JP2709256B2 - マイコバクテリアプローブ - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- Genetics & Genomics (AREA)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドプ
ローブに関し、特に、マイコバクテリアＤＮＡに対して
選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプ
ローブに関する。
ローブに関し、特に、マイコバクテリアＤＮＡに対して
選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプ
ローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】健康管理者は、マイコバクテリア感染の
症例の有意の増大に遭遇している。多数のこれらの新規
の症例はエイズ（ＡＩＤＳ）の流行に関係している。医
師は、マイコバクテリア感染を診断する場合に彼等を援
助する臨床微生物学者を信頼している。しかしながら、
このような感染の診断は、生物の酸性高速染色および培
養に続く生化学的検定法に大きく依存している。これら
は時間を浪費する過程である。したがって、マイコバク
テリア感染を診断する新規の、特に迅速な方法が引き続
き必要とされている。
症例の有意の増大に遭遇している。多数のこれらの新規
の症例はエイズ（ＡＩＤＳ）の流行に関係している。医
師は、マイコバクテリア感染を診断する場合に彼等を援
助する臨床微生物学者を信頼している。しかしながら、
このような感染の診断は、生物の酸性高速染色および培
養に続く生化学的検定法に大きく依存している。これら
は時間を浪費する過程である。したがって、マイコバク
テリア感染を診断する新規の、特に迅速な方法が引き続
き必要とされている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、マイコバクテ
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリ
ゴヌクレオチドプローブを提供する。オリゴヌクレオチ
ドプローブは、（ａ）本明細書中において配列番号：１
（ＭＫ１４）として与えられたＤＮＡ配列から本質的に
成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）マイコバクテ
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるＭＫ
１４のフラグメントから成るオリゴヌクレオチドプロー
ブ；（ｃ）ＭＫ１４に対してハイブリッド形成し且つマ
イコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブ；および（ｄ）前述
のいずれかに相補的であり且つマイコバクテリア核酸に
対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオ
チドプローブから成る群より選択される。
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリ
ゴヌクレオチドプローブを提供する。オリゴヌクレオチ
ドプローブは、（ａ）本明細書中において配列番号：１
（ＭＫ１４）として与えられたＤＮＡ配列から本質的に
成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）マイコバクテ
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるＭＫ
１４のフラグメントから成るオリゴヌクレオチドプロー
ブ；（ｃ）ＭＫ１４に対してハイブリッド形成し且つマ
イコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブ；および（ｄ）前述
のいずれかに相補的であり且つマイコバクテリア核酸に
対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオ
チドプローブから成る群より選択される。
【０００４】前述の第一の実施態様は、（ａ）本明細書
中において配列番号：２２（Ｍ．カンサシイフラグメン
トＢＣ）として与えられたＤＮＡ配列から本質的に成る
オリゴヌクレオチドプローブ，本明細書中において配列
番号：２３（ヒト型結核菌フラグメントＢＣ）として与
えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌクレオチ
ドプローブおよび本明細書中において配列番号：２４
（鳥型結核菌フラグメントＢＣ）として与えられた配列
から本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）
マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形
成しうる上記（ａ）のプローブのフラグメントから成る
オリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）上記（ａ）のプロ
ーブに対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア
核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌ
クレオチドプローブ；並びに（ｄ）前述のいずれかに相
補的であり且つマイコバクテリア核酸に対して選択的に
ハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブか
ら成る群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブで
ある。
中において配列番号：２２（Ｍ．カンサシイフラグメン
トＢＣ）として与えられたＤＮＡ配列から本質的に成る
オリゴヌクレオチドプローブ，本明細書中において配列
番号：２３（ヒト型結核菌フラグメントＢＣ）として与
えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌクレオチ
ドプローブおよび本明細書中において配列番号：２４
（鳥型結核菌フラグメントＢＣ）として与えられた配列
から本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）
マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形
成しうる上記（ａ）のプローブのフラグメントから成る
オリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）上記（ａ）のプロ
ーブに対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア
核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌ
クレオチドプローブ；並びに（ｄ）前述のいずれかに相
補的であり且つマイコバクテリア核酸に対して選択的に
ハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブか
ら成る群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブで
ある。
【０００５】前述の第二の実施態様は、（ａ）本明細書
中において配列番号：１４（ＭＫ１４−Ｃ）として与え
られたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌクレオチド
プローブ；（ｂ）マイコバクテリア核酸に対して選択的
にハイブリッド形成しうるＭＫ１４−Ｃのフラグメント
から成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）ＭＫ１４
に対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア核酸
に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレ
オチドプローブ；および（ｄ）前述のいずれかに相補的
であり且つマイコバクテリア核酸に対して選択的にハイ
ブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブから成
る群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブであ
る。
中において配列番号：１４（ＭＫ１４−Ｃ）として与え
られたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌクレオチド
プローブ；（ｂ）マイコバクテリア核酸に対して選択的
にハイブリッド形成しうるＭＫ１４−Ｃのフラグメント
から成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）ＭＫ１４
に対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア核酸
に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレ
オチドプローブ；および（ｄ）前述のいずれかに相補的
であり且つマイコバクテリア核酸に対して選択的にハイ
ブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブから成
る群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブであ
る。
【０００６】前述の第三の実施態様は、マイコバクテリ
ア・カンサシイ核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブであり、そのオリゴ
ヌクレオチドプローブは、（ａ）本明細書中において配
列番号：１５（ＭＫ１４−Ｄ）として与えられたＤＮＡ
配列から本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブ；
（ｂ）マイコバクテリア・カンサシイ核酸に対して選択
的にハイブリッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントか
ら成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）ＭＫ１４に
対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア・カン
サシイ核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオ
リゴヌクレオチドプローブ；および（ｄ）前述のオリゴ
ヌクレオチドプローブのいずれかに相補的であり且つマ
イコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択
される。
ア・カンサシイ核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブであり、そのオリゴ
ヌクレオチドプローブは、（ａ）本明細書中において配
列番号：１５（ＭＫ１４−Ｄ）として与えられたＤＮＡ
配列から本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブ；
（ｂ）マイコバクテリア・カンサシイ核酸に対して選択
的にハイブリッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントか
ら成るオリゴヌクレオチドプローブ；（ｃ）ＭＫ１４に
対してハイブリッド形成し且つマイコバクテリア・カン
サシイ核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオ
リゴヌクレオチドプローブ；および（ｄ）前述のオリゴ
ヌクレオチドプローブのいずれかに相補的であり且つマ
イコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成
しうるオリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択
される。
【０００７】核酸試料中のマイコバクテリア核酸を検出
する方法を本明細書中において更に開示する。その方法
は、オリゴヌクレオチドプローブを、マイコバクテリア
核酸に対する該オリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイセーションを可能にする条件下で核酸試料に接触さ
せ、そこにおいて、オリゴヌクレオチドプローブは上記
のプローブであり、そして次に、オリゴヌクレオチドプ
ローブが核酸試料に対してハイブリッド形成するか否か
を検出することを含み、オリゴヌクレオチドプローブの
核酸試料に対するハイブリダイセーションは、核酸試料
がマイコバクテリア核酸を含むことを示す。
する方法を本明細書中において更に開示する。その方法
は、オリゴヌクレオチドプローブを、マイコバクテリア
核酸に対する該オリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイセーションを可能にする条件下で核酸試料に接触さ
せ、そこにおいて、オリゴヌクレオチドプローブは上記
のプローブであり、そして次に、オリゴヌクレオチドプ
ローブが核酸試料に対してハイブリッド形成するか否か
を検出することを含み、オリゴヌクレオチドプローブの
核酸試料に対するハイブリダイセーションは、核酸試料
がマイコバクテリア核酸を含むことを示す。
【０００８】本明細書中において更に開示するのは、核
酸試料中のマイコバクテリア核酸を検出するためのキッ
トである。キットは、上記のオリゴヌクレオチドプロー
ブと一緒にハイブリダイセーション溶液を含む。オリゴ
ヌクレオチドプローブは、凍結乾燥するかまたはハイブ
リダイセーション溶液中で保存してよい。
酸試料中のマイコバクテリア核酸を検出するためのキッ
トである。キットは、上記のオリゴヌクレオチドプロー
ブと一緒にハイブリダイセーション溶液を含む。オリゴ
ヌクレオチドプローブは、凍結乾燥するかまたはハイブ
リダイセーション溶液中で保存してよい。
【０００９】核酸試料中の選択されたマイコバクテリア
核酸配列を増幅する方法を本明細書中において更に開示
する。増幅方法は、少なくとも１対のオリゴヌクレオチ
ドプローブを、選択されたマイコバクテリア核酸配列に
対するオリゴヌクレオチドプローブそれぞれのハイブリ
ダイセーションを可能にする条件下で核酸試料に接触さ
せ、そこにおいて、該プローブ対は互いに増幅対を含み
且つ該オリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、（ｉ）
マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形
成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリゴヌクレ
オチドプローブ；（ｉｉ）ＭＫ１４に対してハイブリッ
ド形成し且つマイコバクテリア核酸に対して選択的にハ
イブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブ；お
よび（ｉｉｉ）前述のいずれかに相補的であり且つマイ
コバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成し
うるオリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択さ
れ；そして次に、該選択されたマイコバクテリア標的配
列を増幅することを含む。
核酸配列を増幅する方法を本明細書中において更に開示
する。増幅方法は、少なくとも１対のオリゴヌクレオチ
ドプローブを、選択されたマイコバクテリア核酸配列に
対するオリゴヌクレオチドプローブそれぞれのハイブリ
ダイセーションを可能にする条件下で核酸試料に接触さ
せ、そこにおいて、該プローブ対は互いに増幅対を含み
且つ該オリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、（ｉ）
マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形
成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリゴヌクレ
オチドプローブ；（ｉｉ）ＭＫ１４に対してハイブリッ
ド形成し且つマイコバクテリア核酸に対して選択的にハ
イブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブ；お
よび（ｉｉｉ）前述のいずれかに相補的であり且つマイ
コバクテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成し
うるオリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択さ
れ；そして次に、該選択されたマイコバクテリア標的配
列を増幅することを含む。
【００１０】本発明は、好都合に、種々の異なるマイコ
バクテリア種に対して結合するプローブおよび特定のマ
イコバクテリア種に対して結合するプローブ双方を提供
する。それらの一般用プローブは、マイコバクテリア感
染に関する最初のスクリーンとして有用であり、そして
最初のスクリーンとして現在用いられている６週間程度
の培養を必要とする培養技術に代わる迅速な変法を提供
する。最初のスクリーンで陽性の結果が見出されると、
本明細書中の種特異性プローブは、特定の感染を診断す
る迅速な手段を提供する。
バクテリア種に対して結合するプローブおよび特定のマ
イコバクテリア種に対して結合するプローブ双方を提供
する。それらの一般用プローブは、マイコバクテリア感
染に関する最初のスクリーンとして有用であり、そして
最初のスクリーンとして現在用いられている６週間程度
の培養を必要とする培養技術に代わる迅速な変法を提供
する。最初のスクリーンで陽性の結果が見出されると、
本明細書中の種特異性プローブは、特定の感染を診断す
る迅速な手段を提供する。
【００１１】本明細書中においては、ヌクレオチド配列
を５′〜３′方向に左から右へ一本鎖だけで表わす。本
明細書中で用いられる一文字のヌクレオチド記号は、Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学専門用語委員会（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓ
ｓｉｏｎ）の推薦による当該技術分野でのそれらの標準
的な意味を有する。
を５′〜３′方向に左から右へ一本鎖だけで表わす。本
明細書中で用いられる一文字のヌクレオチド記号は、Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学専門用語委員会（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓ
ｓｉｏｎ）の推薦による当該技術分野でのそれらの標準
的な意味を有する。
【００１２】本明細書中で用いられる「マイコバクテリ
ア」という用語は、好酸性の非運動性桿状細菌に関する
当該技術分野でのその慣用的な意味を有する。一般的に
は、Ｂ．デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ，７２４〜７４２（第３版、１９８０年）を参
照されたい。例として、マイコバクテリアとしては、制
限されないが、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、鳥
型結核菌、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結
核菌−ＢＣＧ，Ｍ．ケロネー（ｃｈｅｌｏｎａｅ）、
Ｍ．フォルツイツム（ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴル
ドネー（ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．イントラセルレア
（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ、
Ｍ．マイクロティ（ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．スクロフラ
セウム（ｓｃｒｏｆｌａｃｅｕｍ）およびヒト型結核菌
がある。
ア」という用語は、好酸性の非運動性桿状細菌に関する
当該技術分野でのその慣用的な意味を有する。一般的に
は、Ｂ．デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ，７２４〜７４２（第３版、１９８０年）を参
照されたい。例として、マイコバクテリアとしては、制
限されないが、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、鳥
型結核菌、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結
核菌−ＢＣＧ，Ｍ．ケロネー（ｃｈｅｌｏｎａｅ）、
Ｍ．フォルツイツム（ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴル
ドネー（ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．イントラセルレア
（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ、
Ｍ．マイクロティ（ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．スクロフラ
セウム（ｓｃｒｏｆｌａｃｅｕｍ）およびヒト型結核菌
がある。
【００１３】本明細書中で用いられる「増幅対」という
用語は、選択されたマイコバクテリア核酸配列を、下記
で更に詳細に説明されるポリメラーゼ連鎖反応、リガー
ゼ連鎖反応または鎖置換増幅などの工程によって増幅す
る場合に一緒に用いるのに適しているように選択された
本発明の１対のオリゴヌクレオチドプローブを意味す
る。
用語は、選択されたマイコバクテリア核酸配列を、下記
で更に詳細に説明されるポリメラーゼ連鎖反応、リガー
ゼ連鎖反応または鎖置換増幅などの工程によって増幅す
る場合に一緒に用いるのに適しているように選択された
本発明の１対のオリゴヌクレオチドプローブを意味す
る。
【００１４】本発明を実施するための核酸（すなわち、
ＤＮＡまたはＲＮＡ）試料は、適当な源のいずれからも
入手することができる。典型的に、核酸試料は、マイコ
バクテリアを有すると疑われる生体液および生体組織の
試料の形で入手する。適当な生体液としては、制限され
ないが、喀痰、気管支洗浄液、胃洗浄液（飲み込まれた
痰を含む）、血液、乳汁およびリンパ液がある。適当な
組織試料としては、制限されないが、皮膚および軟組織
試料がある。マイコバクテリアがヒトおよび動物種双方
に感染している場合、本発明はヒトおよび獣医学診断法
双方に適用しうるし、そして試料をヒトおよび動物種双
方から採取することができる。例えば、ウシ型結核菌は
ウシの結核を引き起こし且つヒトに伝染しうるので、本
発明を用いてウシの感染を診断し且つヒトに伝染させる
ことがあるウシ型結核菌の存在に関して牛乳を検査する
ことができる。もう一つの例は、鳥類（例えば、ニワト
リおよびハト）、更にはブタに感染する鳥型結核菌およ
びＭ．イントラセルレアであり、したがって、本発明を
用いてこのような感染を検出することができる。更に、
ヒトは種々のマイコバクテリアからの感染に感受性であ
り、制限されないが、ヒト型結核菌、Ｍ．カンサシイ、
鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレア（ｉｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｉｒｅ）、Ｍ．スクロフラセウムおよびＭ．フ
ォルツイツムがあり、そして本発明を用いてこのような
感染を検出することができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡ）試料は、適当な源のいずれからも
入手することができる。典型的に、核酸試料は、マイコ
バクテリアを有すると疑われる生体液および生体組織の
試料の形で入手する。適当な生体液としては、制限され
ないが、喀痰、気管支洗浄液、胃洗浄液（飲み込まれた
痰を含む）、血液、乳汁およびリンパ液がある。適当な
組織試料としては、制限されないが、皮膚および軟組織
試料がある。マイコバクテリアがヒトおよび動物種双方
に感染している場合、本発明はヒトおよび獣医学診断法
双方に適用しうるし、そして試料をヒトおよび動物種双
方から採取することができる。例えば、ウシ型結核菌は
ウシの結核を引き起こし且つヒトに伝染しうるので、本
発明を用いてウシの感染を診断し且つヒトに伝染させる
ことがあるウシ型結核菌の存在に関して牛乳を検査する
ことができる。もう一つの例は、鳥類（例えば、ニワト
リおよびハト）、更にはブタに感染する鳥型結核菌およ
びＭ．イントラセルレアであり、したがって、本発明を
用いてこのような感染を検出することができる。更に、
ヒトは種々のマイコバクテリアからの感染に感受性であ
り、制限されないが、ヒト型結核菌、Ｍ．カンサシイ、
鳥型結核菌、Ｍ．イントラセルレア（ｉｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｉｒｅ）、Ｍ．スクロフラセウムおよびＭ．フ
ォルツイツムがあり、そして本発明を用いてこのような
感染を検出することができる。
【００１５】本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、
用いられる特定の検定形式に応じて任意の適当な長さで
あってよい。概して、オリゴヌクレオチドプローブの長
さは少なくとも１０〜１５ヌクレオチドである。例え
ば、マイコバクテリアを検出するのに用いられるオリゴ
ヌクレオチドプローブの長さは１５〜２０ヌクレオチド
であるのが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブは、
下記に詳細に説明されるように、鎖置換増幅プローブの
要素を組込むことができる。オリゴヌクレオチドプロー
ブの増幅対が向けられている核酸配列の長さは５０〜１
５０ヌクレオチドであるのが好ましい。
用いられる特定の検定形式に応じて任意の適当な長さで
あってよい。概して、オリゴヌクレオチドプローブの長
さは少なくとも１０〜１５ヌクレオチドである。例え
ば、マイコバクテリアを検出するのに用いられるオリゴ
ヌクレオチドプローブの長さは１５〜２０ヌクレオチド
であるのが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブは、
下記に詳細に説明されるように、鎖置換増幅プローブの
要素を組込むことができる。オリゴヌクレオチドプロー
ブの増幅対が向けられている核酸配列の長さは５０〜１
５０ヌクレオチドであるのが好ましい。
【００１６】本明細書中において開示された特定の核酸
配列に対してハイブリッド形成する核酸配列に関して、
ハイブリダイセーションは、標準的なハイブリダイセー
ション検定において減少した緊縮、中程度の緊縮または
均一緊縮条件（例えば、プローブの融解温度未満の２０
若しくは３０度の温度で０．５Ｘ ＳＳＣおよび０．１
％ＳＤＳの洗浄緊縮で表わされる条件またはＭＫ１４Ｄ
ＮＡに対するＤＮＡ配列の融解温度未満の１０度の温度
で０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄緊縮で
表わされる均一条件）の条件下で実施することができ
る。Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））
を参照されたい。概して、本明細書中に開示されたＭＫ
１４ＤＮＡに対してハイブリッド形成する核酸配列は、
本明細書中に開示されたＭＫ１４ＤＮＡの配列と少なく
とも６５％相同、７０％相同および７５％またはそれ以
上相同である。
配列に対してハイブリッド形成する核酸配列に関して、
ハイブリダイセーションは、標準的なハイブリダイセー
ション検定において減少した緊縮、中程度の緊縮または
均一緊縮条件（例えば、プローブの融解温度未満の２０
若しくは３０度の温度で０．５Ｘ ＳＳＣおよび０．１
％ＳＤＳの洗浄緊縮で表わされる条件またはＭＫ１４Ｄ
ＮＡに対するＤＮＡ配列の融解温度未満の１０度の温度
で０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄緊縮で
表わされる均一条件）の条件下で実施することができ
る。Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））
を参照されたい。概して、本明細書中に開示されたＭＫ
１４ＤＮＡに対してハイブリッド形成する核酸配列は、
本明細書中に開示されたＭＫ１４ＤＮＡの配列と少なく
とも６５％相同、７０％相同および７５％またはそれ以
上相同である。
【００１７】本発明のプローブは、天然に存在する糖−
リン酸主鎖、更にはホスホロチオエート、ジチオネー
ト、アルキルホスホネートおよびα−ヌクレオチドを含
む修飾主鎖と一緒に用いることができる。修飾糖−リン
酸主鎖は、概して、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびツォ
ー（Ｔ′ｓｏ）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．，２３：２９５（１９８８）およびモラン（Ｍ
ｏｒａｎ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：
５０１９（１９８７）によって例示されている。本発明
のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）かまたはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）から構築することができ、ＤＮＡが好
ましい。
リン酸主鎖、更にはホスホロチオエート、ジチオネー
ト、アルキルホスホネートおよびα−ヌクレオチドを含
む修飾主鎖と一緒に用いることができる。修飾糖−リン
酸主鎖は、概して、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびツォ
ー（Ｔ′ｓｏ）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．，２３：２９５（１９８８）およびモラン（Ｍ
ｏｒａｎ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：
５０１９（１９８７）によって例示されている。本発明
のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）かまたはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）から構築することができ、ＤＮＡが好
ましい。
【００１８】検出法におけるプローブの使用としては、
ノザンブロット（ＲＮＡ検出）、サザンブロット（ＤＮ
Ａ検出）、ウェスタンブロット（タンパク質検出）およ
びドットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）
がある。他の検出法としては、ディップスティック組立
等でのプローブを含むキットがある。
ノザンブロット（ＲＮＡ検出）、サザンブロット（ＤＮ
Ａ検出）、ウェスタンブロット（タンパク質検出）およ
びドットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）
がある。他の検出法としては、ディップスティック組立
等でのプローブを含むキットがある。
【００１９】本発明のプローブを用いることにより形成
されたハイブリッド分子を検出するには、典型的に、検
出可能な標識をプローブの一つに加える。プローブはい
くつかの方法によって標識することができる。プローブ
は放射性標識し且つオートラジオグラフ法によって検出
することができる。オートラジオグラフ法のためのこの
ような標識としては、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ
および３２Ｐがある。典型的に、放射性同位体の選択は
同位体の合成の容易さ、安定性および半減期に関する研
究選択に依存する。他の検出可能な標識としては、リガ
ンド、発蛍光団、化学発光剤、検出器による電気化学、
時間分解蛍光、酵素および抗体がある。例えば、抗体は
リガンドで標識することができる。本発明のプローブと
一緒に用いるための他の検出可能な標識としては、ビオ
チン、放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、補酵素、ルシ
フェリン、常磁性金属、スピン標識および単クローン性
抗体がある。標識の選択は、標識をプローブに結合させ
る方法を指示する。
されたハイブリッド分子を検出するには、典型的に、検
出可能な標識をプローブの一つに加える。プローブはい
くつかの方法によって標識することができる。プローブ
は放射性標識し且つオートラジオグラフ法によって検出
することができる。オートラジオグラフ法のためのこの
ような標識としては、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ
および３２Ｐがある。典型的に、放射性同位体の選択は
同位体の合成の容易さ、安定性および半減期に関する研
究選択に依存する。他の検出可能な標識としては、リガ
ンド、発蛍光団、化学発光剤、検出器による電気化学、
時間分解蛍光、酵素および抗体がある。例えば、抗体は
リガンドで標識することができる。本発明のプローブと
一緒に用いるための他の検出可能な標識としては、ビオ
チン、放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、補酵素、ルシ
フェリン、常磁性金属、スピン標識および単クローン性
抗体がある。標識の選択は、標識をプローブに結合させ
る方法を指示する。
【００２０】放射性ヌクレオチドは、いくつかの手段に
よって本発明のプローブ中に組込むことができる。この
ような手段は二本鎖プローブのニックトランスレーショ
ンを含み、放射性ｄＮＴＰの存在下で大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩまたは他のこのようなＤ
ＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて特定
の挿入断片を有する一本鎖Ｍ１３プラスミドをコピー
し、放射性ｄＮＴＰの存在下において逆転写酵素を用い
てＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを転写し、放射性ｒＮＴＰの
存在下においてＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いてＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターな
どの強プロモーターを含むベクターからＲＮＡを転写
し、ターミナルトランスフェラーゼを用いて放射性ヌク
レオチドでプローブの３′末端をテーリングし、そして
ガンマ３２Ｐ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてプローブの５′末端をリン酸化することによ
る。
よって本発明のプローブ中に組込むことができる。この
ような手段は二本鎖プローブのニックトランスレーショ
ンを含み、放射性ｄＮＴＰの存在下で大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩまたは他のこのようなＤ
ＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて特定
の挿入断片を有する一本鎖Ｍ１３プラスミドをコピー
し、放射性ｄＮＴＰの存在下において逆転写酵素を用い
てＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを転写し、放射性ｒＮＴＰの
存在下においてＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
を用いてＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターな
どの強プロモーターを含むベクターからＲＮＡを転写
し、ターミナルトランスフェラーゼを用いて放射性ヌク
レオチドでプローブの３′末端をテーリングし、そして
ガンマ３２Ｐ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてプローブの５′末端をリン酸化することによ
る。
【００２１】選択された、すなわち標的の核酸配列の増
幅は、適当な手段のいずれによっても実施することがで
きる。概して、Ｄ．クウォー（Ｋｗｏｈ）およびＴ．ク
ウォー、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．，８，
１４〜２５（１９９０）を参照されたい。適当な増幅技
術の例としては、制限されないが、ポリメラーゼ連鎖反
応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写に基づく増幅
（Ｄ．クウォーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３〜１１７７（１９８９）
を参照されたい）、自己持続配列複製（Ｊ．グアテリ
（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４〜１８７８（１９
９０）を参照されたい）およびＱβレプリカーゼシステ
ム（Ｐ．リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７〜１２０２（１９８
８）を参照されたい）がある。
幅は、適当な手段のいずれによっても実施することがで
きる。概して、Ｄ．クウォー（Ｋｗｏｈ）およびＴ．ク
ウォー、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．，８，
１４〜２５（１９９０）を参照されたい。適当な増幅技
術の例としては、制限されないが、ポリメラーゼ連鎖反
応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写に基づく増幅
（Ｄ．クウォーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３〜１１７７（１９８９）
を参照されたい）、自己持続配列複製（Ｊ．グアテリ
（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４〜１８７８（１９
９０）を参照されたい）およびＱβレプリカーゼシステ
ム（Ｐ．リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７〜１２０２（１９８
８）を参照されたい）がある。
【００２２】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は既知の
技法によって実施する。例えば、米国特許第４，６８
３，１９５号明細書；同第４，６８３，２０２号明細
書；同第４，８００，１５９号明細書；および同第４，
９６５，１８８号明細書を参照されたい（本明細書中に
引用した米国特許参考文献全部の開示は参考として本明
細書中に包含される）。概して、ＰＣＲは、最初に、核
酸試料を（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ存在下
において）ハイブリッド形成条件下で検出される特定の
配列の各鎖に関する一つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーで処理し、結果として、各核酸鎖に相補的である各プ
ライマーの伸長生成物を合成し、そのプライマーは特定
の配列の各鎖に対してそれとハイブリッド形成するよう
に十分に相補的であり、その結果、それをその補体から
分離する場合、各プライマーから合成された伸長生成物
は他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型とし
て役立つことができ、そして次に、検出される１種類の
または複数の配列が存在する場合、試料を変性条件下で
処理してプライマー伸長生成物をそれらの鋳型から分離
することを行う。これらの工程は、所望の程度の増幅が
得られるまで循環する。増幅された配列の検出は、反応
生成物に対して、反応生成物にハイブリッド形成しうる
オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴ
ヌクレオチドプローブ）を加え、プローブは検出しうる
標識を有し、そして次に既知の技法によって標識を検出
することによって実施することができる。
技法によって実施する。例えば、米国特許第４，６８
３，１９５号明細書；同第４，６８３，２０２号明細
書；同第４，８００，１５９号明細書；および同第４，
９６５，１８８号明細書を参照されたい（本明細書中に
引用した米国特許参考文献全部の開示は参考として本明
細書中に包含される）。概して、ＰＣＲは、最初に、核
酸試料を（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ存在下
において）ハイブリッド形成条件下で検出される特定の
配列の各鎖に関する一つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーで処理し、結果として、各核酸鎖に相補的である各プ
ライマーの伸長生成物を合成し、そのプライマーは特定
の配列の各鎖に対してそれとハイブリッド形成するよう
に十分に相補的であり、その結果、それをその補体から
分離する場合、各プライマーから合成された伸長生成物
は他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型とし
て役立つことができ、そして次に、検出される１種類の
または複数の配列が存在する場合、試料を変性条件下で
処理してプライマー伸長生成物をそれらの鋳型から分離
することを行う。これらの工程は、所望の程度の増幅が
得られるまで循環する。増幅された配列の検出は、反応
生成物に対して、反応生成物にハイブリッド形成しうる
オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴ
ヌクレオチドプローブ）を加え、プローブは検出しうる
標識を有し、そして次に既知の技法によって標識を検出
することによって実施することができる。
【００２３】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は既知の技法
によって実施する。例えば、Ｒ．ワイス（Ｗｅｉｓ
ｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２９２（１９９１）
を参照されたい。概して、反応は、２対のオリゴヌクレ
オチドプローブを用いて行われ、その一方の対は検出さ
れる配列の一方の鎖に結合し、もう一方の対は検出され
る配列の他方の鎖に結合する。各対は、それが対応する
鎖に互いに完全に重なり合う。反応は、最初に、検出さ
れる配列の鎖を変性（例えば、分離）し、熱安定性リガ
ーゼの存在下での２対のオリゴヌクレオチドプローブと
それらの鎖との反応の結果としてオリゴヌクレオチドプ
ローブの各対を互いに連結させ、次に、反応生成物を分
離した後、配列が所望の程度まで増幅されるまで工程を
周期的に繰返すことによって行われる。次に、検出はＰ
ＣＲに関する上記と同様の方法で行うことができる。
によって実施する。例えば、Ｒ．ワイス（Ｗｅｉｓ
ｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２９２（１９９１）
を参照されたい。概して、反応は、２対のオリゴヌクレ
オチドプローブを用いて行われ、その一方の対は検出さ
れる配列の一方の鎖に結合し、もう一方の対は検出され
る配列の他方の鎖に結合する。各対は、それが対応する
鎖に互いに完全に重なり合う。反応は、最初に、検出さ
れる配列の鎖を変性（例えば、分離）し、熱安定性リガ
ーゼの存在下での２対のオリゴヌクレオチドプローブと
それらの鎖との反応の結果としてオリゴヌクレオチドプ
ローブの各対を互いに連結させ、次に、反応生成物を分
離した後、配列が所望の程度まで増幅されるまで工程を
周期的に繰返すことによって行われる。次に、検出はＰ
ＣＲに関する上記と同様の方法で行うことができる。
【００２４】鎖置換増幅（ＳＤＡ）も既知の技法によっ
て実施する。Ｇ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３
９２〜３９６（１９９２）；Ｇ．ウォーカーら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１〜１６
９６（１９９２）を参照されたい。ＳＤＡは、単一の増
幅プライマーか１対の増幅プライマーを用いて行うこと
ができ、指数的増幅は後者で達成される。概して、ＳＤ
Ａ増幅プライマーは、５′〜３′方向に、フランキング
配列（重要ではないＤＮＡ配列）、反応に用いられた制
限酵素の制限部位並びに増幅および／または検出される
標的配列に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオ
チド配列（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプロー
ブ）を含む。フランキング配列は認識部位に対する制限
酵素の結合を容易にするのに極めて役立ち、好ましく
は、長さが約１５〜２０ヌクレオチドであり；制限部位
はＳＤＡ反応において機能的であり（すなわち、プライ
マー鎖に組込まれたホスホロチオエート結合は引き続き
のニッキングを阻害しない−−非パリンドローム認識部
位の使用によって満足させることができる条件）；オリ
ゴヌクレオチドプローブ部分の長さは、好ましくは、約
１３〜１５ヌクレオチドである。ＳＤＡは、下記のよう
に単一の増幅プライマーを用いて行われる。すなわち、
検出される配列を含む制限フラグメント（好ましくは、
長さ約５０〜約１００ヌクレオチドおよび好ましくは低
ＧＣ含量）を、ＤＮＡ試料を１種類またはそれ以上の制
限酵素で消化することによって製造し、ＳＤＡ増幅プラ
イマーを、制限フラグメントを含む反応混合物に加え、
その結果として制限フラグメントおよび増幅プライマー
間の二重らせんを各末端の５′オーバーハングと一緒に
形成し、増幅プローブ上の制限部位に結合する制限酵素
（例えば、ＨｉｎｃＩＩ）を反応混合物に加え、エキソ
ヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、エキソ
ヌクレアーゼ欠失型の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、
Ｖ．ダービーシャー（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ）、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４０，１９９〜２０１（１９８８）を参照
されたい）を反応混合物に加え、そして３個のｄＮＴＰ
および１個のｄＮＴＰ［αＳ］を反応混合物に加える
が、そのｄＮＴＰ［αＳ］は、ホスホロチオエート結合
が、用いられる特定の制限酵素の制限部位（例えば、制
限酵素がＨｉｎｃＩＩである場合、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ［αＳ］）でプライマー鎖
中に組込まれるように選択される。ＤＮＡポリメラーゼ
はｄＮＴＰを有する二重らせんの３′末端を伸長合成し
て標的鎖の下流補体を生成し、制限酵素は増幅プライマ
ー上の制限部位を切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼは
増幅プライマーの３′末端をニックで伸長合成して、前
に生成された標的鎖の下流補体を置換する。制限酵素は
新規の相補鎖が制限部位から生成されるとそれらを連続
的に切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼは切断された制
限部位から新規の相補鎖を連続的に生成するので、その
工程は本質的に反復する。ＳＤＡは二本鎖標的ＤＮＡ配
列上で１対のプライマーを用いて行うことができ、第二
のプライマーは相補鎖の５′末端に結合するので二組の
反復反応が同時に生じ、一方の組の反応は他方の組の反
応において増幅プライマーの標的として役立つのでその
工程は指数的に進行する。更に、最初にＤＮＡ試料を消
化して制限フラグメントを生成する工程は、ＤＮＡポリ
メラーゼの鎖置換活性を利用することおよびフランキン
グ位置５′で基質に結合する１対の「バンパー」プライ
マーを各増幅プライマーが結合する位置に加えることに
よって削除することができる。各バンパープライマー伸
長生成物は対応する増幅プライマー伸長生成物を置換
し、そして二つの置換した相補的増幅プライマー伸長生
成物は互いに結合して、そのＳＤＡプライマー対と一緒
に指数ＳＤＡの基質として引き続き役立つことがある二
本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する。
て実施する。Ｇ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３
９２〜３９６（１９９２）；Ｇ．ウォーカーら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１〜１６
９６（１９９２）を参照されたい。ＳＤＡは、単一の増
幅プライマーか１対の増幅プライマーを用いて行うこと
ができ、指数的増幅は後者で達成される。概して、ＳＤ
Ａ増幅プライマーは、５′〜３′方向に、フランキング
配列（重要ではないＤＮＡ配列）、反応に用いられた制
限酵素の制限部位並びに増幅および／または検出される
標的配列に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオ
チド配列（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプロー
ブ）を含む。フランキング配列は認識部位に対する制限
酵素の結合を容易にするのに極めて役立ち、好ましく
は、長さが約１５〜２０ヌクレオチドであり；制限部位
はＳＤＡ反応において機能的であり（すなわち、プライ
マー鎖に組込まれたホスホロチオエート結合は引き続き
のニッキングを阻害しない−−非パリンドローム認識部
位の使用によって満足させることができる条件）；オリ
ゴヌクレオチドプローブ部分の長さは、好ましくは、約
１３〜１５ヌクレオチドである。ＳＤＡは、下記のよう
に単一の増幅プライマーを用いて行われる。すなわち、
検出される配列を含む制限フラグメント（好ましくは、
長さ約５０〜約１００ヌクレオチドおよび好ましくは低
ＧＣ含量）を、ＤＮＡ試料を１種類またはそれ以上の制
限酵素で消化することによって製造し、ＳＤＡ増幅プラ
イマーを、制限フラグメントを含む反応混合物に加え、
その結果として制限フラグメントおよび増幅プライマー
間の二重らせんを各末端の５′オーバーハングと一緒に
形成し、増幅プローブ上の制限部位に結合する制限酵素
（例えば、ＨｉｎｃＩＩ）を反応混合物に加え、エキソ
ヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、エキソ
ヌクレアーゼ欠失型の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、
Ｖ．ダービーシャー（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ）、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４０，１９９〜２０１（１９８８）を参照
されたい）を反応混合物に加え、そして３個のｄＮＴＰ
および１個のｄＮＴＰ［αＳ］を反応混合物に加える
が、そのｄＮＴＰ［αＳ］は、ホスホロチオエート結合
が、用いられる特定の制限酵素の制限部位（例えば、制
限酵素がＨｉｎｃＩＩである場合、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰ［αＳ］）でプライマー鎖
中に組込まれるように選択される。ＤＮＡポリメラーゼ
はｄＮＴＰを有する二重らせんの３′末端を伸長合成し
て標的鎖の下流補体を生成し、制限酵素は増幅プライマ
ー上の制限部位を切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼは
増幅プライマーの３′末端をニックで伸長合成して、前
に生成された標的鎖の下流補体を置換する。制限酵素は
新規の相補鎖が制限部位から生成されるとそれらを連続
的に切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼは切断された制
限部位から新規の相補鎖を連続的に生成するので、その
工程は本質的に反復する。ＳＤＡは二本鎖標的ＤＮＡ配
列上で１対のプライマーを用いて行うことができ、第二
のプライマーは相補鎖の５′末端に結合するので二組の
反復反応が同時に生じ、一方の組の反応は他方の組の反
応において増幅プライマーの標的として役立つのでその
工程は指数的に進行する。更に、最初にＤＮＡ試料を消
化して制限フラグメントを生成する工程は、ＤＮＡポリ
メラーゼの鎖置換活性を利用することおよびフランキン
グ位置５′で基質に結合する１対の「バンパー」プライ
マーを各増幅プライマーが結合する位置に加えることに
よって削除することができる。各バンパープライマー伸
長生成物は対応する増幅プライマー伸長生成物を置換
し、そして二つの置換した相補的増幅プライマー伸長生
成物は互いに結合して、そのＳＤＡプライマー対と一緒
に指数ＳＤＡの基質として引き続き役立つことがある二
本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する。
【００２５】ＳＤＡを用いる場合、本発明のオリゴヌク
レオチドプローブを選択して、グアニンにシトシンを加
えた含量が低い、好ましくは、プローブの全ヌクレオチ
ド組成の７０％未満を含むようにするのが好ましい。同
様に、標的配列のＧＣ含量を低くして二次構造の生成を
避ける必要がある。
レオチドプローブを選択して、グアニンにシトシンを加
えた含量が低い、好ましくは、プローブの全ヌクレオチ
ド組成の７０％未満を含むようにするのが好ましい。同
様に、標的配列のＧＣ含量を低くして二次構造の生成を
避ける必要がある。
【００２６】核酸試料中のマイコバクテリア核酸を検出
するためのキットは少なくとも１種類の本発明のプロー
ブと、該プローブおよび核酸試料間のハイブリダイセー
ションを可能にするハイブリダイセーション溶液とを含
み、プローブは溶液中に懸濁しているかまたは凍結乾燥
状態で別個に与えられる。適当なハイブリダイセーショ
ン溶液の一つの例は、６Ｘ ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナト
リウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）、０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５Ｘデンハー
ト溶液［０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）４００型、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリド
ン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン］およびベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ガ
イサーズバーグ、ＭＤ２０８７７ ＵＳＡからカタログ
番号５５６５ＵＡとして商業的に入手可能な、切断さ
れ、変性したサケ精子ＤＮＡの１００μｇ／ｍｌから成
る溶液である。Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３８７〜３８８（１９
８２）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー）を更に参照されたい。キットの成分は一般的な容器
（例えば、フランジを付けうるシールで密封された容
器）中に一緒に包装され、典型的に、キットは本発明の
方法の具体的な実施態様を実施するための取扱い説明書
を含む。用いられる検定形式に応じた追加の任意のキッ
ト成分としては、前記に説明したようなＰＣＲを実施す
るための第一プローブと一緒に用いるのに適した本発明
の第二のプローブ（またはＬＣＲを実施するためのキッ
トの場合、本発明の２対のプローブ）、１種類またはそ
れ以上の検出用プローブおよび検出工程を実施するため
の手段（例えば、検出しうる標識で標識した本発明のプ
ローブおよび場合により検出しうる標識が酵素である場
合の酵素基質）がある。
するためのキットは少なくとも１種類の本発明のプロー
ブと、該プローブおよび核酸試料間のハイブリダイセー
ションを可能にするハイブリダイセーション溶液とを含
み、プローブは溶液中に懸濁しているかまたは凍結乾燥
状態で別個に与えられる。適当なハイブリダイセーショ
ン溶液の一つの例は、６Ｘ ＳＳＣ（０．９Ｍ塩化ナト
リウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）、０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５Ｘデンハー
ト溶液［０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）４００型、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリド
ン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン］およびベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ガ
イサーズバーグ、ＭＤ２０８７７ ＵＳＡからカタログ
番号５５６５ＵＡとして商業的に入手可能な、切断さ
れ、変性したサケ精子ＤＮＡの１００μｇ／ｍｌから成
る溶液である。Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３８７〜３８８（１９
８２）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー）を更に参照されたい。キットの成分は一般的な容器
（例えば、フランジを付けうるシールで密封された容
器）中に一緒に包装され、典型的に、キットは本発明の
方法の具体的な実施態様を実施するための取扱い説明書
を含む。用いられる検定形式に応じた追加の任意のキッ
ト成分としては、前記に説明したようなＰＣＲを実施す
るための第一プローブと一緒に用いるのに適した本発明
の第二のプローブ（またはＬＣＲを実施するためのキッ
トの場合、本発明の２対のプローブ）、１種類またはそ
れ以上の検出用プローブおよび検出工程を実施するため
の手段（例えば、検出しうる標識で標識した本発明のプ
ローブおよび場合により検出しうる標識が酵素である場
合の酵素基質）がある。
【００２７】本発明を下記の実施例で更に詳細に説明す
るが、そこにおいて、「Ｋｂ」はキロベースを意味し、
「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意
味し、「ｐモル」はピコモルを意味し、「μｌ」はマイ
クロリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、
「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ＤＴＴ」はジチオ
トレイトールを意味し、「Ｔｍ」は融解温度を意味し、
そして温度は特に断らない限り摂氏度で与えられる。こ
れらの実施例は単に例示を目的とするものであり，本発
明を制限すると解釈すべきではない。
るが、そこにおいて、「Ｋｂ」はキロベースを意味し、
「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意
味し、「ｐモル」はピコモルを意味し、「μｌ」はマイ
クロリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、
「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ＤＴＴ」はジチオ
トレイトールを意味し、「Ｔｍ」は融解温度を意味し、
そして温度は特に断らない限り摂氏度で与えられる。こ
れらの実施例は単に例示を目的とするものであり，本発
明を制限すると解釈すべきではない。
【００２８】
実施例１菌株およびゲノムＤＮＡ調製試料 本明細書中に記載した実施例で用いたマイコバクテリア
は、Ｍ．アフリカヌムＬＣＤＣ５０１、鳥型結核菌 Ａ
ＴＣＣ２５２９１、ウシ型結核菌 ＣＤＣ４、ウシ型結
核菌−ＢＣＧ ＣＤＣ３４、Ｍ．ケロネー ＴＭＣ１５
４３、Ｍ．フォルツイツム ＴＭＣ１５２９、Ｍ．ゴル
ドネー ＴＭＣ１３１８、Ｍ．イントラセルレア ＡＴ
ＣＣ１３９５０、Ｍ．カンサシイ ＴＭＣ１２０１、
Ｍ．マイクロティ ＬＣＤＣ２０１、Ｍ．スクロフラセ
ウム ＣＤＣ７８およびヒト型結核菌 ＡＴＣＣ２７２
９４であった。用いた非マイコバクテリアは、百日咳菌
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ） ＡＴ
ＣＣ８４６７、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ） ＡＴＣＣ４４８０８、ジフテリ
ア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ） ＡＴＣＣ１１９１３、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＡＴＣＣ１１７７５、フ
ラボバクテリウム・メニンギセプティクム（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｉｓｅｐｔｉｃｕ
ｍ） ＡＴＣＣ１３２５３、ノカルジア・アステロイデ
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＡＴ
ＣＣ３３０８、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） ＡＴＣＣ１
３８０８、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ） ＡＴＣＣ６３０３、アデノウ
イルス・シグマ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｓｉｇｍａ）
Ｄ３３９０（アドウイルス（Ａｄｖｉｒｕｓ））、真
核生物ＤＮＡマッコイ（ＭｃＣｏｙ）細胞（ｅｕｋＤＮ
Ａ）であった。遅増殖性マイコバクテリアは、Ｍ．アフ
リカヌム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌−
ＢＣＧ、Ｍ．イントラセルレア、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．
マイクロティ、Ｍ．スクロフラセウムおよびヒト型結核
菌である。速増殖性マイコバクテリアは、Ｍ．ケロネ
ー、Ｍ．フォルツイツムおよびＭ．ゴルドネーである。
マイコバクテリア菌株全部をＢＡＣＴＥＣバイアル中で
培養した後、７０℃で４時間加熱殺菌した。ゲノムＤＮ
Ａを既知の技法によって単離した。Ｓ．ヴィスバナザン
（Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎ）ら、種々の細菌からＤＮ
Ａを単離する簡単な酵素法（Ｓｉｍｐｌｅ Ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ），Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１
０，５９〜６４（１９８９）を参照されたい。非マイコ
バクテリア菌株をルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン中で培
養し、そしてゲノムＤＮＡをＣＴＡＢミニ−プレプ法に
よって単離した。例えば、Ｆ．アスベル（Ａｓｕｂｅ
ｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）を参
照されたい。
は、Ｍ．アフリカヌムＬＣＤＣ５０１、鳥型結核菌 Ａ
ＴＣＣ２５２９１、ウシ型結核菌 ＣＤＣ４、ウシ型結
核菌−ＢＣＧ ＣＤＣ３４、Ｍ．ケロネー ＴＭＣ１５
４３、Ｍ．フォルツイツム ＴＭＣ１５２９、Ｍ．ゴル
ドネー ＴＭＣ１３１８、Ｍ．イントラセルレア ＡＴ
ＣＣ１３９５０、Ｍ．カンサシイ ＴＭＣ１２０１、
Ｍ．マイクロティ ＬＣＤＣ２０１、Ｍ．スクロフラセ
ウム ＣＤＣ７８およびヒト型結核菌 ＡＴＣＣ２７２
９４であった。用いた非マイコバクテリアは、百日咳菌
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ） ＡＴ
ＣＣ８４６７、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ） ＡＴＣＣ４４８０８、ジフテリ
ア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ） ＡＴＣＣ１１９１３、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＡＴＣＣ１１７７５、フ
ラボバクテリウム・メニンギセプティクム（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｉｓｅｐｔｉｃｕ
ｍ） ＡＴＣＣ１３２５３、ノカルジア・アステロイデ
ス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＡＴ
ＣＣ３３０８、ロドコッカス・ロドクラス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） ＡＴＣＣ１
３８０８、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ） ＡＴＣＣ６３０３、アデノウ
イルス・シグマ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｓｉｇｍａ）
Ｄ３３９０（アドウイルス（Ａｄｖｉｒｕｓ））、真
核生物ＤＮＡマッコイ（ＭｃＣｏｙ）細胞（ｅｕｋＤＮ
Ａ）であった。遅増殖性マイコバクテリアは、Ｍ．アフ
リカヌム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌−
ＢＣＧ、Ｍ．イントラセルレア、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．
マイクロティ、Ｍ．スクロフラセウムおよびヒト型結核
菌である。速増殖性マイコバクテリアは、Ｍ．ケロネ
ー、Ｍ．フォルツイツムおよびＭ．ゴルドネーである。
マイコバクテリア菌株全部をＢＡＣＴＥＣバイアル中で
培養した後、７０℃で４時間加熱殺菌した。ゲノムＤＮ
Ａを既知の技法によって単離した。Ｓ．ヴィスバナザン
（Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎ）ら、種々の細菌からＤＮ
Ａを単離する簡単な酵素法（Ｓｉｍｐｌｅ Ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ），Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１
０，５９〜６４（１９８９）を参照されたい。非マイコ
バクテリア菌株をルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン中で培
養し、そしてゲノムＤＮＡをＣＴＡＢミニ−プレプ法に
よって単離した。例えば、Ｆ．アスベル（Ａｓｕｂｅ
ｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）を参
照されたい。
【００２９】実施例２Ｍ．カンサシイライブラリー Ｍ．カンサシイゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（ギブコ
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））で切断した。フラグメント寸
法は１．４Ｋｂ〜＜２００ｂｐであった。ベクターであ
るブルースクリプト（ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）ＳＫ＋
（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をＢａｍ
ＨＩ（ギブコ ＢＲＬ）で消化した後、ウシの腸由来の
アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（ベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））
を用いてホスファターゼ処理した。挿入断片７５０ｎｇ
を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ギブコ ＢＲＬ）１単位／１０μｌ
中においてベクター２０ｎｇに連結させた。連結反応は
１５℃で一晩中インキュベートした後、コンピテントＪ
Ｍ１０９細胞（ストラタジーン）中を形質転換した。１
０００の独立単離物が得られた。
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））で切断した。フラグメント寸
法は１．４Ｋｂ〜＜２００ｂｐであった。ベクターであ
るブルースクリプト（ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）ＳＫ＋
（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をＢａｍ
ＨＩ（ギブコ ＢＲＬ）で消化した後、ウシの腸由来の
アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（ベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））
を用いてホスファターゼ処理した。挿入断片７５０ｎｇ
を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ギブコ ＢＲＬ）１単位／１０μｌ
中においてベクター２０ｎｇに連結させた。連結反応は
１５℃で一晩中インキュベートした後、コンピテントＪ
Ｍ１０９細胞（ストラタジーン）中を形質転換した。１
０００の独立単離物が得られた。
【００３０】実施例３クローンＭＫ１４の識別および配列決定 前記の実施例２で生じた１０００のクローンから、種々
のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリアＤＮＡか
ら成るゲノムブロットをスクリーンするのに１５クロー
ンを選択した。１５クローンの内、ＭＫ１４（配列番
号：１）は全部のマイコバクテリアにハイブリッド形成
し、そして試験されたいずれの非マイコバクテリアにも
クロスハイブリッド形成しないことが分かった。
のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリアＤＮＡか
ら成るゲノムブロットをスクリーンするのに１５クロー
ンを選択した。１５クローンの内、ＭＫ１４（配列番
号：１）は全部のマイコバクテリアにハイブリッド形成
し、そして試験されたいずれの非マイコバクテリアにも
クロスハイブリッド形成しないことが分かった。
【００３１】ＭＫ１４を、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅ
ｎａｓｅ）変型２．０キット（ユナイテッド・ステーツ
・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いて［α−３５Ｓ］−
デオキシアデノシン三リン酸（ＮＥＮ−デュポン（Ｄｕ
Ｐｏｎｔ））で配列決定した。ＭＫ１４を、更に、製造
業者によって示唆されたように染料プライマーキットを
用いるアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ ＤＮＡシークエン
サーを用いて配列決定した。
ｎａｓｅ）変型２．０キット（ユナイテッド・ステーツ
・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いて［α−３５Ｓ］−
デオキシアデノシン三リン酸（ＮＥＮ−デュポン（Ｄｕ
Ｐｏｎｔ））で配列決定した。ＭＫ１４を、更に、製造
業者によって示唆されたように染料プライマーキットを
用いるアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ ＤＮＡシークエン
サーを用いて配列決定した。
【００３２】実施例４オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチド（オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ））を、製
造業者によって示唆されたようにアプライド・バイオシ
ステムズ３８０Ｂシンセサイザーで合成した。オリゴを
５０℃で脱ブロックした後、製造業者によって示唆され
たようにオリゴヌクレオチド・ピュアリフィケーション
・カートリッジ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）によっ
て精製した。オリゴヌクレオチドの名称および配列を表
１に記載する。
造業者によって示唆されたようにアプライド・バイオシ
ステムズ３８０Ｂシンセサイザーで合成した。オリゴを
５０℃で脱ブロックした後、製造業者によって示唆され
たようにオリゴヌクレオチド・ピュアリフィケーション
・カートリッジ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）によっ
て精製した。オリゴヌクレオチドの名称および配列を表
１に記載する。
【００３３】
【表１】 オリゴヌクレオチド１４−３（配列番号：２）に関し
て、ＭＫ１４（配列番号：１）の９８位に対応する位置
のＴは、このプローブの合成がより初期の配列情報に基
づいていたので不存在であったことに注目されたい。こ
の変化は、このオリゴヌクレオチドで合成されたＭＫ１
４フラグメント（下記で論及される）中に組込まれる
が、悪影響は見られなかった。
て、ＭＫ１４（配列番号：１）の９８位に対応する位置
のＴは、このプローブの合成がより初期の配列情報に基
づいていたので不存在であったことに注目されたい。こ
の変化は、このオリゴヌクレオチドで合成されたＭＫ１
４フラグメント（下記で論及される）中に組込まれる
が、悪影響は見られなかった。
【００３４】実施例５ポリメラーゼ連鎖反応によるＭＫ１４フラグメントＡ〜
Ｅの製造 クローンＭＫ１４を、前記の実施例４で記載した鋳型お
よびオリゴヌクレオチドプライマーとしてプラスミドＭ
Ｋ１４を図１に示したパターンで用いるポリメラーゼ連
鎖反応によってＡ〜Ｅと称する５個のより小型のフラグ
メントに分割した。
Ｅの製造 クローンＭＫ１４を、前記の実施例４で記載した鋳型お
よびオリゴヌクレオチドプライマーとしてプラスミドＭ
Ｋ１４を図１に示したパターンで用いるポリメラーゼ連
鎖反応によってＡ〜Ｅと称する５個のより小型のフラグ
メントに分割した。
【００３５】ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５
ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２００
μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、各プライマー
１．０μＭ、鋳型としてのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ／１
００μｌまたは鋳型としてのプラスミドＤＮＡ５０ｎｇ
／１００μｌから成る反応２５〜１００μｌ中で行われ
た。反応に鉱油を重層し９５℃で５分間加熱した。Ａｍ
ｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シー
タス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｃｅｔｕｓ））２．
５単位／１００μｌを加え、循環を開始した。典型的に
は、試料を９４℃で１分３０秒間、３７〜５０℃で２分
間、７２℃で３分間２５〜３０サイクルインキュベート
した。これを次に７２℃で７分間インキュベートした
後、４℃で貯蔵した。
リス−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５
ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２００
μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、各プライマー
１．０μＭ、鋳型としてのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ／１
００μｌまたは鋳型としてのプラスミドＤＮＡ５０ｎｇ
／１００μｌから成る反応２５〜１００μｌ中で行われ
た。反応に鉱油を重層し９５℃で５分間加熱した。Ａｍ
ｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シー
タス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｃｅｔｕｓ））２．
５単位／１００μｌを加え、循環を開始した。典型的に
は、試料を９４℃で１分３０秒間、３７〜５０℃で２分
間、７２℃で３分間２５〜３０サイクルインキュベート
した。これを次に７２℃で７分間インキュベートした
後、４℃で貯蔵した。
【００３６】フラグメントＡ（配列番号：１２）はＭＫ
１４のヌクレオチド５〜９５から成り；フラグメントＢ
（配列番号：１３）はＭＫ１４のヌクレオチド９６〜２
０２から成り（前記の実施例４の注釈に注目された
い）；フラグメントＣ（配列番号：１４）はＭＫ１４の
ヌクレオチド２０３〜３３７から成り；フラグメントＤ
（配列番号：１５）はＭＫ１４のヌクレオチド３３８〜
４２９から成り；そしてフラグメントＥ（配列番号：１
６）はＭＫ１４のヌクレオチド４３０〜５２７から成っ
た。
１４のヌクレオチド５〜９５から成り；フラグメントＢ
（配列番号：１３）はＭＫ１４のヌクレオチド９６〜２
０２から成り（前記の実施例４の注釈に注目された
い）；フラグメントＣ（配列番号：１４）はＭＫ１４の
ヌクレオチド２０３〜３３７から成り；フラグメントＤ
（配列番号：１５）はＭＫ１４のヌクレオチド３３８〜
４２９から成り；そしてフラグメントＥ（配列番号：１
６）はＭＫ１４のヌクレオチド４３０〜５２７から成っ
た。
【００３７】実施例６ゲノムサザンブロット分析によって決定されるＭＫ１４
フラグメントＡ〜Ｅのハイブリダイセーションパターン 前記の実施例５で製造したＭＫ１４フラグメントＡ〜Ｅ
を、種々のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリア
由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析用のプローブ
として用いた。全部のフラグメントが独特のハイブリダ
イセーションパターンを生じた。フラグメントＣ（ＭＫ
１４−Ｃ）（配列番号：１４）は強い属特異性を示した
が（図２）、フラグメントＤ（ＭＫ１４−Ｄ）（配列番
号：１５）は強いＭ．カンサシイ特異性を示した（図
３）。フラグメントＡ（ＭＫ１４−Ａ）（配列番号：１
２）は試験されたマイコバクテリアの全種に対してハイ
ブリッド形成したが、少数の非マイコバクテリア種に対
して交差反応した。フラグメントＢ（ＭＫ１４−Ｂ）
（配列番号：１３）はＭ．カンサシイに対して強くハイ
ブリッド形成し、ＴＢ複合生物に対して弱くハイブリッ
ド形成し、そして試験された非マイコバクテリア種に対
する交差反応性を示さなかった。フラグメントＥ（ＭＫ
１４−Ｅ）（配列番号：１６）は、ウシ型結核菌、Ｍ．
ゴルドネー、Ｍ．イントラセルレアおよびＭ．カンサシ
イに対して十分にハイブリッド形成し、試験された他の
マイコバクテリア種に対してはハイブリッド形成しなか
ったし、そして試験された非マイコバクテリア種に対す
る交差反応性を示さなかった。
フラグメントＡ〜Ｅのハイブリダイセーションパターン 前記の実施例５で製造したＭＫ１４フラグメントＡ〜Ｅ
を、種々のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリア
由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析用のプローブ
として用いた。全部のフラグメントが独特のハイブリダ
イセーションパターンを生じた。フラグメントＣ（ＭＫ
１４−Ｃ）（配列番号：１４）は強い属特異性を示した
が（図２）、フラグメントＤ（ＭＫ１４−Ｄ）（配列番
号：１５）は強いＭ．カンサシイ特異性を示した（図
３）。フラグメントＡ（ＭＫ１４−Ａ）（配列番号：１
２）は試験されたマイコバクテリアの全種に対してハイ
ブリッド形成したが、少数の非マイコバクテリア種に対
して交差反応した。フラグメントＢ（ＭＫ１４−Ｂ）
（配列番号：１３）はＭ．カンサシイに対して強くハイ
ブリッド形成し、ＴＢ複合生物に対して弱くハイブリッ
ド形成し、そして試験された非マイコバクテリア種に対
する交差反応性を示さなかった。フラグメントＥ（ＭＫ
１４−Ｅ）（配列番号：１６）は、ウシ型結核菌、Ｍ．
ゴルドネー、Ｍ．イントラセルレアおよびＭ．カンサシ
イに対して十分にハイブリッド形成し、試験された他の
マイコバクテリア種に対してはハイブリッド形成しなか
ったし、そして試験された非マイコバクテリア種に対す
る交差反応性を示さなかった。
【００３８】サザンブロット分析に関して、ゲノムＤＮ
ＡをＰｓｔＩ（ギブコ ＢＲＬ）で消化した。反応を
０．８％アガロースゲル上で分離した後、ナイロン膜
（ギブコＢＲＬ ナイロン−１またはＮＥＮ−デュポン
ジーン・スクリーン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ））に
転写した。Ｊ．サムブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（第２版、１９８９年）（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー）を参照されたい。次に、フィル
ターを紫外線架橋し（ストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａ
ｌｉｎｋｅｒ））且つハイブリッド形成した（ギブコ
ＢＲＬ）（サムブルックら）。プローブを、［α−３２
Ｐ］−デオキシアデノシン三リン酸および［α−
３２Ｐ］−デオキシシチジン三リン酸（ＮＥＮ−デュポ
ン）を用いるランダムプライマー（ベーリンガー・マン
ハイム・バイオケミカルズ）によって標識した。ブロッ
トを、予測されたＴｍより低い−２５℃〜−１０℃で洗
浄した（サムブルックら）。フィルターをＸＡＲ−５フ
ィルムに１〜７日間感光させた。
ＡをＰｓｔＩ（ギブコ ＢＲＬ）で消化した。反応を
０．８％アガロースゲル上で分離した後、ナイロン膜
（ギブコＢＲＬ ナイロン−１またはＮＥＮ−デュポン
ジーン・スクリーン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ））に
転写した。Ｊ．サムブルックら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（第２版、１９８９年）（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー）を参照されたい。次に、フィル
ターを紫外線架橋し（ストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａ
ｌｉｎｋｅｒ））且つハイブリッド形成した（ギブコ
ＢＲＬ）（サムブルックら）。プローブを、［α−３２
Ｐ］−デオキシアデノシン三リン酸および［α−
３２Ｐ］−デオキシシチジン三リン酸（ＮＥＮ−デュポ
ン）を用いるランダムプライマー（ベーリンガー・マン
ハイム・バイオケミカルズ）によって標識した。ブロッ
トを、予測されたＴｍより低い−２５℃〜−１０℃で洗
浄した（サムブルックら）。フィルターをＸＡＲ−５フ
ィルムに１〜７日間感光させた。
【００３９】実施例７ゲノムサザンブロット分析によって決定されるＭＫ１４
フラグメントＣ１およびＣ２のハイブリダイセーション
パターン フラグメントＭＫ１４−Ｃを前記に記載のＰＣＲ増幅に
よって二つのより小型のフラグメントに分割し、オリゴ
ヌクレオチドＭＫ１４−１３（ＴＡＧ ＴＡＴＣＧＡ
ＣＴＧ ＣＧＴ）（配列番号：１７）およびＭＫ１４−
１４（ＴＣＴＴＧＣ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＧ）（配列
番号：１８）を用いて並びにオリゴヌクレオチドＭＫ１
４−１５（ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧＡ）
（配列番号：１９）およびＭＫ１４−１０（配列番号：
９）を用いてそれぞれフラグメントＭＫ１４−Ｃ１（配
列番号：２０）およびフラグメントＭＫ１４−Ｃ２（配
列番号：２１）を生じた。ＭＫ１４−Ｃ１は遅増殖性マ
イコバクテリア全部に対してハイブリッド形成したが、
しかしながら、それはＭ．フォルツイツムおよびＭ．ゴ
ルドネーに対してはハイブリッド形成しなかった。フラ
グメントＭＫ１４−Ｃ２は試験されたマイコバクテリア
全部に対してハイブリッド形成し、そして試験された非
マイコバクテリアＤＮＡに対してクロスハイブリッド形
成しなかった。
フラグメントＣ１およびＣ２のハイブリダイセーション
パターン フラグメントＭＫ１４−Ｃを前記に記載のＰＣＲ増幅に
よって二つのより小型のフラグメントに分割し、オリゴ
ヌクレオチドＭＫ１４−１３（ＴＡＧ ＴＡＴＣＧＡ
ＣＴＧ ＣＧＴ）（配列番号：１７）およびＭＫ１４−
１４（ＴＣＴＴＧＣ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＧ）（配列
番号：１８）を用いて並びにオリゴヌクレオチドＭＫ１
４−１５（ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧＡ）
（配列番号：１９）およびＭＫ１４−１０（配列番号：
９）を用いてそれぞれフラグメントＭＫ１４−Ｃ１（配
列番号：２０）およびフラグメントＭＫ１４−Ｃ２（配
列番号：２１）を生じた。ＭＫ１４−Ｃ１は遅増殖性マ
イコバクテリア全部に対してハイブリッド形成したが、
しかしながら、それはＭ．フォルツイツムおよびＭ．ゴ
ルドネーに対してはハイブリッド形成しなかった。フラ
グメントＭＫ１４−Ｃ２は試験されたマイコバクテリア
全部に対してハイブリッド形成し、そして試験された非
マイコバクテリアＤＮＡに対してクロスハイブリッド形
成しなかった。
【００４０】実施例８フラグメントＭＫ１４−ＣのＰＣＲ分析 ＭＫ１４−ＣをＰＣＲ分析によって更に分析した。多数
のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリアＤＮＡを
鋳型として用いる、オリゴ１４−３（配列番号：２）お
よび１４−１０（配列番号：９）を含むＰＣＲ増幅反応
は、最もよい属特異性を示した（図４）。これらのオリ
ゴはフラグメントＢおよびＣを含む２４２ｂｐの生成物
を増幅する（図１）（配列番号：２２）。試験された遅
増殖性マイコバクテリア全部において正しい寸法の生成
物が存在した。速増殖性マイコバクテリアであるＭ．ケ
ロネー、Ｍ．フォルツイツムおよびＭ．ゴルドネーは、
臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上の２４２ｂ
ｐバンドを示さなかった。増幅された生成物の内部領域
に対する特定のプローブは、臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル上で視覚化されないことがある特定の生
成物のみを示す。それは、更に、遅増殖性マイコバクテ
リアにおいて見られた２４２ｂｐの生成物が実際にＭＫ
１４−Ｃ様生成物であることを証明する。
のマイコバクテリアおよび非マイコバクテリアＤＮＡを
鋳型として用いる、オリゴ１４−３（配列番号：２）お
よび１４−１０（配列番号：９）を含むＰＣＲ増幅反応
は、最もよい属特異性を示した（図４）。これらのオリ
ゴはフラグメントＢおよびＣを含む２４２ｂｐの生成物
を増幅する（図１）（配列番号：２２）。試験された遅
増殖性マイコバクテリア全部において正しい寸法の生成
物が存在した。速増殖性マイコバクテリアであるＭ．ケ
ロネー、Ｍ．フォルツイツムおよびＭ．ゴルドネーは、
臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上の２４２ｂ
ｐバンドを示さなかった。増幅された生成物の内部領域
に対する特定のプローブは、臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル上で視覚化されないことがある特定の生
成物のみを示す。それは、更に、遅増殖性マイコバクテ
リアにおいて見られた２４２ｂｐの生成物が実際にＭＫ
１４−Ｃ様生成物であることを証明する。
【００４１】サザンブロットは、ＭＫ１４−Ｃをプロー
ブとして用いるこれらのＰＣＲ増幅反応で行った。ＰＣ
Ｒサザンブロットは、ＰＣＲ反応５μｌを１．０％アガ
ロースゲル上で分離したことを除き、前記のゲノムサザ
ンブロットと同じ方法で行った。プローブは遅増殖性マ
イコバクテリア全部およびＭ．ゴルドネーに対してハイ
ブリッド形成した。それは、Ｍ．ケロネー、Ｍ．フォル
ツイツム、大腸菌、百日咳菌、Ｎ．アステロイデス、
Ｒ．ロドクラスまたは真核生物ＤＮＡに対してハイブリ
ッド形成しなかった（図５）。
ブとして用いるこれらのＰＣＲ増幅反応で行った。ＰＣ
Ｒサザンブロットは、ＰＣＲ反応５μｌを１．０％アガ
ロースゲル上で分離したことを除き、前記のゲノムサザ
ンブロットと同じ方法で行った。プローブは遅増殖性マ
イコバクテリア全部およびＭ．ゴルドネーに対してハイ
ブリッド形成した。それは、Ｍ．ケロネー、Ｍ．フォル
ツイツム、大腸菌、百日咳菌、Ｎ．アステロイデス、
Ｒ．ロドクラスまたは真核生物ＤＮＡに対してハイブリ
ッド形成しなかった（図５）。
【００４２】実施例９トリ型結核菌およびヒト型結核菌からのＭＫ１４フラグ
メントＢおよびＣのサブクローニング 全部のマイコバクテリアを増幅するオリゴヌクレオチド
の選択は、ＭＫ１４−Ｃ ＤＮＡ配列が異なる種の中で
どの程度相同であるかということに依存する。したがっ
て、それを決定して、２種類の追加の種の鳥型結核菌お
よびヒト型結核菌からの類似のＤＮＡの配列決定を行っ
た。次に、新規の配列とＭ．カンサシイ配列との比較を
もちいて具体的なオリゴヌクレオチドを設計することが
できた。ＰＣＲ増幅反応は、オリゴ１４−３（配列番
号：２）および１４−１０（配列番号：９）を用い、鳥
型結核菌、ヒト型結核菌およびＭ．カンサシイのゲノム
ＤＮＡを鋳型として用いて行った。２４２ｂｐの生成物
を低融点（Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ）アガ
ロース（ギブコＢＲＬ）によって単離した。次に、それ
らを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、０．
５ｍＭ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ（スト
ラタジーン）１０単位／２０μｌ中において３７℃で３
０分間キナーゼ処理した。ベクターであるブルースクリ
プトＳＫ＋をＨｉｎｃＩＩ（ギブコＢＲＬ）で消化した
後、ＣＩＡＰ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ）でホスファターゼ処理した。３対１の比率で挿
入断片およびベクターを１５℃で一晩中連結反応させ
た。それぞれのサブクローンを前記のように配列決定し
た。
メントＢおよびＣのサブクローニング 全部のマイコバクテリアを増幅するオリゴヌクレオチド
の選択は、ＭＫ１４−Ｃ ＤＮＡ配列が異なる種の中で
どの程度相同であるかということに依存する。したがっ
て、それを決定して、２種類の追加の種の鳥型結核菌お
よびヒト型結核菌からの類似のＤＮＡの配列決定を行っ
た。次に、新規の配列とＭ．カンサシイ配列との比較を
もちいて具体的なオリゴヌクレオチドを設計することが
できた。ＰＣＲ増幅反応は、オリゴ１４−３（配列番
号：２）および１４−１０（配列番号：９）を用い、鳥
型結核菌、ヒト型結核菌およびＭ．カンサシイのゲノム
ＤＮＡを鋳型として用いて行った。２４２ｂｐの生成物
を低融点（Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ）アガ
ロース（ギブコＢＲＬ）によって単離した。次に、それ
らを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、０．
５ｍＭ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ（スト
ラタジーン）１０単位／２０μｌ中において３７℃で３
０分間キナーゼ処理した。ベクターであるブルースクリ
プトＳＫ＋をＨｉｎｃＩＩ（ギブコＢＲＬ）で消化した
後、ＣＩＡＰ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ）でホスファターゼ処理した。３対１の比率で挿
入断片およびベクターを１５℃で一晩中連結反応させ
た。それぞれのサブクローンを前記のように配列決定し
た。
【００４３】Ｍ．カンサシイフラグメントＢＣ（配列番
号：２２）と、ヒト型結核菌フラグメントＢＣ（配列番
号：２３）または鳥型結核菌フラグメントＢＣ（配列番
号：２４）とを比較したところ、相同性はそれぞれ７９
％および８０％である。鳥型結核菌をヒト型結核菌と比
較した場合でも、相同性は７６％である。３種類全部を
並列させた場合、相同性は６９％である。
号：２２）と、ヒト型結核菌フラグメントＢＣ（配列番
号：２３）または鳥型結核菌フラグメントＢＣ（配列番
号：２４）とを比較したところ、相同性はそれぞれ７９
％および８０％である。鳥型結核菌をヒト型結核菌と比
較した場合でも、相同性は７６％である。３種類全部を
並列させた場合、相同性は６９％である。
【００４４】実施例１０オリゴ１４−２３および１４−１５を用いるプライマー
拡張によるＰＣＲ増幅反応のスクリーニング 同一セットのＰＣＲ増幅反応の特異性を、オリゴ１４−
２３（図４）を用いるプライマー伸長によってスクリー
ンした。オリゴ１４−２３（ＣＴＡ ＧＴＧＡＡＴ Ｇ
ＧＧ Ａ）（配列番号：２５）を、前記の配列相同性情
報を用いて設計した。結果は、サザンブロットと同一の
特異性を示した（データは示されていない）。様々な強
さのバンドについてはオリゴ配列で説明することができ
る。オリゴ配列はヒト型結核菌およびＭ．カンサシイに
おいて同一であるが、しかしながら、鳥型結核菌におい
ては誤対合が一つ存在する。
拡張によるＰＣＲ増幅反応のスクリーニング 同一セットのＰＣＲ増幅反応の特異性を、オリゴ１４−
２３（図４）を用いるプライマー伸長によってスクリー
ンした。オリゴ１４−２３（ＣＴＡ ＧＴＧＡＡＴ Ｇ
ＧＧ Ａ）（配列番号：２５）を、前記の配列相同性情
報を用いて設計した。結果は、サザンブロットと同一の
特異性を示した（データは示されていない）。様々な強
さのバンドについてはオリゴ配列で説明することができ
る。オリゴ配列はヒト型結核菌およびＭ．カンサシイに
おいて同一であるが、しかしながら、鳥型結核菌におい
ては誤対合が一つ存在する。
【００４５】プライマー伸長に関して、オリゴヌクレオ
チド１４−２３の２ピコモルを１ＸＲＥａｃｔ１（ＢＲ
Ｌ）中において［ｇ−３２Ｐ］−アデノシン三リン酸
（ＮＥＮ−デュポン）４．６ピコモルおよびポリヌクレ
オチドキナーゼ（ストラタジーン）１単位／μｌでキナ
ーゼ処理した。反応を３７℃で３０分間インキュベート
した後、６５℃まで１０分間加熱した。次に、反応をＴ
Ｅ（１０ｍＭトリス／８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２
Ｘの容量まで希釈した。プライマー伸長反応に関して、
ＰＣＲ反応５μｌを１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（パーキン・エ
ルマー・シータス）、０．１２５ｍＭ ｄＮＴＰおよび
標識プライマー０．０５ピコモル／１０μｌ中で１０μ
ｌまで希釈した。反応を９５℃まで１０分間加熱した
後、室温まで冷却した。クレノウラージフラグメント
（Ｋｌｅｎｏｗ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｂ
ＲＬ）１．５単位を加え、そして試料を３７℃で１０分
間インキュベートした。停止溶液（ＵＳＢ）を加え、そ
して試料を９５℃まで５分間過熱した後に８％アクリル
アミド変性ゲル上で分離した。次に、ゲルをＸＡＲフィ
ルムに２〜１６時間感光させた。
チド１４−２３の２ピコモルを１ＸＲＥａｃｔ１（ＢＲ
Ｌ）中において［ｇ−３２Ｐ］−アデノシン三リン酸
（ＮＥＮ−デュポン）４．６ピコモルおよびポリヌクレ
オチドキナーゼ（ストラタジーン）１単位／μｌでキナ
ーゼ処理した。反応を３７℃で３０分間インキュベート
した後、６５℃まで１０分間加熱した。次に、反応をＴ
Ｅ（１０ｍＭトリス／８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２
Ｘの容量まで希釈した。プライマー伸長反応に関して、
ＰＣＲ反応５μｌを１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（パーキン・エ
ルマー・シータス）、０．１２５ｍＭ ｄＮＴＰおよび
標識プライマー０．０５ピコモル／１０μｌ中で１０μ
ｌまで希釈した。反応を９５℃まで１０分間加熱した
後、室温まで冷却した。クレノウラージフラグメント
（Ｋｌｅｎｏｗ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｂ
ＲＬ）１．５単位を加え、そして試料を３７℃で１０分
間インキュベートした。停止溶液（ＵＳＢ）を加え、そ
して試料を９５℃まで５分間過熱した後に８％アクリル
アミド変性ゲル上で分離した。次に、ゲルをＸＡＲフィ
ルムに２〜１６時間感光させた。
【００４６】もう一つのプライマー伸長反応は、同一の
ＰＣＲで増幅した生成物でオリゴ１４−１５（配列番
号：１６）を用いて行った。このオリゴは、Ｍ．カンサ
シイ、ヒト型結核菌および鳥型結核菌間での相同性が極
めて小さく、１３ｂｐの６〜７個の誤対合を有する。検
出された生成物だけがＭ．カンサシイおよび対照プラス
ミドｐＭＫ１４からのものであった（データは示されて
いない）。更に、Ｍ．ゴルドネーで見られた僅かなバン
ドが存在した。２種類の異なるオリゴを用いてプライマ
ー伸長により同一のＰＣＲ増幅反応を検出することによ
って、劇的に異なるプロフィールが得られた。オリゴ１
４−２３は属特異性を示したが、オリゴ１４−１５は
Ｍ．カンサシイ特異性を示した。これは、用いられた検
定および検出方法に応じて、ここで提供された配列を
Ｍ．カンサシイ、ヒト型結核菌または鳥型結核菌特異性
に用いることができるということを示している。サザン
ブロットおよびプライマー伸長検定双方において、Ｎ．
アステロイデスおよびＭ．フォルツイツムは、長期間の
暴露後に極めて弱いハイブリダイセーションを示した。
ＰＣＲで増幅した生成物でオリゴ１４−１５（配列番
号：１６）を用いて行った。このオリゴは、Ｍ．カンサ
シイ、ヒト型結核菌および鳥型結核菌間での相同性が極
めて小さく、１３ｂｐの６〜７個の誤対合を有する。検
出された生成物だけがＭ．カンサシイおよび対照プラス
ミドｐＭＫ１４からのものであった（データは示されて
いない）。更に、Ｍ．ゴルドネーで見られた僅かなバン
ドが存在した。２種類の異なるオリゴを用いてプライマ
ー伸長により同一のＰＣＲ増幅反応を検出することによ
って、劇的に異なるプロフィールが得られた。オリゴ１
４−２３は属特異性を示したが、オリゴ１４−１５は
Ｍ．カンサシイ特異性を示した。これは、用いられた検
定および検出方法に応じて、ここで提供された配列を
Ｍ．カンサシイ、ヒト型結核菌または鳥型結核菌特異性
に用いることができるということを示している。サザン
ブロットおよびプライマー伸長検定双方において、Ｎ．
アステロイデスおよびＭ．フォルツイツムは、長期間の
暴露後に極めて弱いハイブリダイセーションを示した。
【００４７】前述の実施例は本発明を例示するものであ
り、それを制限するものと解釈されるべきではない。本
発明を請求の範囲によって定義するが、請求の範囲の同
等物はそこに包含される。
り、それを制限するものと解釈されるべきではない。本
発明を請求の範囲によって定義するが、請求の範囲の同
等物はそこに包含される。
【図１】図１は、クローンＭＫ１４の地図を示す。プラ
スミドＭＫ１４の挿入断片は５個のサブフラグメントＡ
〜Ｅに細分割された。ＤＮＡに沿って、オリゴヌクレオ
チド（オリゴ）は箱形で示され且つオリゴリスト（表
１）により標識される。各フラグメントの寸法およびＧ
Ｃ含量は記載の通りである。
スミドＭＫ１４の挿入断片は５個のサブフラグメントＡ
〜Ｅに細分割された。ＤＮＡに沿って、オリゴヌクレオ
チド（オリゴ）は箱形で示され且つオリゴリスト（表
１）により標識される。各フラグメントの寸法およびＧ
Ｃ含量は記載の通りである。
【図２】図２は、３２Ｐで標識されたＭＫ１４−Ｃでプ
ローブされたマイコバクテリアおよび非マイコバクテリ
アのサザンブロットを示す。このバンディングパターン
は強い属特異性を示し、試験されたいずれの非マイコバ
クテリアにおいても交差反応性は見られない。
ローブされたマイコバクテリアおよび非マイコバクテリ
アのサザンブロットを示す。このバンディングパターン
は強い属特異性を示し、試験されたいずれの非マイコバ
クテリアにおいても交差反応性は見られない。
【図３】図３は、３２Ｐで標識されたＭＫ１４−Ｄでプ
ローブされたマイコバクテリアおよび非マイコバクテリ
アのサザンブロットを示す。このプローブは強いＭ．カ
ンサシイ特異性を示し且つ試験された他のいずれの生物
とも交差反応しない。
ローブされたマイコバクテリアおよび非マイコバクテリ
アのサザンブロットを示す。このプローブは強いＭ．カ
ンサシイ特異性を示し且つ試験された他のいずれの生物
とも交差反応しない。
【図４】図４は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アガ
ロースゲルを示す。オリゴ１４−３（配列番号：２）お
よび１４−１０（配列番号：９）をプライマーとして用
いるＰＣＲ増幅反応は、１％臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル上で視覚化することによって分析され
た。２４２ｂｐの生成物に対する矢印の点は、鋳型とし
て用いられた遅増殖性マイコバクテリアの全部の列で見
られた。正の対照として、プラミドＭＫ１４（ｐＭＫ１
４）を鋳型として用いた。負の対照としては、鋳型ＤＮ
Ａの代わりに水を加えた。
ロースゲルを示す。オリゴ１４−３（配列番号：２）お
よび１４−１０（配列番号：９）をプライマーとして用
いるＰＣＲ増幅反応は、１％臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル上で視覚化することによって分析され
た。２４２ｂｐの生成物に対する矢印の点は、鋳型とし
て用いられた遅増殖性マイコバクテリアの全部の列で見
られた。正の対照として、プラミドＭＫ１４（ｐＭＫ１
４）を鋳型として用いた。負の対照としては、鋳型ＤＮ
Ａの代わりに水を加えた。
【図５】図５は、３２Ｐで標識されたＭＫ１４−Ｃでプ
ローブした図４でのＰＣＲゲルのサザンブロットを示
す。２４２ｂｐの生成物に対する矢印の点は、遅増殖性
マイコバクテリア全部およびＭ．ゴルドネーに存在す
る。それは，非マイコバクテリア全部において不存在で
あり且つマイコバクテリアＭ．ケロネーおよびＭ．フォ
ルツイツムにおいて不存在である。正および負の対照は
図４の場合と同じである。
ローブした図４でのＰＣＲゲルのサザンブロットを示
す。２４２ｂｐの生成物に対する矢印の点は、遅増殖性
マイコバクテリア全部およびＭ．ゴルドネーに存在す
る。それは，非マイコバクテリア全部において不存在で
あり且つマイコバクテリアＭ．ケロネーおよびＭ．フォ
ルツイツムにおいて不存在である。正および負の対照は
図４の場合と同じである。
フロントページの続き (72)発明者 ダリル・ディー・シャンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27712，ダーラム，ドンフィル・ドライ ブ 1108
Claims (10)
- 【請求項１】 マイコバクテリア核酸に対して選択的に
ハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドプローブで
あって、 （ａ）本明細書中において配列番号：１（ＭＫ１４）と
して与えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌク
レオチドプローブ； （ｂ）マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリ
ッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリゴ
ヌクレオチドプローブ；および （ｃ）前述のいずれかに相補的であり且つマイコバクテ
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリ
ゴヌクレオチドプローブから成る群より選択される上記
のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２】 本明細書中において配列番号：１（ＭＫ
１４）として与えられた配列から本質的に成る請求項１
に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３】 本明細書中において配列番号：１２（Ｍ
Ｋ１４−Ａ）、配列番号：１３（ＭＫ１４−Ｂ）、配列
番号：１４（ＭＫ１４−Ｃ）、配列番号：１５（ＭＫ１
４−Ｄ）、配列番号：１６（ＭＫ１４−Ｅ）、配列番
号：２０（ＭＫ１４−Ｃ１）および配列番号：２１（Ｍ
Ｋ１４−Ｃ２）として与えられた配列から本質的に成る
プローブから成る群より選択される請求項１に記載のオ
リゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項４】 （ａ）本明細書中において配列番号：２
２（Ｍ．カンサシイ（Ｋａｎｓａｓｉｉ）フラグメント
ＢＣ）として与えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオ
リゴヌクレオチドプローブ，本明細書中において配列番
号：２３（ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）フラグメントＢＣ）として与えられたＤＮＡ配列か
ら本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブおよび本明
細書中において配列番号：２４（鳥型結核菌（Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ）フラグメントＢＣ）として与えられた配列から
本質的に成るオリゴヌクレオチドプローブ；並びに （ｂ）前述のいずれかに相補的であり且つマイコバクテ
リア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオリ
ゴヌクレオチドプローブから成る群より選択される請求
項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項５】 核酸試料中のマイコバクテリア核酸を検
出する方法であって、 （ａ）オリゴヌクレオチドプローブを、マイコバクテリ
ア核酸に対する該オリゴヌクレオチドプローブのハイブ
リダイセーションを可能にする条件下で核酸に接触さ
せ、該オリゴヌクレオチドプローブは、 （ｉ）本明細書中において配列番号：１（ＭＫ１４）と
して与えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌク
レオチドプローブ； （ｉｉ）マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブ
リッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリ
ゴヌクレオチドプローブ；および （ｉｉｉ）前述のいずれかに相補的であり且つマイコバ
クテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうる
オリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択され；
そして次に、 （ｂ）該オリゴヌクレオチドプローブが該核酸試料にハ
イブリッド形成するか否かを検出し、オリゴヌクレオチ
ドプローブの核酸試料に対するハイブリダイセーション
は、核酸試料がマイコバクテリア核酸を含むことを示す
ことを含む上記の方法。 - 【請求項６】 前記の検出工程の前に鎖置換増幅工程を
更に含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 核酸試料中の選択されたマイコバクテリ
ア核酸配列を増幅する方法であって、 （ａ）少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプローブ
を、選択されたマイコバクテリア核酸配列に対する該オ
リゴヌクレオチドプローブそれぞれのハイブリダイセー
ションを可能にする条件下で核酸試料に接触させ、該プ
ローブ対は互いに増幅対を含み且つ該オリゴヌクレオチ
ドプローブそれぞれは、 （ｉ）マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブリ
ッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリゴ
ヌクレオチドプローブ；および （ｉｉ）前述のいずれかに相補的であり且つマイコバク
テリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうるオ
リゴヌクレオチドプローブから成る群より選択され；そ
して次に、 （ｂ）該少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプローブ
と該核酸試料とを周期的に反応させて増幅生成物を生じ
ることによって該選択されたマイコバクテリア標的配列
を増幅することを含む上記の方法。 - 【請求項８】 前記の増幅工程を鎖置換増幅によって実
施する請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 核酸試料中の核酸のマイコバクテリア核
酸を検出するためのキットであって、 （ｉ）本明細書中において配列番号：１（ＭＫ１４）と
して与えられたＤＮＡ配列から本質的に成るオリゴヌク
レオチドプローブ； （ｉｉ）マイコバクテリア核酸に対して選択的にハイブ
リッド形成しうるＭＫ１４のフラグメントから成るオリ
ゴヌクレオチドプローブ；および （ｉｉｉ）前述のいずれかに相補的であり且つマイコバ
クテリア核酸に対して選択的にハイブリッド形成しうる
オリゴヌクレオチドプローブから成る群より選択される
オリゴヌクレオチドプローブと一緒にハイブリダイセー
ション溶液を含む上記のキット。 - 【請求項１０】 前記のオリゴヌクレオチドプローブ
が、本明細書中において配列番号：１２（ＭＫ１４−
Ａ）、配列番号：１３（ＭＫ１４−Ｂ）、配列番号：１
４（ＭＫ１４−Ｃ）、配列番号：１５（ＭＫ１４−
Ｄ）、配列番号：１６（ＭＫ１４−Ｅ）、配列番号：２
０（ＭＫ１４−Ｃ１）および配列番号：２１（ＭＫ１４
−Ｃ２）として与えられた配列から本質的に成るオリゴ
ヌクレオチドプローブから成る群より選択される請求項
９に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88965192A | 1992-05-26 | 1992-05-26 | |
| US889651 | 1992-05-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630796A JPH0630796A (ja) | 1994-02-08 |
| JP2709256B2 true JP2709256B2 (ja) | 1998-02-04 |
Family
ID=25395518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5124470A Expired - Fee Related JP2709256B2 (ja) | 1992-05-26 | 1993-05-26 | マイコバクテリアプローブ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0571911B1 (ja) |
| JP (1) | JP2709256B2 (ja) |
| KR (1) | KR960002876B1 (ja) |
| AU (1) | AU663180B2 (ja) |
| BR (1) | BR9302052A (ja) |
| CA (1) | CA2096497A1 (ja) |
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