローブである、実施形態９９のアドレサブルアレイ。
１０１．少なくとも２つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０２．少なくとも３つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０３．少なくとも４つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０４．少なくとも５つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０５．少なくとも１０個の仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０６．最大１０個の仮想プローブを含む、実施形態９９９～１０４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０７．最大１５個の仮想プローブを含む、実施形態９９～１０５のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０８．各仮想プローブが計量プローブを含む、実施形態９９～１０７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０９．各仮想プローブが２～４個のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態９９～１０８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１１０．各仮想プローブが２～３個のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１０９のアドレサブルアレイ。
１１１．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態９９～１１０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１１２．１２～１００個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１３．１２～５０個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１４．２５～７５個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１５．５０～１００個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１６．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１７．１４個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１８．８４個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１９．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、第１の微生物および第２の微生物にそれぞれ由来するゲノム配列である、実施形態実施形態９９～１１８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２０．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態１１９のアドレサブルアレイ。
１２１．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１２０のアドレサブルアレイ。
１２２．プローブ分子の１つ以上がポリチミジン尾部を含む、実施形態９９～１２１のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２３．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１２２のアドレサブルアレイ。
１２４．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１２３のアドレサブルアレイ。
１２５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態９９～１２４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２６．ｒＲＮＡをコード化する遺伝子が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である、実施形態１２５のアドレサブルアレイ。
１２７．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態９９～１２４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２８．少なくとも１つの仮想プローブが、真正細菌の種由来のゲノム配列を、真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列から区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２９．少なくとも１つの仮想プローブが、グラム陽性細菌由来のゲノム配列とグラム陰性細菌由来のゲノム配列とを区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３０．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる目の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２９のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３１．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる科の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３２．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる属の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３１のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３３．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる群の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３２のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３４．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる種の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３３のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３５．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３６．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３５のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３７．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３６のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３８．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３９．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４０．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３９のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４１．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１４０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４２．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が由来する初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含む、実施形態９９～１４１のいずれか１つに記載のアレイで試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子の少なくとも１つは、第１のゲノムに対応する標的核酸および第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）仮想プローブのプローブ分子は、単独で第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）プローブ分子は、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、第１および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションによって、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）未結合核酸分子をアレイから洗浄する工程
（ｃ）アレイ上の各プローブ分子位置においてシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｄ）シグナルが
（ｉ）アレイのプローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が試験試料中に存在することを示す場合、シグナルを分析して、試料中に第１のゲノムに対応する標的核酸または第２のゲノムに対応する標的核酸が存在するかどうかを判定し、それにより初期試料または試験試料中に第１の生物または第２の生物が存在するかどうかを判定し、
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）で作製されていないことを示す場合、その初期試料または試験試料が第１の生物または第２の生物を含んでいないと判定する工程、を含む方法。
１４３．工程（ｄ）（ｉ）の分析が、（ｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、（ｉｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従って分析することを含む、実施形態１４２の方法。
１４４．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、プローブ分子が、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１４２または実施形態１４３の方法。
１４５．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって試験試料を調製することをさらに含み、第１のゲノムおよび第２のゲノムが試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、実施形態１４４の方法。
１４６．工程（ｄ）がコンピュータ実装され、工程（ｄ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータが閾値以上である場合、第１の式に従ってシグナルデータを分析し、計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従ってシグナルデータを分析するための命令を含む、実施形態１４２～１４５のいずれか１つの方法。
１４７．ユーザに通知を提供することをさらに含み、通知が、場合により試験試料中の第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、実施形態１４６の方法。
１４８．システムであって、
（ａ）実施形態９９～１４１のいずれか１つのアレイの各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダと；
（ｂ）１つ以上のプロセッサとを含み、
（ｉ）プロセッサの少なくとも１つが、光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）プロセッサの少なくとも１つが、試験試料中の核酸分子（存在する場合）への仮想プローブ中のプローブ分子のハイブリダイゼーションの後に生成される、１つ以上の仮想プローブについてのシグナルデータを分析するように構成され、場合により、分析は、試験試料が第１のゲノム配列および／または第２のゲノム配列を含むかどうかを決定することを含み、
（ｉｉｉ）プロセッサの少なくとも１つが、分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置へのインターフェースまたはネットワークを有する、システム。
１４９．アレイ上の蛍光標識された分子を励起することができる光源を含む、実施形態１４８のシステム。
１５０．ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、未結合核酸分子をアレイから洗浄することができるプレートハンドリングロボットをさらに含む、実施形態１４８または実施形態１４９のシステム。
１５１．実施形態１４８～１５０のいずれか１つのシステムを使用して実行される、実施形態１～９８および１４２～１４７のいずれか１つの方法。
１５２．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が初期試料中に存在するかどうかを検出するための試験試料を調製する方法であって、
（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをもたらす工程；
（ｂ）計量プローブを含む、第１の微生物の第１のゲノム配列を第２の微生物の第２の相同ゲノム配列から区別するための仮想プローブを含む実施形態９９～１４１のいずれか１つに記載のアレイと、工程（ａ）のＰＣＲ増幅産物とを接触させる工程；および
（ｃ）アレイから未結合核酸分子を洗浄する工程を含む、方法。
１５３．（ｄ）アレイ上の各プローブ分子位置におけるシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｅ）試験試料中の核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションが検出される場合、
（ｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従って分析する工程をさらに含む、実施形態１５２の方法。
１５４．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態１５２～１５３のいずれの１つの方法。
１５５．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態１５４の方法。
１５６．ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５７．ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５８．ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５９．ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６０．ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６１．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６２．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６３．ポリチミジン尾部を含む、実施形態１５６～１６２のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６４．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１６３のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６５．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１６４のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６６．標識を含む、実施形態１５６～１６５のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６７．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１６８．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１６９．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１７０．各オリゴヌクレオチドプローブ分子がポリチミジン尾部を含む、実施形態１６７～１６９のいずれか１つの仮想プローブ。
１７１．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１７０の仮想プローブ。
１７２．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１７１の仮想プローブ。
１７３．以下を含むアドレサブルアレイ：
（ａ）位置的にアドレサブルなプローブ分子の群であって、各々がアレイ上の離散した位置にあり、実施形態１５６～１６６のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、プローブ分子の群；および
（ｂ）任意選択により、１つ以上の制御プローブ分子。
１７４．仮想プローブ中の各プローブ分子がアレイ内の離散した位置にある、実施形態１６７～１７２のいずれか１つの仮想プローブを含むアドレサブルアレイ。
１７５．１つ以上の制御プローブ分子を含む、実施形態１７４のアドレサブルアレイ。
１７６．ヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７を含むプローブ分子から選択される２つ以上のプローブ分子を含む、キット。
１７７．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１７８．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１７９．ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８０．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８１．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８２．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８３．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８４．プローブ分子が標識されている、実施形態１７６～１８３のいずれか１つのキット。
１８５．プローブ分子が蛍光標識で標識されている、実施形態１８４のキット。
１８６．プローブ分子が標識されていない、実施形態１７６～１８３のいずれか１つのキット。
１８７．第１のゲノム配列および第２の相同ゲノム配列を増幅することができる１つ以上のＰＣＲプライマー対をさらに含む、実施形態１７６～１８６のいずれか１つのキット。
本開示は、以下の特定の実施形態によって例示される。
１．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が調製された初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）複数のプローブ分子を含む仮想プローブで試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）仮想プローブが少なくとも２つのプローブ分子を含み、それぞれが第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）プローブ分子の少なくとも１つは、第１のゲノムに対応する標的核酸および第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）仮想プローブのプローブ分子は、単独で第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）プローブ分子は、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションによって、第１のゲノムおよび第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｃ）プローブ分子の試験試料中の核酸へのハイブリダイゼーションが検出された場合、
（ｉ）計量プローブの試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量されたシグナルを第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）計量プローブの試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量されたシグナルを第２の式に従って分析する工程を含む、方法。
２．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが生シグナルである、実施形態１の方法。
３．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが正規化シグナルである、実施形態１の方法。
４．計量プローブが属プローブである、実施形態１～３のいずれか１つの方法。
５．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、プローブ分子が、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１～４のいずれか１つの方法。
６．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって試験試料を調製することをさらに含み、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、実施形態５の方法。
７．ＰＣＲプライマーが複数のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが複数の第１のアンプリコンを含み、かつ／または第２のアンプリコンセットが複数の第２のアンプリコンを含む、実施形態６の方法。
８．（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができる第１のＰＣＲプライマーのセットを使用して、初期試料に対して第１のＰＣＲ増幅反応を行うこと、（ｂ）第１のＰＣＲプライマーのセットとは異なる、第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができる第２のＰＣＲプライマーのセットを使用して、初期試料に対して第２のＰＣＲ増幅反応を行うこと、および（ｃ）第１および第２のＰＣＲ反応で生成されたアンプリコンを組み合わせ、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、複数の第１のアンプリコンを含む第１のアンプリコンセットおよび複数の第２のアンプリコンを含む第２のアンプリコンセットをそれぞれもたらすことによって試験試料を調製することをさらに含む、実施形態５の方法。
９．複数の第１のアンプリコンが第１ゲノム中の種々の領域に対応し、かつ／または複数の第２のアンプリコンが第２のゲノム中の種々の領域に対応する、実施形態７または実施形態８の方法。
１０．ＰＣＲプライマーが単一のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが単一の第１のアンプリコンからなり、第２のアンプリコンセットが単一の第２のアンプリコンからなる、実施形態６の方法。
１１．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１２．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１３．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることができるアンプリコンの領域において少なくとも３つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態１０の方法。
１４．ＰＣＲ増幅反応が、反応によって生成される任意のアンプリコン中に測定可能なシグナルを生成する標識を組み入れる、実施形態６～１３のいずれか１つの方法。
１５．プライマーが標識されている、実施形態６～１４のいずれか１つの方法。
１６．少なくとも１つのプライマーが５’蛍光標識されている、実施形態１５の方法。
１７．複数のプライマーが５’蛍光標識されている、実施形態１５の方法。
１８．ＰＣＲ反応が、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドを含む、実施形態６～１７のいずれか１つの方法。
１９．各プローブ分子が、第１のゲノムおよび／または第２のゲノム中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。
２０．仮想プローブが、互いに対して１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。
２１．仮想プローブが、互いに対して１つのヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態２０の方法。
２２．仮想プローブが、互いに対して２つのヌクレオチドミスマッチを有するプローブ分子を含む、実施形態２０の方法。
２３．仮想プローブのプローブ分子が、アレイ上に存在する位置的にアドレサブルなプローブ分子であり、各々アレイ上の離散した位置にある、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
２４．仮想プローブ中のプローブ分子と試験試料中の核酸（存在する場合）とのハイブリダイゼーションからのシグナルを検出および／または定量することが、仮想プローブ中のプローブ分子の位置で標識を検出および／または定量することを含む、実施形態２３の方法。
２５．工程（ｂ）が、
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物をアレイと接触させること；
（ｉｉ）アレイからの未結合核酸分子を洗浄すること；および
（ｉｉｉ）アレイ上の各プローブ分子位置における標識のシグナル強度を測定することを含む、実施形態２３または実施形態２４の方法。
２６．アレイが１つ以上の制御プローブ分子を含む、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法。
２７．プローブ分子がオリゴヌクレオチドプローブ分子である、実施形態２３～２６のいずれか１つの方法。
２８．プローブ分子のうちの１つ以上がポリチミジン尾部を有する、実施形態２７の方法。
２９．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態２７の方法。
３０．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態２９の方法。
３１．ＰＣＲ増幅反応がリアルタイムＰＣＲ増幅反応である、実施形態６～２２のいずれか１つの方法。
３２．（ａ）各プローブ分子が、識別可能な標識と、標識およびクエンチャー部分の両方がプローブに結合している場合に標識の検出を阻害するクエンチャー部分とを含み；
（ｂ）標識が、リアルタイムＰＣＲ増幅反応中にプローブ分子の切断と同時に測定可能なシグナルを生成し；
（ｃ）各標識が、他の各標識と識別可能である、
実施形態３１の方法。
３３．標識が蛍光標識である、実施形態３２の方法。
３４．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態５～３３のいずれか１つの方法。
３５．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態５～３４のいずれか１つの方法。
３６．第１および第２の微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１～３５のいずれか１つの方法。
３７．微生物の１つ以上がヒト病原体または動物病原体である、実施形態１～３６のいずれか１つの方法。
３８．微生物が細菌、ウイルス、または真菌である、実施形態３６～３７のいずれか１つの方法。
３９．微生物が細菌である、実施形態３６～３８のいずれか１つの方法。
４０．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態３９の方法。
４１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態４０の方法。
４２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態４０または実施形態４１の方法。
４３．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態３９～４２のいずれか１つの方法。
４４．第１の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、実施形態１～４３のいずれか１つの方法。
４５．第２の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、実施形態１～４４のいずれか１つの方法。
４６．各ブール演算子が、「ＡＮＤ」、「ＯＲ」、および「ＮＯＴ」から独立して選択される、実施形態４４または実施形態４５の方法。
４７．各関係演算子が、「より大きい」（「＞」）、「より小さい」（「＜」）、「以上」（「≧」）および「以下」（「≦」）から独立して選択される、実施形態４４～４６のいずれか１つの方法。
４８．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上のブール演算子によって組み合わされる、実施形態４４～４６のいずれか１つの方法。
４９．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上の関係演算子によって組み合わされる、実施形態４４～４８のいずれか１つの方法。
５０．第１の式および／または第２の式において、シグナルが１つ以上のシグナル比によって組み合わされる、実施形態４４～４９のいずれか１つの方法。
５１．仮想プローブが２つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１～５０のいずれか１つの方法。
５２．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるが、第１の標的核酸にはできない第２のプローブ分子とを含む、実施形態５１の方法。
５３．第１のプローブが計量プローブである、実施形態５２の方法。
５４．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１の標的核酸および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる第２のプローブ分子とを含む、実施形態５１の方法。
５５．第１のプローブが計量プローブである、実施形態５４の方法。
５６．仮想プローブが第１のプローブおよび第２のプローブを含み、第１の式および第２の式が、第１のプローブおよび第２のプローブからのシグナルをシグナル比で組み合わせる、実施形態１～５５のいずれか１つの方法。
５７．第１の式および第２の式が各々、シグナル比を所定のカットオフ値と比較し、第１の式のカットオフ値と第２の式のカットオフ値とが異なる、実施形態５６の方法。
５８．第１の微生物がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種（ＣＮＳ）であり、第２の微生物がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種（ＣＰＳ）である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
５９．第２の微生物が黄色ブドウ球菌である、実施形態５８の方法。
６０．仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態５８または実施形態５９のいずれか１つの方法。
６１．ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態６０に記載の方法。
６２．閾値が０．２である、実施形態６１の方法。
６３．仮想プローブが、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態５８～６２のいずれか１つの方法。
６４．仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する第１のプローブ分子と、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する第２のプローブ分子とを含み、第１の式および第２の式が、第１のプローブおよび第２のプローブからのシグナルをシグナル比で組み合わせる、実施形態６３の方法。
６５．シグナル比が、第１のプローブのシグナルを第２のプローブのシグナルで割ったものである、実施形態６４の方法。
６６．第１の式および第２の式が各々、シグナル比を所定のカットオフ値と比較し、第１の式のカットオフ値と第２の式のカットオフ値とが異なる、実施形態６４または実施形態６５の方法。
６７．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合にシグナル比が第１の式のカットオフ値以上である場合、ＣＮＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６の方法。
６８．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合にシグナル比が第２の式のカットオフ値を超える場合、ＣＮＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６または実施形態６７の方法。
６９．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値以上である場合にシグナル比が第１の式のカットオフ値未満である場合、ＣＰＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６～６８のいずれか１つの方法。
７０．計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合にシグナル比が第２の式のカットオフ値以下である場合、ＣＰＳが試料中に存在すると決定することを含む、実施形態６６～６９のいずれか１つの方法。
７１．第１の式のカットオフ値が１．５であり、第２の式のカットオフ値が３である、実施形態６６～７０のいずれか一つの方法。
７２．第１の微生物がストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７３．仮想プローブが、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７２の方法。
７４．ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態７３の方法。
７５．仮想プローブが、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７２～７４のいずれの１つの方法。
７６．第１および第２の微生物が腸内細菌科細菌である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７７．第１および第２の微生物が、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・アスブリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ）およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ）から選択される、実施形態７６の方法。
７８．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）であり、第２の微生物が肺炎レンサ球菌である、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
７９．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７８の方法。
８０．仮想プローブが、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態７８～７９のいずれの１つの方法。
８１．ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態８０に記載の方法。
８２．仮想プローブが３つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１～５７のいずれか１つの方法。
８３．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセット中の第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセット中の第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることができる第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、第１のプローブ分子とは異なる第２のプローブ分子と、（ｉｉｉ）第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、第１および第２のプローブ分子とは異なる第３のプローブ分子とを含む、実施形態８２の方法。
８４．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）であり、第２の微生物が肺炎レンサ球菌である、実施形態７８～８３のいずれか１つの方法。
８５．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４の方法。
８６．仮想プローブが、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４または実施形態８５の方法。
８７．仮想プローブが、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、実施形態８４～８６のいずれの１つの方法。
８８．ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子が計量プローブである、実施形態８７に記載の方法。
８９．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態６～８８のいずれの１つの方法。
９０．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態８９の方法。
９１．初期試料または試験試料が、微生物の１つ以上による感染のリスクがある、実施形態３６～９０のいずれか１つの方法。
９２．初期試料または試験試料が、微生物の１つ以上による感染を有すると疑われる、実施形態３６～９１のいずれか１つの方法。
９３．初期試料または試験試料が、生物学的試料、環境的試料または食品である、実施形態１～９２のいずれか１つの方法。
９４．初期試料または試験試料が、血液、血清、唾液、尿、胃液、消化液、涙、便、精液、膣液、間質液、腫瘍組織に由来する液、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、指の爪、皮膚細胞、血漿、鼻スワブから得られた液、鼻咽頭洗浄液から得られた液、脳脊髄液、組織試料、喉スワブから得られた液もしくは組織、創傷スワブから得られた液もしくは組織、生検組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帯血、リンパ液、空洞液、痰、膿、微生物叢、メコニウム、母乳、または前述のいずれかから加工、抽出もしくは分別された試料から選択される生物学的試料である、実施形態９３の方法。
９５．生物学的試料が、
（ａ）尿、痰、または尿から加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｂ）痰、または痰から加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｃ）創傷スワブ、または創傷スワブから加工、抽出もしくは分別された試料；
（ｄ）血液、または血液から加工、抽出もしくは分別された試料；または
（ｅ）腹膜透析液、または腹膜透析液から加工、抽出もしくは分別された試料である、実施形態９４の方法。
９６．初期試料または試験試料が、土壌、地下水、地表水、廃水、または上記のいずれかから加工、抽出もしくは分別された試料から選択される環境的試料である、実施形態９３の方法。
９７．工程（ｃ）がコンピュータ実装され、工程（ｃ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータが閾値以上である場合、第１の式に従ってシグナルデータを分析し、計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従ってシグナルデータを分析するための命令を含む、実施形態１～９６のいずれか１つの方法。
９８．ユーザに通知を提供することをさらに含み、通知が、場合により試験試料中の第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、実施形態９７の方法。
９９．以下を含むアドレサブルアレイ：
（ａ）第１のゲノム配列を第２の相同ゲノム配列から区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、位置的にアドレサブルなオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、それぞれがアレイ上の離散した位置にあり、１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブ分子の１つ以上が計量プローブである、仮想プローブ；および
（ｂ）場合により、１つ以上の制御プローブ分子。
１００．計量プローブの１つ以上が属プローブである、実施形態９９のアドレサブルアレイ。
１０１．少なくとも２つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０２．少なくとも３つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０３．少なくとも４つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０４．少なくとも５つの仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０５．少なくとも１０個の仮想プローブを含む、実施形態９９または実施形態１００のアドレサブルアレイ。
１０６．最大１０個の仮想プローブを含む、実施形態９９９～１０４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０７．最大１５個の仮想プローブを含む、実施形態９９～１０５のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０８．各仮想プローブが計量プローブを含む、実施形態９９～１０７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１０９．各仮想プローブが２～４個のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態９９～１０８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１１０．各仮想プローブが２～３個のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１０９のアドレサブルアレイ。
１１１．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態９９～１１０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１１２．１２～１００個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１３．１２～５０個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１４．２５～７５個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１５．５０～１００個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１６．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１７．１４個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１８．８４個のプローブ分子を含む、実施形態１１１のアドレサブルアレイ。
１１９．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、第１の微生物および第２の微生物にそれぞれ由来するゲノム配列である、実施形態実施形態９９～１１８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２０．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態１１９のアドレサブルアレイ。
１２１．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１２０のアドレサブルアレイ。
１２２．プローブ分子の１つ以上がポリチミジン尾部を含む、実施形態９９～１２１のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２３．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１２２のアドレサブルアレイ。
１２４．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１２３のアドレサブルアレイ。
１２５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態９９～１２４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２６．ｒＲＮＡをコード化する遺伝子が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である、実施形態１２５のアドレサブルアレイ。
１２７．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、実施形態９９～１２４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２８．少なくとも１つの仮想プローブが、真正細菌の種由来のゲノム配列を、真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列から区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１２９．少なくとも１つの仮想プローブが、グラム陽性細菌由来のゲノム配列とグラム陰性細菌由来のゲノム配列とを区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３０．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる目の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１２９のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３１．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる科の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３２．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる属の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３１のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３３．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる群の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３２のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３４．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる種の微生物由来のゲノム配列を区別するためのプローブ分子を含む、実施形態９９～１３３のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３５．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３４のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３６．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３５のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３７．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３６のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３８．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３７のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１３９．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３８のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４０．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１３９のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４１．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むプローブ分子を含む、実施形態９９～１４０のいずれか１つのアドレサブルアレイ。
１４２．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が由来する初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含む、実施形態９９～１４１のいずれか１つに記載のアレイで試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子の少なくとも１つは、第１のゲノムに対応する標的核酸および第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）仮想プローブのプローブ分子は、単独で第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）プローブ分子は、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、第１および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションによって、第１および第２のゲノムに対応する標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）未結合核酸分子をアレイから洗浄する工程
（ｃ）アレイ上の各プローブ分子位置においてシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｄ）シグナルが
（ｉ）アレイのプローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が試験試料中に存在することを示す場合、シグナルを分析して、試料中に第１のゲノムに対応する標的核酸または第２のゲノムに対応する標的核酸が存在するかどうかを判定し、それにより初期試料または試験試料中に第１の生物または第２の生物が存在するかどうかを判定し、
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）で作製されていないことを示す場合、その初期試料または試験試料が第１の生物または第２の生物を含んでいないと判定する工程、を含む方法。
１４３．工程（ｄ）（ｉ）の分析が、（ｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、（ｉｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従って分析することを含む、実施形態１４２の方法。
１４４．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、プローブ分子が、第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、プローブ分子が第１のアンプリコンセット中および第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１４２または実施形態１４３の方法。
１４５．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって試験試料を調製することをさらに含み、第１のゲノムおよび第２のゲノムが試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、実施形態１４４の方法。
１４６．工程（ｄ）がコンピュータ実装され、工程（ｄ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータが閾値以上である場合、第１の式に従ってシグナルデータを分析し、計量プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従ってシグナルデータを分析するための命令を含む、実施形態１４２～１４５のいずれか１つの方法。
１４７．ユーザに通知を提供することをさらに含み、通知が、場合により試験試料中の第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、実施形態１４６の方法。
１４８．システムであって、
（ａ）実施形態９９～１４１のいずれか１つのアレイの各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダと；
（ｂ）１つ以上のプロセッサとを含み、
（ｉ）プロセッサの少なくとも１つが、光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）プロセッサの少なくとも１つが、試験試料中の核酸分子（存在する場合）への仮想プローブ中のプローブ分子のハイブリダイゼーションの後に生成される、１つ以上の仮想プローブについてのシグナルデータを分析するように構成され、場合により、分析は、試験試料が第１のゲノム配列および／または第２のゲノム配列を含むかどうかを決定することを含み、
（ｉｉｉ）プロセッサの少なくとも１つが、分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置へのインターフェースまたはネットワークを有する、システム。
１４９．アレイ上の蛍光標識された分子を励起することができる光源を含む、実施形態１４８のシステム。
１５０．ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、未結合核酸分子をアレイから洗浄することができるプレートハンドリングロボットをさらに含む、実施形態１４８または実施形態１４９のシステム。
１５１．実施形態１４８～１５０のいずれか１つのシステムを使用して実行される、実施形態１～９８および１４２～１４７のいずれか１つの方法。
１５２．第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が初期試料中に存在するかどうかを検出するための試験試料を調製する方法であって、
（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをもたらす工程；
（ｂ）計量プローブを含む、第１の微生物の第１のゲノム配列を第２の微生物の第２の相同ゲノム配列から区別するための仮想プローブを含む実施形態９９～１４１のいずれか１つに記載のアレイと、工程（ａ）のＰＣＲ増幅産物とを接触させる工程；および
（ｃ）アレイから未結合核酸分子を洗浄する工程を含む、方法。
１５３．（ｄ）アレイ上の各プローブ分子位置におけるシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｅ）試験試料中の核酸へのプローブ分子のハイブリダイゼーションが検出される場合、
（ｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量されたシグナルを、計量プローブからのシグナルが閾値未満である場合、第２の式に従って分析する工程をさらに含む、実施形態１５２の方法。
１５４．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態１５２～１５３のいずれの１つの方法。
１５５．ＰＣＲ条件が、ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長になるように選択される、実施形態１５４の方法。
１５６．ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５７．ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５８．ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１５９．ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６０．ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６１．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６２．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６３．ポリチミジン尾部を含む、実施形態１５６～１６２のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６４．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１６３のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６５．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１６４のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６６．標識を含む、実施形態１５６～１６５のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１６７．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１６８．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１６９．仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
１７０．各オリゴヌクレオチドプローブ分子がポリチミジン尾部を含む、実施形態１６７～１６９のいずれか１つの仮想プローブ。
１７１．ポリチミジン尾部が１０ｍｅｒ～２０ｍｅｒである、実施形態１７０の仮想プローブ。
１７２．ポリチミジン尾部が１５ｍｅｒである、実施形態１７１の仮想プローブ。
１７３．以下を含むアドレサブルアレイ：
（ａ）位置的にアドレサブルなプローブ分子の群であって、各々がアレイ上の離散した位置にあり、実施形態１５６～１６６のいずれか１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、プローブ分子の群；および
（ｂ）任意選択により、１つ以上の制御プローブ分子。
１７４．仮想プローブ中の各プローブ分子がアレイ内の離散した位置にある、実施形態１６７～１７２のいずれか１つの仮想プローブを含むアドレサブルアレイ。
１７５．１つ以上の制御プローブ分子を含む、実施形態１７４のアドレサブルアレイ。
１７６．ヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７を含むプローブ分子から選択される２つ以上のプローブ分子を含む、キット。
１７７．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１７８．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１７９．ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８０．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８１．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８２．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８３．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態１７６のキット。
１８４．プローブ分子が標識されている、実施形態１７６～１８３のいずれか１つのキット。
１８５．プローブ分子が蛍光標識で標識されている、実施形態１８４のキット。
１８６．プローブ分子が標識されていない、実施形態１７６～１８３のいずれか１つのキット。
１８７．第１のゲノム配列および第２の相同ゲノム配列を増幅することができる１つ以上のＰＣＲプライマー対をさらに含む、実施形態１７６～１８６のいずれか１つのキット。
９．参考文献の引用
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に組み込まれる１つ以上の参考文献の教示と本開示との間に不一致がある場合、本明細書の教示が意図される。
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に組み込まれる１つ以上の参考文献の教示と本開示との間に不一致がある場合、本明細書の教示が意図される。
Claims (46)
- 第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または試験試料が調製された初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）複数のプローブ分子を含む仮想プローブで前記試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）前記仮想プローブが少なくとも２つのプローブ分子を含み、それぞれが前記第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または前記第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）前記プローブ分子の少なくとも１つが、前記第１のゲノムに対応する標的核酸および前記第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、前記計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、前記試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）前記仮想プローブの前記プローブ分子が、単独で前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）前記プローブ分子が、前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸への前記プローブ分子のハイブリダイゼーションによって、前記第１のゲノムおよび第２のゲノムに対応する前記標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）前記仮想プローブ中の前記プローブ分子と、もしあれば前記試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｃ）前記プローブ分子の前記試験試料中の核酸へのハイブリダイゼーションが検出された場合、
（ｉ）前記計量プローブの前記試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが閾値以上である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量された前記シグナルを第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）前記計量プローブの前記試料中の核酸へのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが閾値未満である場合、工程（ｂ）で検出および／または定量された前記シグナルを第２の式に従って分析する工程を含む、方法。 - 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが生シグナルである、請求項１に記載の方法。
- 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが正規化シグナルである、請求項１に記載の方法。
- 前記計量プローブが属プローブである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、前記第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、前記仮想プローブ中の各プローブ分子が、前記第１のアンプリコンセットおよび／または前記第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、前記プローブ分子が、前記第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、前記プローブ分子が前記第１のアンプリコンセット中および前記第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、前記第１のアンプリコンセットと前記第２のアンプリコンセットとを区別することができる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のゲノムおよび前記第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、前記初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって前記試験試料を調製することをさらに含み、前記第１のゲノムおよび第２のゲノムが前記初期試料中に存在する場合、それぞれ前記第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、請求項５に記載の方法。
- 前記仮想プローブの前記プローブ分子が、アレイ上に存在する位置的にアドレサブルなプローブ分子であり、各々前記アレイ上の離散した位置にある請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物を前記アレイと接触させること；
（ｉｉ）前記アレイからの未結合核酸分子を洗浄すること；および
（ｉｉｉ）前記アレイ上の各プローブ分子位置における標識のシグナル強度を測定することを含む、請求項７に記載の方法。 - 前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡをコード化する遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットが、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１および第２の微生物が同じ群のメンバーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物の１つ以上がヒト病原体または動物病原体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が細菌、ウイルス、または真菌である、請求項１１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が細菌である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列をそれぞれ含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記第１の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、前記プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の式が、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、（ｉｉｉ）１つ以上のシグナル比、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせによって、前記プローブ分子の標的核酸へのハイブリダイゼーションからのシグナルを組み合わせる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記仮想プローブが２つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の微生物がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種（ＣＮＳ）であり、前記第２の微生物がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌種（ＣＰＳ）である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の微生物が黄色ブドウ球菌である、請求項２０に記載の方法。
- 前記仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、請求項２０または請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
- ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する前記プローブ分子が計量プローブである、請求項２２に記載の方法。
- 前記仮想プローブが、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有するプローブ分子を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記仮想プローブが、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する第１のプローブ分子と、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する第２のプローブ分子とを含み、前記第１の式および第２の式が、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブからのシグナルをシグナル比で組み合わせる、請求項２４に記載の方法。
- 前記第１の式および前記第２の式が各々、前記シグナル比を所定のカットオフ値と比較し、前記第１の式の前記カットオフ値と前記第２の式の前記カットオフ値とが異なる、請求項２５に記載の方法。
- 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが前記閾値以上である場合に前記シグナル比が前記第１の式の前記カットオフ値以上である場合、ＣＮＳが前記試料中に存在すると決定することを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが前記閾値未満である場合に前記シグナル比が前記第２の式の前記カットオフ値を超える場合、ＣＮＳが前記試料中に存在すると決定することを含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
- 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが前記閾値以上である場合に前記シグナル比が前記第１の式の前記カットオフ値未満である場合、ＣＰＳが前記試料中に存在すると決定することを含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルが前記閾値未満である場合に前記シグナル比が前記第２の式の前記カットオフ値以下である場合、ＣＰＳが前記試料中に存在すると決定することを含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初期試料または試験試料が、生物学的試料、環境的試料または食品である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が血液または血液から加工、抽出もしくは分別された試料である、請求項３１に記載の方法。
- 工程（ｃ）がコンピュータ実装され、工程（ｃ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、前記１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、前記１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）前記仮想プローブ中の前記プローブ分子と、もしあれば前記試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルデータが閾値以上である場合、前記第１の式に従って前記シグナルデータを分析し、前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが閾値未満である場合、前記第２の式に従って前記シグナルデータを分析するための命令を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- ユーザに通知を提供することをさらに含み、前記通知が、場合により前記試験試料中の前記第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、請求項３３に記載の方法。
- 以下を含むアドレサブルアレイ：
（ａ）第１のゲノム配列を第２の相同ゲノム配列から区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、位置的にアドレサブルなオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、それぞれが前記アレイ上の離散した位置にあり、前記１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、前記第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続するヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブ分子の１つ以上が計量プローブである、仮想プローブ；および
（ｂ）場合により、１つ以上の制御プローブ分子。 - 第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が、試験試料または前記試験試料が由来する初期試料中に存在するかどうかを検出する方法であって、
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含む、請求項３５に記載のアレイで前記試験試料をプロービングする工程であって、
（ｉ）各プローブ分子が、前記第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または前記第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、
（ｉｉ）前記仮想プローブの前記プローブ分子の少なくとも１つが、前記第１のゲノムに対応する標的核酸および前記第２のゲノムに対応する相同標的核酸にハイブリダイズすることができる計量プローブであり、その結果、前記計量プローブのそのような標的核酸へのハイブリダイゼーションが、前記試験試料中の標的核酸の相対量の尺度を提供することができ、
（ｉｉｉ）前記仮想プローブの前記プローブ分子が、単独で前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸を区別することができず、
（ｉｖ）前記プローブ分子が、前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸に等しくハイブリダイズせず、その結果、前記第１および第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸への前記プローブ分子のハイブリダイゼーションによって、前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸を区別することができる、工程；
（ｂ）未結合核酸分子を前記アレイから洗浄する工程
（ｃ）前記アレイ上の各プローブ分子位置において前記シグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｄ）前記シグナルが、
（ｉ）前記アレイの前記プローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が前記試験試料中に存在することを示す場合、前記シグナルを分析して、前記試料中に前記第１のゲノムに対応する標的核酸または前記第２のゲノムに対応する標的核酸が存在するかどうかを判定し、それにより前記初期試料または前記試験試料中に前記第１の生物または第２の生物が存在するかどうかを判定し、
（ｉｉ）前記仮想プローブの前記プローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）で作製されていないことを示す場合、その初期試料または試験試料が前記第１の生物または前記第２の生物を含んでいないと判定する工程、を含む方法。 - 工程（ｄ）（ｉ）の分析が、（ｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量された前記シグナルを、前記計量プローブからの前記シグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、（ｉｉ）工程（ｃ）で検出および／または定量された前記シグナルを、前記計量プローブからの前記シグナルが前記閾値未満である場合、第２の式に従って分析することを含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記第１のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、前記第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、前記仮想プローブ中の各プローブ分子が、前記第１のアンプリコンセットおよび／または前記第２のアンプリコンセット中の１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができ、前記プローブ分子が、前記第１のアンプリコンセット中のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンセット中のアンプリコンに同様にハイブリダイズせず、それにより、前記プローブ分子が前記第１のアンプリコンセット中および前記第２のアンプリコンセット中のアンプリコンへハイブリダイズすることで、前記第１のアンプリコンセットと前記第２のアンプリコンセットとを区別することができる、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
- 前記第１のゲノムおよび前記第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して、前記初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって前記試験試料を調製することをさらに含み、前記第１のゲノムおよび第２のゲノムが前記試料中に存在する場合、それぞれ前記第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットもたらす、請求項３８に記載の方法。
- 工程（ｄ）がコンピュータ実装され、工程（ｄ）が、１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のコンピュータ可読命令を記憶するメモリに連結された１つ以上のプロセッサを有するコンピュータシステムにおいて、前記１つ以上のコンピュータ可読命令を実行することを含み、前記１つ以上のコンピュータ可読命令が、（ｉ）前記仮想プローブ中の前記プローブ分子と、もしあれば前記試験試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからのシグナルデータを受信するため、および（ｉｉ）前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルデータが閾値以上である場合、前記第１の式に従って前記シグナルデータを分析し、前記計量プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションからの前記シグナルが閾値未満である場合、前記第２の式に従って前記シグナルデータを分析するための命令を含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
- ユーザに通知を提供することをさらに含み、前記通知が、場合により前記試験試料中の前記第１の微生物および／または第２の微生物の有無に関する、請求項４０に記載の方法。
- システムであって、
（ａ）請求項３５に記載のアレイの各プローブ分子位置についてのシグナルデータを生成するための光学リーダと；
（ｂ）１つ以上のプロセッサとを含み、
（ｉ）前記プロセッサの少なくとも１つが、前記光学リーダからシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）前記プロセッサの少なくとも１つが、存在する場合、試験試料中の核酸分子への前記仮想プローブ中の前記プローブ分子のハイブリダイゼーションの後に生成される、前記１つ以上の仮想プローブについてのシグナルデータを分析するように構成され、場合により、分析は、前記試験試料が前記第１のゲノム配列および／または前記第２のゲノム配列を含むかどうかを決定することを含み、
（ｉｉｉ）前記プロセッサの少なくとも１つが、前記分析の結果を出力するための記憶もしくは表示装置へのインターフェースまたはネットワークを有する、システム。 - 前記アレイ上の蛍光標識された分子を励起することができる光源を含む、請求項４２に記載のシステム。
- ＰＣＲ増幅反応の前記産物を前記アレイに添加することができ、未結合核酸分子を前記アレイから洗浄することができるプレートハンドリングロボットをさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載のシステム。
- 第１のゲノムを有する第１の微生物または第２のゲノムを有する同じ属の第２の微生物が初期試料中に存在するかどうかを検出するための試験試料を調製する方法であって、
（ａ）前記第１のゲノムおよび前記第２のゲノムの両方にハイブリダイズし、それらからＰＣＲ増幅を開始することができるＰＣＲプライマーを使用して前記初期試料に対してＰＣＲ増幅反応を行い、前記第１のゲノムおよび第２のゲノムが前記初期試料中に存在する場合、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをもたらす工程；
（ｂ）計量プローブを含む、前記第１の微生物の第１のゲノム配列を前記第２の微生物の第２の相同ゲノム配列から区別するための仮想プローブを含む請求項３５に記載のアレイと、工程（ａ）のＰＣＲ増幅産物とを接触させる工程；および
（ｃ）前記アレイから未結合核酸分子を洗浄する工程を含む、方法。 - （ｆ）前記アレイ上の各プローブ分子位置における前記シグナルを検出および／または定量する工程；および
（ｇ）前記試験試料中の核酸への前記プローブ分子のハイブリダイゼーションが検出される場合、
（ｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量された前記シグナルを、前記計量プローブからの前記シグナルが閾値以上である場合、第１の式に従って分析し、
（ｉｉ）工程（ｄ）で検出および／または定量された前記シグナルを、前記計量プローブからの前記シグナルが閾値未満である場合、第２の式に従って分析する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
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