JPH10500023A - 結核菌検出用材料及び検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から標的ＤＮＡを例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって検出するために有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから標的ＤＮＡを検出する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 結核菌検出用材料及び検出方法 発明の分野 本発明は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） の検出に有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓの増幅及び／または検出に有用な方法に関する。発明の背景 結核の発病率は数十年来減少する傾向にあったが、警戒を要する新しい症例が 増加しつつある。結核の原因因子となるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの最も一 般的な感染経路は、僅か数個の生菌を含む飛沫の吸入である。マイコバクテリア は肺組織中で複製され、一次感染病巣を形成し、ここから局部リンパ系に侵入す る。次いで、感染は血管系及びリンパ系を介して体内に広域に散在するようにな る。初期病巣は通常は治癒して小さい肉芽腫を形成する。肉芽腫には限りなく多 数の結核菌の生菌が内包されているであろう。臨床的な結核の最も一般的な形態 は一次感染後の結核であり、通常は肺が侵される。この疾患は初期感染から多数 の年月が経過した後に発症することもあり、 その理由は、（例えば、加齢、病気、栄養不良またはアルコール中毒などによっ て）細胞性免疫が一時的に喪失または低下し、その結果として病巣の休止中の結 核菌が再活性化するからであると考えられている。現在では、後天性免疫不全症 候群（ＡＩＤＳ）、生活の困窮とこれに伴う栄養不良などが発病の増加につなが る重大な要因となっている。 結核及びその他のマイクコバクテリウム性疾患は、臨床的な根拠、放射線医学 に基づき、痰、血液、気管支洗浄液、胃洗浄液、尿または脳脊髄液の塗抹標本中 に抗酸性細菌を検出することによって暫定的に診断され得る。通常はこれらの検 体の塗抹標本をチールーニールセン法または蛍光ローダミン−オーラミン（ａｕ ｒａｍｉｎｅ）染料によって染色し顕微鏡で観察する。しかしながら、顕微鏡的 に陽性の喀痰サンプルを検出できるのは肺結核患者の約３０〜５０％にとどまる ので、痰の培養検査が必須である。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及び他のマイ クコバクテリウム種の存在を維持する培養は時間の掛かる難しい処理である。そ の理由は、ある種のマイクコバクテリウム種は増殖が極めて遅くまた容易には実 現し難い栄養条件を要求するからである。いくつかのサンプルは培養培地に直接 接種できる であろうが、殆どの検体は例えば強アルカリによる汚染除去を要する。次いで検 体を一般には、他の細菌の増殖を阻止するためにペニシリンのような抗生物質の 存在下でレーウェンシュタイン−イエンセン培地のような卵を主成分とする培地 及び／またはＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９ブイヨンのような限定培地に接種 する。次に培養物を３５〜３７℃で１〜７週間インキュベートする。しかしなが ら、培養法も約７０％しか有効でない。 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するための他の方法も開発された。これ らの方法としては、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中に見出される核酸に特異的 なプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションアッセイがある。例えば、１９ ９１年１２月１２日公開のＧｕｅｓｄｏｎ ａｎｄ Ｔｈｉｅｒｒｙによる「Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの特異的検出」という名 称のＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ９１／１９００４は、Ｔｈｉｅｒｒｙら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１８８（１９９０）に記載されているようなＭ．ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの多くの菌株中に多数コピーとして存在する挿入要素で あるＩＳ６１１０の塩基１−３０；２５０− ２７５；１０２９−１０５８；１２００−１２２９；１２６０−１２８９；１２ ６３−１２９４；１７３５−１７６４及び１７７２−１７９６間に見出だされる ポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドプライマーの使用を教示している 。該出願はＩＳ６１１０由来の配列及び該配列に対して少なくとも８０％の相同 性を有している配列を請求の範囲に記載している。該出願に記載されたプローブ はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検 出に使用された。 １９８８年６月２５日公開のＨｏｇａｎらのＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ８８／０３ ９５７は、核酸ハイブリダイゼーション法を用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ及びマイコバクテリウム・イントラセルラーレＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒｅのような非ウイルス性生物の検出方法を記載している。この方法では、検出 すべき特定の非ウイルス性生物または非ウイルス性生物群に特有の選択されたリ ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の領域にハイブリダイズするために十分に相補的な オリゴヌクレオチドを構築する。関与する非ウイルス性生物の１つまたは複数の 可変領域ｒＲＮＡ配列と１つまたは複数の識別すべき非ウイルス性生物の１つま たは複数の可変領域ｒＲＮＡ配列とを比較するこ とによって標的ｒＲＮＡを選択する。トリ型結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ及 びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ可変配列に特異的であり適正な緊縮性条件下で互いの核酸または他の いかなる細菌種の核酸とも交差反応しないプローブ配列を同定する。Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合細菌の２３Ｓ ｒＲＮＡの ３つの可変領域サブ配列に特異的なプローブも開示されており、また、マイコバ クテリウム属の細菌のハイブリダイゼーションアッセイに有用なｒＲＮＡ可変領 域プローブ（１５Ｓ，２３Ｓ ｒＲＮＡ特異的）；大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基１８５−２２５に対応する領域のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ；Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ＲＮＡの塩基１８５−２２５に対応する 領域のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのＲＮＡ； Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ＲＮＡの塩基１８５−２２５に対応する領域のＭｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合体に含まれる種のｒＲＮ Ａ；Ｅ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ＲＮＡの塩基５４０−５７５，１ １５５−１１９０及び２１９５−２２３５に対応する領域のＭｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合体に含まれる種のｒＲＮＡ；Ｅ．ｃ ｏｌｉの１６Ｓ ＲＮＡの塩基１０２５−１０６０に対応する領域のマイコバク テリウム属のＲＮＡ；なども開示されている。 １９８９年７月２５日に許諾されたＫｏｈｎｅの米国特許第４，８５１，３３ ０号は、非ウイルス性微生物を検出及び定量するための核酸ハイブリダイゼーシ ョンの使用を提案している。より特定的には該特許は、生物、生物の部門または 群において保存されることが分かっているリボソームＲＮＡ配列にのみ相補的な ｃＤＮＡプローブの作製を記載している。該特許は代表例としてマイコプラズマ ・ホミニスＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓのリボソームＲＮＡに相補的 であるがヒトリボソームＲＮＡに相補的でないｃＤＮＡプローブの作製を記載し てぃる。該特許は、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓプローブがヒト組織培養物及び他の哺乳 動物の細胞培養物中のＭ．ｈｏｍｉｎｉｓ汚染の検出に有用であると主張してい る。 Ｃｒａｗｆｏｒｄらの米国特許第５，１６８，０３９号は臨床材料中のＭ．ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合体を検出する ために使用される単離及び精製された反復的ＤＮＡ配列を目的としている。該特 許は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの染色体ＤＮＡ中に見出される反復要素の クローニング及び配列決定を記載し、更に、クローニングされたこれらの反復要 素をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合体の代表的菌株を検出するためのプロ ーブ及びプライマーとして使用することを記載している。 Ｃｒａｗｆｏｒｄらの米国特許第５，１８３，７３７号（前出の米国特許第５ ，１６８，０３９号の分割特許）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複合体の細菌検出用プライマーとして上記のよ うな反復要素を使用することを教示している。該特許はまた、膜を主体とする核 酸ハイブリダイゼーションアッセイを用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−複 合体の細菌検出用プローブとして反復要素を使用することを教示している。 １９９０年１２月１３日公開のＬａｎｅらによるＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５， １５７は、ユウバクテリア用の「汎用」核酸プローブ及び細菌検出方法を提案し ている。該出願は、特定条件下でリボソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）、ｒＲＮＡ 遺伝子 （ｒＤＮＡ）にハイブリダイズする核酸プローブ及びプローブセットを記載し、 また、同じ条件下で試験サンプル中に存在し得る真核細胞のｒＲＮＡまたはｒＤ ＮＡにハイブリダイズしない該プローブのいくつかの増幅産物及びｉｎ ｖｉｔ ｒｏ転写産物を記載している。より詳細には、該出願に記載されているプローブ は、高度に保存されたある種の細菌性２３Ｓまたは１６ＳのｒＲＮＡ配列に特異 的に相補的である。ユウバクテリア間で最大の類似性を有している領域を同定す るために１６Ｓ及び２３ＳのｒＲＮＡの位置合わせされたセットを処理するコン ピューターアルゴリズムを用いてプローブを選択した。このようにして得られた 核酸プローブは多様な細菌種間で極めて広汎にハイブリダイズする。細菌種間で 相同であることが判明したプローブに関してはまた、非細菌性ｒＲＮＡ配列との 違いをコンピューターアルゴリズムを用いて判断した。これらの分析に基づいて 最終的に４１のプローブ、即ち２３Ｓ ｒＲＮＡを標的とする２２のプローブと １６Ｓ ｒＲＮＡを標的とする１９のプローブとを選択した。該出願に記載され ている１６Ｓの増幅プライマーとしては、殆どのユウバクテリア、ボレリアＢｏ ｒｒｅｌｉａ及びスピロヘータｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、エン テリクスｅｎｔｅｒｉｃｓ、デイノコッカスＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、カンピロ バクターＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、フゾバクテリアＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉ ａ及びバチルスＢａｃｉｌｌｕｓ種を検出するプライマーがある。これらのプロ ーブのいくつかはカンサス・マイコバクテリウムＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ及びウシ型結核菌Ｍ．ｂｏｖｉｓを検出し得ると断定されてい る。該出願は、プローブと細菌含有被疑サンプル中のｒＲＮＡとの間のハイブリ ダイゼーションを検出するためにサンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセ イを使用すること、及び、上記のごとく得られたプローブを用いる１６Ｓ ｒＲ ＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することを記載している。 該出願に記載のプローブ（１６Ｓ及び２３Ｓの双方のｒＲＮＡプローブ）は広範 囲の細菌種を検出し得ると断定されている。 １９９０年１１月１日公開のＨａｎｃｅらのＰＣＴ出願ＷＯ９０／１２，８７ ５は、放線菌目の核酸配列を開示しており、また開示された核酸配列を放線菌目 に見出される核酸の合成及び検出に使用することを記載している。該出願は、結 核菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、トリ型結核菌Ｍ．ａｖｉｕｍ、マ イコバクテリウム・フォルチュイツムＭ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、パラ結核菌Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＢＣＧ、カンサス・マイコバクテリウムＭ ．ｋａｎｓａｓｉｉ、マイコバクテリウム・マルモエンセＭ．ｍａｌｍｏｅｎｓ ｅ及びマイコバクテリウム・マリヌムＭ．ｍａｒｉｎｕｍから成る８種類のマイ コバクテリウム中に同族体を有する６５ｋＤ（キロダルトン）のマイコバクテリ ウム抗原をコードする３８３塩基対のポリヌクレオチドを開示している。これら の細菌のＤＮＡ及び／または転写産物を検出するためにこれらのプローブを使用 することが記載されている。より特定的には、６５ｋＤ抗原の塩基３９７−４１ ６を含むオリゴヌクレオチドが開示されている（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら，Ｉｎｆｅ ｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．５６：４４６−４５１（１９８８）参照）。６５ｋ Ｄ抗原をコードする同じ遺伝子の塩基５３５−５５４に対応する別の配列も開示 されている。該出願は、上記オリゴヌクレオチドをマイコバクテリウム種の検出 を目的とするポリメラーゼ連鎖反応でプライマーとして使用することを提案して いる。 １９９０年１０月３１日公開のＢａｒｒｙらの欧州特許出願第０，３９５，２ ９２号は、種々の微生物に特異的なＤＮＡプ ローブの作製方法を記載している。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ 、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄ ｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖ ｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び他の細菌に特異的 なプローブが開示されている。Ｍ．ａｖｉｕｍ用ＤＮＡプローブは、１６Ｓのリ ボソームＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳのリボソームＲＮＡをコードする遺 伝子との中間に存在する可変遺伝子間領域から得られた。Ｍ．ｂｏｖｉｓ用ＤＮ Ａプローブは、１６ＳのリボソームＲＮＡ遺伝子と２３ＳのリボソームｒＲＮＡ 遺伝子との中間に存在する可変遺伝子間領域及び１６ＳのリボソームＲＮＡをコ ードする遺伝子のＶ６可変領域から得られた。同様に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓ用ＤＮＡプローブは、１６ＳのリボソームＲＮＡ遺伝子と２３Ｓのリボソ ームＲＮＡ遺伝子との中間に存在する可変遺伝子間領域から得られた。 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのタンパク質抗原Ｂ 遺伝子（ｐａｂ遺伝子）のヌクレオチド配列 は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，Ｉｎｆ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． ５７：２４８１−２４８８（１９８９）によって記載された。ｐａｂ遺伝子は１ ９９３ヌクレオチドの長さをもつ。ｐａｂ遺伝子の推定アミノ酸配列は、大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉのリン酸塩結合タンパク質（Ｐｓ＋Ｓ）に３０％の相同性を示す。 タンパク質抗原ｂはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのビルレント菌株に結合し、 また、より少ない程度でＭ．ｂｏｖｉｓのＢＣＧに結合し、ＢＣＧは結核に対す るワクチンとして使用され多少の成果を示したという理由から、タンパク質抗原 ｂを分析用に選択した。Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｉ ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｊｏｕｒｎ ａｌ ２：２９３−２９５（１９７７）参照。 Ｂａｉｒｄら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：９３１−９３９（ １９８９）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１０ ｋＤ抗原遺伝子をクローニングし配列決定した。１０ｋＤ抗原は（Ｍ．ｂｏｖｉ ｓの１０ｋＤタンパク質との類似によって）Ｔ細胞性遅延型過敏症の誘発に関与 していた。Ｍ．ｂｏｖｉｓの１０ｋＤ抗原のＮ末端ア ミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを用いて１０ｋＤ抗原遺伝子を単離した。 このプローブを選択した理由は、１０ｋＤのＭ．ｂｏｖｉｓ抗原と１０ｋＤのＭ ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原との間の免疫交差反応性が証明されたからであ る。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１０ｋＤ抗原遺伝子をクローニングし配列 決定すると、集合分子量１０．７ｋＤを有する９９個のアミノ酸をコードする３ ００ヌクレオチドのコーディング配列が判明した。配列は、２つの原核細胞性熱 ショックタンパク質に相同であり更に熱ショックタンパク質と同様のプロモータ ー配列を開始コドンの上流に有することが判明した。 Ｒｏｇａｌｌら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．４０：３２３−３３０は 、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｋｎａｓａ ｓｉｉ ＤＳＭ４３２２４、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ ＡＴＣＣ２５２７５、Ｍ．ｓｃ ｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ１９９８１、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ ＡＴＣＣ２ ５７９９、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ ＡＴＣＣ１４４７０、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ Ａ ＴＣＣ１９２５０、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ１４４７４、Ｍ．ａｖ ｉ ｕｍ ＤＳＭ４３２１６、Ｍ．ｉｎｔ ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ＡＴＣＣ１５ ９８５、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＡＴＣＣ１９６９８、Ｍ．ｇ ａｓｔｒａｅ ＡＴＣＣ１５７５４、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ ＡＴＣＣ２９５ ７１、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１９５３０、Ｍ．ｔｅ ｒｒａｅ ＡＴＣＣ１５７５５、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ ＡＴＣＣ１４４７２、 Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ＡＴＣＣ１４４６８、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ＡＴ ＣＣ６８４１及びノカルジア・アステロイデスＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏ ｉｄｅｓ ＡＴＣＣ３３０６の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し分析した。 この分析から得られたデータは、細菌間の系統学的関係を明らかにした。データ は、増殖の速いマイコバクテリウム、即ちＭ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅ ｌｏｎａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及びＭ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓは、その他 の全ての被験マイコバクテリアとは異なるグループを形成することを示した。遅 く増殖するマイコバクテリア種は全て、９４．８％を上回る値の類似性をもち高 度に近縁であることが判明した。 Ｈｅｒｍａｎｓら，Ｉｎｆ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．５９：２ ６９５−２７０５（１９９１）は、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧから単一コピー挿入 要素ＩＳ９８７の配列を決定した。ＩＳ９８７の配列は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓの挿入配列ＩＳ９８６に実質的に等しいこと、及び、３５−４１ｂｐの スペーサーＤＮＡによって各々が隔てられた３６ｂｐ直列反復配列の２０個の等 しいコピーを含むＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ染色体の領域に存在することが観察さ れた。データはまた、ＩＳ９８７がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１ ０とほぼ等しく、両者の違いは、ＩＳ９８７が単一読取り枠（ＯＲＦ）中にＯＲ Ｆａと命名された１つの読取り枠（ＯＲＦ）を有するがＩＳ６１１０は異なる２ つのＯＲＦから成るＯＲＦａを含むことだけであることを示した。これらの読取 り枠は推定トランスポザーゼの発現に１つの役割を果たすであろう。データはま た、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ染色体の直列反復配列含有領域の寸法及び組 成が多形性であり、試験した他の９種のマイコバクテリウムではこれらの反復配 列が観察されなかったことを示す。著者らはまた、ＩＳ挿入部位に多形性が観察 されるので制限フラグメントの長さ多形性の分析によってＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓ複合体の菌株の型判定が容易であると示唆している。 Ｔｈｉｅｒｒｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１８８（１９９０ ）は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの挿入配列ＩＳ６１１０をクローニングし 配列決定した。１３６１ヌクレオチドのＤＮＡ配列は、長さ２８ｂｐの逆方向反 復配列を含み３個の不適正塩基対及びＩＳ要素の各端の３塩基対の直列反復配列 を有している挿入配列（ＩＳ）の特性を示した。著者らは、このＩＳ要素がＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体を同定するためのプローブとして有用であろう と示唆している。 上述のように、オリゴヌクレオチドプローブは、ドットブロット、スロットブ ロット、サザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブ リダイゼーションなどの方法を使用する核酸ハイブリダイゼーションによって種 々の微生物を検出するために使用される。または、標的ＤＮＡを増幅するポリメ ラーゼ連鎖反応を使用してもよい。Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１ ９５号はポリメラーゼ連鎖反応を詳細に記載している。 本発明の背景にはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）として知られる代替的な標的増 幅方法のメカニズムが重要な関係を有している。ＬＣＲにおいては、２つの一次 プローブパートナー（第一 及び第二プローブ）と２つの二次プローブパートナー（第三及び第四プローブ） とを含むプローブ対が使用される。全部のプローブは過剰量で使用される。一次 プローブ対の第一プローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブリダイズし、同 じプローブ対の第二プローブは同じ標的鎖の第２のセグメントにハイブリダイズ し、第１セグメントと第２セグメントとが連続し、その結果として、一次プロー ブは５′−リン酸塩−３′ヒドロキシルの関係で互いに隣接し、リガーゼがこの 対の２つのプローブを共有結合的に融合または結合させて融合産物が得られる。 更に、第三（二次）プローブは第一プローブの一部分に、第四（二次）プローブ は第二プローブの一部分に、同様の隣接状態でハイブリダイズし得る。勿論、標 的が最初から二重鎖である場合には、二次プローブも最初から標的の相補鎖にハ イブリダイズするであろう。一次プローブの融合鎖は標的鎖から分離された後、 相補的な二次融合産物を形成すべく結合し得る第三プローブ及び第四プローブと ハイブリダイズするであろう。標的またはその相補鎖に機能的に等価の融合産物 を得ることが重要である。ハイブリダイゼーションと結合とのサイクルを繰返す ことによって、標的配列が増幅される。この方法は、１９８９ 年６月１４日公開のＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第３２０，３０８ 号及び１９９１年７月３１日公開のＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第 ４３９，１８２号により完全に記載されている。 リガーゼ連鎖反応に関して潜在する問題は、プローブの標的非依存結合によっ て生じるバックグラウンドシグナルの問題である。第三プローブが第一プローブ にハイブリダイズし、第四プローブが第二プローブにハイブリダイズするので、 過剰量で添加されたプローブは、それらの間で容易に二重鎖を形成し得る。これ らの二重鎖は標的の存在に無関係に結合して融合産物を形成し、この融合産物は 、増幅されたがより以上の増幅を支持する能力を有している所望の標的との識別 が難しい。これらの二重鎖の標的非依存性平滑端結合は比較的稀にしか生起しな いが、診断用アッセイにおける不都合な高いバックグラウンドシグナルを発生さ せる十分な原因となる。 このバックグラウンドの問題を克服するための試案がいくつか発表されている 。例えば、ＷＯ９０／０１０６９（Ｓｅｇｅｖ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び 英国特許出願公開第２，２２５，１１２号（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｉｎ ｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｐｌｃ．）は、結合に先立ってポリメラーゼ媒介ギャップ充 填段階を含む結合を主体とする増幅スキームの改良方法を記載している。更に、 １９９１年７月３１日公開のＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第４３９ ，１８２号はバックグラウンドを低減させるＬＣＲの変法を教示している。この ような変法の１つはギャップ充填及び結合を含む。 １９９１年７月３１日公開のＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第４３ ９，１８２号に記載されたギャップ充填結合方法では、平滑端二重鎖を形成し得 るプローブ対を使用する代わりに、先ず１つのプローブ対の少なくとも一方のプ ローブに「修飾された」末端を設け、形成される二重鎖が「非平滑端」となるよ うにするか及び／またはプローブ対のリガーゼ触媒融合の基質にならないように している。「修飾された」末端は結合点に関する定義であって、相補的プローブ に関する定義ではない。「修飾された末端」の一例では、１つのプローブ対の一 方のプローブの末端と同じプローブ対の他方のプローブの末端との間に「ギャッ プ」が形成されるように複数の塩基が削除されている。修飾の別の例では、プロ ーブと標的配列との間にミスマッチが存在する。次に、プローブを結合可能にす るために 修飾を「補正」する。「補正」は、１つのプローブ対の２つのプローブを（標的 依存的に）結合可能にする処理を意味する。従って、標的、標的相補鎖またはこ れらに由来するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプローブだけを補正 する。使用される修飾端の種類次第で種々の方法で「補正」を行うことができる 。 当業界では、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びマイコバクテリウム属の細菌 を迅速且つ高感度で検出するための新規な試薬及び方法の必要性がまだ解決には 至っていない。発明の概要 本発明の主題は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓか ら標的ＤＮＡを特異的に検出するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブ である。このようなオリゴヌクレオチドプローブは１０〜約５０ヌクレオチドの 長さをもち、配列番号１、１１、１６または２１で示される配列に対して、本文 中に定義したハイブリダイズ条件下でこれらの配列またはその相補鎖にハイブリ ダイズし得る十分な相補性または相同性を有している。十分な相補性または相同 性を有すると定義されるためには一般に約８０％〜１００％、好ましくは９０％ 以上の相補性または相同性が必要である。より短いプローブは概して、より高い パーセンテージ範囲を要し、より長いプローブは概して、より低いパーセンテー ジ範囲で有用である。１５〜４０、通常は約２０〜２５ヌクレオチドの範囲の長 さを有するプローブが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドプローブはマイ コバクテリウム属の他の生物を含む他の近縁生物と実質的に交差反応しないのが 好ましい。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドプローブの好適例は配列番号 ２−５、７−１０、１２−１５、１７−２０及び２２−３３で示されるプローブ である。 本発明の別の主題は、図１Ａ−Ｃに示すプローブセット１（配列番号２−５） 、プローブセット２（配列番号７−１０）、プローブセット３（配列番号１２− １５）、プローブセット４（配列番号１７−２０）、プローブセット５（配列番 号２２−２５）、プローブセット６（配列番号２６−２９）及びプローブセット ７（配列番号３０−３３）並びにその組合わせなどのような、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓから標的ＤＮＡを検出するために有用な組成物である。 本発明の別の主題は、本発明の組成物によって提供される標 識オリゴヌクレオチドプローブを用いたリガーゼ連鎖反応を使用してＭ．ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓから標的ＤＮＡを検出する方法である。本発明方法では一般 に、標的ＤＮＡ含有被疑サンプルを準備し、本発明の組成物である１組以上のプ ローブセットを準備し、プローブセットのプローブの少なくとも１つを検出可能 ラベルで標識し、また、１種類から３種類のデオキシヌクレオチド三リン酸とポ リメラーゼとリガーゼとを準備する。次に、プローブセットと標的ＤＮＡ含有被 疑サンプルとを混合する段階と、プローブセットと標的ＤＮＡ含有被疑サンプル との混合物を変性する段階と、変性プローブセットを変性標的ＤＮＡにハイブリ ダイズさせてハイブリダイズプローブを作製する段階と、ハイブリダイズしたプ ローブを鋳型依存的（Iemplate dependent manner）に補正して隣合うプローブ を作製する段階と、互いの延長上で「補正されて」隣合ったプローブをリガーゼ によって結合させて再編成プローブを形成する段階と、再編成プローブ中のラベ ルを検出する段階とから成る処理サイクルを少なくとも一回実施する。本文中の 「補正」なる用語は、欧州特許第４３９，１８２号と同じ意味で使用されている 。 本発明の更に別の主題は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの 検出に有用なキットである。キットは、１つまたは複数の本発明のプローブセッ トとリガーゼ試薬とを収容した適当な容器から成る。本発明の別のキットは、リ ガーゼ試薬と、ポリメラーゼ試薬と、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸 と１種以上のプローブセットとを含み、プローブセットのプローブの少なくとも １つがラベルを有している。図面の簡単な説明 図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの種特異的標的 ＤＮＡ及び夫々の標的と位置合わせしたオリゴヌクレオチドプローブを示す。 図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、マイコバクテリウムの属特異的標的ＤＮＡ及び 夫々の標的と位置合わせしたオリゴヌクレオチドプローブを示す。 図中、塩基を以下の略号で示す。Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミン、Ｇ＝グアニン、 Ｃ＝シトシン、Ｉ＝イノシン。図２Ａの、最後の例に示した塩基は標的に対する ミスマッチである。同じく図中、ハプテンを以下の略号で示す。ＣＺ＝カルバゾ ール、ＡＤ＝アダマンタン、Ｆ＝フルオレセイン、Ｂ＝ビオチン。標的ＤＮＡは 二重鎖であるが一本の鎖だけを図示している。発明の詳細な説明 本発明のオリゴヌクレオチド配列は、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５７：２４８１−２４８８（１９８９）に記載 されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのタンパク質抗原Ｂをコードする遺伝子； Ｈｅｒｍａｎｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５９：２６ ９５−２７０５にＭ．ｂｏｖｉｓの挿入要素ＩＳ９８７に伴って報告された直列 反復配列；Ｔｈｉｅｒｒｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１ ８８（１９９０）に記載されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの挿入配列様要素 ＩＳ６１１０；Ｒｏｇａｌｌら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．４０：３２ ３−３３０（１９９０）に記載されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓリ ボソームＲＮＡ遺伝子；Ｓｈｉｎｎｉｃｋら（Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕ ｎ．，５６：４４６−４５１）に記載されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの６ ５ｋＤの熱ショックタンパク質をコードする遺伝子；及び、Ｂａｉｒｄら，Ｊ． Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：９３１−９３９（１９８９）に記載され たＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１０ｋＤの熱ショックタンパク質をコードす る遺伝子；などに由来する。 本発明で利用される改良リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、本文中でＡ、Ｂ（一 次プローブ）及びＡ′、Ｂ′（二次プローブ）と呼ぶ２対のプローブを使用する 。本文中で使用されたプローブ対なる用語は、同じ標的鎖に特異的であり且つ標 的にアニーリングした後で最終的に互いに結合する２つのプローブを意味する。 得られる二重鎖が「非平滑」になるか及び／または２つのプローブ二重鎖のリガ ーゼ触媒融合の適当な基質とならないように、一方のプローブ対のプローブの少 なくとも１つが最初から「修飾された」末端を有している。「修飾された末端」 は、結合点に関する定義であって、相補的プローブに関する定義ではない。プロ ーブ対が標的配列にアニーリングしたときに１つのプローブ末端と次のプローブ 末端との間に「ギャップ」が生じるように、「修飾された末端」では複数の塩基 が削除されている。修飾された末端の別の例としては、標的配列に対して不適正 （ミスマッチ）な塩基がある。 本発明の実施態様の殆どにおいては、修飾された末端が「リセス」と呼ばれる 。リセスは、標的にハイブリダイズした後の２つの一次プローブ間または２つの 二次プローブ間のギャップ である。これらの修飾された末端の存在は、標的の非存在下の相補的プローブの 二重鎖の平滑端相互結合に起因する虚偽の陽性シグナルの発生を減らす。 次に、プローブを結合可能にするために修飾を「補正」する。本文中で使用さ れた「補正」なる用語は、２つの一次プローブまたは２つの二次プローブを夫々 のパートナーに標的依存的に結合可能にする処理を意味する。従って、標的、標 的相補鎖またはそれらに由来するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプ ローブだけが「補正されて」いる。使用される修飾端の種類次第でいくつかの「 補正」手順を選択し得る。ギャップ充填及びニックトランスレーション活性は後 出の実施例でより詳細に説明する２つの補正方法である。 本文中で使用された「結合点」または「予定結合点」なる用語は、鋳型依存的 に結合すべきプローブ対間の特定場所を意味する。これは、「補正された」プロ ーブが３′−ヒドロキシル−５′−ホスフェートの関係でそのパートナーに隣接 する部位である。４つのＬＣＲプローブから成る各セット毎に、一次プローブ対 に１個及び二次プローブ対に１個の合計２個の「結合点」が存在する。従来のＬ ＣＲにおいては、２つの結合点が互 いに対向し、従って、プローブ対が互いにハイブリダイズしたときに平滑端をも つ二重鎖が形成される。本発明の殆どの実施態様で使用したＬＣＲ方法では、結 合点が互いに対向せず、ギャップの存在によって互いの間に塩基１つ以上のずれ が生じている。（１つまたは複数の）結合点の正確な位置は選択された配列次第 で違っており、従って各実施態様毎により詳細に定義する。 各プローブは、従来のヌクレオチドホスホラミジット化学及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｄｕｐ ｏｎｔ，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）；またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆ ｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能な器具を用いて常套的に合成され得るデオキシリボ 核酸（ＤＮＡ）から成る。リガーゼによって結合させるためには適当なプローブ の５′端のリン酸化が必要であり、このリン酸化は当業界で公知のようにキナー ゼまたは市販の合成試薬によって行うとよい。 一般に、本発明の実施に有用なＬＣＲ方法は、標的ＤＮＡを変性する段階と、 （ａ）修飾されたプローブを標的（及び、二重鎖の場合従って標的相補鎖が存在 する場合には標的相補鎖） にハイブリダイズさせ、（ｂ）修飾を標的依存的に（例えばギャップ充填によっ て）補正してプローブを結合可能にし、（ｃ）補正されたプローブをそのパート ナーに結合させて融合産物または結合産物を形成し、（ｄ）融合産物を標的から 解離させる段階とから成り、所望の標的配列を増幅するためにハイブリダイゼー ション、補正及び結合段階を繰返す反復処理から成る。段階（ａ）、（ｃ）及び （ｄ）は、全部の実施態様で本質的に同じであり、一緒に説明する。段階（ｂ） は使用された修飾の種類次第で違っているが、本文ではギャップ充填法及び「エ キソ」法の場合だけを説明する。 「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズ」条件は一般に、核生成 及びアニーリングを促進する条件であると定義される。しかしながら、このよう なアニーリングが温度、イオン強度、プローブ長さ及びプローブのＧ：Ｃ含量の ような複数のパラメーターにかなり予測可能に依存することは当業界で公知であ る。例えば、反応温度を下げるとアニーリングが促進される。任意の所与のプロ ーブセットについて、融点即ちＴｍは公知の複数の方法のいずれかによって算定 できる。概して、診断目的の用途では融点をやや下回るハイブリダイゼーション 温度を使用する。イオン強度即ち「塩」濃度も融点に影響を与える。その理由は 、少量のカチオンはホスホジエステル主鎖の負電荷を相殺することによって二重 鎖の形成を安定化する傾向を有するからである。典型的な塩濃度はカチオンの種 類及び原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。同様に、高いＧ： Ｃ含量及びプローブの長さの増加も二重鎖形成を安定化することが知られている 。その理由は、Ａ：Ｔ対が水素結合を２個しかもたないのに比べてＧ：Ｃ対合が ３個の水素結合を有しているため、及び、プローブが長いほどプローブを一緒に 保持する水素結合が多いためである。従って、高いＧ：Ｃ含量及びプローブの長 さの増加は融点を上昇させることによって「ハイブリダイゼーション」条件に影 響を与える。 所与の診断目的の場合、使用プローブを選択すると、Ｇ：Ｃ含量及び長さは既 知数となり、これらに基づいてどの「ハイブリダイゼーション条件」を用いるか を正確に決定する。イオン強度は一般に酵素活性に対して最適になるように選択 されるので、残された可変パラメーターは温度だけである。特異性を改善するた めに、ハイブリダイゼーション温度としてはプローブのＴｍをやや下回る温度、 一般にはＴｍを２℃〜１０℃下回る 温度を選択する。従って、特定のプローブセット及び系に対する適当な「ハイブ リダイゼーション条件」を得ることは当業者の通常の知識で十分である。 ＬＣＲの場合、プローブが化学量論的に反応すると予想されるので、プローブ をほぼ等しいモル濃度で添加する。各プローブは一般に約５ナノモル（ｎＭ）〜 約９０ｎＭの範囲の濃度、好ましくは約１０ｎＭ〜約３５ｎＭの濃度で存在する 。５０μＬという典型的な反応容量の場合、これは、約３×１０¹¹〜約１×１０¹² 分子の各プローブを添加することと等価である。５０μＬあたり約５×１０¹¹ 分子が良好な出発点であった。各反応に使用するプローブの最適量は、実行が必 要なサイクルの回数及び反応容量に従って変化する。所与のサイクル回数で最適 のシグナルを与えるプローブ濃度は、当業者が容易に決定できる。 プローブの準備後、本発明で使用されるＬＣＲ方法の次の段階は特異的補正段 階であり、次いで１つのプローブ対のプローブの１つを隣接のパートナーに結合 させる。従って、補正された一次プローブの各々は、その対応する一次パートナ ーに結合され、補正された二次プローブの各々は、その対応する二次パ ートナーに結合される。「隣接の」プローブとは、連続的に配向された標的とハ イブリダイズ可能な２つのプローブのいずれか一方を意味しており、一方のプロ ーブのリン酸化５′端がパートナープローブの３′ヒドロキシル端と隣接した状 態にある。「隣合う」プローブは（１つまたは複数の）修飾端を標的依存的に補 正することによって作製される。酵素結合は隣り合う２つのプローブを共有結合 させる好ましい方法であるから、本願明細書の記載では終始「結合」なる用語を 使用する。しかしながら、「結合」は一般用語であり、２つのプローブを共有結 合させる任意の方法を包含すると理解されたい。 好ましい酵素結合段階を可能にする条件及び試薬は当業者に公知である。本発 明に有用な結合試薬としては、Ｔ４リガーゼ、及び、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の ＤＮＡリガーゼ、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡリガ ーゼのような原核生物リガーゼがある。これはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏｓ．１０７００１及び １０７００２，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。現状では、Ｌ ＣＲの熱サイクル処理中に活性を維持する能力を有する熱安定リガーゼが好まれ て いる。熱安定リガーゼがないときは、サイクルを反復する度毎にリガーゼを添加 しなければならない。また、Ｒａｂｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１： １０６３７−１０６４７（１９８６）に報告されているショウジョウバエのＤＮ Ａリガーゼのような真核生物リガーゼも有用である。 結合後、融合（再編成）プローブを標的から解離させ（例えば溶融し）、従来 のＬＣＲと同様にプロセスを数サイクル反復する。サイクルの反復回数は１回〜 約１００回の範囲でよく、現在では約１５回〜約７０回の範囲が好ましい。 プローブが夫々の相補的（二次）プローブにハイブリダイズしたときに予定結 合点から遠いプローブ端が単独では他の不都合な結合反応に参加できないように プローブを設計するのが望ましい。従って、結合可能な付着末端または平滑末端 ができないようにしなければならない。このような末端を使用する必要があると きは、５′末端リン酸塩を無効にするか、除去するかまたはブロックしなければ ならない。このためには、オリゴヌクレオチドプローブ（５′末端リン酸基を通 常は全く含まない）を合成するか、または、（例えばＤＮＡの制限消化物から作 製されたオリゴヌクレオチドから）末端リン酸基を除去するホス ファターゼ酵素を使用するとよい。代替的に、詳細に後述するように少なくとも 一方のプローブの末端を「フック」またはマーカー部分でブロックすることによ ってプローブの外端の「不都合な」結合を防止してもよい。上記方法のいずれか １つを使用しない場合には、プローブの外端がジグザグになり、従ってプローブ が接合されても対数増幅の鋳型として役に立たない。 増幅後、増幅された配列は当業界で公知の多数の慣用の方法によって検出され 得る。一般に検出は、分離後に分離画分中のラベルの量を測定することによって 行う。勿論、系に添加したラベルの総量を既知数とし、非分離画分中に存在する 量を測定することによって、分離画分中のラベルを減算法で測定してもよい。分 離は、電気泳動、クロマトグラフィー、または、後述の好ましい方法などによっ て行うとよい。 特に好ましい構造では、ハプテンまたは「フック」（ラベルとも呼ばれる）を 少なくとも２つのプローブの空いた外端（融合産物の対向端）、好ましくは４つ のプローブ全部の外端に結合させる。「フック」は結合パートナーに親和性を有 する任意の部分である。一般には、融合産物の一端（例えばＡの５′端及びＡ′ の３′端）のフックが、固相にコートされた特異的結 合試薬（例えば抗体またはアビジン）によって固定化され得る抗原またはハプテ ンから成る。他端（例えばＢの３′端及びＢ′の５′端）の（１つまたは複数の ）フックは、ラベルまたは抗体−酵素複合体のようなラベル系によって認識され 得る異なる抗原またはハプテンを含む。代表的なフックの非限定例としては、色 素原、酵素などの触媒、発光化合物、化学発光化合物、³²Ｐのような放射性元素 、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン、 ダンシル、２−４−ジニトロフェノール、ブロモウラシル及びその他の修飾ヌク レオド、相補的ヌクレオド、レクチン／糖質の対、酵素とその補酵素、並びに当 業界で公知のその他の物質がある。例示できる他のフックとしては、米国特許出 願第０７／８０８，５０８号（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．，「３−フェニル −１−アダマンタン酢酸用ハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体」）に記載さ れているようなアダマンタン酢酸、及び、審査中の共有米国特許出願第０７／８ ０８，８３９号（Ｆｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，「カルバゾール及びジベンゾフラン誘導 体用のハプテン、トレーサー、免疫原及び抗体」）に記載されているようなカル バゾール及びジベンゾフランの誘導体がある。これらの２つの特許 出願は双方とも１９９１年１２月１７日に出願されたものである。 オリゴヌクレオチドの３′端にハプテンを付加する方法は１９９０年１２月２ ０日出願の審査中の共有米国特許出願第０７／６３０，９０８号に開示されてい る。３′及び５′端を標識する他の方法（例えば、Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅ ｒII、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）も公知 であり、実用化されている。５′端にハプテンを付加する方法では、Ｔｈｕｏｎ ｇ，Ｎ．Ｔ．ら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（４６）：６９０５−５９０８ （１９８８）またはＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．ら，米国特許出願第０７／２４６，６ ８８号（ＮＴＩＳオーダー番号Ｐａｔ−Ａｐｐｌ−７−２４６，６８８（１９８ ８））に記載されているようなホスホラミジット試薬を用いる。従って、代表的 な結合オリゴヌクレオチドは、微粒子エンザイムイムノアッセイ（ＭＥＩＡ）法 を用いてＩＭｘ（登録商標）計器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって検出できるように一端にカルバゾール 及び他端にアダマンタンが結合されている。アッセイプロトコルは、実用化され ているα−フェトプロ テインアッセイに使用されるプロトコルと同様であるが以下のごとく変更して用 いる。（１）抗α−フェトプロテイン抗体をコートした微粒子の代わりに抗カル バゾール抗体をコートした微粒子を使用する、（２）抗α−フェトプロテイン抗 体とアルカリホスファターゼとの複合体の代わりに、抗−３−フェニル−１−ア ダマンタン酢酸抗体とアルカリホスファターゼとの複合体を使用する。 また、ＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡアッセイのプロトコルは１９９１年７月３ １日公開のＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第４３９，１８２号にも記 載されている。このプロトコルを以下に簡単に説明する。ＬＣＲで増幅させた１ ００μＬの反応混合物をサンプルウエルにピペットで注入する。次いで３０μＬ のこのサンプルをインキュベーションウエルにピペットで注入し、抗カルバゾー ル抗体をコートした微粒子をウエルに加える。次に、抗カルバゾール抗体とカル バゾール末端を有する核酸配列とから成る複合体を形成させるべくインキュベー ションを適当な期間継続する。インキュベーション後、混合物をＩＭｘ（登録商 標）反応セルのガラス繊維捕獲マトリックスにピペットで注入し、アルカリホス ファターゼに結合させた抗 アダマンタン抗体を加える。この結果として、微粒子−オリゴヌクレオチド−酵 素の複合体が形成され、この複合体はガラス繊維捕獲マトリックスの表面に捕獲 される。洗浄段階で余剰の試薬を除去した後（このプロトコル中にガラス繊維捕 獲マトリックスから溢れる筈の試薬溶液はガラス繊維捕獲マトリックス下方の吸 取紙によって吸収される）、ガラス繊維捕獲マトリックスを４−メチルウンベリ フェリルホスフェート（ＭＵＰ）によって処理する。表面に結合した酵素は蛍光 非発生ＭＵＰを４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）に変換させ、ＭＵの蛍光を 測定し得る。以下の実施例で与えられた数値は、カウント数／秒／秒（ｃ／ｓ／ ｓ）で表されるこの方法の速度読取り値である。結合プローブの量はこの速度に 正比例する。標識オリゴヌクレオチドをＭＥＩＡで読出すというこの考え方は、 １９９０年３月７日公開のＬａｆｆｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．らの欧州特許出願公開第３ ５７，０１１号「標的核酸配列の検出及び増幅」、及びその他の文献に記載され ている。 以下の代表例では、プローブ対を「フルオレセイン」ハプテン及び「ビオチン 」ハプテンで標識するか、または「カルバゾール」ハプテン及びアダマンタン酢 酸（「アダマンタン」）ハ プテンで標識する。一般には、上記のように「フルオレセイン」と「ビオチン」 とを一緒に使用し、「アダマンタン」と「カルバゾール」とを一緒に使用するが 、事実上はいかなるハプテンのいかなる組合わせも可能であろう。好ましくは、 プローブ対の成員の各々を異なるラベルで標識する。 殆どの実施例において、ＩＭｘ（登録商標）計器で結果を読取った。この計器 は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌ ｌｉｎｏｉｓ）から市販されており、欧州特許出願公開第２８８，７９３号及び Ｆｉｏｒｅ，Ｍ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４／９：１７２６−１７３２（ １９８８）に記載されている。ＩＭｘ（登録商標）計器は一般に、５−１２カウ ント数／秒／秒の「マシーン」ノイズ即ちバックグラウンドを発生することに留 意されたい。本発明の実施に使用し得る同様に適当な他の検出方法としては、Ｅ ＬＩＳＡ、ＥＩＡ及びイムノクロマトグラフィー、並びに、ザサンブロッティン グ、ドットブロッティング、スロットブロッティング、溶液ハイブリダイゼーシ ョン、などの核酸ハイブリダイゼーション法、並びに他の当業界で公知の方法が ある。 ポリメラーゼの量は以下のごとく定義される単位で表す。酵 素１単位は、合計１０ナノモルのヌクレオチドを酸不溶性物質に７０℃、３０分 間で取込ませるために必要な酵素の量に等しい。本文中のリガーゼ酵素の単位は 、１ｍｇの９５％純度の好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） のＤＮＡリガーゼが約１×１０⁸単位の比活性を有すると定義する。この単位は 正確に標準化されていないので最大２０％の範囲で変化するが、最適な値は通常 の知識を有する当業者に明らかであろう。 以下に本発明を実施例によって説明するが、これらの実施例は本発明の代表例 であって本発明を少しも限定するものではない。例えば、表には特定長さの配列 を示している。塩基数に多少の増減を有するが同じマップ位置を包含する配列は これらの配列と等価であり、表に示した配列と同じ位置で標的にハイブリダイズ する限り本発明の範囲に包含されると考えられることを理解されたい。また、標 的配列に約８０％以上の相同性を有する配列も本発明の範囲内に包含されると理 解されたい。本発明の配列中の何らかの塩基置換は修飾された末端から３ヌクレ オチド以上離れて存在するのが好ましい。 ギャップ充填による延長部が正確に結合点で終結し、延長プ ローブがプローブパートナーに隣接して該パートナーに結合できるように、標的 配列及びプローブは、１９９１年７月２１日公開の欧州特許出願公開第４３９， １８２号にＫ．Ｂａｃｋｍａｎらによって教示されている「停止塩基」を含むよ うに選択した。 以下の実施例のライン希釈剤（ＬＤ）は、標的ＤＮＡ及びプローブの非存在下 のマシーンノイズを検出するために使用した標準ＩＭｘ（登録商標）緩衝試薬で ある。データはいずれもＩＭｘ（登録商標）速度をカウント数／秒／秒（ｃ／ｓ ／ｓ）で表す。実施例 実施例１：プローブセット１（配列番号２、３、４及び５）を用いたＭ．ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中で、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのタンパ ク質抗原ｂ（ｐａｂ）遺伝子のヌクレオチド３４７−３９０（配列番号１）に対 応する標的配列を検出するためにプローブセット１（配列番号２、３、４及び５ ）を選択した。ＬＣＲ反応混合物は、５０ｍＭのＥＰＰＳと、３０ｍＭのＭｇＣ ｌ₂と、２０ｍＭのＫ⁺（ＫＯＨ及びＫＣｌに由来） （ＬＣＲバッファ）と、１０μＭのＮＡＤと、１．７μＭのｄＡＴＰと、１．７ μＭのｄＣＴＰ（ギャップ充填ヌクレオチド）と、１×１０²分子の各オリゴヌ クレオチドプローブと、１８，０００単位の好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ ｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡリガーゼと、２単位の好熱菌ポリメラーゼ（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ， ｃａｔ．ｎｏ．１０７０．０１）と、２μｇのヒト胎盤ＤＮＡと、表１に示す標 的ＤＮＡとを最終容量２００μｌ中に含有していた。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０型サーモサイクラーによるサイクル処理を、１サイクルあたり９３℃で１ 秒間；６５℃で１秒間；６８℃で１分間１５秒に設定し、合計４０サイクル実施 した。プローブを前述のようにカルバゾール及びアダマンタンで標識した。増幅 後、前述のＡｂｂｏｔｔの自動ＩＭｘ（登録商標）分析装置を用いたサンドイッ チイムノアッセイによって結合産物を検出した。 表１は、１０、２５及び１００分子のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄ ｍａｎに由来の標的ＤＮＡ分子にプローブセット１を用いたＬＣＲの結果を示す 。表１はまた、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａ ｎｓａｓ ｉｉに由来の標的ＤＮＡ及びヒト胎盤のＤＮＡを用いたＬＣＲの結果も示す。 これらの実験の結果は、プローブセット１（配列番号２、３、４及び５）が１ ０分子という少数のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＤＮＡを検出できたこ と、及び、１０⁷ゲノムという多数のＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌ ｕｌａｒｅ及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのＤＮＡと交差反応を示さなかったことを 示す。実施例２：プローブセット２（配列番号７、８、９及び１０）を用いたＭ．ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中で、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｐａｂ 遺伝子のヌクレオチド３５０−３８７（配列番号６）に対応する標的配列を検出 するためにプローブセット２（配列番号７、８、９及び１０）を選択した。ヒト 胎盤ＤＮＡを３３０ｎｇ／ｒｘｎの濃度で存在させ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０型サーモサイクラーによるサイクル処理を、１サイクルあたり９４℃で１ 秒間；５５℃で１秒間；６０℃で５５秒間に設定して合計４０サイクル実施した 以外は、実施例１と同様にしてＬＣＲを実施した。反応あたりの存在量は、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的ＤＮＡの場合１０分子／反応であり、他の標的Ｄ ＮＡは１×１０⁵分子／反応であった。プロ ーブをカルバゾール及びアダマンタンで標識し前述のように検出した。結果を表 ２に示す。 結果は、プローブセット２（配列番号７、８、９及び１０）が１０分子／反応 という少数のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡを検出できるが、１×１０⁵ 分子／反応で存在する他の標的ＤＮＡは検出可能なシグナルを殆ど与えなかっ たことを示す。実施例３：プローブセット３（配列番号１２、１３、１４及び１５）を用いたＭ ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中で、ＩＳ９８７近傍の直列反復配列のヌクレ オチド２５４４−２５９３（配列番号１１）に対応する標的配列を検出するため にプローブセット３（配列番号１２、１３、１４及び１５）を選択した。ギャッ プ充填ヌクレオチドがｄＣＴＰ及びｄＴＴＰであった以外は実施例１と同様にし て反応させた。標的ＤＮＡの種類及び濃度を表３に示す。更に、各オリゴヌクレ オチドプローブを１×１０¹²分子及び２×１０¹²分子の双方の濃度で用いてＬＣ Ｒを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーによるＬＣ Ｒサイクル処理を、１サイクルあたり９３℃で１秒間；６７℃で１秒間；７０℃ で１分１５秒間に設定して実施した。 プローブを前述のようにカルバゾール及びアダマンタンで標 識し、前述の全自動ＩＭｘ（登録商標）分析装置を用いてデータを採取した。 これらのデータは、プローブセット３（配列番号１２、１３、１４及び１５） が１×１０¹²のプローブ分子／ｒｘｎまたは２×１０¹²のプローブ分子／ｒｘｎ を用いることによって２５分子及び１００分子のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ の標的ＤＮＡを検出できたことを示す。実施例４：プローブセット４（配列番号１７、１８、１９及び２０）を用いたＭ ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中で、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ様 要素ＩＳ６１１０のヌクレオチド５３５−５７８（配列番号１６）に対応する標 的配列を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブセット４（配列番号１７、 １８、１９及び２０）を選択した。これらの実験では、ギャップ充填にｄＣＴＰ 及びｄＴＴＰを使用し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーに よるサイクル処理を１サイクルあたり９４℃で１秒間；６５℃で１秒間；７０℃ で５５秒間に設定して合計４０サイクル行う以外は、実施例１と同様にして反応 させた。標的ＤＮＡの種類及び量を表４に示す。次いで反応産物を冷却し、実施 例１と同様に分析した。プローブを前述のようにカルバゾール及びアダマンタン で標識した。 これらのデータは、プローブセット４（配列番号１７、１８、１９及び２０） が１０分子という少数のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓの標的ＤＮＡを検出できることを示す。Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒｅ １４１９、Ｍ．ａｖｉｕｍ ＣＳＵＳｅｒ＃１及びＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ １２０３に由来の１０⁶分子の標的ＤＮＡをプローブセット４（配列番号１７ 、１８、１９及び２０）で試験したときは、１つの明らかな「例外サンプル」を 除いてシグナルは全く発生しなかった。ヒト胎盤ＤＮＡ（２μｇ）は平均ＩＭｘ （登録商標）速度２５．９２ｃ／ｓ／ｓを与えたが、これは３つの例外サンプル を原因とする不自然な高値である。実施例５：プローブセット５（配列番号２２、２３、２４及び２５）のＭ．ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異性 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｐａｂ遺伝子のヌクレオチド５８５−６２７ （配列番号２１）に対応する標的ＤＮＡを検出するためにオリゴヌクレオチドプ ローブセット５（配列番号２２、２３、２４及び２５）を選択した。 各反応を、ＬＣＲバッファ中で実施し、反応混合物は５×１０¹¹分子の各プロ ーブ／ｒｘｎと、３，４００単位のリガーゼと、０．５単位のポリメラーゼと、 ５０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡと、２０００コピー／反応の標的ＤＮＡとをすべて最 終 容量５０μｌ中に含有していた。ギャップ充填ヌクレオチドはｄＣＴＰであった 。反応混合物に鉱油を重層させ、ＣＯＹサーモサイクラーによるサイクル処理を 、１サイクルあたり８５℃で３０秒間；５５℃で２０秒間に設定して４５サイク ル行った。次に５０μｌのサンプルをＩＭｘ（登録商標）ライン希釈剤で２００ μｌに希釈し、ＩＭｘ（登録商標）処理に適した量にした。ラベルはビオチン及 びフルオレセインであった。 結果を表５に示す。 この実験のＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ ＬＲ１３０のＩＭｘ（登録商標） 速度は、データの分散が大きいこと（１６８７．５ｃ／ｓ／ｓと４１６．１ｃ／ ｓ／ｓ）、及び、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ １３０２の平均が８．１ｓｃ ／ｓ／ｓという低い値を示していることを考えると、信憑性がない。恐らくはサ ンプルＬＲ１３０が汚染されていることが原因で得られた値であろう。同様にＭ ．ｃｈｅｌｏｎａｅの場合にも、IＭｘ（登録商標）速度３１７．９ｃ／ｓ／ｓ 及び４７．５ｃ／ｓ／ｓという信じ難い高い値が読取られたので平均ＩＭｘ（登 録商標）速度が異常に高い値となったが、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ１３４３のＩＭ ｘ（登録商標）速度は８．３ｃ／ｓ／ｓ及び８．４ｓｃ／ｓ／ｓにすぎなかった 。同様にＭ．ｐｈｌｅｉも、反応の１つがＩＭｘ（登録商標）速度５１０．５ｃ ／ｓ／ｓを示したので得られた平均ＩＭｘ（登録商標）速度が異常に高い値とな ったが、この反応の重複試験は速度９．１ｃ／ｓ／ｓを示したのでＭ．ｐｈｌｅ ｉ １５１６の平均速度は８．７ｃ／ｓ／ｓとなった。実施例６：プローブセット６（配列番号２６、２７、２８及び２９）を用いたＭ ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 プローブセット５（配列番号２６、２７、２８及び２９）を用いてＭ．ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓのタンパク質抗原ｂ（ｐａｂ）遺伝子のヌクレオチド５８５ −６２７（配列番号２１）に対応する標的配列を検出するために上述のＬＣＲ法 の変法を使用した。この実施例で使用したＬＣＲ法と実施例１との違いは、この 実施例では、２セットの平滑端プローブを使用し、プローブＢの５′端が、反応 に使用されたＤＮＡポリメラーゼの５′から３′方向のエキソヌクレアーゼ活性 によって結合する前に補正された標的に対するミスマッチを有していることであ る。「エキソ」法または「ニックトランスレーション」法などの種々の呼び名で 知られるこの方法の基本原理は、１９９２年８月３日出願の審査中の共有米国特 許出願第０７／９２５，４０２号により詳細に記載されている。 実施例１に記載の反応条件を使用した。しかしながら、この変形ＬＣＲ法の効 率に対してポリメラーゼの濃度増加が与える効果を判断するために、ＤＮＡポリ メラーゼを２単位及び４単位の双方の濃度で使用して反応を実施した。この特定 ＬＣＲ法 では、１種類だけのギャップ充填ヌクレオチド三リン酸の存在が必要であり、こ の場合にはｄＣＴＰを用いた。標的ＤＮＡは反応あたり２５分子存在していた。 Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーによるサイクル処理を、１ サイクルあたり９３℃で１秒間；６２℃で１秒間；６５℃で１分３０秒間に設定 して５０サイクル繰返した。プローブをカルバゾール及びアダマンタンで標識し た。結合産物を前述のように自動ＩＭｘ（登録商標）分析装置を用いて検出した 。ポリメラーゼが夫々２単位及び４単位の場合に実験は夫々１７４５．７ｃ／ｓ ／ｓ及び１７３４．３ｃ／ｓ／ｓというほぼ同じ平均ＩＭｘ（登録商標）速度を 示した。２μｇ／ｒｘｎのヒト胎盤ＤＮＡと夫々２単位及び４単位のポリメラー ゼとを用いた対照実験は夫々１１．３２ｃ／ｓ／ｓ及び１２．４４ｃ／ｓ／ｓと いうほぼ同じＩＭｘ（登録商標）速度を示した。実施例７：プローブセット７（配列番号３０）３１、３２及び３３）を用いたＭ ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｐａｂ遺伝子のヌクレオチド５８５−６３３ （配列番号２１）に対応する標的ＤＮＡを検出するためにオリゴヌクレオチドプ ローブセット７（配列番号 ３０、３１、３２及び３３）を選択した。ヒト胎盤ＤＮＡが３００ｎｇ／ｒｘｎ の量で存在し、ギャップ充填にｄＧＴＰとｄＴＴＰとを使用し、Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーによるサイクル処理を１サイクルあたり９ ３℃で１秒間；６２℃で１秒間；６５℃で１分１０秒間に設定して４０サイクル 繰返したこと以外は、実施例１と同様にＬＣＲを実施した。プローブを前述のよ うにアダマンタン及びカルバゾールで標識した。結合産物を実施例１と同様に検 出した。表７はアッセイの結果を示す。 これらのデータは、プローブセット７（配列番号３０）３１、３２及び３３） がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから１０分子という少数の標的ＤＮＡを検出で きたことを示す。実施例８：プローブセット９（配列番号４０）４１、４２及び４３）を用いたマ イコバクテリウム属の細菌の検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド７２ １−７６０（配列番号３９）に対応する標的配列を検出するためにオリゴヌクレ オチドプローブセット９（配列番号４０、４１、４２及び４３）を選択した。Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーによるサイクル処理を１サイ クルあたり９４℃で１秒間；５５℃で１秒間；６０℃で４０秒間に設定して合計 ４０サイクル繰返し、ヒト胎盤ＤＮＡが３００ｎｇ／ｒｘｎの量で存在し、各プ ローブが７．５×１０¹¹分子／反応の量で存在したこと以外は、実施例１と同様 にＬＣＲを実施した。ギャップ充填ヌクレオチドはｄＣＴＰ及びｄＴＴＰであっ た。プローブを夫々フルオレセイン及びビオチンで標識した。表８はこれらのア ッセイの結果を示す。 これらの結果は、１６Ｓの７２１−７６０に対応するプローブセットがマイコ バクテリウム属の多数の種及び菌株を検出し得ることを示す。実施例９：プローブセット１１（配列番号５０、５１、５２及び５３）を用いた マイコバクテリウム属の細菌の検出 マイコバクテリウム属の細菌の検出にプローブセットを使用する目的で、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの６５ｋＤの熱ショック遺伝子のヌクレオチド２４４ −２８６（配列番号４９）に対応する標的配列を検出するためにオリゴヌクレオ チドプローブセット１１（配列番号５０、５１、５２及び５３）を選択した。ギ ャップ充填ヌクレオチドがｄＴＴＰである以外は実施例５と同様にＬＣＲを実施 した。表９で特に注釈がない限り、マイコバクテリウムの標的ＤＮＡは１０ｐｇ ／ｒｘｎで存在し、これは典型的なマイコバクテリウムゲノムの約２，０００コ ピーと等価である。最終反応容量は５０μｌであった。ＣＯＹサーモサイクラー によるサイクル処理を１サイクルあたり８５℃で３０秒間；５５℃で２０秒間に 設定して４０サイクル繰返した。ラベルはビオチン及びフルオレセインであった 。反応産物を実施例１に記載の手順で分析した。結果を表９に示す。デー タは、プローブセット１１（配列番号５０）５１、５２及び５３）がＭ．ｆｏｔ ｕｉｔｕｍ及びＭ．ｔｅｒｒａｅ由来の標的ＤＮＡ以外の試験した全部の標的Ｄ ＮＡを検出したことを示す。 実施例１０：プローブセット１２（配列番号５５、５６、５７及び５８）を用い たマイコバクテリウム属の細菌の検出 マイコバクテリウム属の細菌用プローブとしてプローブセットを使用する目的 で、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの６５ｋＤの熱ショック遺伝子のヌクレオチ ド４０５−４５２（配列番号５４）に対応する標的配列を検出するためにオリゴ ヌクレオチドプローブセット１２（配列番号５５、５６、５７及び５８）を選択 した。ギャップ充填ヌクレオチドがｄＡＴＰ及びｄＧＴＰであり、ヒト胎盤ＤＮ Ａが３３０ｎｇ／ｒｘｎの量で存在し、各プローブが６×１０¹²プローブ／ｒｘ ｎの量で存在し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモサイクラーによるサ イクル処理を１サイクルあたり９４℃で１秒間；５５℃で１秒間；６０℃で５５ 秒間に設定して合計４０サイクル繰返した以外は、実施例１と同様にＬＣＲを実 施した。プローブをビオチン及びフルオレセインで夫々標識した。 次に、実施例１に記載した自動ＩＭｘ（登録商標）手順によって反応産物を分 析した。これらの実験の結果を表１０に示す。標的ＤＮＡの種類及び量を表１０ に示す。 データは、プローブセット１２（配列番号５５、５６、５７及び５８）がＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒｅの各々から１０，０００分子のゲノムＤＮＡを検出できたことを示す。実施例１１：プローブセット１３（配列番号６０）６１、６２及び６３）を用い たマイコバクテリウム属の細菌の検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１０ｋＤの熱ショックタンパク質遺伝子のヌ クレオチド４７７−５２４（配列番号５９）に対応する標的ＤＮＡ配列を検出す るためにオリゴヌクレオチドプローブセット１３（配列番号６０、６１、６２及 び６３） を選択した。ギャップ充填ヌクレオチドがｄＴＴＰ及びｄＧＴＰであり、プロー ブの各々が２×１０¹¹分子で存在し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サーモ サイクラーによるサイクル処理を１サイクルあたり９４℃で１秒間；６０℃で１ 秒間；６５℃で５５秒間に設定して４０サイクル繰返した以外は、実施例１と同 様にＬＣＲを実施した。プローブをカルバゾール及びアダマンタンで夫々標識し た。次に、実施例１に記載の全自動ＩＭｘ（登録商標）手順によって反応産物を 分析した。標的ＤＮＡの種類及び量を表１１に示す。これらの実験の結果を表１ １にまとめる。 これらのデータは、プローブセット１３（配列番号６０、６１、６２及び６３ ）が試験したマイコバクテリウムの種及び菌株から１００分子という少数の標的 ＤＮＡを検出できたことを示す。更に、プローブセットはヒト胎盤ＤＮＡを含む 反応で使用したときはシグナルを殆どまたは全く発生しなかった。実施例１２：プローブセット１４（配列番号６５、６６、６７及び６８）を用い たマイコバクテリウム属の細菌の検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳのリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオ チド１０５９−１０９８（配列番号６４）に対応する標的ＤＮＡを検出するため にオリゴヌクレオチドプローブセット１４（配列番号６５、６６、６７及び６８ ）を選択した。プローブの各々が５×１０¹¹分子で存在し、反応混合物が３３０ ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡを含む以外は実施例１と同様にＬＣＲアッセイを実施した 。ギャップ充填ヌクレオチドはｄＡＴＰ及びｄＧＴＰであった。プローブをビオ チン及びフルオレセインで夫々標識した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０型サ ーモサイクラーによるサイクル処理を、１サイクルあたり９４℃で１秒間；５７ ℃で１秒間；６２℃で２０秒間に設定して合計４０サイクル繰返した。反応産物 を実施例１と同様に分析した。結果を表１２に示す。 結果は、プローブセット１４（配列番号６５、６６、６７及び６８）が１，０ ００分子の試験した標的ＤＮＡを全て検出できたことを示す。実施例１３：プローブセット１５（配列番号６９、７０、７１及び７２）を用い たマイコバクテリウム属の細菌の検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（及び他の細菌）の１６ＳのリボソームＲＮＡ のヌクレオチド６９０−７３２（配列番号３４）に対応する標的ＤＮＡを検出す るためにオリゴヌクレオチドプローブセット１５（配列番号６９、７０、７１及 び７２）を選択した。ギャップ充填ヌクレオチドがｄＡＴＰであり、各プローブ を２×１０²分子の量で使用した以外は実施例５と同様にＬＣＲを実施した。プ ローブをビオチン及びフルオレセインで標識した。反応混合物に鉱油を重層し、 ＣＯＹサーモサイクラーによるサイクル処理を１サイクルあたり８５℃で３０秒 間；４０℃で３０秒間に設定して４５サイクル繰返した。反応産物を実施例１と 同様に分析した。結果を表１３に示す。 これらの結果は、プローブセット１５がマイコバクテリウム属の少なくとも４ 種から標的ＤＮＡを検出できたことを示す。実施例１４：プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）を用いた マイコバクテリウム属の細菌の検出 Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（及び他の細菌）の１６ＳのリボソームＲＮＡ 遺伝子のヌクレオチド６９０−７３２（配列番号３４）に対応する標的ＤＮＡを 検出するためにオリゴヌクレオチドプローブセット８（配列番号３５、３６、３ ７及び３８）を選択した。プローブが２×１０²分子／反応の量で存在し、サイ クル処理を１サイクルあたり８５℃で３０秒間；５５℃で３０秒間に設定して合 計４５サイクル繰返した以外は実施例５と同様にＬＣＲを実施した。反応産物を 実施例１と同様に分析した。プローブをビオチン及びフルオレセインで夫々標識 した。結果を表１４に示す。 これらの結果は、プローブセット８がマイコバクテリウム属の数種の細菌から 標的ＤＮＡを検出できたことを示す。しかし ながらこのプローブはＭ．ｔｅｒｒａｅから標的ＤＮＡを検出することはできな かった。実施例１５：プローブセット１６（配列番号７３、７４、７５及び７６）を用い たマイコバクテリウム属の細菌の検出 種々のマイコバクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的ＤＮＡを検出 するためにオリゴヌクレオチドプローブセット１６（配列番号７３、７４、７５ 及び７６）を選択した。ギャップ充填ヌクレオチドとしてｄＡＴＰを用い各プロ ーブを２×１０²分子の量で使用して実施例１と同様にＬＣＲを実施した。Ｓｕ ｔｔｅｒ Ｄｕｎｋｅｒサーモサイクラーによるサイクル処理を１サイクルあた り８５℃で８５秒間；６２℃で１２０秒間に設定して合計４０サイクル繰返した 。反応産物を実施例１と同様に分析した。結果を表１５に示す。 これらのデータは、プローブセット１６（配列番号７３、７４、７５及び７６ ）がマイコバクテリウム属の細菌から標的ＤＮＡのサブセットを検出できたこと を示す。実施例１６：プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）及び１６ （配列番号７３、７４、７５及び７６）から選択されたプローブによるマイコバ クテリウム属の細菌の検出 種々のマイコバクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する標的配列 を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブセット８（配列番号３５、３６、 ３７及び３８）及び１６（配列番号７３、７４、７５及び７６）を選択した。Ｓ ｕｔｔｅｒ Ｄｕｎｋｅｒによるサイクル処理を１サイクルあたり８５℃で５５ 秒間次いで６２℃で８５秒間に設定して合計４０サイクル繰返した以外は実施例 １と同様にＬＣＲを実施した。反応産物を実施例１と同様に分析した。プローブ を前述のようにカルバゾール及びアダマンタンで標識した。ヒト胎盤ＤＮＡは３ ３０ｎｇ／反応で存在した。 以下のプローブグループを使用した。 グループ１：セット８（ＧＳＭ１Ａ）のプローブＡ（配列番号 ３５）及びＡ′（配列番号３６）； セット１６（ＧＳＭ１Ｂ）のプローブＡ（配列番 号７３）及びＡ′（配列番号７４） グループ２：セット１６（ＧＳＭ１Ｂ）のプローブＢ（配列番 号７５）及びＢ′（配列番号７６） グループ３：セット８（ＧＳＭ１Ａ）のプローブＡ（配列番号 ３５）、プローブＡ′（配列番号３６）、プロー ブＢ（配列番号３７）、及び、プローブＢ′（配 列番号３８） 表１６は使用したプローブの組合わせとそれらの濃度とを示す。 これらの組合わせの各々を用いて得られた結果を表１７に示す。 これらの結果は、グループ１及び２を組合わせたプローブセットがＭ．ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅの双方を検出したことを示す。実施例１７：プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）及びプロ ーブセット１６（配列番号７３、７４、７５及び７６）の混合物を用いたマイコ バクテリウム属の細菌の検出 種々のマイコバクテリアの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する標的ＤＮ Ａを検出するためにオリゴヌクレオチドプローブセット８（配列番号３５、３６ 、３７及び３８）及びオリゴヌクレオチドプローブセット１６（配列番号７３、 ７４、７５及び７６）を併用した。８つのプローブ全部が５×１０¹¹分子／反応 で存在し、ＣＯＹサーモサイクラーによるサイクル処理を５５℃で３０秒間；８ ５℃で２０秒間に設定して合計４５サイクル繰返した以外は実施例５と同様にＬ ＣＲを実施した。反応産物を実施例１と同様に分析した。プローブをビオチン及 びフルオレセインで標識した。結果を表１８に示す。 これらの結果は、プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）及 び１６（配列番号７３、７４、７５及び７６） の組合わせが試験したマイコバクテリウム属細菌種の全部から標的ＤＮＡを検出 できたことを示す。実施例１８：プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）及び１６ （配列番号７３、７４、７５及び７６）から選択されたプローブによるマイコバ クテリウム属の細菌の検出 図２Ａに示すように、ＧＳＭ１Ａ（プローブセット８）とＧＳＭ１Ｂ（プロー ブセット１６）との３つの違いは、Ａ／Ａ′中の２つの位置とＢ／Ｂ′中の１つ の位置とに存在する。先行実施例で示唆したように、２つのプローブセットはマ イコバクテリアの異なるサブセットを検出する。従って、双方のサブセットの検 出を改善する目的で、ＧＳＭ１ＡのプローブとＧＳＭ１Ｂのプローブとを種々の 割合で組合わせて広範囲のマイコバクテリウム種の検出用プローブとして使用し た。 好ましい方法においては、ＧＳＭ１Ａ及びＧＳＭ１ＢのＡ／Ａ′対を夫々２： １で組合わせ、合計濃度はＡ／Ａ′＝Ｂ／Ｂ′とした。 ＧＳＭ１ＡのＡ／Ａ′が２．６７×１０¹²/ｒｘｎ、ＧＳＭ１ＢのＡ／Ａ′が １．３３×１０¹²/ｒｘｎ、ＧＳＭ１ＢのＢ／Ｂ′が４×１０¹²／ｒｘｎ及びヒ ト胎盤ＤＮＡが３３０ｎｇ ／ｒｘｎの量で存在するようにオリゴヌクレオチドプローブの量を変更した以外 は、実施例１と同様にＬＣＲを実施した。Ｓｕｔｔｅｒ ｄｕｎｋｅｒによるサ イクル処理を１サイクルあたり８５℃で８５秒間；６２℃で８５秒間に設定して 合計４０サイクル繰返した。反応産物を実施例１と同様に検出した。マイコバク テリウムの標的ＤＮＡは１００コピー／ｒｘｎの濃度で存在していた。マイコバ クテリウムでない標的ＤＮＡは１０ｎｇ／ｒｘｎ（約１×１０⁶分子）の濃度で 存在していた。プローブを前述のようにカルバゾール及びアダマンタンで標識し た。結果を表１９に示す。 これらの結果は、プローブセット８（配列番号３５、３６、３７及び３８）と プローブセット１６（配列番号７３、７４、７５及び７６）との組合わせが、マ イコバクテリウム属の多くの種類の細菌から標的ＤＮＡを検出できたことを示す 。 上記実施例は代表例であって、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定す るものではない。例えば、配列表には特定長さの配列を示している。塩基数に多 少の増減はあるとしても同じマップ位置を包含している配列は、配列表の配列と 同じ位置で標的にハイブリダイズするならば、配列表の配列に等価であると考え られ本発明の範囲に包含されると理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイビス，アラン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、シツクス・セント・アイブ ズ・レーン（番地なし) (72)発明者 センプル−フエイシー，イングリツド・イ ー アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ビー チ・パーク、チユーエス・レーン・1120 (72)発明者 マンラブ，マシユー・テイー アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、エコー・コート・11、アパ ートメント５ (72)発明者 ソロモン，ナタリー・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツ フアロー・グローブ、ソーンデイル・ドラ イブ・467 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１０〜約５０ヌクレオチドの長さを有し、ハイブリダイズ条件下で配列番号 １、１１、１６または２１で示される配列またはその相補配列とハイブリダイズ すべく前記配列に対して十分な相補性または相同性を有しており、他の生物との 交差反応を実質的に生じることなく結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出することを特徴とするＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから標的ＤＮＡを検出するために有用なオリゴヌ クレオチドプローブ。 ２．前記プローブが配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、 １４、１５、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、 ２８、２９、３０、３１、３２及び３３で示されるプローブから成るグループか ら選択されることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 ３．サンプル中のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの標的ＤＮＡの存在を検出する 方法であって、 （ａ）前記標的ＤＮＡ含有被疑サンプルを準備し、 （ｂ）前記標的ＤＮＡを変性し、 （ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るラベルを結合させた請求項１または２に 記載のオリゴヌクレオチドを前記標的ＤＮＡとハイブリダイズさせ、 （ｄ）発生したシグナルを検出することによって前記標的ＤＮＡの存在を判定す る段階から成る方法。 ４．更に、前記ハイブリダイズ段階に加えて、少なくとも一回の標的増幅段階を 含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．前記増幅段階がリガーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項４に記載の 方法。 ６．プローブセット１（配列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−１ ０）、プローブセット３（配列番号１２−１５）、プローブセット４（配列番号 １７−２０）、プローブセット５（配列番号２２−２５）、プローブセット６（ 配列番号２６−２９）及びプローブセット７（配列番号３０−３３）並びにその 組合わせから成るグループから選択されることを特徴とするサンプル中のＭ．ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから標的ＤＮＡを検出するために有用な組成物。 ７．サンプル中のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの標的ＤＮＡの存在を検出する ためのリガーゼ連鎖反応を利用する方法であって、前記リガーゼ連鎖反応が、 （ａ）前記標的ＤＮＡ含有被疑サンプルを準備する段階と、 （ｂ）請求項６に記載のプローブセットを１組以上準備し、前記プローブセット のプローブの少なくとも１つを検出可能ラベルで標識する段階と、 （ｃ）リガーゼを準備する段階と、 （ｄ）（Ｉ）前記プローブセットを前記標的ＤＮＡ含有被疑サンプルと混合し、 （II）前記プローブセットと前記標的ＤＮＡ含有被疑サンプルとの前記混合物を 変性し、 （III）前記変性プローブセットを前記変性標的ＤＮＡにハイブリダイズさせて ハイブリダイズしたプローブを作製し、 （IV）前記ハイブリダイズしたプローブを鋳型依存的に補正し、 （Ｖ）前記延長上に隣合うプローブを前記リガーゼを用いて結合させて再編成プ ローブを形成し、 （VI）前記再編成プローブ中の前記ラベルを検出する段階から成るサィクルを少 なくとも一回実行する段階から成り、前記段 階（Ｉ）と（II）とを逆の順序で行ってもよいことを特徴とする方法。 ８．段階（ｃ）が更に、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸とポリメラー ゼとの準備を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．前記段階II〜VIを約１０回〜約５０回繰返すことを特徴とする請求項７に記 載の方法。 １０．前記リガーゼが熱安定リガーゼであることを特徴とする請求項７に記載の 方法。 １１．前記ポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請 求項７に記載の方法。 １２．前記ラベルが特異的結合パートナーから成ることを特徴とする請求項７に 記載の方法。 １３．前記プローブセットが２つのラベルを有しており、プローブパートナーが 異なるラベルを有していることを特徴とする請求項７に記載の方法。 １４．前記プローブセットが２つの結合パートナーを有しており、プローブパー トナーが異なる結合パートナーを有していることを特徴とする請求項１２に記載 の方法。 １５．前記再編成プローブ中の前記ラベルをサンドイッチイムノアッセイを用い て検出することを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの標的ＤＮＡの検出に有用なキットであっ て、 （ａ）プローブセット１（配列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７− １０）、プローブセット３（配列番号１２−１５）、プローブセット４（配列番 号１７−２０）、プローブセット５（配列番号２２−２５）、プローブセット６ （配列番号２６−２９）及びプローブセット７（配列番号３０−３３）並びにそ の組合わせから成るグループから選択された１組以上のプローブセツトと、 （ｂ）ポリメラーゼ試薬と、 （ｃ）リガーゼ試薬と を収容した１つ以上の適当な容器から成ることを特徴とするキット。 １７．前記プローブセットのプローブの少なくとも１つが検出可能なラベルを有 していることを特徴とする請求項１６に記載のキット。 １８．プローブ対が２つの異なるラベルを有していることを特徴とする請求項１ ６に記載のキット。 １９．ポリメラーゼ及びリガーゼが熱安定性であることを特徴とする請求項１６ に記載のキット。