JPH0767657A - クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列 - Google Patents
クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列Info
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- JPH0767657A JPH0767657A JP5242215A JP24221593A JPH0767657A JP H0767657 A JPH0767657 A JP H0767657A JP 5242215 A JP5242215 A JP 5242215A JP 24221593 A JP24221593 A JP 24221593A JP H0767657 A JPH0767657 A JP H0767657A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属菌
の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来のオリゴヌクレオチドプ
ローブを合成した。本配列は、新規であり、リバースド
ットブロットハイブリダイゼーションに使用できる。 【効果】 食品及びその他の検体中の汚染菌（クレブシ
エラ属菌）の高感度且つ極めて迅速な検出同定ができ
る。
の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来のオリゴヌクレオチドプ
ローブを合成した。本配列は、新規であり、リバースド
ットブロットハイブリダイゼーションに使用できる。 【効果】 食品及びその他の検体中の汚染菌（クレブシ
エラ属菌）の高感度且つ極めて迅速な検出同定ができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌の１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子に由来する塩基配列及びその利用に関する。
更に詳細には、本発明に係る塩基配列は、１８塩基から
なる核酸断片であって、分子交雑により大腸菌群、特に
クレブシエラ属菌と特異的に結合するため、この細菌を
検出することができるものである。
ＮＡ遺伝子に由来する塩基配列及びその利用に関する。
更に詳細には、本発明に係る塩基配列は、１８塩基から
なる核酸断片であって、分子交雑により大腸菌群、特に
クレブシエラ属菌と特異的に結合するため、この細菌を
検出することができるものである。
【０００２】したがって本発明は、食品その他の検体か
らクレブシエラ属菌を検出するのに利用することができ
るほか、細菌の同定等、食品、医療その他バイオテクノ
ロジーの技術分野で重用されるものである。
らクレブシエラ属菌を検出するのに利用することができ
るほか、細菌の同定等、食品、医療その他バイオテクノ
ロジーの技術分野で重用されるものである。
【０００３】
【従来の技術】従来、食品その他の検体中における大腸
菌群、特にクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニ
エ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等
のクレブシエラ属細菌の検出は、次のようにして行って
いるが、その菌種同定には数日〜１週間もの長い期間を
要する。
菌群、特にクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニ
エ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等
のクレブシエラ属細菌の検出は、次のようにして行って
いるが、その菌種同定には数日〜１週間もの長い期間を
要する。
【０００４】先ず、食品等検体中の大腸菌群の検査は、
ＢＧＬＢ発酵管培地による推定試験を経てＥＭＢ培地に
よる確定試験、そしてＬＢ培地での乳糖分解、ガス発生
試験後グラム染色での確認（グラム陰性短桿菌）によ
り、大腸菌群であることが判明する。ここでの試験に約
２日間を要する。
ＢＧＬＢ発酵管培地による推定試験を経てＥＭＢ培地に
よる確定試験、そしてＬＢ培地での乳糖分解、ガス発生
試験後グラム染色での確認（グラム陰性短桿菌）によ
り、大腸菌群であることが判明する。ここでの試験に約
２日間を要する。
【０００５】次に、ＩＭＶＩＣ鑑定で菌種の同定に移
る。Ｉｎｄｏｌｅ，ＭＲ，ＶＰ，Ｃｉｔｒａｔｅなどの
各反応試験で大腸菌群の分類を行う。この期間約２日な
いし３日間を要する。そのため、菌種同定に要する期間
は１週間弱となる。
る。Ｉｎｄｏｌｅ，ＭＲ，ＶＰ，Ｃｉｔｒａｔｅなどの
各反応試験で大腸菌群の分類を行う。この期間約２日な
いし３日間を要する。そのため、菌種同定に要する期間
は１週間弱となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のように従来の方
法では菌種を検出するために少なくとも数日を要する。
本発明は、この作業日数を大幅に短縮することを目的と
する。
法では菌種を検出するために少なくとも数日を要する。
本発明は、この作業日数を大幅に短縮することを目的と
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に鋭意研究した結果、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
において広く腸内細菌に保存されている領域（ｖａｒｉ
ａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）からプライマーを合成するの
に成功し、そしてこれを用いてＰＣＲ法によって１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、次いでＤＮＡの塩基配列を
決定するのに成功し、そして遂に、これらの配列よりプ
ローブとなり得る領域を選択し、１８塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプローブを新たに合成するのに成功し、
本発明の完成に至ったものである。図１に１６Ｓ ｒＲ
ＮＡの２次構造を示す。
に鋭意研究した結果、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
において広く腸内細菌に保存されている領域（ｖａｒｉ
ａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）からプライマーを合成するの
に成功し、そしてこれを用いてＰＣＲ法によって１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、次いでＤＮＡの塩基配列を
決定するのに成功し、そして遂に、これらの配列よりプ
ローブとなり得る領域を選択し、１８塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプローブを新たに合成するのに成功し、
本発明の完成に至ったものである。図１に１６Ｓ ｒＲ
ＮＡの２次構造を示す。
【０００８】更に、これらの新規合成プローブは、１８
塩基の核酸断片であって分子交雑によってクレブシエラ
属菌種に特異的に結合するという特性を有しているの
で、この特性を利用することにより、例えばリバースド
ットブロットハイブリダイゼーションその他既知の方法
によって、これらの菌種の検出、同定が正確且つ迅速に
実施できることも研究の結果確認された。
塩基の核酸断片であって分子交雑によってクレブシエラ
属菌種に特異的に結合するという特性を有しているの
で、この特性を利用することにより、例えばリバースド
ットブロットハイブリダイゼーションその他既知の方法
によって、これらの菌種の検出、同定が正確且つ迅速に
実施できることも研究の結果確認された。
【０００９】以下、本発明を実施例にしたがって具体的
に説明する。
に説明する。
【００１０】（Ａ）菌ＤＮＡの調製 以下に示す試薬を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を調製
する。
する。
【００１１】１．培地Ｂａｃｔｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃ Ｍｅｄｉｕｍ３ 細菌培地用寒天末 ２．１０×ＰＣＲバッファー 反応時の濃度 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０) １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２５ｍＭ ＫＣｌ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ ３．ＰＣＲプライマー Ｆ ５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−
３’ Ｒ ５’−ＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣ−
３’ （１０μＭに調整） ４．２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（但しｄＮＴＰは１．５ｍ
Ｍ） ５．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ ６．ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍｌ）
ｃ Ｍｅｄｉｕｍ３ 細菌培地用寒天末 ２．１０×ＰＣＲバッファー 反応時の濃度 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０) １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２５ｍＭ ＫＣｌ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ ３．ＰＣＲプライマー Ｆ ５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−
３’ Ｒ ５’−ＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣ−
３’ （１０μＭに調整） ４．２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（但しｄＮＴＰは１．５ｍ
Ｍ） ５．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ ６．ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍｌ）
【００１２】その調製方法は、次のとおりである。
【００１３】１；終夜平面培地で培養した菌を滅菌した
楊子を用いて２００μｌの滅菌水に懸濁し、１００℃で
５分間煮沸する。 ２；煮沸したサンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心
し、ＤＮＡを上清中に集め、この上清をＰＣＲに用い
る。ＰＣＲは次のようにして行う（図２）。 ３；反応系 煮沸したＤＮＡ ３８μｌ １０×ＰＣＲバッファー ５μｌ プライマー ２μｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ ３μｌ ＲＮａｓｅＡ １μｌ ＶＥＮＴ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） １μｌ 計５０μｌを良く混ぜてＰＣＲ法により増幅する。 ４；ＰＣＲ法のプログラムは、以下に示す通り。 ９４℃ ２分 ４８℃ ２分 ７２℃ ２分
を１回 ９４℃ ３０秒 ４８℃ ３０秒 ７２℃ ２分
を２９回 ７２℃ ２分 を１回 ５；増幅したＤＮＡを確認するために、１．５％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動しＥｔＢｒ溶液染色し確認す
る。 ６；ＰＣＲ反応液を５０μｌの滅菌蒸留水に溶かし、全
量の１００μｌをハイブリダイゼーションに用いる。 ７；上記したように増幅したＰＣＲサンプルはミニゲル
で確認後、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離精製し、切り出したゲルを透析チューブにいれ、ＴＢ
Ｅ緩衝液中で１５０ｍＡ、で２時間抽出する。次いでサ
ンプルは、 フェノール抽出、エタノール沈殿を行い
滅菌水に希釈し、ＤＮＡシーケンサ ーを用いて塩基
配列を解析した。
楊子を用いて２００μｌの滅菌水に懸濁し、１００℃で
５分間煮沸する。 ２；煮沸したサンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心
し、ＤＮＡを上清中に集め、この上清をＰＣＲに用い
る。ＰＣＲは次のようにして行う（図２）。 ３；反応系 煮沸したＤＮＡ ３８μｌ １０×ＰＣＲバッファー ５μｌ プライマー ２μｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ ３μｌ ＲＮａｓｅＡ １μｌ ＶＥＮＴ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） １μｌ 計５０μｌを良く混ぜてＰＣＲ法により増幅する。 ４；ＰＣＲ法のプログラムは、以下に示す通り。 ９４℃ ２分 ４８℃ ２分 ７２℃ ２分
を１回 ９４℃ ３０秒 ４８℃ ３０秒 ７２℃ ２分
を２９回 ７２℃ ２分 を１回 ５；増幅したＤＮＡを確認するために、１．５％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動しＥｔＢｒ溶液染色し確認す
る。 ６；ＰＣＲ反応液を５０μｌの滅菌蒸留水に溶かし、全
量の１００μｌをハイブリダイゼーションに用いる。 ７；上記したように増幅したＰＣＲサンプルはミニゲル
で確認後、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離精製し、切り出したゲルを透析チューブにいれ、ＴＢ
Ｅ緩衝液中で１５０ｍＡ、で２時間抽出する。次いでサ
ンプルは、 フェノール抽出、エタノール沈殿を行い
滅菌水に希釈し、ＤＮＡシーケンサ ーを用いて塩基
配列を解析した。
【００１４】（Ｂ）オリゴヌクレオチドプローブの配列
決定 上記により解析した配列を図３に示す。図３には、クレ
ブシエラ属菌以外の大腸菌群に属する細菌の配列も示し
た。なお略号は次の菌種を表わす。
決定 上記により解析した配列を図３に示す。図３には、クレ
ブシエラ属菌以外の大腸菌群に属する細菌の配列も示し
た。なお略号は次の菌種を表わす。
【００１５】 Ｃ ：Ｃｉｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ Ａ ：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ Ｅｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｋ２：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ Ｋ２ Ｋ７：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ Ｋ７ Ｐ２：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｐ２ Ｐ３：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｐ３ Ｅｎ：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ
Ｐ２ Ｐ３：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｐ３ Ｅｎ：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ
【００１６】これらの配列により、プローブとなり得る
領域を選択し、１８塩基のオリゴヌクレオチドプローブ
をそれぞれ合成するとともに、各菌種に共通の領域から
１８塩基のコントロールプローブも合成した。
領域を選択し、１８塩基のオリゴヌクレオチドプローブ
をそれぞれ合成するとともに、各菌種に共通の領域から
１８塩基のコントロールプローブも合成した。
【００１７】すなわち、本発明において使用するオリゴ
ヌクレオチドプローブの配列は次のとおりであって、い
ずれも従来未知の新規物質である。
ヌクレオチドプローブの配列は次のとおりであって、い
ずれも従来未知の新規物質である。
【００１８】Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａを特異的に結合する配
列 ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧ−３’ ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列
列 ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧ−３’ ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列
【００１９】Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に結合
する配列 ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡ−３’ ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＴＡＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列
する配列 ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡ−３’ ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＴＡＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列
【００２０】次に、このようにして合成したオリゴプロ
ーブを、下記（Ｃ）、（Ｄ）にしたがい、ナイロンメン
ブレンへ固定する（図４）。
ーブを、下記（Ｃ）、（Ｄ）にしたがい、ナイロンメン
ブレンへ固定する（図４）。
【００２１】（Ｃ）オリゴヌクレオチドのＴ−ｔａｉｌ
ｉｎｇ 以下に示す試薬を用いて、オリゴプローブの３’末端に
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の作用によりデオキシＴＴＰを結合させる。
ｉｎｇ 以下に示す試薬を用いて、オリゴプローブの３’末端に
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の作用によりデオキシＴＴＰを結合させる。
【００２２】１．Terminal deoxynucleotidyltranferas
e（TOYOBO） ２．10×Cacodylate buffer［1M sodium Cacodylate(pH
7.6), 0.25M Tris-HCl(pH7.6), 2mM DTT］ ３．1M Tris-HCl(pH7.6) ４．200mM DTT ５．100mM CoCl2 ６．dTTP ７．20×SSPE［20mM Na2EDTA, 0.16M NaOH, 0.2M NaH2P
O4(H2O), 3.6M NaCl］ ８．20×SSC［3.0M NaCl, 0.3M Sodium Citrate］ ９．10％SDS 10．Duralon ＵＶ(STRATAGENE) 11．ブロッター 12．ＵＶ stratalinker 1800(STRATAGENE)
e（TOYOBO） ２．10×Cacodylate buffer［1M sodium Cacodylate(pH
7.6), 0.25M Tris-HCl(pH7.6), 2mM DTT］ ３．1M Tris-HCl(pH7.6) ４．200mM DTT ５．100mM CoCl2 ６．dTTP ７．20×SSPE［20mM Na2EDTA, 0.16M NaOH, 0.2M NaH2P
O4(H2O), 3.6M NaCl］ ８．20×SSC［3.0M NaCl, 0.3M Sodium Citrate］ ９．10％SDS 10．Duralon ＵＶ(STRATAGENE) 11．ブロッター 12．ＵＶ stratalinker 1800(STRATAGENE)
【００２３】その結合方法は次のとおりである。
【００２４】１；以下に示す組成でＤＮＡの３’末端に
ポリｄＴを付加する。 １０×Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ １００ｍＭ ｄＴＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ＣｏＣｌ2 １０μｌ ２５Units／μl ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２μｌ ２μＭ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 全量１００μｌ ２；以上の試薬をエッペンドルフに入れて３７℃で２時
間インキュベートする。 ３；等量のフェノール／クロロフォルム１００μｌを加
えＶｏｒｔｅｘし室温で３分間１３０００ｒｐｍで遠心
する。 ４；除蛋白された上清をとり３Ｍ酢酸ナトリウム１０μ
ｌ、１００％エタノール３３０μｌ、グリコーゲン１μ
ｌを加えて混和。 ５；軽く遠心し−２０℃で３０分放置する。 ６；４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除
く。 ７；７０％エタノールを加え遠心し上清を除き乾燥す
る。 ８；１０８μｌの水に溶かし８μｌを用いてアガロース
電気泳動を行いポリｄＴが約４００ｍｅｒ．ついている
ことを確認する。
ポリｄＴを付加する。 １０×Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ １００ｍＭ ｄＴＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ＣｏＣｌ2 １０μｌ ２５Units／μl ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２μｌ ２μＭ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 全量１００μｌ ２；以上の試薬をエッペンドルフに入れて３７℃で２時
間インキュベートする。 ３；等量のフェノール／クロロフォルム１００μｌを加
えＶｏｒｔｅｘし室温で３分間１３０００ｒｐｍで遠心
する。 ４；除蛋白された上清をとり３Ｍ酢酸ナトリウム１０μ
ｌ、１００％エタノール３３０μｌ、グリコーゲン１μ
ｌを加えて混和。 ５；軽く遠心し−２０℃で３０分放置する。 ６；４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除
く。 ７；７０％エタノールを加え遠心し上清を除き乾燥す
る。 ８；１０８μｌの水に溶かし８μｌを用いてアガロース
電気泳動を行いポリｄＴが約４００ｍｅｒ．ついている
ことを確認する。
【００２５】（Ｄ）プローブのフィルターへの固定 ナイロンメンブレンにプローブをドットブロッターで吸
引し、ＵＶ照射でＴＴＰポリマーを固定する。その具体
的方法は次のとおりである。
引し、ＵＶ照射でＴＴＰポリマーを固定する。その具体
的方法は次のとおりである。
【００２６】１；あらかじめ１０×ＳＳＣにフィルター
を浸しておく。 ２；プローブ溶液１００μｌを１５ｍｌのチューブにい
れ１０×ＳＳＣを４ｍｌ加える。 ３；６５℃で５分間インキュベーションし次いで５分氷
冷する。 ４；それを、２００μｌずつブロッティングする。 ５；１０×ＳＳＣ ４５０μｌで洗い５分間吸引する。 ６；フィルターをＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １
８００でＵＶ照射する。（２４０ｎｍ） ７；５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（試薬はその都度作
成する。２０×ＳＳＰＥ２５ｍｌいれ、滅菌水８０ｍｌ
メスアップ、１０％ＳＤＳ １ｍｌ入れて１００ｍｌに
する。結晶化することがあるので注意）で３７℃、１５
分間フィルターを洗う。 ８；水で１分間洗い、乾燥させる。
を浸しておく。 ２；プローブ溶液１００μｌを１５ｍｌのチューブにい
れ１０×ＳＳＣを４ｍｌ加える。 ３；６５℃で５分間インキュベーションし次いで５分氷
冷する。 ４；それを、２００μｌずつブロッティングする。 ５；１０×ＳＳＣ ４５０μｌで洗い５分間吸引する。 ６；フィルターをＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １
８００でＵＶ照射する。（２４０ｎｍ） ７；５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（試薬はその都度作
成する。２０×ＳＳＰＥ２５ｍｌいれ、滅菌水８０ｍｌ
メスアップ、１０％ＳＤＳ １ｍｌ入れて１００ｍｌに
する。結晶化することがあるので注意）で３７℃、１５
分間フィルターを洗う。 ８；水で１分間洗い、乾燥させる。
【００２７】（Ｅ）菌ＤＮＡの増幅及び標識 上記により調製、固定化したプローブとハイブリダイゼ
ーションする菌、つまり検出しようとする対象菌のＤＮ
Ａの増幅及び標識は、図５のようにして行う。それには
先ず、保存領域より合成された１８塩基のプライマーを
用いる。番号はＥ．ｃｏｌｉ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓ
ｙｓｔｅｍによるものである。反応系にフルオレセイン
のついたｄＵＴＰヌクレオチドミックスを加えることで
フルオレセインラベルされたリボソームＲＮＡ遺伝子の
増幅フラグメント約３６２ｂｐが得られる。この反応液
を５分間煮沸し１本鎖にしハイブリダイゼーションを行
う。
ーションする菌、つまり検出しようとする対象菌のＤＮ
Ａの増幅及び標識は、図５のようにして行う。それには
先ず、保存領域より合成された１８塩基のプライマーを
用いる。番号はＥ．ｃｏｌｉ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓ
ｙｓｔｅｍによるものである。反応系にフルオレセイン
のついたｄＵＴＰヌクレオチドミックスを加えることで
フルオレセインラベルされたリボソームＲＮＡ遺伝子の
増幅フラグメント約３６２ｂｐが得られる。この反応液
を５分間煮沸し１本鎖にしハイブリダイゼーションを行
う。
【００２８】ここで、プライマーとしては、下記する２
種類の配列が例示されるが、これらはいずれも従来未知
のプライマーである。 ５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ３’ ３’ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＣＧＣＡＴ５’
種類の配列が例示されるが、これらはいずれも従来未知
のプライマーである。 ５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ３’ ３’ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＣＧＣＡＴ５’
【００２９】（Ｆ）ハイブリダイゼーション 以下に示す試薬を用いて、例えばリバースドットブロッ
トハイブリダイゼーション（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ
ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等のハイブリ
ダイゼーションを行う。
トハイブリダイゼーション（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ
ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等のハイブリ
ダイゼーションを行う。
【００３０】１．ラピッドハイブリダイゼーションバッ
ファー（アマシャムジャパン） ２．Antibody wash buffer（100mM Tris-HCl (7.5)，15
0mM NaCl） ３．Blocking buffer(0.5％w/v blocking agent in ant
ibody wash buffer) ４．0.5％w/v BSA(fraction V)in antibody wash buffe
r ５．anti-fluorescein-HRP (ホースラディッシュパーオ
キシデース)conjugate ６．Tween20
ファー（アマシャムジャパン） ２．Antibody wash buffer（100mM Tris-HCl (7.5)，15
0mM NaCl） ３．Blocking buffer(0.5％w/v blocking agent in ant
ibody wash buffer) ４．0.5％w/v BSA(fraction V)in antibody wash buffe
r ５．anti-fluorescein-HRP (ホースラディッシュパーオ
キシデース)conjugate ６．Tween20
【００３１】その方法は、次のとおりであって（図
６）、先ずナイロンメンブレンに固定されたオリゴプロ
ーブと１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで標識させたも
のをハイブリダイゼーションバッファー中で４２℃、１
時間反応させる。その後、抗フルオレセインコンジュゲ
イトのホースラディッシュパーオキシデースを加え室温
で１時間反応させる。ハイブリダイズしたＤＮＡに酵素
標識する。そして、基質の過酸化水素を反応させること
によりルミノールの発光が生じＸ線フィルムに検出する
システムである。その具体的な方法は次のとおりであ
る。
６）、先ずナイロンメンブレンに固定されたオリゴプロ
ーブと１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで標識させたも
のをハイブリダイゼーションバッファー中で４２℃、１
時間反応させる。その後、抗フルオレセインコンジュゲ
イトのホースラディッシュパーオキシデースを加え室温
で１時間反応させる。ハイブリダイズしたＤＮＡに酵素
標識する。そして、基質の過酸化水素を反応させること
によりルミノールの発光が生じＸ線フィルムに検出する
システムである。その具体的な方法は次のとおりであ
る。
【００３２】１；（プレハイブリダイゼーション） ４２℃で加温したラピッドハイブリダイゼーションバッ
ファーをメンブレンに１２．５ｍｌ／１００ｃｍ2の濃
度で加え１５分間ハイブリダイゼーションを行う。 ２；（ハイブリダイゼーション） 増幅したＰＣＲ産物を５分間煮沸し１５分間氷冷する。 ３；ハイブリダイゼーションバッファーに加え４２℃で
６０分間ハイブリダイゼーションを行う。 ４；（メンブレンの洗浄） ５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで室温で２０分間軽く洗浄
する。１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５５℃で１５分間
洗浄する。 ５；（抗体標識準備） 室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２
ｍｌ／ｃｍ2）で１分間洗浄する。５５℃で溶解したｂ
ｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍｌ／ｃｍ2）
で６０分間洗浄する。室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ
ｈ ｂｕｆｆｅｒ（２ｍｌ／ｃｍ2）で１分間洗浄す
る。 ６；（ＨＲＰ標識） ＢＳＡ ０．０５ｇをａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂ
ｕｆｆｅｒ １０ｍｌに溶解する。１０００分の１のＨ
ＲＰ ａｎｔｉｂｏｄｙを加える。０．２５ｍｌ／ｃｍ
2で室温で６０分間反応させる。０．１％ｖ／ｖ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂｕ
ｆｆｅｒで１０分間２回洗浄する。０．１％ｖ／ｖ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂ
ｕｆｆｅｒで５分間２回洗浄する。 ７；（検出） 検出試薬１と２（アマシャムジャパン社）を０．１２５
ｍｌ／ｃｍ2の量になるように等量混ぜ合わせメンブレ
ンにかける。１分間静置し余分な試薬を除きフィルムカ
セットにはさむ。約５分感光させて検出する。
ファーをメンブレンに１２．５ｍｌ／１００ｃｍ2の濃
度で加え１５分間ハイブリダイゼーションを行う。 ２；（ハイブリダイゼーション） 増幅したＰＣＲ産物を５分間煮沸し１５分間氷冷する。 ３；ハイブリダイゼーションバッファーに加え４２℃で
６０分間ハイブリダイゼーションを行う。 ４；（メンブレンの洗浄） ５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで室温で２０分間軽く洗浄
する。１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５５℃で１５分間
洗浄する。 ５；（抗体標識準備） 室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２
ｍｌ／ｃｍ2）で１分間洗浄する。５５℃で溶解したｂ
ｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍｌ／ｃｍ2）
で６０分間洗浄する。室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ
ｈ ｂｕｆｆｅｒ（２ｍｌ／ｃｍ2）で１分間洗浄す
る。 ６；（ＨＲＰ標識） ＢＳＡ ０．０５ｇをａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂ
ｕｆｆｅｒ １０ｍｌに溶解する。１０００分の１のＨ
ＲＰ ａｎｔｉｂｏｄｙを加える。０．２５ｍｌ／ｃｍ
2で室温で６０分間反応させる。０．１％ｖ／ｖ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂｕ
ｆｆｅｒで１０分間２回洗浄する。０．１％ｖ／ｖ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂ
ｕｆｆｅｒで５分間２回洗浄する。 ７；（検出） 検出試薬１と２（アマシャムジャパン社）を０．１２５
ｍｌ／ｃｍ2の量になるように等量混ぜ合わせメンブレ
ンにかける。１分間静置し余分な試薬を除きフィルムカ
セットにはさむ。約５分感光させて検出する。
【００３３】（Ｇ）結果 ハイブリダイゼーションの結果を図７、図８に示す。す
なわち、発光しているメンブレンに５分間感光させた結
果である。左に各メンブレン毎の菌種名を示し（クレブ
シエラ属菌以外の菌種も示した）、プローブは、メンブ
レンの左からそれぞれ、コントロールプローブ、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ，
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（異なる菌株由来のもの）、
Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ特異的プローブである。これらの結
果よりコントロールは全菌種とハイブリダイゼーション
しているためＤＮＡは増幅していることが言える。Ｅ．
ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅはそれぞれ検出されてい
る。また、シュードモナス、バチルスでは検出されなか
った。
なわち、発光しているメンブレンに５分間感光させた結
果である。左に各メンブレン毎の菌種名を示し（クレブ
シエラ属菌以外の菌種も示した）、プローブは、メンブ
レンの左からそれぞれ、コントロールプローブ、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ，
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（異なる菌株由来のもの）、
Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ特異的プローブである。これらの結
果よりコントロールは全菌種とハイブリダイゼーション
しているためＤＮＡは増幅していることが言える。Ｅ．
ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅはそれぞれ検出されてい
る。また、シュードモナス、バチルスでは検出されなか
った。
【００３４】上記した結果から明らかなように、本方法
によれば、クレブシエラ属菌がきわめて短時日のうちに
正確に検出することができる。しかも本方法によれば、
例えばＰＣＲを１回だけ行うと１０2ＣＦＵの菌が検出
され、更にＰＣＲを２回行ってハイブリダイゼーション
をすることにより１０の０乗のオーダーの菌数でも検出
でき、したがってＰＣＲをくり返すことによって検出精
度を更に向上させることができる。
によれば、クレブシエラ属菌がきわめて短時日のうちに
正確に検出することができる。しかも本方法によれば、
例えばＰＣＲを１回だけ行うと１０2ＣＦＵの菌が検出
され、更にＰＣＲを２回行ってハイブリダイゼーション
をすることにより１０の０乗のオーダーの菌数でも検出
でき、したがってＰＣＲをくり返すことによって検出精
度を更に向上させることができる。
【００３５】したがって、本方法によれば各種の検体、
サンプル中のクレブシエラ属菌を自由に検出することが
可能となるが、例えば食品中での検出は図９のようにし
て行えばよく、約８時間というきわめて短い時間で菌の
同定ができることから、本方法は食品中の菌の迅速同定
にもきわめて有効である。
サンプル中のクレブシエラ属菌を自由に検出することが
可能となるが、例えば食品中での検出は図９のようにし
て行えばよく、約８時間というきわめて短い時間で菌の
同定ができることから、本方法は食品中の菌の迅速同定
にもきわめて有効である。
【００３６】
【発明の効果】本発明に係る配列は、従来未知の新規物
質であって、クレブシエラ属菌種に対して特異的に分子
結合するものであり他の菌種とは結合しないという特徴
を有するものである。また、この合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いることで、食品その他臨床検体からの
菌種検出にハイブリダイゼーション法と共に利用でき、
すぐれた検出試薬も提供することができる。
質であって、クレブシエラ属菌種に対して特異的に分子
結合するものであり他の菌種とは結合しないという特徴
を有するものである。また、この合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いることで、食品その他臨床検体からの
菌種検出にハイブリダイゼーション法と共に利用でき、
すぐれた検出試薬も提供することができる。
【図１】１６Ｓ ｒＲＮＡの２次構造を示す。
【図２】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子からのＰＣＲ法の概要
を示す。
を示す。
【図３】オリゴヌクレオチドプローブ及びコントロール
プローブの位置とＤＮＡ配列を示す。
プローブの位置とＤＮＡ配列を示す。
【図４】オリゴヌクレオチドプローブのＴ−ｔａｉｌｉ
ｎｇ及びナイロンメンブレンへの固定化を示す。
ｎｇ及びナイロンメンブレンへの固定化を示す。
【図５】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎの増幅と標識を示す。
ｒｅｇｉｏｎの増幅と標識を示す。
【図６】リバースドットブロットハイブリダイゼーショ
ンを示す。
ンを示す。
【図７】ハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図８】同じくハイブリダイゼーションの結果（続き）
を示す。
を示す。
【図９】食品サンプルからの菌の検出システムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 壇原 宏文 神奈川県横浜市港北区篠原西町30−40 (72)発明者 阿部 章夫 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法人 北里研究所内 (72)発明者 川原 一芳 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法人 北里研究所内 (72)発明者 松井 英則 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法人 北里研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 以下に示す４種の配列及び／又はそれに
相補的な配列の少なくともひとつからなるＤＮＡ配列。 ＡＡＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧ ＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＡ ＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡ ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＴＡＡ - 【請求項２】 請求項１に記載したＤＮＡ配列からなる
オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３】 該オリゴヌクレオチドプローブがクレブ
シエラ属菌検出用プローブである請求項２に記載のプロ
ーブ。 - 【請求項４】 請求項３に記載したプローブを用いるこ
とを特徴とするクレブシエラ属菌検出試薬。 - 【請求項５】 該クレブシエラ属菌検出試薬がリバース
ドットブロットハイブリダイゼーションシステムに基づ
くものであることを特徴とする請求項４に記載の検出試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24221593A JP3499263B2 (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24221593A JP3499263B2 (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767657A true JPH0767657A (ja) | 1995-03-14 |
| JP3499263B2 JP3499263B2 (ja) | 2004-02-23 |
Family
ID=17085959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24221593A Expired - Fee Related JP3499263B2 (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | クレブシエラ属菌の検出及び塩基配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3499263B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| WO2021201091A1 (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | デンカ株式会社 | クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ |
-
1993
- 1993-09-03 JP JP24221593A patent/JP3499263B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8067207B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-11-29 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8182996B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-05-22 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Compositions and methods for detecting Klebsiella pneumoniae |
| US10047404B2 (en) | 1999-09-28 | 2018-08-14 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved tuf genes and their use to generate probes and primers for detection of coagulase-negative Staphylococcus |
| WO2021201091A1 (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | デンカ株式会社 | クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3499263B2 (ja) | 2004-02-23 |
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