WO2021201091A1 - クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ - Google Patents

クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ Download PDF

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klebsiella
primer
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一博 舘田
佑弥 宮武
和明 山内
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デンカ株式会社
学校法人東邦大学
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/26—Klebsiella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to oligonucleotides for detecting Klebsiella spp. More specifically, the present invention relates to an oligonucleotide probe or kit, or a method for detecting Klebsiella pneumoniae and Klebsiella pneumoniae or differentiating them.
  • Klebsiella spp. Is a gram-negative bacillus that is widely present in the environment.
  • Klebsiella pneumoniae which is called Pneumococcus in Japanese name, is a resident bacterium in the human intestinal tract and pharynx, and is pathogenic to humans such as respiratory infections, urinary tract infections, and bloodstream infections. As shown, it is one of the typical causative bacteria of indigenous infections, and is the most frequently observed species of Klebsiella spp. From clinical materials.
  • Klebsiella pneumoniae there is a resistant strain that carries an enzyme that degrades various antibacterial drugs called extended-spectrum ⁇ -lactamase (ESBL), and carbapenem-resistant enterococcal bacteria (carbapenem-). It is listed as one of the resetant Enterobacteria (CRE), and the difficulty of treatment and its expansion have become an international problem.
  • ESBL extended-spectrum ⁇ -lactamase
  • carbapenem-resistant enterococcal bacteria carbapenem-resistant enterococcal bacteria
  • Non-Patent Document 1 As a method for detecting infectious disease-causing bacteria such as Klebsiella pneumoniae, a culture identification method in which the causative bacteria are isolated and cultured and the bacteria are identified based on their biochemical properties is known. So far, some of the Klebsiella pneumoniae isolated from clinical material have been found to be a different species, probably Klebsiella variicola, at a rate of 10% to 15% (non-patent literature). 1). Klebsiella variicola, a bacterium belonging to the genus Klebsiella, is a related species of Klebsiella pneumoniae, which was registered as a new species in 2004. It is known that it is not a resident bacterium (Non-Patent Document 1).
  • this bacterium has some properties (for example, adonitol resolution) that are partially different from those of Klebsiella pneumoniae, but there is currently no definitive index and it is difficult to distinguish this bacterium. ..
  • Klebsiella spp. are currently classified into 14 species and 5 subspecies, and other species showing pathogenicity to humans include Klebsiella aerogenes, Klebsiella oxytoca, and Klebsiella planticola. It has been known.
  • Klebsiella bacteria must be considered in the differentiation of Klebsiella bacteria contained in clinical materials. These differentiations are difficult with existing phenotypic tests, and therefore, for the purpose of accurate differentiation of Klebsiella spp. Etc. have been adopted.
  • Non-Patent Document 1 genes such as rpoB, gyrA, mdh, infB, phoE, and nifH genes are differentiated by MLST (Non-Patent Document 1). Conventionally, discrimination has been performed based on the sequence information of. However, these methods lack simplicity because they require sequence analysis, and it is difficult to adopt them as routine work in an actual medical field.
  • Non-Patent Document 2 a discrimination method by multiplex PCR and gel electrophoresis of three genes of blaSHV, blaOKP, and blaLEN has been reported with an effort that can be adopted for routine work in the medical field (Non-Patent Document 2).
  • this method focuses on analysis by gel electrophoresis, with a minimum PCR product length of 348 bp and a long one of 995 bp, and is not suitable for real-time PCR, which is currently widely used, because the product length is too long. Is.
  • Non-Patent Document 3 a method of combining real-time PCR and Sanger sequence and differentiating based on the sequence information of 16S rDNA and rpoB gene has also been reported (Non-Patent Document 3). This method also lacks simplicity because it requires sequence analysis for discrimination.
  • Klebsiella variicola a novel species with clinical and plant associated disolates.
  • Syst Appl Microbiol 27, 27-35 A one-step multiplex PCR to identify Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, and Klebsiella quasipneumoniae in the clinical routine, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease Volume 87, Issue 4, April 2017, Pages 315-317 Journal of Microbiological Methods Volume 159, April 2019, Pages 148-156
  • an object of the present invention is to provide an oligonucleotide or the like for detecting a bacterium belonging to the genus Klebsiella (Klebsiella spp.) Or differentiating those bacteria.
  • a primer set for detecting the presence of one or more Klebsiella spp. Selected from the group consisting of Klebsiella variicola and Klebsiella pneumoniae in a sample.
  • the gyrB gene has the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6, or one or several bases are deleted in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the primer set according to [1] which has a substituted, inserted or added base sequence and encodes a GyrB protein.
  • the target gyrB gene has a base sequence containing at least 10 consecutive bases from the base sequences from positions 1887 to 2063 of the base sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a primer set for detecting the presence of Krebsiera variicola wherein the first primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, 1 or It has a base sequence containing at least 10 consecutive bases in the base sequence in which several bases are deleted, substituted, inserted or added, and has the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 [1]. ] To the primer set according to any one of [3].
  • a primer set for detecting the presence of Krebsiera variicola wherein the second primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, or in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, 1 or It has a base sequence containing at least 10 consecutive bases in the base sequence in which several bases are deleted, substituted, inserted or added, and has the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 [1].
  • the primer set according to any one of [4].
  • a set of primers for detecting the presence of Klebsiella palichola further comprising a third primer and a fourth primer targeting the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae, according to [1] to [5].
  • the third primer has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or is a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • the fourth primer has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, or is a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • a primer set for detecting the presence of Klebsiella pneumoniae wherein the first primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, 1 or It has a base sequence containing at least 10 consecutive bases in the base sequence in which several bases are deleted, substituted, inserted or added, and has the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 [1].
  • the second primer has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, or is a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • the primer set according to any one of [1], [2], [9], and [10] further comprising a third primer and a fourth primer targeting the gyrB gene of Klebsiella palichola.
  • the third primer has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or is a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7. Any of [1], [2], [9] to [11], which has a base sequence containing at least 10 consecutive bases in the sequence and has the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Primer set described in. [13]
  • the fourth primer has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, or is a base in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the gyrB gene has the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6, or one or several bases are deleted in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the probe according to [15] which has a substituted, inserted or added base sequence and encodes a GyrB protein.
  • the target gyrB gene has a base sequence containing at least 10 consecutive bases from the base sequences from positions 1887 to 2063 of the base sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6. 15] or the probe according to [16].
  • [18] At least consecutive base sequences having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
  • a kit comprising the primer set according to any one of [1] to [14] and the probe according to any one of [15] to [18].
  • [20] A method for detecting the presence of Klebsiella variicola in a sample, wherein the primer set according to any one of [1] to [9] is used.
  • Klebsiella pneumoniae That are differentiated from Klebsiella pneumoniae are Klebsiella pneumoniae; Klebsiella michiganensis; Klebsiella quasiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella 2 or more selected from the group consisting of Klebsiella granulomatis; Klebsiella grimontii; and Klebsiella oxytoca [22] to 20 or more.
  • Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae
  • Klebsiella michiganensis Klebsiella quasiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella klebsiella 2 or more selected from the group consisting of Klebsiella granulomatis
  • the Klebsiella bacterium differentiated from Klebsiella pneumoniae is Klebsiella pneumoniae, further using a fourth and fifth primer and / or probe that targets the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae, [20] ] To [23].
  • a method for detecting the presence of Klebsiella pneumoniae in a sample using the primer set according to any one of [1], [2], and [9] to [14].
  • the method according to [25] comprising the step of differentiating Klebsiella pneumoniae from other Klebsiella spp. Using the first and second primers.
  • the method according to [26] further using the probe according to any one of [15] to [18].
  • Klebsiella spp. That are differentiated from Klebsiella pneumoniae are Klebsiella variicola; Klebsiella pichiganensis; Klebsiella cruneumonier; Klebsiella aerogenes; Klebsiella planticola; Klebsiella granulomatis; The method according to any one of [25] to [27], which is one or more selected from the group consisting of.
  • the Klebsiella bacterium differentiated from Klebsiella pneumoniae is Klebsiella variicola, further using a fourth and fifth primer and / or probe that targets the gyrB gene of Klebsiella variicola, [25] ] To [28].
  • the oligonucleotide of the present invention it becomes possible to more easily distinguish Klebsiella variicola and / or Klebsiella pneumoniae from other Klebsiella spp.
  • the oligonucleotide of the present invention can exhibit excellent discrimination ability in comparison with other primers and probes targeting the same gyrB gene.
  • the solid line is K.
  • Detection results on a substrate using a DNA probe targeting the genomic DNA of Chlamydia pneumoniae The vertical axis shows the fluorescence intensity measured in pCode.
  • the result of the negative control (water) is deleted from the result of FIG.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity measured in pCode.
  • Detection results on a substrate using a DNA probe for clinical specimens The vertical axis shows the fluorescence intensity measured in pCode.
  • the present embodiment will be described, but the scope of the present invention is not construed as being limited to the following embodiments.
  • a primer set for detecting the presence of one or more Klebsiella spp. Selected from the group consisting of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in a sample is provided.
  • the primer set consists of a first primer and a second primer that target the gyrB gene of Klebsiella spp.
  • the gyrB gene encodes the GyrB protein, which is a subunit of DNA gyrase.
  • the sample is not particularly limited as long as the presence of Klebsiella spp., Including Klebsiella variicola or Klebsiella pneumoniae, is suspected, but human or non-human blood, serum, plasma, urine, stool, saliva, sputum, Examples thereof include body fluids such as tissue fluid, saliva, and swabs, or dilutions thereof, and blood, serum, plasma, urine, stool, spinal fluid, or dilutions thereof are preferable.
  • the sample may be food, soil, plant or the like.
  • one or several bases have the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, or in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3. Examples thereof include those having a deletion, substitution, insertion or addition base sequence and encoding a GyrB protein.
  • one or several bases have the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 4 to 6, or in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 4 to 6. Examples thereof include those having a deletion, substitution, insertion or addition base sequence and encoding a GyrB protein.
  • the first primer as a forward primer is 1 or 1 in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 or in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 under stringent conditions. It may have any sequence as long as several bases can hybridize with the deleted, substituted, inserted or added base sequence.
  • the second primer as a reverse primer is the complementary strand of the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 or the base shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 under stringent conditions.
  • the complementary strand of the sequence may have any sequence as long as it can hybridize with a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added.
  • stringent condition means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, based on information such as the length of a base sequence. Can be determined as appropriate.
  • stringent conditions can be set with reference to Molecular Cloning (Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Stringent conditions are polynucleotides with high homology (preferably identity), such as 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably. It can be said that it is a condition that polynucleotides having 99% or more homology hybridize with each other and polynucleotides showing lower homology do not hybridize with each other.
  • Specific stringent conditions include hybridization solution (50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0)), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate.
  • a base sequence complementary to the desired base sequence in 10 ⁇ g / ml of denatured salmon sperm DNA and 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) and a sample suspected of having Krebsiera variicola are present at about 42 ° C.
  • Conditions are for incubation at about 50 ° C. and washing with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS at about 65 ° C. to about 70 ° C.
  • the design of the primer and probe is performed so as not to cause a cross-reactivity with the sequences of other related species, but it can be appropriately changed according to the system used for detecting the amplification product and other conditions and other conditions.
  • an amplification product having a length of 100 to 200 bases for example, it is preferable to target the base sequences from the 1887 position to the 2063 position of the base sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the primer is designed to have a base sequence containing at least 10 consecutive bases among the base sequences constituting such a target. It is preferable to design so that there is a mismatch with Klebsiella spp. Other than Klebsiella variicola at the end of the primer, especially at the 3'end.
  • the first primer targeting the gyrB gene of Krebsiera variicola has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 10 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be mentioned. 5'-GGTGAACACCCTGGTTTC-3'(SEQ ID NO: 7)
  • a second primer that targets the gyrB gene of Krebsiera variicola it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 10 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned. 5'-CGATATTCCGGCCCCATAG-3'(SEQ ID NO: 8)
  • the first primer targeting the gyrB gene of Krebsiera pneumoniae has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 10 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be mentioned. 5'-GGTGAACACCCTGGTCTC-3'(SEQ ID NO: 10)
  • a second primer that targets the gyrB gene of Krebsiera pneumoniae it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 10 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned. 5'-GATATTCCGGCCCCATAATG-3'(SEQ ID NO: 11)
  • the lengths of the first and second primers are arbitrary and can be appropriately set in the range of, for example, about 10 bases to about 35 bases, but are preferably at least 10 bases or more.
  • the ratio of the first primer and the second primer is not particularly limited and may be the same or different from each other.
  • the concentration of one primer can be adjusted to be higher than the concentration of the other primer.
  • the first and second primers can specifically amplify all or part of the region of the gyrB gene of Klebsiella variicola or Klebsiella pneumoniae, which allows differentiation from other Klebsiella spp. Become.
  • the amplification products of the first and second primers are subjected to melting curve analysis and the melting temperature is compared with the melting temperature of the amplification products of other primer sets to Klebsiella variicola or Klebsiella pneumoniae and other Klebsiella strains. Can also be distinguished from.
  • Klebsiella spp Klebsiella Mishiganenshisu (Klebsiella michiganensis); Klebsiella oak pneumoniae (Klebsiella quasipneumoniae); Klebsiella aerogenes (Klebsiella aerogenes); Klebsiella planticola (Klebsiella planticola); Klebsiella Guranuromatisu (Klebsiella granulomatis ); Klebsiella grimontii; Klebsiella oxytoca and the like, but the bacterial species contained in the sample is not limited to these.
  • the Klebsiella spp. May be one or more.
  • the primer set may be a combination of the first and second primers for Klebsiella variicola and the first and second primers for Klebsiella pneumoniae, or these first and second primers, respectively or in combination.
  • Other primers such as third, fourth, fifth, sixth and the like may be included. Detection sensitivity can be improved by using appropriate additional primers.
  • a primer for example, a primer for detecting other Klebsiella strains that are expected to be contained in the sample and the like are assumed.
  • a third primer that targets the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae that can be used to detect or differentiate Klebsiella variicola, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or is set forth in SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, and the base sequence contains at least 10 consecutive bases, which is the same as the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. Those having a function can be mentioned.
  • a fourth primer targeting the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae that can be used to detect or differentiate Klebsiella palichola, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or is set forth in SEQ ID NO: 11.
  • the base sequence one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, and the base sequence contains at least 10 consecutive bases, which is the same as the base sequence shown in SEQ ID NO: 11. Those having a function can be mentioned.
  • a third primer that targets the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae that can be used to detect or differentiate Klebsiella pneumoniae, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or is set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the base sequence one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, and the base sequence contains at least 10 consecutive bases, which is the same as the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Those having a function can be mentioned.
  • a fourth primer that targets the gyrB gene of Klebsiella pneumoniae that can be used to detect or differentiate Klebsiella pneumoniae, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or is set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the base sequence one or several bases are deleted, substituted, inserted or added, and the base sequence contains at least 10 consecutive bases, which is the same as the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. Those having a function can be mentioned.
  • the presence of Klebsiella variicola and / or Klebsiella pneumoniae contained in the sample can be detected by a nucleic acid amplification reaction using the above primers.
  • Nucleic acid amplification methods include PCR methods, such as multiplex PCR, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method, ICAN (Isothermal and Chemical primer-initiated method, Ligase chain reaction, Ligase chain reaction) The Chain Reaction) method, the SDA (Strand Displacement Amplification) method, and the like can be mentioned.
  • LAMP Loop-mediated isothermal amplification
  • ICAN Isothermal and Chemical primer-initiated method
  • Ligase chain reaction Ligase chain reaction
  • the Chain Reaction The Chain Reaction
  • SDA String Displacement Amplification
  • the amplification product can be detected by a known method such as electrophoresis using polyacrylamide or agarose gel.
  • electrophoresis the presence of an amplification product can be identified from the mobility of the amplification product with respect to the mobility of a marker having a known molecular weight.
  • a labeled substance capable of specifically recognizing the amplification product may be used.
  • a labeled substance capable of specifically recognizing the amplification product include fluorescent dyes, biotin, digoxigenin and the like.
  • fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
  • a probe for detecting the presence of one or more Klebsiella spp. Selected from the group consisting of Klebsiella variicola and Klebsiella pneumoniae in a sample.
  • the probe can target the gyrB gene of Klebsiella spp.
  • the probe is preferably designed so that its interior contains a mismatch with other Klebsiella spp. As a result, the base length of the full-match portion during hybridization can be shortened, the specificity can be improved, and false positives can be reduced.
  • a probe that can be used to detect or discriminate Krebsiera variicola, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 8 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be mentioned. 5'-GTTGCAGCAGTAGTTGAG-3'(SEQ ID NO: 9)
  • a probe that can be used to detect or discriminate Klebsiella pneumoniae, it has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12 below, or in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, one or several bases are present.
  • the deleted, substituted, inserted or added base sequences those having a base sequence containing at least 8 consecutive bases and having the same function as the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be mentioned. 5'-GAACTGCAGCATTTTG-3'(SEQ ID NO: 12)
  • the probe may be bound to a solid phase such as beads.
  • solids include beads suitable for multiplex assays, such as beads with unique analog code identifiers for storing information about multiplex assays as disclosed in WO2018052464A1. To be done.
  • kits In a third aspect, a kit comprising a primer set and a probe for detecting the presence of one or more Klebsiella spp. Selected from the group consisting of Klebsiella variicola and Klebsiella pneumoniae in a sample is provided.
  • the kit may include reagents used to detect one or more Klebsiella spp., For example, reagents for performing an amplification reaction, selected from the group consisting of Klebsiella variicola and Klebsiella pneumoniae.
  • Reagents that carry out the amplification reaction include, for example, buffers, salts, primers, deoxyribonucleotides, thermostable DNA polymerase and the like.
  • the contents and reagents of the kit can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the amplification method, and the kit may further contain a solid phase compound for hybridization with an amplification product or a probe obtained by using a primer. ..
  • the kit may further include primers and probes to detect other Klebsiella strains that are expected to be included in the sample.
  • Detection method In a fourth aspect, a method for detecting the presence of one or more Klebsiella spp. Selected from the group consisting of Klebsiella variicola and Klebsiella pneumoniae in a sample is provided.
  • the primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 can be used to detect the presence of Klebsiella pneumoniae, and the primer sets of SEQ ID NOs: 10 and 11 can be used to detect the presence of Klebsiella pneumoniae.
  • Klebsiella variicola can be differentiated from other Klebsiella spp. With higher accuracy.
  • Primer sets and probes for detecting Klebsiella pneumoniae may be used in combination.
  • primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 and the probe of SEQ ID NO: 12 in combination.
  • a primer set and a probe for detecting Klebsiella variicola may be used together.
  • the difference in the detected bacteria may be determined by further subjecting the sample to whole genome analysis and ANI (Average Nucleotide Identity) analysis.
  • ANI Average Nucleotide Identity
  • Example 1 K.K. by real-time PCR targeting genomic DNA.
  • Primer probe design K Variicola's DSM15968 strain, MGH20 strain, X39 strain gyrB gene (SEQ ID NOs: 1, 2, 3), K. Primer probes of SEQ ID NOs: 7 to 12 were designed from the results of multiple sequence alignment of a part of the gyrB gene (SEQ ID NOs: 4, 5, and 6) of the NU-CRE047 strain, CHS105 strain, and KPNIH33 strain of Pneumoniae.
  • Nucleic acid amplification and melting curve analysis K. Beautyi Cola JCM12419 strain, K.K.
  • the reagent used for amplification was TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver. 2 (Takara Bio Inc.), EvaGreen (biotium Inc.) was used as the intercalator dye.
  • Each primer was added so that the final concentration was 0.2 ⁇ M and the genomic DNA of the template was 10 ⁇ g / L. TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.
  • a PCR reaction solution was prepared by mixing 1 ⁇ for 2 ⁇ Reaction buffer and 1 U for Multiplex Enzyme Mix in 2 and mixing template DNA and the like.
  • a Light Cycler 480 System II (Roche Diagnostics) was used as the measuring device.
  • the amplification reaction conditions used are as follows. 94 ° C: 30 seconds 60 ° C: 60 seconds-> 94 ° C: 30 seconds (45 cycles) 72 ° C: 600 seconds
  • Figure 2 shows the measurement results of the melting curve analysis.
  • the melting temperatures of the amplified products of Chlamydia pneumoniae were 84.7 ° C and 83.8 ° C, respectively, with a difference of about 1 ° C. From the above, it was found that the targeted nucleic acid components can be amplified by using the primers of SEQ ID NOs: 7, 8, 10 and 11, and further, the amplification products can be identified by the melting temperature.
  • the expensive TaqMan Probe which is often used as a luminescent substance in the region, is not adopted, and it is possible to identify with an inexpensive intercalator dye, which is a cost aspect required for the experiment. It turned out to be excellent.
  • Example 2 K.K. Beautyi Cola and K.K. Detection on a substrate using a DNA probe targeting the genomic DNA of Chlamydia pneumoniae
  • TakaRa Multiplex Assay Kit Ver. 2 (Takara Bio Inc.) was used. Each primer was added so that the final concentration was 0.2 ⁇ M, and the genomic DNA of the template was 10 ⁇ g / L.
  • a PCR reaction solution was prepared by mixing 1 ⁇ for 2 ⁇ Reaction buffer and 1 U for Multiplex Enzyme Mix in 2 and mixing template DNA and the like.
  • a T100 Thermal Cycler (Bio-Rad) was used as the nucleic acid amplification device. After completion of the amplification reaction, a heat denaturation reaction was carried out in the same instrument before being subjected to a hybridization reaction on a substrate.
  • the reagent used for the hybridization reaction on the substrate was a solution containing the substrate 1 on which the probe of SEQ ID NO: 9 was immobilized and the substrate 2 on which the probe of SEQ ID NO: 12 was immobilized, Saline-sodium-phosphate-.
  • EDTA Buffer SSPE-buffer
  • a heat-denatured PCR reaction solution were mixed.
  • Pentavidin-Phycoerythrin (PlexBio) was used as a reagent for labeling.
  • IntelliPlex 1000 ⁇ Code Processor (PlexBio) was used as an instrument.
  • PlexBio registered trademark
  • Fluorescent Analogizer (PlexBio) was used.
  • Example 3 Detection on a substrate using a DNA probe for 5 clinical samples (blood culture medium)
  • K.K. Specimens 1 and 2 identified as Chlamydia pneumoniae, K. pneumoniae. Specimen 3, K. aerogenes identified as aerogenes. Specimen 4, K. oxytoca identified as oxytoca.
  • sample 5 identified as planticola
  • the genomic DNA extracted according to the standard protocol attached to the reagent was used as a template using QIAamp BiOstic Bacteremia DNA Kit (QIAGEN), and SEQ ID NOs: 7, 8, 10 and 11 were used.
  • SEQ ID NOs: 7, 8, 10 and 11 were used.
  • primer set amplification by PCR, hybridization reaction on a substrate, labeling, and fluorescence measurement were performed.
  • primers in which biotin was modified via a linker were used at the 5'ends of SEQ ID NOs: 8 and 11.
  • TakaRa Multiplex Assay Kit Ver. 2 (Takara Bio Inc.) was used. Each primer was added so that the final concentration was 0.2 ⁇ M, and the genomic DNA of the template was 10 ⁇ g / L.
  • a PCR reaction solution was prepared by mixing 1 ⁇ for 2 ⁇ Reaction buffer and 1 U for Multiplex Enzyme Mix in 2 and mixing template DNA and the like.
  • a T100 Thermal Cycler (Bio-Rad) was used as the nucleic acid amplification device. After completion of the amplification reaction, a heat denaturation reaction was carried out in the same instrument before being subjected to a hybridization reaction on a substrate.
  • the reagent used for the hybridization reaction on the substrate was a solution containing the substrate 1 on which the probe of SEQ ID NO: 9 was immobilized and the substrate 2 on which the probe of SEQ ID NO: 12 was immobilized, Saline-sodium-phosphate-.
  • EDTA Buffer SSPE-buffer
  • a heat-denatured PCR reaction solution were mixed.
  • Pentavidin-Phycoerythrin (PlexBio) was used as a reagent for labeling.
  • IntelliPlex 1000 ⁇ Code Processor (PlexBio) was used as an instrument.
  • PlexBio registered trademark
  • Fluorescent Analogizer (PlexBio) was used.
  • the sample 1 was K.K. It was suggested that it may be Balii Cola.
  • Verification 1 which will be described later, as a result of whole-genome analysis using a next-generation sequencer and bacterial species identification by ANI, the sample 1 was found to be K.K. It was found that it was classified as a varii-cola, and it was conventionally differentiated by using the primer sets of SEQ ID NOs: 7, 8, 10 and 11 and the probes of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12 in combination with Example 1. I could't do K. Beautyi Cola and K.K. It became clear that it is possible to distinguish Chlamydia pneumoniae.
  • Verification 1 The DDH (DNA-DNA Hybridization) method has long been used for whole genome analysis using the next-generation sequencer of sample 1 and bacterial species identification using the sequence information of the bacterial species identification gene by ANI.
  • the ANI Average Nucleotide Identification
  • ANI is a method for identifying bacterial species based on the calculation result of which reference sequence registered in the database has high sequence similarity to the sequence of the entire genome to be analyzed. ..
  • Specimen 1 is K.K. on the database. It shows the highest similarity to Balii Cola (ANI Value: 99.15%), followed by K.K. It was pneumoniae (ANI Value: 95.89%).
  • the threshold value for determining the same bacterial species is 95 to 96% (Kim, M, HS Oh, SC Park, J Chun. 2014. Towers a taxonomy coherence beverage strategy 16S rRNA gene sequence symmetry for Species identification of prokaryotes. Int J System Evol Microbiol 64: 346-351.), And the sample 1 is based on this threshold. It was identified as Balii Cola. From the above, the validity of the results of Example 2 was supported from the whole genome analysis and the bacterial species identification by ANI.
  • Primer and probe design K From the results of multiple sequence alignment of some of the gyrB genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 3) of the DSM15968 strain, MGH20 strain, and X39 strain of Baliicola, SEQ ID NOs: 7-9 and K.K. From the results of multiple alignment of some gyrB genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 3) of the DSM15968 strain, MGH20 strain, and X39 strain of Baliicola, SEQ ID NOs: 13 to 15 and K.K.
  • Primer probes of SEQ ID NOs: 25 to 27 were designed from the multiple sequence results of some gyrB genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 3) of the DSM15968 strain, MGH20 strain, and X39 strain of Brownicola. In addition, each was designated as assay sets 1 to 6.
  • Basi Cola JCM12419 strain, K.K. Using genomic DNA extracted from Pneumonier JCM1662 T strain as a template, SEQ ID NO: 7, 8, 10, 11 or SEQ ID NO: 13, 14, 10, 11 or SEQ ID NO: 16, 17, 10, 11 or SEQ ID NO: 19, 20, 10 , 11 or the primer set of SEQ ID NO: 22, 23, 10, 11 or SEQ ID NO: 25, 26, 10, 11 is used for amplification by PCR, and hybridization reaction, labeling, and fluorescence measurement on a substrate. rice field. At this time, primers in which biotin modification was performed at the 5'ends of SEQ ID NOs: 8, 11, 14, 17, 20, 23, and 26 via a linker were used.
  • TakaRa Multiplex Assay Kit Ver. 2 (Takara Bio Inc.) was used. Each primer was added so that the final concentration was 0.2 ⁇ M, and the genomic DNA of the template was 10 ⁇ g / L.
  • a PCR reaction solution was prepared by mixing 1 ⁇ for 2 ⁇ Reaction buffer and 1 U for Multiplex Enzyme Mix in 2 and mixing template DNA and the like.
  • a T100 Thermal Cycler (Bio-Rad) was used as the nucleic acid amplification device. After completion of the amplification reaction, a heat denaturation reaction was carried out in the same instrument before being subjected to a hybridization reaction on a substrate.
  • the reagents used for the hybridization reaction on the substrate were the substrate 1 on which the probe of SEQ ID NO: 9 was immobilized, the substrate 3 on which the probe of SEQ ID NO: 15 was immobilized, and the substrate on which the probe of SEQ ID NO: 18 was immobilized.
  • SSPE-buffer Hybride-sodium-phospate-EDTA Buffer
  • Pentavidin-Phycoerythrin (PlexBio) was used as a reagent for labeling.
  • IntelliPlex 1000 ⁇ Code Processor (PlexBio) was used as an instrument.
  • PlexBio registered trademark
  • Fluorescent Analogizer (PlexBio) was used.
  • the assay set 1 has the highest discrimination ability, and the assay sets 5 and 3 have the next highest discrimination ability.
  • the third was found to be assay set 3. It can be said that the closer the signal / noise value is to 1, the lower the assay ability is or the assay set cannot be differentiated. It was found that the assay sets 2, 4 and 6 are the assay sets having a low discrimination ability.
  • the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 and the probe of SEQ ID NO: 9 of the assay set 1 are K.K. Beautyi Cola and K.K. It was found that the pneumoniae has the highest discrimination ability.

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Abstract

本発明は、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ）の存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる、プライマーセット、を提供する。

Description

クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
　本発明は、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐｐ．）を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、クレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出又はそれらの菌を鑑別するためのオリゴヌクレオチドプローブ又はキット、あるいは方法に関する。
　クレブシエラ属細菌は、環境中に広く存在するグラム陰性桿菌である。なかでもクレブシエラ・ニューモニエは、和名で肺炎桿菌と呼ばれ、ヒト腸管および咽頭の常在菌であり、呼吸器感染症、尿路感染症、血流感染症等、ヒトに対して病原性を示す、日和見感染症の代表的な起因菌のひとつで、クレブシエラ属細菌の中で最も高頻度で臨床材料から観測される種である。
　クレブシエラ・ニューモニエには、基質拡張型βラクタマーゼ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ　β－ｌａｃｔａｍａｓｅ：ＥＳＢＬ）という、多種の抗菌薬を分解する酵素を保有する耐性株が存在し、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ：ＣＲＥ）のうちの一つとして挙げられ、治療の難渋化及びその拡大が国際的な問題となっている。
　クレブシエラ・ニューモニエのような感染症原因菌の検出方法として、原因菌を分離培養し、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法等が知られている。これまで、臨床材料から分離されクレブシエラ・ニューモニエとして同定されたうちの一部は、おそらくは１０％から１５％程度の割合で、実はクレブシエラ・バリイコーラという別種である事が判明している（非特許文献１）。クレブシエラ属細菌のクレブシエラ・バリイコーラは、２００４年に新種として登録されたクレブシエラ・ニューモニエの類縁種であり、バナナやサトウキビ等の植物、また、ハキリアリの巣内の菌糸からの分離報告がなされ、ヒトの常在細菌ではないことが知られている（非特許文献１）。本菌は、既存の表現型試験において、いくつかの性状（例えば、アドニトール分解能）がクレブシエラ・ニューモニエと一部異なる傾向が報告されているが、確たる指標は現在なく、鑑別は困難とされている。
　また、クレブシエラ属細菌は、現在１４種および亜種５種へと分類がなされており、他にヒトに対して病原性を示す種は、クレブシエラ・アエロゲネス、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・プランティコーラ等が知られている。
　前述の通り、臨床材料中に含まれるクレブシエラ属細菌の鑑別では、多種のクレブシエラ属細菌を考慮しなければならない。これらの鑑別は既存の表現型試験では困難であり、そこで、臨床材料中に含まれるクレブシエラ属細菌の正確な鑑別を目的として、シーケンス解析、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法等の遺伝子法が採用されてきた。
　中でも、クレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラを鑑別する手法としては、例えば、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｍｄｈ、ｉｎｆＢ、ｐｈｏＥ、ｎｉｆＨ遺伝子の６遺伝子を対象としたＭＬＳＴによる鑑別（非特許文献１）等の、遺伝子の配列情報に基づいて従来鑑別が行われてきた。しかし、これらの手法は、シーケンス解析を行う必要性があるため簡便性に欠け、実際の医療現場でルーチンワークとして採用することは難しい。
　より簡便な手法としては、すなわち、医療現場でルーチンワークに採用できる程度の労力で、ｂｌａＳＨＶ、ｂｌａＯＫＰ、ｂｌａＬＥＮの３遺伝子のマルチプレックスＰＣＲとゲル電気泳動による判別法が報告された（非特許文献２）。しかし、本法はＰＣＲの産物長が最低でも３４８ｂｐ、長いもので９９５ｂｐと、ゲル電気泳動での解析に焦点を当てており、現在広く普及しているリアルタイムＰＣＲにおいては産物長が長すぎるため、不適である。
　また他には、リアルタイムＰＣＲとサンガーシーケンスを組み合わせ、１６Ｓ　ｒＤＮＡとｒｐｏＢ遺伝子の配列情報をもとに鑑別する手法も報告されている（非特許文献３）。本法もまた、鑑別の為にシーケンス解析を行う必要があり、簡便さに欠ける。
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ，　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｓｏｌａｔｅｓ．　Ｓｙｓｔ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２７，　２７－３５ ：Ａ　ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ，　ａｎｄ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｏｕｔｉｎｅ，　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｏｌｕｍｅ　８７，　Ｉｓｓｕｅ　４，　Ａｐｒｉｌ　２０１７，　Ｐａｇｅｓ　３１５－３１７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｖｏｌｕｍｅ　１５９，　Ａｐｒｉｌ　２０１９，　Ｐａｇｅｓ　１４８－１５６
　上記事情に鑑みて、本発明は、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐｐ．）を検出、又はそれらの菌を鑑別するためのオリゴヌクレオチド等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、クレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラ、さらには他のクレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子の配列に着目し、その中でも、特定の位置に着目することで、既報の手法と比較して、より簡便にクレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラを鑑別することのできる手法を見出した。
　即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］　検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
　クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる、プライマーセット。
［２］　ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１］に記載のプライマーセット。
［３］　標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［４］　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［５］　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第二のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のプライマーセット。
［６］　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］～［５］のいずれかに記載のプライマーセット。
［７］　第三のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のプライマーセット。
［８］　第四のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［７］のいずれかに記載のプライマーセット。
［９］　クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［１０］　第二のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１１］　クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］、［２］、［９］、［１０］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１２］　第三のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１１］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１３］　第四のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１２］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１４］　プライマーがビオチンで標識されている、［１］～［１３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１５］　検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブであって、
　クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、プローブ。
［１６］　ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１５］に記載のプローブ。
［１７］　標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１５］又は［１６］に記載のプローブ。
［１８］　配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１５］～［１７］のいずれかに記載のプローブ。
［１９］　［１］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットと、［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブとを含む、キット。
［２０］　検体において、クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するための方法であって、［１］～［９］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２１］　第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・バリイコーラとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］　［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエ；クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；及びクレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）から成る群から選択される１種又は２種以上である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエであり、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２０］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］　検体において、クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するための方法であって、［１］、［２］、［９］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２６］　第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・ニューモニエとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２５］に記載の方法。
［２７］　［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２６］に記載の方法。
［２８］　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラ；クレブシエラ・ミシガネンシス；クレブシエラ・カシニューモニエ；クレブシエラ・アエロゲネス；クレブシエラ・プランティコーラ；クレブシエラ・グラヌロマティス；クレブシエラ・グリモンティ；及びクレブシエラ・オキシトカから成る群から選択される１種又は２種以上である、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラであり、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２５］～［２８］のいずれかに記載の方法。
　本発明のオリゴヌクレオチドによれば、より簡便にクレブシエラ・バリイコーラ及び／又はクレブシエラ・ニューモニエとその他のクレブシエラ属細菌を鑑別することが可能になる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、同じｇｙｒＢ遺伝子を標的とする他のプライマー及びプローブとの比較で優れた鑑別能力を発揮しうる。
Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）、Ｋ．ニューモニエのＮＵ－ＣＲＥ０４７株、ＣＨＳ１０５株、ＫＰＮＩＨ３３株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号４、５、６）のｇｙｒＢ遺伝子の一部の多重整列結果。 配列番号７及び８、１０及び１１のプライマーセットを用いて得られた増幅産物の融解曲線解析の結果。実線はＫ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、破線はＫ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株、一点鎖線はコントロール（水）の結果をそれぞれ示す。 Ｋ．バリイコーラ及びＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出結果。縦軸はｐＣｏｄｅにおいて測定した蛍光強度を示す。 図３の結果から陰性コントロール（水）の結果を削除したもの。縦軸はｐＣｏｄｅにおいて測定した蛍光強度を示す。 臨床検体を対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出結果。縦軸はｐＣｏｄｅにおいて測定した蛍光強度を示す。 Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（１～３０１ｂｐ）。 Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（３００～６００ｂｐ）。 Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（７０１～１０００ｂｐ）。 Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（１６０１～１９００ｂｐ）。 Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（２０５１～２３５０ｂｐ）。 アッセイセット１～６を用いた蛍光測定結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。
（プライマーセット）
　第一の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットが提供される。プライマーセットは、クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる。
　ｇｙｒＢ遺伝子は、ＤＮＡジャイレースのサブユニットであるＧｙｒＢタンパク質をコードしている。
　検体は、クレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエを含むクレブシエラ属菌種の存在が疑われるものであれば特に限定されないが、ヒト又は非ヒト由来の血液、血清、血漿、尿、便、唾液、喀痰、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物等が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。検体は食品、土壌、植物等であってもよい。
　クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子の例として、配列番号１～３のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～３のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードするものが挙げられる。
　クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子の例として、配列番号４～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号４～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードするものが挙げられる。
　例えば、フォワードプライマーとしての第一のプライマーは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～のいずれかに示される塩基配列、又は配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、とハイブリダイズすることができるものであればどのような配列を有していてもよい。
　同様に、リバースプライマーとしての第二のプライマーは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の相補鎖、又は配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の相補鎖において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、とハイブリダイズすることができるものであればどのような配列を有していてもよい。
　本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えば塩基配列の長さなどの情報を基に適宜決定され得る。例えば、ストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件とは、相同性（好ましくは同一性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件ともいえる。
　具体的なストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））中に所望の塩基配列に相補的な塩基配列と、クレブシエラ・バリイコーラの存在が疑われる検体とを約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件である。
　プライマー、プローブの設計は、他の類縁種の配列と交差反応を起こさないように行われるが、増幅産物などの検出に使用する系やその他の条件に応じて適宜変更することができる。１００～２００塩基長の長さの増幅産物を生成する場合、例えば、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列を標的とすることが好ましい。プライマーは、このような標的を構成する塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有するように設計される。プライマーの末端、特に３‘末端において、クレブシエラ・バリイコーラ以外のクレブシエラ属細菌とのミスマッチが存在するように設計を行うことが好ましい。
　クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーの例として、以下の配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣ－３’（配列番号７）
　クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第二のプライマーの例として、以下の配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧ－３’（配列番号８）
　クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーの例として、以下の配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣ－３’（配列番号１０）
　クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第二のプライマーの例として、以下の配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＡＡＴＧ－３’（配列番号１１）
　第一及び第二のプライマーの長さは任意であり、例えば約１０塩基～約３５塩基の範囲で適宜設定できるが、少なくとも１０塩基以上であることが好ましい。
　第一のプライマーと第二のプライマーの比率は特に限定されず、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。プライマーセットが非対称ＰＣＲ法で使用される場合、一方のプライマーの濃度が他方のプライマーの濃度よりも高くなるように調整され得る。
　第一と第二のプライマーはクレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子の全部又は一部の領域を特異的に増幅することができ、これにより、その他のクレブシエラ属菌種との鑑別が可能になる。あるいは、第一と第二のプライマーの増幅産物を融解曲線解析にかけ、その融解温度を他のプライマーセットによる増幅産物の融解温度と比較することでクレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエとその他のクレブシエラ菌種とを区別することもできる。
　その他のクレブシエラ属菌種としては、クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；クレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）等が挙げられるが、検体に含まれる菌種はこれらに限定されない。また、クレブシエラ属菌種は１種又は２種以上であってもよい。
　プライマーセットはクレブシエラ・バリイコーラ用の第一及び第二のプライマーとクレブシエラ・ニューモニエ用の第一及び第二のプライマーとを組み合わせてもよいし、これらの第一及び第二のプライマーをそれぞれ又は組み合わせて、これら以外のプライマー、例えば第三、第四、第五、第六等の追加のプライマーを含んでいてもよい。適切な追加のプライマーを使用することで検出感度が向上し得る。そのようなプライマーとしては、例えば、検体中に含まれることが予想されるその他のクレブシエラ菌種を検出するためのプライマー等が想定される。
　クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーの例として、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
　クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第四のプライマーの例として、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
　クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーの例として、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
　クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第四のプライマーの例として、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
　上記プライマーを用いる核酸増幅反応により、検体に含まれるクレブシエラ・バリイコーラ及び／又はクレブシエラ・ニューモニエの存在を検出することができる。
　核酸増幅法としてはＰＣＲ法があり、マルチプレックスＰＣＲ、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。検体に多数のクレブシエラ属細菌が含まれていると予想される場合、複数の菌を網羅的に同時検出することが可能なマルチプレックスＰＣＲが好ましい。
　増幅産物の検出方法は、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルを用いた電気泳動法など、既知の方法で行うができる。例えば、電気泳動では、分子量が既知のマーカーの移動度に対する増幅産物の移動度から、増幅産物の存在を同定することができる。
　核酸増幅反応後の増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる標識体を利用してもよい。そのような標識体としては蛍光色素、ビオチン、ジゴキシゲニン等が挙げられる。標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー等を用いて検出することができる。
（プローブ）
　第二の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブが提供される。プローブはクレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とすることができる。
　プローブは、好ましくはその内部がその他のクレブシエラ属細菌に対するミスマッチを含むように設計される。これにより、ハイブリダイズ時のフルマッチ部分の塩基長が短くなり、特異性が向上し、偽陽性が低減し得る。
　クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るプローブの例として、以下の配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧ－３’（配列番号９）
　クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るプローブの例として、以下の配列番号１２に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１２に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１２に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１２）
　プローブはビーズ等の固相体に結合されてもよい。そのような固相体の例としては、マルチプレックスアッセイに適したビーズ、例えば、ＷＯ２０１８０５２４６４Ａ１に開示されているようなマルチプレックスアッセイについての情報を記憶するための固有のアナログコード識別子を有するビーズが挙げられる。
（キット）
　第三の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットとプローブとを含むキットが提供される。
　キットには、クレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の検出に使用する試薬、例えば増幅反応を行うための試薬を含めてもよい。増幅反応を行う試薬は、例えば緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を含む。キットの内容物や試薬は増幅方法に応じて当業者が適宜決定することができ、キットはプライマーを用いて得られる増幅産物又はプローブとハイブリダイゼーションさせるための固相体を更に含んでいてもよい。
　キットは更に、検体中に含まれることが予想されるその他のクレブシエラ菌種を検出するためのプライマーやプローブを含んでもよい。
（検出方法）
　第四の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するための方法が提供される。クレブシエラ・バリイコーラの存在の検出には配列番号７及び８のプライマーセットを、クレブシエラ・ニューモニエの存在の検出には配列番号１０及び１１のプライマーセットを用いることができる。
　プライマーセットにプローブを組み合わせることが好ましい。例えば、配列番号７及び８のプライマーと、配列番号９のプローブを併用することでクレブシエラ・バリイコーラがその他のクレブシエラ属細菌からより高精度に鑑別され得る。クレブシエラ・ニューモニエを検出するためのプライマーセット及びプローブを併用してもよい。
　クレブシエラ・ニューモニエをその他のクレブシエラ属細菌から高精度に鑑別するためには、例えば、配列番号１０及び１１のプライマーと、配列番号１２のプローブを併用することが好ましい。クレブシエラ・バリイコーラを検出するためのプライマーセット及びプローブを併用してもよい。
　検体を更に全ゲノム解析、そしてＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析にかけることで検出された細菌の異同を判断してもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
実施例１：ゲノムＤＮＡを対象とするリアルタイムＰＣＲによるＫ．バリイコーラ及びＫ．ニューモニエの検出
プライマー・プローブの設計
　図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）、Ｋ．ニューモニエのＮＵ－ＣＲＥ０４７株、ＣＨＳ１０５株、ＫＰＮＩＨ３３株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号４、５、６）のｇｙｒＢ遺伝子の一部の多重整列結果から、配列番号７～１２のプライマー・プローブを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
核酸増幅および融解曲線解析
　Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。増幅に用いた試薬はＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、インターカレーター色素にＥｖａＧｒｅｅｎ（ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。測定装置にはＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた。
　使用した増幅反応条件は以下のとおりである。
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数４５回）
７２℃：６００秒
　更に、増幅産物について融解曲線解析を以下の条件で行った。
９５℃：３０秒
６０℃－＞９５℃：０．１１℃／秒で昇温
　融解曲線解析の測定結果を図２に示す。Ｋ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの増幅産物の融解温度は、それぞれ８４．７℃と８３．８℃と、およそ１℃の差があった。以上から、配列番号７、８、１０、１１のプライマーを用いることで、標的とした核酸成分を増幅させ、さらに、増幅産物の融解温度による識別ができることが分かった。
　特筆すべき点として、本実施例では、当該領域で発光物質にしばしば用いられる高価なＴａｑＭａｎ　Ｐｒｏｂｅを採用しておらず、安価なインターカレーター色素で識別が可能であり、実験に必要なコストの面で秀でていることが分かった。
実施例２：Ｋ．バリイコーラおよびＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
核酸増幅および検出
　Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
　増幅にはＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
　基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１２のプローブが固定化された基板２が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
　標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ　１０００　πＣｏｄｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎａｌａｙｚｅｒ　（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
　使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
　測定結果を図３に示す。Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株を鋳型とした場合、基板１においては顕著に蛍光が観測され、基板２ではほとんど蛍光が観測されなかった。また、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合、基板１においては微弱ながら、また、基板２では顕著な蛍光が観測された。また、陰性コントロールとして水を鋳型とした場合では、基板１においては微弱ながら蛍光が観測され、基板２においてはほとんど蛍光が観測されなかった。
　このことから、基板１のバックグラウンド値が高いと判断でき、図３の結果から陰性コントロールの値を差し引いた場合の結果を図４に示す。
　陰性コントロールを差し引くことで、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合、基板１においてはほとんど蛍光が観測されず、また、基板２では顕著な蛍光が観測された。
　以上から、配列番号７、８、１０、１１のプライマーおよび配列番号９および配列番号１２のプローブを用いることで、従来では鑑別のできなかったＫ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別が可能となることが期待できた。
実施例３：臨床検体（血液培養液）５検体を対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
核酸増幅および検出
　培養同定法において、Ｋ．ニューモニエと同定された検体１および２、Ｋ．アエロゲネスと同定された検体３、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）と同定された検体４、Ｋ．プランティコーラと同定された検体５に対して、ＱＩＡａｍｐ　ＢｉＯｓｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
　増幅にはＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
　基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１２のプローブが固定化された基板２が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
　標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ　１０００　πＣｏｄｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎａｌａｙｚｅｒ　（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
　使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
　測定結果を図５に示す。なお、実施例２で、基板１のバックグラウンド値が高いことを受け、図５では陰性コントロールとして水を鋳型とした場合の値を差し引いた。
　検体１を鋳型とした場合、基板１において蛍光が観測され、また、検体２を鋳型とした場合、基板２において蛍光が観測された。このことから、実施例１の結果に鑑み、検体１はＫ．バリイコーラである可能性が示唆された。後述する検証１にて、検体１について、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定を行った結果、検体１はＫ．バリイコーラとして分類がされることが判明し、実施例１と合わせ、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用い、配列番号９および配列番号１２のプローブを用いることで、従来では鑑別のできなかったＫ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別が可能となることが明らかとなった。
　さらに、検体３、４、５については、どちらの基板からも蛍光が観測されなかったため、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用い、配列番号９および配列番号１２のプローブを用いても、他のクレブシエラ属細菌であるＫ．アエロゲネス、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランティコーラを誤って検出することはないことが分かった。
検証１：検体１の次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定
　遺伝子の配列情報を用いた菌種同定には、古くはＤＤＨ（ＤＮＡ－ＤＮＡ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が用いられてきたが、現在では、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法が標準的な手法として取って代わってきている。
ＡＮＩとは、解析対象の全ゲノムの配列が、データベース上に登録されているどのリファレンス配列に対して配列類似性が高いかという計算結果をもとにして、菌種の同定を行う手法である。
ｉ）分離コロニーからの釣菌およびゲノム抽出
分離コロニーから釣菌し、Ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ（日本ジェネティクス社）で処理した上清を、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、ゲノムを抽出した。
ｉｉ）ライブラリー調製
ＱＩＡｓｅｑ　ＦＸ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、試薬付属の標準プロトコールに則り、ライブラリーを調製した。
ｉｉｉ）シーケンス反応
ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　ｖ３　６００　ｃｙｃｌｅｓを用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、機器にＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、３００ｂｐ×２のペアエンドシーケンス反応をおこなった。
ｉｉｉｉ）ＡＮＩによる菌種同定
機器から取得した生データに対し、トリミングにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ　ｖｅｒｓｉｏｎ　０．３８を用い、ｄｅ　ｎｏｖｏアセンブリーにＳＰＡｄｅｓ　ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１３．０を用いて全ゲノムの配列を作成した。データベースにＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑを用いて、ＢＢＴｏｏｌｓでＡＮＩによる菌種同定をおこなった。
　検体１は、データベース上のＫ．バリイコーラと最も高い類似性（ＡＮＩ　Ｖａｌｕｅ：９９．１５％）を示し、次点はＫ．ニューモニエ（ＡＮＩ　Ｖａｌｕｅ：９５．８９％）であった。一般的に、ＡＮＩによる菌種同定における、同一菌種であると判定する閾値は９５～９６％（Ｋｉｍ，Ｍ，ＨＳ　Ｏｈ，ＳＣ　Ｐａｒｋ，Ｊ　Ｃｈｕｎ．　２０１４．Ｔｏｗａｒｄｓ　ａ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｇｙｒＢｌｅｏｔｉｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｆｏｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｅｖｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　６４：３４６―３５１．）とされており、本閾値を以って、検体１はＫ．バリイコーラとして同定がされた。以上から、全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定からも、実施例２の結果の妥当性が支持された。
Ｋ．バリイコーラおよびＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
プライマーおよびプローブの設計
　図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の一部の多重整列結果から配列番号７～９、図６に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１３～１５、図７に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１６～１８、図８に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１９～２１、図９に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２２～２４、図１０に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２５～２７のプライマー・プローブを設計した。また、それぞれをアッセイセット１～６とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
核酸増幅および検出
　Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１あるいは配列番号１３、１４、１０、１１あるいは配列番号１６、１７、１０、１１あるいは配列番号１９、２０、１０、１１あるいは配列番号２２、２３、１０、１１あるいは配列番号２５、２６、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
　増幅にはＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
　基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１５のプローブが固定化された基板３および配列番号１８のプローブが固定化された基板４および配列番号２１のプローブが固定化された基板５および配列番号２４のプローブが固定化された基板６が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
　標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ　１０００　πＣｏｄｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎａｌａｙｚｅｒ　（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
　使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
　測定結果を図１１に示す。また、Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株を鋳型とした場合の蛍光値をシグナルとし、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合の蛍光値をノイズとしたときの各アッセイセットのシグナル／ノイズを算出した結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　シグナル／ノイズの値が大きいほど、鑑別能力が高いアッセイセットであると言え、このことから最も鑑別能力が高かったのはアッセイセット１であり、次に鑑別能力が高いのはアッセイセット５、３番目がアッセイセット３であることが分かった。シグナル／ノイズの値が１に近いほど、鑑別能力が低い、あるいは鑑別ができないアッセイセットであると言え、アッセイセット２、４、６は鑑別能力が低いアッセイセットであることが分かった。
　以上から、ｇｙｒＢ遺伝子内の６つの領域で作成したアッセイセット１～６のうち、アッセイセット１である配列番号７、８のプライマーおよび配列番号９のプローブが、Ｋ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別能力が最も高いことが分かった。

Claims (29)

  1. 　検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
    　クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる、プライマーセット。
  2. 　ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、請求項１に記載のプライマーセット。
  3. 　標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  4. 　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  5. 　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第二のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  6. 　クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  7. 　第三のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  8. 　第四のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  9. 　クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
  10. 　第二のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１、２、９のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  11. 　クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、請求項１、２、９、１０のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  12. 　第三のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１、２、９～１１のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  13. 　第四のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１、２、９～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  14. 　プライマーがビオチンで標識されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  15. 　検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブであって、
    　クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、プローブ。
  16. 　ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、請求項１５に記載のプローブ。
  17. 　標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、請求項１５又は１６に記載のプローブ。
  18. 　配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のプローブ。
  19. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載のプライマーセットと、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のプローブとを含む、キット。
  20. 　検体において、クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いる、方法。
  21. 　第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・バリイコーラとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 　請求項１５～１８のいずれか一項に記載のプローブを更に用いる、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエ；クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；及びクレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）から成る群から選択される１種又は２種以上である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエであり、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 　検体において、クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するための方法であって、請求項１、２、９～１４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いる、方法。
  26. 　第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・ニューモニエとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 　請求項１５～１８のいずれか一項に記載のプローブを更に用いる、請求項２６に記載の方法。
  28. 　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラ；クレブシエラ・ミシガネンシス；クレブシエラ・カシニューモニエ；クレブシエラ・アエロゲネス；クレブシエラ・プランティコーラ；クレブシエラ・グラヌロマティス；クレブシエラ・グリモンティ；及びクレブシエラ・オキシトカから成る群から選択される１種又は２種以上である、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 　クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラであり、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
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