JP4280788B2 - Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種用の核酸プローブおよび増幅オリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

発明の分野
ここに記載され特許請求される本発明は、被験試料中の淋菌および髄膜炎菌の検出を可能とする、淋菌および髄膜炎菌に対する増幅オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブの設計および使用に関する。

発明の背景
ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属には、ヒトに病原性であり、他の既知の保有宿種を有しない化膿性球菌の２つのグラム陰性種：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が含まれる。多くの非病原性種もまたヒトの上部呼吸管に住み、髄膜炎菌と容易に混同される。髄膜炎菌性髄膜炎は、１９世紀の始めには感染性疾患として認識されており、特に軍人の間で流行している。髄膜炎菌性髄膜炎の原因病原体は髄膜炎菌である。

淋菌は、流行性の性的感染症の主要因の１つであり、米国で流行している。淋菌による感染は、尿道炎、子宮頸炎、および直腸炎等の多くの一般的な症状を引き起こす。さらに、淋菌による慢性的感染は、骨盤炎症性疾患の原因となりうる。

ナイセリアはグラム陰性の球菌であり、多糖類含有カプセルを有する髄膜炎菌に成長する。淋菌もまたカプセルを有するが、このようなカプセルの正確な化学組成はわかっていない。さらに、淋菌および髄膜炎菌の両方とも毒性に役割を果たす線毛を有するかもしれない。

髄膜炎菌および淋菌は、培養するのが困難であり、体液から生物を増殖させるためには特殊な技術を必要とする。さらに、生物の培養物を最大にするためには、選択的培地（例えば、Ｔｈａｙｅｒ−Ｍａｒｔｉｎ培地）および３−１０％の二酸化炭素中で約３５℃での増殖が必要である。

難しい培養に加え、イムノアッセイによる淋菌および髄膜炎菌の検出は、感度および特異性がないという欠点を有する。これは、同一の臨床標本にしばしば見いだされる種々の他の病原体および非病原性微生物との間の交叉反応のためであるようである。

ナイセリアの検出のための核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドが記載されている。Ｂｉｋｅｎｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：３０８９−３０９４（１９９２）は、リガーゼ連鎖反応において用いるための、淋菌のＯｐａおよびｐｉｌｉｎ遺伝子に対するプローブの組を記載する。Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４０：１４３２−１４３４（１９９２）は、髄膜炎菌の増幅および検出のための、ＩＳ１１０６と称される挿入エレメントに対するプライマーを記載する。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ７：７−１７（１９９３）は、ポリメラーゼ連鎖反応において用いるための、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡの内部転写スペーサーに対するプライマー、および髄膜炎菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのサブ領域に対する１組のプライマーを記載する。淋菌および／または髄膜炎菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列の検出のためのプローブは、Ｇｒａｎａｔｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｚ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：９４４−９４８（１９９０），Ｗｏｌｆｆ，米国特許５，１７３，４０１（１９９２年１２月２２日）、ＲｏｓｓａｕおよびＶａｎ Ｈｅｕｖｅｒｓｗｉｊｎ，欧州特許出願公開０３３７８９６，Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９、およびＢａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，２１７，８６２（１９９３年６月８日）により記載されている。

発明の概要
本発明は、ナイセリアのｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）またはｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的であるように設計された、新規かつ有用な増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ、またはナイセリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列またはその相補物の特定の部分に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求する。これらの増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブは病原性ナイセリアのｒＲＮＡに由来するため、これらのｒＲＮＡ遺伝子から発現されるＲＮＡのレベルがより高く、生物間でのｒＲＮＡ配列の横の伝達がないため、優れた検出アッセイが得られる。

増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、標的ナイセリア１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはｒＤＮＡ遺伝子配列にハイブリダイズすることにより機能する。好ましい態様においては、本明細書に記載されるプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、一緒に用いた場合、血液または組織等の臨床試料中に見いだされる他の微生物および淋菌種から髄膜炎菌を区別することができる。したがって、増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブは、アッセイにおいて用いて、髄膜炎菌由来核酸を選択的に検出および／または増幅することができる。好ましい態様においては、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、淋菌からの核酸より髄膜炎菌からの核酸に選択的にハイブリダイズすることができる。本発明のある態様においては、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションの同定を助けるために、アクリジニウムエステルまたは放射性同位体等のリポーター基を含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明のある態様においては、増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を促進する核酸配列を随意に有する。

本発明は、ナイセリアからの核酸の存在を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特徴とする。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１１： GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２： GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５： CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６： CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５： GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６： GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７： CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号２８： CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
配列番号１： GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３： GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号２９： CCGCTACCCG GTACGTTC
配列番号３０： CATCGGCCGC CGATATTGGC
配列番号３１： GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２： GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号３３： CCGCUACCCG GUACGUUC
配列番号３４： CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
から選択される。

本発明は、髄膜炎菌からの核酸の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特徴とする。これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは以下のヌクレオチド配列：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC、および
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
から選択される。

本発明はまた、淋菌の核酸の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特徴とする。好ましくは、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１： GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３： GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号２９： CCGCTACCCG GTACGTTC
配列番号３０： CATCGGCCGC CGATATTGGC
配列番号３１： GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２： GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号３３： CCGCUACCCG GUACGUUC
配列番号３４： CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
の１つから選択されるヌクレオチド配列を有する。

本発明の別の観点は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブをヘルパーオリゴヌクレオチド（プローブ）とともにを含むプローブ混合物である。好ましくは、ヘルパーオリゴヌクレオチドは、アッセイプローブのその標的核酸に対する特異的ハイブリダイゼーションを容易にするために用いられる；ヘルパーオリゴヌクレオチドは、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ，米国特許５，０３０，５５７に記載されており、これを本明細書の一部としてここに引用し、これは本発明と共通の譲渡人に譲渡されている。本発明においてヘルパープローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、次の配列：
配列番号２ GGGATAACTG ATCGAAAGAT CAGCTAATAC CGCATACG
配列番号４ ACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
配列番号３９ GGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
配列番号４０ ACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUG
配列番号１３ GCCTTCGGGT TGTAAAGGAC TTTTGTCAGG GAAGAAAA
配列番号１４ GCTGATGACG GTACCTGAAG AATAAGCACC GGC
配列番号３５ GCCUUCGGGU UGUAAAGGAC UUUUGUCAGG GAAGAAAA
配列番号３６ GCUGAUGACG GUACCUGAAG AAUAAGCACC GGC
配列番号１７ TTTTCTTCCC TGACAAAAGT CCTTTACAAC CCGAAGGC
配列番号１８ GCCGGTGCTT ATTCTTCAGG TACCGTCATC AGC
配列番号３７ UUUUCUUCCC UGACAAAAGU CCUUUACAAC CCGAAGGC、および
配列番号３８ GCCGGUGCUU AUUCUUCAGG UACCGUCAUC AGC
を含む。

本発明の別の観点は、本発明のオリゴヌクレオチドと髄膜炎菌または淋菌からのヌクレオチドポリマーの特定の領域との間に形成される核酸ハイブリッドである、髄膜炎菌および淋菌を検出するための組成物を含む。一般に、ヌクレオチドポリマーは、本発明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補物に実質的に対応し、髄膜炎菌または淋菌のリボソームＲＮＡをコードするｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに由来する核酸配列を含む。これらの組成物中に存在するオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、またはこれらの組み合わせであってもよい。すなわち、本発明の組成物は、１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、１つまたはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチド、および１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブを含んでいてもよい。

その標的配列にハイブリダイズしたプローブを含む本発明の組成物は、核酸配列の存在を検出するのに有用である。その標的核酸配列にハイブリダイズしたヘルパーオリゴヌクレオチドを含む本発明の組成物は、ハイブリダイゼーションに利用可能な標的核酸の特定の部分を作成するのに有用である。その標的配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを含む本発明の組成物は、プライマーの３’末端にポリメラーゼのための開始部位を作りだすのに、および／または標的配列の３’末端の伸長のためのテンプレートを提供するのに有用である。

本発明はまた、ナイセリアの存在を検出する方法に関する。この方法においては、被験試料をストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、ここで、核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、髄膜炎菌の標的核酸配列とハイブリダイズすることができるが淋菌からの核酸配列とはハイブリダイズしない。本発明はまた、これらの方法において用いられるオリゴヌクレオチドおよびその同等物に関する。オリゴヌクレオチドは、プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションを同定することを助けるリポーター分子を随意に含んでいてもよい。本発明は、ヒトからの被験試料、例えば、血液、血液由来試料、組織、組織由来試料、他の体液および身体試料等の中のナイセリア核酸の存在を検出するのに有用である。

本発明はまた、少なくとも１つの本発明の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸を増幅する、髄膜炎菌の存在を検出するための方法を企図する。好ましい態様においては、この増幅の後に、本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて増幅された核酸を検出する検出工程が行われる。本発明の方法はまた、ＲＮＡプロモーターのためのヌクレオチド配列を含む増幅オリゴヌクレオチドの使用を企図する。

別の観点においては、本発明は、増幅アッセイにおいてナイセリア属の生物の検出に有用な増幅オリゴヌクレオチドを特徴とする。このようなオリゴマーは、好ましくは次のヌクレオチド配列：
配列番号５ GTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
配列番号６ GGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４１ GUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
配列番号４２ GGCGAGUGGC GAACGGGUGA GUAACAUA
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU、および
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
の１つに実質的に対応する。

ここで、オリゴマーは、未修飾であってもよく、または、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される特定の核酸配列（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むが、これらに限定されない）および／またはＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始を促進する配列の５’末端への付加等の修飾を含んでいてもよい。プロモーター配列の１つの例には、次の配列が含まれる：
配列番号５３：５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’。有用なプロモーター配列の他の例は、種々の市販のベクター、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(R) ベクターまたはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのｐＧＥＭ（商標）ベクターに含まれている。

本発明の別の観点においては、増幅オリゴヌクレオチドは、次の配列：
配列番号２３ GTCTTGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
配列番号２４ TATGTTACTC ACCCGTTCGC CACTCGCC
配列番号１９ CTGAAGAATA AGCACCGGCT AACTACGTGC AGCAGC
配列番号２１ CGATGACGGT ACCTGAAGAA TAAGCACCGG CTAAC
配列番号２０ AACGGCCTTT TCTTCCCTGA CAAAAGTCCT TTACAACCCG
配列番号２２ GTCCTTTACA ACCCGAAGGC CTTC
配列番号４７ GUCUUGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
配列番号４８ UAUGUUACUC ACCCGUUCGC CACUCGCC
配列番号４９ CUGAAGAAUA AGCACCGGCU AACUACGUGC AGCAGC
配列番号５０ CGAUGACGGU ACCUGAAGAA UAAGCACCGG CUAAC
配列番号５１ AACGGCCUUU UCUUCCCUGA CAAAAGUCCU UUACAACCCG
配列番号５２ GUCCUUUACA ACCCGAAGGC CUUC
に実質的に対応する配列に結合するかまたはこれにより伸長を引き起こす。

本発明の別の観点は、増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む、１つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットを含む。好ましい態様においては、本発明のキットは、少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドおよびナイセリア、髄膜炎菌または淋菌を他の微生物から区別しうる１つのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む。

特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用の背景の記載は、Ｋｏｈｎｅ、米国特許４，８５１，３３０（１９８９年７月２５日発行）およびＨｏｇａｎら、”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”と題する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に与えられており、両方の参考文献を本明細書の一部としてここに引用する。Ｈｏｇａｎら（上掲）は、試料（例えば、唾液、尿、血液および組織切片、食物、土壌および水）中の非ウイルス生物または非ウイルス生物の群の存在を判定する方法を記載する。

最も好ましい態様においては、組成物、プローブ混合物、プローブ、増幅プライマー、ヘルパーオリゴヌクレオチド等は、その核酸配列に実質的に対応する配列ではなく、特定された核酸配列からなるヌクレオチド配列を有する。これらの最も好ましい態様は、本開示の一部を形成する配列表に掲げられる配列を用いる。

発明の詳細な記述
Ａ．定義
以下の用語は、異なる意味をもつと明記しない限り、本明細書に示した意味をもつ。

“標的核酸”とは、標的ヌクレオチド配列をもつ核酸を意味する。
“オリゴヌクレオチド”とは、互いに共有結合した２以上のヌクレオチドサブユニットからなる一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。好ましくは１０〜１００のヌクレオチド単位が存在し、最も好ましくは１２〜５０のヌクレオチド単位が互いに結合している。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、またはその修飾された誘導体、たとえば２’−Ｏ−メチルリボースであってよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸メチル結合により、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨害しない他の稀な、もしくは天然に存在しない結合により連結していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは一般的でないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含んでもよい。本明細書に定義するオリゴヌクレオチドは核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよく、共有結合したリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合わせを含んでもよい。定められた配列のオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、当業者に知られている方法で、たとえば化学的または生化学的合成法により、また組換え核酸分子、たとえば細菌性またはレトロウイルス性ベクターからのインビトロまたはインビボ発現により製造することができる。この記載が意図するように、オリゴヌクレオチドは野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写生成物からなるものではない。プローブの用途のひとつは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてである。プローブは、病的細胞、感染細胞または病原性細胞の遺伝子転写、または翻訳を、遮断または阻害するためのインビボまたはインビトロ療法用増幅オリゴマーまたはアンチセンス物質としても使用できる。

“標的核酸配列”、“標的ヌクレオチド配列”または“標的配列”とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全部または一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。

核酸のハイブリダイゼーションは、完全または部分的に相補的なヌクレオチド配列をもつ２本の核酸鎖が予め定められた条件下で互いに一緒になって、特異的な水素結合によって安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスである。いずれの核酸鎖も、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはこれらの核酸のうちの１つの類似体であってよい。したがってハイブリダイゼーションにはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが伴う可能性がある。

本明細書で用いる“ハイブリダイゼーション”とは、２本の完全または部分的に相補的な一本鎖核酸鎖が逆平行配向で一緒になって、二本鎖領域を含む安定な構造を形成しうることを意味する。この二本鎖構造（時にハイブリッドと呼ばれる）の２つの成分鎖は、水素結合で互いに保持されている。これらの水素結合は、最も一般的には一本鎖核酸鎖上の塩基アデニンとチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）、またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）を含有するヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合はこれらの“規定（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）”対の構成員でない塩基間でも形成される可能性がある。非規定塩基対合は当技術分野で周知である。たとえばＴｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（Ａｄａｍｓら編、１９９２）参照。

“ストリンジェントな”ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブが、他の微生物またはヒトに由来する被験試料中に存在する他の核酸より多く、標的核酸（好ましくはナイセリア属菌、髄膜炎菌または淋菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズしうることを意味する。これらの条件がＧＣ含量およびプローブ長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、ならびに目的とするハイブリダイゼーション特異性を含めた因子に応じて異なる可能性があることは自明であろう。特異的、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を下記に示す。

ナイセリア属菌、髄膜炎菌または淋菌の検出に際して、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブに有用である特異的、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件の組合わせを採用した。好ましい組合わせの１つは、標的核酸とハイブリダイゼーションプローブを１００μｌの０.０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５.０）、６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（Ｌ.Ｌ.Ｓ.）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）中で６０℃において１５分間、互いにハイブリダイズさせ、次いで３００μｌの０.１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８.５）、１％（ｖ／ｖ）トリトン（ＴＲＩＴＯＮ、商標）Ｘ−１００を添加して６０℃に５〜７分間保持することからなっていた。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の組合わせは、本明細書の開示を読んだのち当業者が判定することができる。

“プローブ”とは、検出しようとする核酸配列に部分的または完全に相補的な配列をもち、したがってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれにハイブリダイズする、一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。“プローブ”という用語には、自然界に普通に存在する核酸は含まれないものとする。精製オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られている方法、たとえば化学合成法により、または組換え核酸分子、たとえばレトロウイルスベクターからのインビトロまたはインビボ発現により製造できる。好ましくはプローブは１０〜１００ヌクレオチドの長さである。プローブは、標的配列に相補的でない領域を、それらの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションに実質的な影響を与えない限り、含んでもよく、含まなくてもよい。そのような配列が存在する場合、それらは５’側プロモーター配列および／またはＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよく、あるいは目的とする二次または三次構造、たとえば触媒活性部位もしくはヘアピン構造をプローブに、標的核酸に、または両者に与える配列を含んでもよい。プローブはリポーター基部分、たとえば放射性同位体、蛍光部分もしくは化学ルミネセント部分、酵素またはリガンド部分で標識されていてもよく、これらはそのプローブが標識配列にハイブリダイズしたことを検出または確認するために利用できる。

本明細書で用いる、特定の配列群“から選択される配列から本質的に構成される核酸配列をもつプローブ（またはオリゴヌクレオチド）”という句は、基本的または新規な特性をもつプローブが、その群に挙げた核酸配列の１つの厳密な相補体である核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイズしうることを意味する。厳密な相補体には対応するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。

“核酸配列に実質的に対応する”という句は、当該核酸がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同一の標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、当該核酸がその核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性をもつのに十分な程度にその核酸配列に類似することを意味する。

実質的に対応する本発明のプローブおよびプライマーが当該配列と異なってもなお同一の標的核酸配列にハイブリダイズする可能性があることは、当業者には理解されるであろう。当該核酸からのこの変異は、その配列内の一致する塩基の割合、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合として表すことができる。この変異が、プローブまたはプライマー中において標的核酸配列の対応する塩基にハイブリダイズしない塩基の個数、すなわちプローブのミスマッチ塩基の個数として表せることも、当業者には理解されるであろう。これらの割合が１００〜８０％であるか、または１０ヌクレオチド標的配列中の０塩基がミスマッチないし１０ヌクレオチド標的配列中の２塩基がミスマッチである場合、本発明のプローブまたはプライマーは核酸配列に実質的に対応する。

好ましい態様においては、この割合は１００〜８５％である。より好ましい態様においては、この割合は９０〜１００％であり、他の好ましい態様においては、この割合は９５〜１００％である。許容しえないほどの非特異的ハイブリダイゼーションを起こすことなく特定の標的配列にハイブリダイズしうるために、種々の割合の相補性においてハイブリダイゼーション条件の多様な変更が要求されるであろうというのは、当業者に理解されるであろう。

“核酸ハイブリッド”または“ハイブリッド”とは、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長さ、最も好ましくは約１２〜５０ヌクレオチド長さの二本鎖水素結合領域を含む核酸構造体を意味する。その際、それぞれの鎖は他方に相補的であり、かつこの領域はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、化学ルミネセントもしくは蛍光検出法、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動を含めた手段（これらに限定されない）で検出するのに十分なほど安定である。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、もしくはＤＮＡ：ＤＮＡデュプレックス分子、またはこれらの核酸の類似体を含むデュプレックス分子からなるものであってよい。

“相補的”とは、２つの一本鎖核酸の類似の領域または同じ一本鎖核酸の２つの異なる領域のヌクレオチド配列が、それらの一本鎖をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズさせて安定な二本鎖水素結合領域になしうるヌクレオチド塩基組成をもつことを意味する。一方の一本鎖領域の連続ヌクレオチド配列が他方の一本鎖領域の類似ヌクレオチド配列と一連の“規定”水素結合塩基対を形成しうる場合（たとえばＡがＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合）、それらのヌクレオチド配列は“完全に”相補的である。

“保存的に修飾された変異体”とは、他の核酸の核酸領域に相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸またはオリゴヌクレオチドであって、この領域が基準核酸に完全に相補的であるものを意味する。このような保存的に修飾された変異体は、ナイセリア属菌、髄膜炎菌または淋菌のヌクレオチド配列をもつ標的核酸領域にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイズすることができる。

“増幅オリゴヌクレオチド”とは、標的核酸配列にハイブリダイズし、また核酸合成の開始につき核酸合成のプライマーもしくはプロモーター鋳型として作用し（たとえば相補鎖の合成のために；これにより官能性プロモーター配列を形成する）、またはその両方が可能であるオリゴヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドをＲＮＡ合成の開始のために設計する場合、そのオリゴヌクレオチドは、標的配列に非相補的ではあるがＲＮＡポリメラーゼ（たとえばＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）により認識されるヌクレオチド配列を含むものでよい。増幅オリゴヌクレオチドは、３’末端がプライマーの延長を阻止するかまたはその程度を少なくするように修飾されていもよく、修飾されていなくてもよい。本明細書に定義する増幅オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長さ、最も好ましくは約１２〜５０ヌクレオチド長さであろう。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは化学的に合成されてもよく、またはベクターに由来するものであってもよいが、それらのオリゴヌクレオチドは天然の核酸ではない。

“核酸の増幅”または“標的増幅”とは、少なくとも１つの標的核酸配列を含む核酸分子の数を増加させることを意味する。
“アンチセンス”または“ネガティブセンス”とは、基準核酸配列のものに相補的な核酸配列をもつことを意味する。

“センス”、“セイムセンス”または“ポジティブセンス”とは、基準核酸配列のものに類似の核酸配列をもつことを意味する。
“ヘルパーオリゴヌクレオチド”とは、標識プローブと異なる遺伝子座において標的核酸とハイブリダイズし、これにより標識プローブのハイブリダイゼーション速度を高めるか、または標的：標識プローブハイブリッドの融解点（Ｔ_ｍ）を高めるか、またはその両方であるように設計された核酸プローブを意味する。

“系統発生的に近縁”とは、それらの生物が発生的に互いに近縁であり、したがってより遠縁の生物より高い全配列相同性をもつことを意味する。系統樹上で隣接位置および隣接位置の次ぎにある生物は近縁である。系統樹上で隣接位置および隣接位置の次ぎより離れた位置にある生物は、それらが有意の全配列相同性をもつ場合にはやはり近縁である。

Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライマーの設計
ハイブリダイゼーション反応条件（ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度が最も重要）は、本発明の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブを、標的ナイセリア属ヌクレオチド配列を含む核酸に優先的にハイブリダイズさせ、被験試料中に存在する疑いのある他の非標的核酸にはハイブリダイズしないように選択することができる。塩濃度が低下し、および／または温度が上昇すると（ストリンジェンシーの増大と呼ばれる)、二本鎖ハイブリッド分子中の対合ヌクレオチド塩基間の水素結合が減少するので、核酸のハイブリダイゼーションは減少する。このプロセスは“融解”と呼ばれる。

一般に、最も安定なハイブリッドは連続的な完全対合した（すなわち水素結合した）ヌクレオチド塩基対を最大数含むものである。したがってこのようなハイブリッドは通常は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増大するのにともなって、融解するのが最も遅いと予想される。しかし１またはそれ以上のミスマッチ、“規定外”、または不完全な塩基対合を含む核酸領域（核酸のヌクレオチド配列のその位置の塩基対合が弱くなるか、または存在しない）は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて被験試料中に存在する他の非選択核酸と交叉反応することなく核酸ハイブリッドを検出しうる比較的高いストリンジェントな条件下で、なお十分に安定である可能性がある。

したがって、一方では標的核酸のヌクレオチド配列と系統発生的には離れているが近縁である生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列との類似性の程度、他方では特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブと標的および非標的核酸との相補性の程度によっては、１またはそれ以上のミスマッチは必ずしも、そのオリゴヌクレオチドがその核酸にハイブリダイズしかつ非標的核酸にはハイブリダイズしない能力を無効にするわけではない。

本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ、与えられた反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分が一本鎖の変性状態になる温度と定義される）と、プローブと被験試料中に存在すると予想されるが検出を目的としない、系統発生的に最も近縁の生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間で形成されるミスマッチハイブリッドのＴ_ｍとの差を最大にするように選定、選択および／または設計された。非標識−増幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本発明に有用であるために標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブのようなきわめて高度の特異性をもつ必要はないが、それらも同様に他の核酸より１またはそれ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズするように設計される。

髄膜炎菌に特異的なプローブは、予想標的領域中において下記の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なプライマーを用いて決定された配列を用いて設計された：ナイセリア属菌株、たとえば淋菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）、髄膜炎菌血清群Ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ.１３０７７）、血清群Ｃ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２４８)、および血清群Ｌ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３８２８）、髄膜炎菌の臨床単離株、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９１９３）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４６８５）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｕｃｏｓａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９６９６）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９１９３）、およびＫｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３３３０）。公表された淋菌ＮＣＴＣ ８３７５の配列（Ｒｏｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６２２７）を含めた系統発生的近縁菌由来の核酸配列も、可変領域を決定するために髄膜炎菌由来の核酸配列との比較として用いられた。

プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドとして用いる核酸配列の同定を容易にするために、さまざまな生物種に由来するヌクレオチド配列を相同性が最大になるように整列させた。ｒＲＮＡ分子内において、全構造と機能間に密接な関係がある。これにより、二次構造が維持されるように進化による一次配列の変化が制限される。たとえばらせんの一方側の塩基が変化すると、相補性を保存するために他方側に進化による代償性変化が起きることがある（共変異（ｃｏ−ｖａｒｉａｎｃｅ）と呼ばれる）。これにより、保存された一次配列および保存された二次構造要素を基準点として用いて、２つのきわめて異なる配列を整列させることができる。ハイブリダイゼーションプローブとして有効な標的配列は、ｒＲＮＡおよびｒＤＮＡ配列の特定の別個の領域（可変領域）において、整列した配列の相同性の変異に注目することにより確認された。

可変領域それぞれの配列の進化は、大部分が分岐性である。この分岐性のため、系統発生的に離れた髄膜炎菌または淋菌の近縁菌ほど、系統発生的に近接する近縁菌より大きな変異性を示す傾向がある。髄膜炎菌と淋菌の種間で見られた、好ましい標的部位を同定しかつ有用なプローブを設計するのに十分な変異を利用した。

本発明者らは、髄膜炎菌と淋菌の間、これらと他のナイセリア属菌種との間、およびナイセリア属構成菌と他の微生物との間で異なる配列を、文献に公表されたｒＲＮＡ配列または本実験室で決定したｒＲＮＡ配列の比較分析により確認した。本明細書に開示する目的に利用または適用できるコンピューターおよびコンピュータープログラムが市販されている。本発明者らは、標的微生物と、同一試料中に見られると思われる系統発生的に最も近接する近縁菌との間に、本発明のプローブを設計するのに十分な変異を認めた。髄膜炎菌株は、プローブ領域において血清群Ａ、ＣおよびＬで表される３つの配列群に分類されている。

ユニークと推定される有効標的ヌクレオチド配列を確認しただけでは、その配列を含むナイセリア属ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズする機能的に種特異性のハイブリダイゼーションアッセイプローブを作成しうるという保証はない。他の種々の因子が種特異性プローブの標的部位としての核酸座の適性を決定するであろう。本明細書に記載するようなハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は多数の因子により影響されるので、これらの因子のうち１またはそれ以上を操作することにより、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、個々のオリゴヌクレオチドの厳密な感受性および特異性が判定されるであろう。種々のアッセイ条件の重要性および効果は、ホーガンらの国際特許出願第ＵＳ８７／０３００９号、ホーガンおよびハモンドの米国特許第５，２１６，１４３号、ならびにコーネの米国特許第４，８５１，３３０号（本願と同一の出願人による）に記載されているので、当業者に知られている。これらは本明細書に参考として含まれるものとする。

目的とするハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（たとえば塩濃度、界面活性剤その他の溶質）も二本鎖ハイブリッドの安定性に著しく影響する可能性がある。群特異性または種特異性プローブを構築する際には、プローブを標的にハイブリダイズさせるイオン濃度および温度などの条件を考慮しなければならない。反応混合物のイオン濃度が高まるのにともなって、一般にハイブリッド核酸の熱安定性は増す。他方、水素結合を破壊する化学物質、たとえばホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール類は、ハイブリッドの熱安定性を著しく低下させる可能性がある。

標的に対するプローブの特異性を最大限に高めるために、本発明の対象プローブは高いストリンジェンシー条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計された。このような条件下では、高度の相補性をもつ核酸一本鎖のみが互いにハイブリダイズするであろう。このような高度の相補性をもたない核酸一本鎖はハイブリッドを形成しないであろう。したがってアッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために２本の核酸鎖間にあるべき相補性の程度を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸の間に形成されるハイブリッドと、プローブと存在する非標的核酸の間に形成される可能性のあるハイブリッドとの差を最大にするように選ばれる。

適正な特異性は、非標的微生物に対する完全な相補性をもつプローブの長さを最小限に抑えることにより達成でき、これは非標的配列に対するＧおよびＣに富む領域の相同性を避けることにより、また不安定にする、非標的配列へのミスマッチを可能な限り多く含むプローブを構築することにより行われる。あるプローブ配列が特定のタイプの微生物のみを検出するのに有用であるか否かは、プローブ:標的ハイブリッドと、プローブ：非標的ハイブリッドとの熱安定性の差によるところが大きい。プローブを設計する際には、これらのハイブリッド間のＴ_ｍ値の差を可能な限り大きくすべきである（好ましくは約５℃以上）。Ｔ_ｍの操作は、プローブ長さおよびプローブ組成（ＧＣ含量対ＡＴ含量）の変更により達成できる。

一般に長さ約１０〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブに最適なハイブリダイゼーション温度は、そのデュプレックスの融解温度より約５℃低い温度である。最適温度より低い温度でのインキュベーションは、ミスマッチ塩基配列をハイブリダイズさせることがあり、したがって特異性を低下させる可能性がある。プローブが長いほど、塩基対間の水素結合が多くなり、一般にＴ_ｍが高くなる。ＧおよびＣの含量を高めてもＴ_ｍが高くなる。Ｇ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対より多い水素結合を示し、したがってより高い熱安定性をもつからである。

Ｔ_ｍを測定するのに好ましい方法は、アーノルドらの米国特許第５，２８３，１７４号によるハイブリダイゼーション保護アッセイ法（ＨＰＡ）を用いてハイブリダイゼーションを測定するものである。これは本出願人が単独で所有するものであり、本明細書に参考として含まれるものとする。Ｔ_ｍはＨＰＡ法により下記の方法で測定できる。過剰量の標的を用いて、コハク酸リチウム緩衝液（０.１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ５.０、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）中でプローブ：標的ハイブリッドを形成する。次いでハイブリッドの一部をコハク酸リチウム緩衝液中に希釈し、予想Ｔ_ｍより低い温度、たとえば５５℃から出発して、２〜５℃ずつ上昇する種々の温度で５分間インキュベートする。次いでこの溶液を緩和なアルカリ性のホウ酸緩衝液（０.１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ７.６、５％(ｖ／ｖ)トリトン（商標）Ｘ−１００）で希釈し、低温（たとえば５０℃）で１０分間インキュベートする。これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルは加水分解されるが、ハイブリダイズしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは相対的に加水分解から保護される。したがって残存アクリジニウムエステルの量はハイブリッドの量に比例し、過酸化水素を添加したのちアルカリを添加した際にアクリジニウムエステルから発生する化学ルミネセンスにより測定できる。化学ルミネセンスはルミノメーター（たとえばＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＩまたはＬＥＡＤＥＲ（登録商標）５０）により測定できる。得られたデータを、最大信号（通常は最低温度からのもの）に対するパーセントとして温度に対しプロットする。Ｔ_ｍは最大信号の５０％が残存する温度と定義される。前記方法のほか、Ｔ_ｍは当業者に周知の同位体法により測定できる（たとえばホーガンら、前掲）。

特定のハイブリッドのＴ_ｍは用いるハイブリダイゼーション溶液に応じて異なることを留意すべきである。塩濃度、界面活性剤、他の溶質などの因子が熱変性処理中のハイブリッドの安定性に影響を与える可能性がある（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１１章（第２版、１９８９））。プローブを構築する際には、プローブを標的にハイブリダイズするのに用いるイオン濃度およびインキュベーション温度などの条件を考慮に入れるべきである。他方、水素結合を破壊する化学物質、たとえばホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール類は、ハイブリッドの熱安定性を著しく低下させる可能性がある。

プローブがその標的に特異的であることを保証するために、高いストリンジェンシー条件下でのみハイブリダイズするプローブを得ることが望ましい。高いストリンジェンシー条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドのみが形成され、十分な程度の相補性をもたないハイブリッドは形成されないであろう。したがってアッセイ条件のストリンジェンシーが、ハイブリッドを形成する２核酸鎖間に必要な相補性の程度を決定する。ストリンジェンシーは、標的との間に形成されるハイブリッドと、他の核酸配列との間に形成されるハイブリッドとの、安定性の差を最大にするように選ばれる。

標的核酸配列の長さ、したがってプローブ配列の長さも重要となる可能性がある。場合によっては、目的とするハイブリダイゼーション特性を与える、特定の領域に由来する幾つかの配列、たとえば位置や長さの異なる可変領域がある。他の場合には１つのプローブが、１塩基異なるヌクレオチド配列をもつ他のプローブより有意に良好なことがある。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズする可能性はあるが、完全に相同性である最長の塩基配列が一般にハイブリッドの安定性を決定し、塩基対の組成も重要である。

ハイブリダイゼーションを阻害する強固な内部構造を形成するｒＲＮＡ領域は、少なくともヘルパープローブを用いないアッセイにおいては好ましい標的領域ではない。同様に、広範な自己相補性を生じるプローブデザインも避けるべきである。２本のうち１本の鎖が完全または部分的に分子内または分子間ハイブリッドを形成している場合、それは新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与する能力がより低いであろう。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によってきわめて安定な分子内らせんおよび二次構造を形成することが知られている。プローブとハイブリダイズするまでは標的配列の実質的な部分が一本鎖状態のままであるようにハイブリダイゼーションアッセイ法を計画することにより、プローブと標的の間のハイブリダイゼーションの速度および程度を著しく高めることができる。これを達成しうる１方法は、標的ヌクレオチド配列として分子内水素結合を比較的形成しにくい配列を選ぶことである。あるいは、またはさらに、標的部位がハイブリダイゼーションアッセイプローブとのハイブリダイゼーションを行いやすいようにしうるヘルパーオリゴヌクレオチドとのプローブ配合物として、ハイブリダイゼーションプローブを用いてもよい。

ＤＮＡ標的は、天然にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物の場合のように二本鎖の形で存在する。これらの二本鎖標的は天然の状態ではプローブとのハイブリダイゼーションを阻止するので、ハイブリダイゼーションの前に変性させる必要がある。適切な変性およびハイブリダイゼーションの条件は当技術分野で知られている（たとえばＥ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９８：５０３（１９７５））。

標的核酸に完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融解温度を推定する多数の方程式がある。このような方程式のひとつ：

Ｔ_ｍ＝81.5＋16.6（log_１０[Na^＋])＋0.41(画分Ｇ＋Ｃ)−(600/Ｎ)

（Ｎ＝オリゴヌクレオチドの長さ（ヌクレオチド数））により、長さ１４〜６０または７０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのＴ_ｍを良好に推定できる。このような計算値から、次いで当技術分野で周知のスクリーニング法を用いて、Ｔ_ｍの経験的確認または“精密な調整”を行うことができる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらに詳細な情報については、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８９）を参照されたい。これが本明細書に参考として含まれるものとする（１１章）。この参考文献は当技術分野で特に周知であり、これによればミスマッチがハイブリッドのＴ_ｍに与える影響も推定できる。たとえば２種以上の微生物のリボソームＲＮＡ（すなわちｒＲＮＡ）の特定領域の既知ヌクレオチド配列から、これらの微生物を互いに区別するオリゴヌクレオチドを設計することができる。

Ｃ．核酸の増幅
好ましくは、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドであり、かつ核酸ポリメラーゼによる延長生成物の合成の基質として用いるのに十分な長さのものである。最適なプライマー長さは、反応温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにそのプライマーの使用方法を含めた幾つかの因子を考慮すべきである。たとえば最適な特異性を得るためには、標的核酸配列の相補性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に少なくとも約１２ヌクレオチドを含むべきである。そのような特異性が必須でない場合、より短いプライマーを使用できる。このような場合、鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形成するために、反応をより低い温度で実施することが望ましいであろう。

目的特性を備えた増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを設計するために有用な指針を本明細書に示す。本発明の最良の形の標的領域は、髄膜炎菌または淋菌の核酸の保存領域を少なくとも２つ、好ましくは３つ含む。これらの領域は約１５〜３５０、好ましくは１５〜１５０ヌクレオチドの長さである。

一組のプライマーまたはプロモータープライマーにつき見られる増幅度は、オリゴヌクレオチドがそれらの相補配列にハイブリダイズする能力、およびそれらが酵素により延長または複製される能力を含めた幾つかの因子に依存する。種々の長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドを用いてもよいが、本発明に好ましいオリゴヌクレオチドは１８〜４０塩基の標的結合領域をもち、標的に対する推定Ｔ_ｍが約６５℃のものである。

プローブのハイブリダイゼーションに影響を与えるパラメーター、たとえばＴ_ｍ、標的配列の相補性および二次構造もプライマーのハイブリダイゼーションに影響を与え、したがって性能にも影響を与える。非特異的延長（プライマー二量体または非標的複製）の程度も増幅効率に影響を与える可能性があり、したがってプライマーは特に配列の３’末端における自己相補性または交叉相補性が低くなるように選ばれる。偽のプライマー延長を少なくするために、長いホモポリマー領域や高いＧＣ含量を避ける。この観点での設計を補助するために、コンピュータープログラムを利用できる。

本発明の増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる核酸ポリメラーゼは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは両者を鋳型依存性様式で取り込んで核酸ポリマーにする化学的、物理的または生物学的物質を意味する。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存性様式で、５’側から３’側の方向へ核酸を合成する。二本鎖核酸中の２本の鎖は逆平行配向であるので、この方向は鋳型の３’領域から鋳型の５’領域の方向である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩが含まれる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例には、種々のレトロウイルス逆転写酵素、たとえばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が含まれる。

大部分の核酸増幅反応に際して、核酸ポリメラーゼが標的核酸を鋳型として用いてヌクレオチド残基をプライマーの３’末端に付加し、こうして標的核酸の１領域に一部または完全に相補的なヌクレオチド配列をもつ第２の核酸鎖が合成される。多くの核酸増幅反応において、生成二本鎖を構成する２本の鎖は、増幅反応を進行させるために化学的または物理的手段で分離されなければならない。あるいは新たに合成された鋳型鎖を、他の手段、たとえば鎖置換法で、または元の標的鎖の一部もしくは全部を消化する核酸分解酵素を用いて、第２のプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用できるようにしてもよい。こうしてこのプロセスを多数回繰り返し、その結果標的ヌクレオチド配列をもつ核酸分子の数が著しく増加する。

第１もしくは第２の増幅オリゴヌクレオチドのうちいずれかまたは両者がプロモーター−プライマーであってもよい。このようなプロモーター−プライマーは通常は標的核酸分子、すなわちプライマー延長生成物のものと相補的でないヌクレオチド配列を含む。たとえばカシアンおよびフルツの米国特許第５，３９９，４９１号（これが参考として本明細書に含まれるものとする）には、このような種々のオリゴヌクレオチドが記載されている。これらの非相補配列は増幅オリゴヌクレオチド上の相補配列の５’側に配置することができ、核酸ポリメラーゼの作用により二本鎖になったときＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供しうる。こうして提供されたプロモーターは、標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーをインビトロ転写することができる。本明細書中でプライマーについて述べる場合、これはその記述の概念に別途明記しない限り、プロモーター−プライマーを包含することは自明であろう。

ある増幅系、たとえばＤａｔｔａｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ.（前掲）の増幅方法では、増幅オリゴヌクレオチドは連鎖置換を補助する５’側−非相補ヌクレオチドを含むことができる。さらに、５’−エキソヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼと組み合わせて用いる場合、増幅オリゴヌクレオチドはそれらの５’末端に酵素消化を防止する修飾をもつことができる。あるいは核酸ポリメラーゼが、たとえば５’−エキソヌクレアーゼ活性をもたない活性ポリメラーゼフラグメントを生成するプロテアーゼで処理することにより、５’−エキソヌクレアーゼ活性を除去するように修飾されてもよい。このような場合、オリゴヌクレオチドはそれらの５’末端で修飾される必要はない。

１．オリゴヌクレオチドの調製
本発明の増幅オリゴヌクレオチドはすべて、当技術分野で知られている方法で容易に調製できる。好ましくはこれらのプライマーは固相法で合成される。たとえばＣａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ.はホスホジエステル結合によりヌクレオチドを連結する標準ホスホルアミダイト固相化学的方法の使用につき記載している。シアノエチルホスホルアミダイト前駆物質を用いる自動固相化学合成法は、Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４０５（１９８４）により記載されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １４３，ｐ．２８７（１９８７））。またバットはホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成法を記載している（“有機リン化合物の硫化のための方法および試薬”と題する国際特許出願公開第ＷＯ９２／０４３５８号、本願と同一出願人）。またクレムらの“オリゴマー合成のための改良方法”と題する国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７８６４号には、ホスホン酸メチル結合を含めた種々の結合を含むオリゴヌクレオチドの合成法を記載している。これら３つの参考文献は本明細書に参考として含まれるものとする。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成法は当業者に知られており、先に本明細書に参考として引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.（前掲）に記載されている。

個々のオリゴヌクレオチドを合成および精製したのち、幾つかの異なる方法を用いてオリゴヌクレオチドを精製し、その品質を制御することができる。好適な方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は当業者に周知である。

本発明のオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、またはヘルパーオリゴヌクレオチドのいずれであってもすべて、それらの性能を高めるための、または増幅生成物の解明を容易にするための基で修飾されていてもよい。たとえば、ホスホロチオエート基またはホスホン酸メチル基など、オリゴヌクレオチドを特定のポリメラーゼの核酸分解活性またはヌクレアーゼ酵素に対して抵抗性にする基をもつような主鎖修飾したオリゴヌクレオチドの場合、これらの酵素を増幅その他の反応に使用することができる。他の修飾例は、核酸鎖中の、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの延長を妨害しないヌクレオチド間に取り込ませた非ヌクレオチドリンカーを用いるものである（たとえばアーノルドら、“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド型連結試薬"、欧州特許第０ ３１３ ２１９号、本明細書に参考として含まれるものとする）。増幅オリゴヌクレオチドは、目的とする修飾ヌクレオチドと天然ヌクレオチドの混合物を含有してもよい。

増幅オリゴヌクレオチドの３’末端は、マクドドナウらの“核酸配列増幅”と題する国際特許出願公開第ＷＯ９４／０３４７２号（本願と同一出願人、本明細書に参考として含まれるものとする）に記載されるように、ＤＮＡ合成の開始を阻止するためにブロックされていてもよい。３’側ブロックした異なる増幅オリゴヌクレオチドの混合物、または３’側ブロックしたオリゴヌクレオチドとブロックしてないものとの混合物は、そこに記載したように核酸の増幅効率を高めることができる。

前記のように、ある核酸ポリメラーゼ中に存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性にするために、オリゴヌクレオチドの５’末端を修飾してもよい。このような修飾は、本明細書に参考として先に引用したアーノルドらの“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド型連結試薬”と題する前掲の特許明細書に記載される方法で、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することにより実施できる。

合成したのち、選ばれたオリゴヌクレオチドプローブを幾つかの周知の方法で標識することができる（たとえばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前掲）。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポーティング基が含まれる。同位体標識には、^３Ｈ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^５７Ｃｏおよび^１４Ｃが含まれる。同位体標識は、ニックトランスレーション、末端標識、第２鎖合成、逆転写の利用、および化学的方法など、当技術分野で知られている方法で、オリゴヌクレオチドに導入できる。放射性標識プローブを用いる場合、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計数、またはγ線計数により検出できる。選ばれる検出方法は標識に用いた個々の放射性同位体に依存するであろう。

非放射性物質を標識に用いることもでき、これらを核酸配列の内部に、または核酸配列の末端に導入できる。修飾したヌクレオチドを、酵素により、または化学的に取り込ませてもよい。プローブの化学的修飾は、プローブ合成の途中または合成後に、たとえば本明細書に参考として先に引用したアーノルドら、“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド型連結試薬"（前掲）に記載される非ヌクレオチドリンカー基を用いて実施することができる。非放射性標識には、蛍光性分子、化学ルミネセント分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンドが含まれる。

好ましくはプローブはアクリジニウムエステルで標識される。アクリジニウムエステル標識は、アーノルドらの“ヌクレオチドプローブのアクリジニウムエステル標識と精製"と題する米国特許第５，１８５，４３９号（本明細書に参考として含まれるものとする）に記載された方法で実施できる。

２．ナイセリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの増幅
本発明の増幅オリゴヌクレオチドは、特定のナイセリア１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列、またはそのｒＤＮＡ対応物に対するものである。これらの増幅オリゴヌクレオチドは、核酸増幅アッセイにおいてハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてナイセリアの存在を検出するために用いられる標的ヌクレオチド配列の少なくとも１つに隣接するか、重複するか、またはそれに含まれる。本明細書に記載され特許請求される増幅オリゴヌクレオチドは、２組の増幅オリゴヌクレオチドを含む。増幅オリゴヌクレオチドの組のメンバーは、以下のヌクレオチド配列：
配列番号２３ GTCTTGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
配列番号２４ TATGTTACTC ACCCGTTCGC CACTCGCC
配列番号１９ CTGAAGAATA AGCACCGGCT AACTACGTGC AGCAGC
配列番号２１ CGATGACGGT ACCTGAAGAA TAAGCACCGG CTAAC
配列番号２０ AACGGCCTTT TCTTCCCTGA CAAAAGTCCT TTACAACCCG
配列番号２２ GTCCTTTACA ACCCGAAGGC CTTC
配列番号４７ GUCUUGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
配列番号４８ UAUGUUACUC ACCCGUUCGC CACUCGCC
配列番号４９ CUGAAGAAUA AGCACCGGCU AACUACGUGC AGCAGC
配列番号５０ CGAUGACGGU ACCUGAAGAA UAAGCACCGG CUAAC
配列番号５１ AACGGCCUUU UCUUCCCUGA CAAAAGUCCU UUACAACCCG および
配列番号５２ GUCCUUUACA ACCCGAAGGC CUUC
の１つを有するかまたはこれに実質的に対応する核酸にハイブリダイズすることができる。

好ましい態様においては、これらの増幅オリゴヌクレオチドは、以下の配列：
配列番号５ GTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
配列番号６ GGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４１ GUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
配列番号４２ GGCGAGUGGC GAACGGGUGA GUAACAUA
配列番号４３ GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
を有するかまたはこれに実質的に対応する。

これらのオリゴヌクレオチドはまた、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、標的核酸をテンプレートとして用いてＲＮＡ転写を指令することができるプロモーター配列を含む追加の非相補的塩基をその５’末端に有していてもよい。例えば、プロモーター、配列番号５３ ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡを用いることができる。

本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドは、これらの配列への修飾または付加物を含まない配列を有していてもよい。あるいは、増幅オリゴヌクレオチドはまた、ブロックされた３’および／または５’末端、またはＲＮＡポリメラーゼにより認識される特定のヌクレオチド配列の付加（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列）を含むがこれに限定されない付加、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始または伸長を促進する配列の付加、または分子内塩基対形成を与えて核酸の二次または三次構造の形成を促進する配列等の修飾を含んでいてもよい。

増幅オリゴヌクレオチドは、ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ（上掲）、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら（上掲）、およびＳｎｉｎｓｋｙら、米国特許５，０７９，３５１（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する；最初の２つは本発明と同一の出願人に譲渡されている）に記載されるように、核酸増幅手順、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、またはＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡｓｅＨまたはその等価物を用いる増幅反応において用いられる。

増幅された標的配列を検出するためには、広範な種類の方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されるＤＮＡ中に取り込まれる検出可能な標識を含むことができる。次に、得られる標識された増幅生成物を未使用標識ヌクレオチドまたはプライマーから分離し、分離した生成物画分中の標識を検出する。

有用な検出可能な標識として働くことができる物質は当該技術分野でよく知られており、これには、放射性同位体、蛍光化合物、化学ルミネセント化合物、発色団、ならびに、直接検出可能ではないが標識された形のその特定の結合パートナー（例えば、アビジンおよび抗体）との反応により容易に検出しうるリガンド（それぞれビオチンおよびハプテン）等が含まれる。

別の方法は、任意の慣用の方法において、検出可能なように標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションおよび得られるハイブリッドの測定により増幅生成物を検出する。特に、化学ルミネセント剤アクリジニウムエステルで標識した核酸プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、残りのアクリジニウムエステルから生成する化学ルミネセントをルミノメータで測定することにより、生成物をアッセイすることができる（例えば、Ａｒｎｏｌｄ， ｅｔ ａｌ．，（上掲）、米国特許５，２８３，１７４、およびＮｅｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．，”Ｎｏｎ−Ｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．１９９２）（両方の参考文献を本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい）。

Ｄ．髄膜炎菌または淋菌のｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ
本明細書に開示され特許請求されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、髄膜炎菌ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド配列の標的核酸に、系統発生的に密接に関連する細菌種の核酸より優先的にハイブリダイズすることができる。これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、髄膜炎菌および前記系統発生的に密接に関連する種のリボソームＲＮＡの対応する領域のヌクレオチド配列の比較に基づいて、設計され、選択され、および／または選ばれた。好ましい態様においては、これらのプローブは、淋菌の核酸より髄膜炎菌の核酸に選択的にハイブリダイズする。

本発明は、髄膜炎菌の核酸に選択的にハイブリダイズし、淋菌の核酸にハイブリダイズせず、以下の核酸配列：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
を有するかまたはそれに実質的に対応する髄膜炎菌の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを企図する。

本発明の多くのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、他の系統発生的に密接に関連する細菌種の核酸より、淋菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡのヌクレオチド配列を含む標的核酸に優先的にハイブリダイズする。好ましい態様においては、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、髄膜炎菌から淋菌の核酸を区別することができる。

淋菌に由来する核酸に選択的にハイブリダイズし、髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズしない本発明のハイブリダイゼーションプローブは、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１ GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３ GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号２９ CCGCTACCCG GTACGTTC
配列番号３０ CATCGGCCGC CGATATTGGC
配列番号３１ GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２ GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号３３ CCGCUACCCG GUACGUUC
配列番号３４ CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
を有するかまたはそれに実質的に対応する。

本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、リポーター基成分、例えば放射性同位体、蛍光または化学ルミネセント成分、または、プローブが標的配列にハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いることができる酵素または他のリガンドで標識される。出願人は、化学ルミネセント剤アクリジニウムエステルを標識として使用することを最も好む。例えば、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１８５，４３９（既に本明細書の一部としてここに引用されている）を参照されたい。アッセイプローブを、２つの鎖が相補性の領域内で水素結合によりアニーリングするのに適当なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を有する核酸を含むと疑われる試料と混合する。

プローブは、１つまたはそれ以上の未標識ヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて、標的髄膜炎菌または淋菌のヌクレオチド配列を有する核酸への結合を容易にしてもよい。次に、プローブは、試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズする；得られるハイブリッドデュープレックスは、当該技術分野でよく知られている種々の技術、例えば、ヒドロキシアパタイト吸着および放射性モニタリングにより、分離し、検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許５，２８３，１７４、（本願と共通の譲渡人に譲渡されており、本明細書の一部としてここに引用する）に開示されるように、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次に残りのハイブリダイズしたプローブに付随する標識の量を測定することを含む技術が含まれる。この後者の技術は、現在出願人が好ましいと考えるものである。

Ｅ．ナイセリアの検出において用いられるヘルパーオリゴヌクレオチド
特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを容易にするために用いられた。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ、”Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”と題する米国特許５，０３０，５５７（本願と共通の譲渡人に譲渡されており、本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。

ヘルパープローブは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的とする領域の近くに位置する核酸配列にハイブリダイズするように選択される。ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸の二次および三次構造を変化させ、プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを容易にする。

髄膜炎菌の核酸の特異的検出を容易にするための特定のヘルパーオリゴヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１３ GCCTTCGGGT TGTAAAGGAC TTTTGTCAGG GAAGAAAA
配列番号１４ GCTGATGACG GTACCTGAAG AATAAGCACC GGC
配列番号１７ TTTTCTTCCC TGACAAAAGT CCTTTACAAC CCGAAGGC
配列番号１８ GCCGGTGCTT ATTCTTCAGG TACCGTCATC AGC
配列番号３５ GCCUUCGGGU UGUAAAGGAC UUUUGUCAGG GAAGAAAA
配列番号３６ GCUGAUGACG GUACCUGAAG AAUAAGCACC GGC
配列番号３７ UUUUCUUCCC UGACAAAAGU CCUUUACAAC CCGAAGGC
配列番号３８ GCCGGUGCUU AUUCUUCAGG UACCGUCAUC AGC
の１つを有するかまたはこれに実質的に対応する。

好ましい態様においては、配列番号：１１、１２、２５または２６に実質的に対応する、髄膜炎菌の核酸に対するハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列：配列番号：１３、１４、３５および３６を有するかまたはこれに実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドとともにプローブ混合物において用いられる。

他の態様においては、配列番号：１５、１６、２７または２８に実質的に対応する、髄膜炎菌の核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ヌクレオチド配列：配列番号：１７、１８、３７および３８を有するかまたはそれに実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドとともにプローブ混合物中において用いられる。

好ましい態様においては、配列番号：１または３１に実質的に対応する、淋菌のリボソーム核酸に対するハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列：配列番号：２または３９を有するかまたはそれに実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドとともに混合物において用いられる。

他の好ましい態様においては、配列番号：３または３２に実質的に対応する淋菌の核酸に対するハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列：配列番号：４または４０を有するかまたはそれに実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドとともに、プローブ混合物中において用いられる。

一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でヘルパーオリゴヌクレオチドを用いてもよいが、種特異的である必要はない。
Ｆ．核酸組成物
他の関連する観点においては、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとこれに実質的に相補的な核酸配列との間の核酸ハイブリッドを含む組成物（プローブ：標的）を特徴とする。プローブと標的との間に形成されるハイブリッドの１つの用途は、標的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（”ＡＥ”）は、アルカリ溶液中での加水分解に耐性であり、一方、一本鎖核酸中に存在するＡＥはアルカリ溶液中で加水分解される（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ”と題する欧州特許出願８８３０８７６７．８、公開番号３０９２３０、および米国特許５，２３８，１７４、本明細書の一部としてここに引用する）。すなわち、未結合ＡＥ−標識プローブを加水分解した後、核酸ハイブリッドと会合して残ったアクリジニウムエステルの化学ルミネセントを測定することにより、標的核酸の存在を検出することができる。

本発明はまた、増幅オリゴヌクレオチドとこれに実質的に相補的な核酸配列との間の核酸ハイブリッドを含む組成物（プライマー：標的）を企図する。プライマーと標的との間に形成される核酸ハイブリッドの１つの用途は、増幅オリゴヌクレオチドの３’末端において核酸ポリメラーゼのための開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ）およびＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ）等のための開始部位を形成することができる。

本発明はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチドとこれに実質的に相補的な核酸配列との間の核酸ハイブリッドを含む組成物（ヘルパーオリゴヌクレオチド：標的）を特徴とする。ヘルパーオリゴヌクレオチドと標的との間のハイブリッドの１つの用途は、特定の核酸配列をハイブリダイゼーションに利用可能にすることである。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチドとその標的との間のハイブリッドは、標的配列にハイブリダイズしうる核酸配列をハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションに利用可能にする。ヘルパーオリゴヌクレオチドの使用の完全な記載は、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎ、米国特許５，０３０，５５７に提供される。

本発明の組成物は、髄膜炎菌に由来する核酸と、以下の核酸配列：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
配列番号１３ GCCTTCGGGT TGTAAAGGAC TTTTGTCAGG GAAGAAAA
配列番号１４ GCTGATGACG GTACCTGAAG AATAAGCACC GGC
配列番号１７ TTTTCTTCCC TGACAAAAGT CCTTTACAAC CCGAAGGC
配列番号１８ GCCGGTGCTT ATTCTTCAGG TACCGTCATC AGC
配列番号３５ GCCUUCGGGU UGUAAAGGAC UUUUGUCAGG GAAGAAAA
配列番号３６ GCUGAUGACG GUACCUGAAG AAUAAGCACC GGC
配列番号３７ UUUUCUUCCC UGACAAAAGU CCUUUACAAC CCGAAGGC
配列番号３８ GCCGGUGCUU AUUCUUCAGG UACCGUCAUC AGC
配列番号５ GTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
配列番号６ GGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４１ GUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
配列番号４２ GGCGAGUGGC GAACGGGUGA GUAACAUA
配列番号４３ GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
の少なくとも１つに実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む、髄膜炎菌の核酸を検出するための組成物を含む。

本発明の好ましい組成物は、髄膜炎菌に由来する核酸と、以下の核酸配列：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
の少なくとも１つに実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む、髄膜炎菌を検出するための組成物を含む。

本発明はまた、髄膜炎菌由来核酸と、配列番号１１または配列番号２５に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：１３、１４、３５または３６の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌由来核酸と、配列番号１２または配列番号２６に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：１３、１４、３５または３６の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌由来核酸と、配列番号１５または配列番号２７に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌由来核酸と、配列番号１６または配列番号２８に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、淋菌由来核酸と、配列番号１または配列番号３１に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：２または３９の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
淋菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、淋菌由来核酸と、配列番号３または配列番号３２に実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブとの間に形成される核酸ハイブリッドを有し、
前記核酸にハイブリダイズし、以下の核酸配列：配列番号：４または４０の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
淋菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：７または４３に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：９または４５に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１１、１５、２５または２７の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１３、１４、３５または３６の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：７または４３に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：９または４５に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１２、１６、２６または２８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１３、１４、３５または３６の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：７または４３に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：９または４５に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１５、１１、２７または２５の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：７または４３に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：９または４５に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１６、１２、２８または２０の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：８または４４に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：１０または４６に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１５、１１、２７または２５の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、髄膜炎菌に由来する核酸および配列番号：８または４４に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：１０または４６に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
髄膜炎菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１６、１２、２８または２６の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：１７、１８、３７または３８の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
髄膜炎菌を検出するための組成物を企図する。

本発明の好ましい組成物は、淋菌に由来する核酸と、以下の核酸配列：
配列番号１ GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３ GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号２９ CCGCTACCCG GTACGTTC
配列番号３０ CATCGGCCGC CGATATTGGC
配列番号３１ GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２ GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号３３ CCGCUACCCG GUACGUUC
配列番号３４ CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
配列番号５ GTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
配列番号６ GGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４１ GUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
配列番号４２ GGCGAGUGGC GAACGGGUGA GUAACAUA
配列番号４３ GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
配列番号２ GGGATAACTG ATCGAAAGAT CAGCTAATAC CGCATACG
配列番号４ ACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
配列番号３９ GGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
配列番号４０ ACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUG
の少なくとも１つに実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む、淋菌を検出するための組成物を含む。

本発明のより好ましい組成物は、淋菌に由来する核酸と、以下の核酸配列：
配列番号１ GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３ GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号３１ GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２ GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号２ GGGATAACTG ATCGAAAGAT CAGCTAATAC CGCATACG
配列番号４ ACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
配列番号３９ GGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
配列番号４０ ACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUG
の少なくとも１つに実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む、淋菌を検出するための組成物を含む。

本発明はまた、淋菌に由来する核酸および配列番号：５または４１に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：６または４２に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを随意に有し、
淋菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：１、２９、３１または３３の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
かつ、以下の核酸配列：配列番号：２または３９の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
淋菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、淋菌に由来する核酸および配列番号：７または４２に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
および／または以下の核酸配列の少なくとも１つ：配列番号：９または４５に実質的に対応する核酸配列のオリゴヌクレオチドを随意に有し、
淋菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：３、３０、３２または３４の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
以下の核酸配列の１つ：配列番号：４または４０に実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよく、
かつ、少なくとも１つの以下の核酸配列：配列番号：８または４４に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを随意に有する、
淋菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、淋菌に由来する核酸および配列番号：１０または４６に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、
淋菌の核酸にハイブリダイズすることができ、以下の核酸配列：配列番号：３、３０、３２または３４の１つに実質的に対応する核酸配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを随意に有し、
および／または、以下の核酸配列：配列番号：４または４０の１つに実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを随意に含んでいてもよい、
淋菌を検出するための組成物を企図する。

本発明はまた、本発明のプローブおよび、以下の核酸配列：
配列番号１３ GCCTTCGGGT TGTAAAGGAC TTTTGTCAGG GAAGAAAA
配列番号１４ GCTGATGACG GTACCTGAAG AATAAGCACC GGC
配列番号１７ TTTTCTTCCC TGACAAAAGT CCTTTACAAC CCGAAGGC
配列番号１８ GCCGGTGCTT ATTCTTCAGG TACCGTCATC AGC
配列番号３５ GCCUUCGGGU UGUAAAGGAC UUUUGUCAGG GAAGAAAA
配列番号３６ GCUGAUGACG GUACCUGAAG AAUAAGCACC GGC
配列番号３７ UUUUCUUCCC UGACAAAAGU CCUUUACAAC CCGAAGGC
配列番号３８ GCCGGUGCUU AUUCUUCAGG UACCGUCAUC AGC
配列番号２ GGGATAACTG ATCGAAAGAT CAGCTAATAC CGCATACG
配列番号４ ACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
配列番号３９ GGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
配列番号４０ ACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUG
の少なくとも１つに実質的に対応する核酸配列を有する少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図する。

本発明はまた、ナイセリア核酸と、次の配列からなる群：
配列番号５ GTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
配列番号６ GGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
配列番号４１ GUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号４３ GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
より選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドとの間に形成される核酸ハイブリッドを含む、ナイセリア核酸を増幅するための組成物を企図する。

Ｇ．アッセイ方法
本発明は、試料中の髄膜炎菌または淋菌の核酸の存在をアッセイする種々の方法を企図する。当業者は、用いられる正確なアッセイ条件、プローブまたはプライマーが、用いられる特定のアッセイ形式および試料の起源により変化することを理解するであろう。

一般に、本発明は、被験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で淋菌からの核酸より髄膜炎菌の標的核酸に優先的にハイブリダイズしうる核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることにより、髄膜炎菌の存在を検出する方法を企図する。前記標的核酸は、以下の配列からなる群：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を有する。

髄膜炎菌の存在を検出する好ましい方法は、被験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で淋菌の核酸配列より髄膜炎菌の標的核酸配列に優先的にハイブリダイズしうる核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を含む。前記標的核酸配列は、次の配列からなる群：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
より選択される配列に実質的に対応する。

淋菌の存在を検出する好ましい方法は、被験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で髄膜炎菌の核酸配列より淋菌の標的核酸配列に優先的にハイブリダイズしうる核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を含む。前記標的核酸配列は、以下の配列からなる群：
配列番号１ GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３ GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号２９ CCGCTACCCG GTACGTTC
配列番号３０ CATCGGCCGC CGATATTGGC
配列番号３１ GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２ GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
配列番号３３ CCGCUACCCG GUACGUUC
配列番号３４ CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
より選択される配列に実質的に対応する。

他の態様においては、本発明はまた、被験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、髄膜炎菌からの核酸配列より淋菌の核酸配列に優先的にハイブリダイズしうる核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることにより、淋菌微生物の存在を検出する方法を企図する。前記標的核酸配列は、以下の配列からなる群：
配列番号１ GAACGTACCG GGTAGCGG
配列番号３ GCCAATATCG GCGGCCGATG
配列番号３１ GAACGUACCG GGUAGCGG
配列番号３２ GCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
より選択される配列に実質的に対応する。

本発明はまた、ナイセリアを検出する方法を企図する。この方法は、まずナイセリア核酸の一部を増幅し、次に随意に、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて本発明のプライマーにより増幅された特定のナイセリア由来核酸についてアッセイすることを含む。増幅された核酸は、ゲル電気泳動を含む多くの方法により検出することができる。

好ましい態様においては、本発明は、まず前記核酸を以下の配列：
配列番号４７ GUCUUGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
配列番号４８ UAUGUUACUC ACCCGUUCGC CACUCGCC
配列番号４９ CUGAAGAAUA AGCACCGGCU AACUACGUGC AGCAGC
配列番号５０ CGAUGACGGU ACCUGAAGAA UAAGCACCGG CUAAC
配列番号５１ AACGGCCUUU UCUUCCCUGA CAAAAGUCCU UUACAACCCG
配列番号５２ GUCCUUUACA ACCCGAAGGC CUUC
の１つまたはそれ以上に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドで増幅することにより、ナイセリア由来核酸を検出する方法を企図しており、ここで、前記増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる伸長の開始を促進する核酸配列を随意に有する。

この第１の方法工程の後、次に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅工程において生成した増幅された核酸を、ナイセリア種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、髄膜炎菌または淋菌に由来する核酸に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブで検出する工程を随意に含んでいてもよい。

本発明の方法において用いられる増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始を促進する核酸配列、例えばプロモーター配列を随意に含んでいもよい。

他の好ましい態様においては、本発明は、以下のヌクレオチド配列：
配列番号：１９または４９、
配列番号：２１または５０、
に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで、または
以下の配列：
配列番号：２０または５１、
配列番号：２２または５２
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記増幅オリゴヌクレオチドの両方で核酸を増幅することにより、被験試料中のナイセリア核酸を増幅する方法を企図しており、ここで、前記増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を随意に有する。

他のより好ましい態様においては、本発明は、以下のヌクレオチド配列：
配列番号：１９または４９
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで、または
以下の配列：
配列番号：２０または５１
に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記増幅オリゴヌクレオチドの両方で、ナイセリア由来核酸を増幅することを含む、被験試料中のナイセリア由来核酸を増幅する方法を企図しており、ここで、前記増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を随意に有する。

他の好ましい態様においては、本発明は、被験試料中のナイセリア由来核酸配列の数を増加させる方法を企図する。この方法は、以下のヌクレオチド配列：
配列番号：２１または５０
に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで、または、以下の配列：
配列番号：２２または５２
に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記増幅オリゴヌクレオチドの両方で、前記核酸を増幅することを含み、ここで前記増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を随意に有する。

上述の方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で髄膜炎菌の核酸に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、増幅された核酸を検出する追加の工程を含むことができる。

選択的に、この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で以下の配列からなる群：
配列番号１１ GGCTGTTGCT AATATCAGCG
配列番号２７ CGCUGAUAUU AGCAACAGCC
配列番号１２ GGCTGTTGCT AATACCAGCG
配列番号２８ CGCUGGUAUU AGCAACAGCC
配列番号１５ CGCTGATATT AGCAACAGCC
配列番号２５ GGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
配列番号１６ CGCTGGTATT AGCAACAGCC
配列番号２６ GGCUGUUGCU AAUACCAGCG
より選択される配列に実質的に対応する核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて髄膜炎菌を検出することができる。

本発明はまた、以下のヌクレオチド配列：
配列番号２３または４７、
配列番号２４または４８、
の１つまたはそれ以上に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで淋菌由来核酸を増幅することにより、被験試料中の淋菌由来核酸の数を増加させる方法を企図しており、ここで、増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を随意に含む。

別の方法は、
以下のヌクレオチド配列：
配列番号：２３または４７、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第１の増幅オリゴヌクレオチドで、または
以下の配列：
配列番号：２４または４８、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記第１のおよび第２の増幅オリゴヌクレオチドの両方で、被験試料中の淋菌由来核酸を増幅する方法を企図しており、ここで、増幅オリゴヌクレオチドの１つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を随意に含む。

淋菌由来核酸を増幅するこれらの方法の後に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で淋菌の核酸に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、増幅された核酸を検出する工程を行うことができる。

好ましくは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号：１、２９、３１、および３３からなる群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を有する。

淋菌の核酸の検出は、配列番号２および配列番号３９からなる群より選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドの使用を含んでいてもよい。

以下のヌクレオチド配列：
配列番号：１９または４９、配列番号：２０または５１、配列番号：２１または５０、配列番号：２２または５２
の１つまたはそれ以上に実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはこれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで淋菌由来核酸を増幅することにより、被験試料中の淋菌由来核酸の数を増加させることにより淋菌の核酸を検出する他の方法が企図され、ここで、増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を任意に含む。

被験試料中のナイセリア核酸を増幅する好ましい方法は、
以下のヌクレオチド配列：
配列番号：１９または４９、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで、または
以下の配列：
配列番号：２０または５１、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドの両方で、核酸を増幅することを含む。

あるいは本発明は、
以下のヌクレオチド配列：
配列番号：２１または５０、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす１つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドで、または
以下の配列：
配列番号：２２または５２、
の１つに実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれにより伸長を引き起こす第２の増幅オリゴヌクレオチドで、または
前記第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドの両方で、核酸を増幅することを含む、被験試料中のナイセリア核酸の増幅を企図する。

ナイセリア核酸の増幅の後に、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で淋菌の核酸に特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて増幅された核酸を検出する。用いられるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好ましくは、配列番号：３、３２、３０、３４からなる群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を有する。

Ｈ．診断システム
本発明はまた、キットの形での診断システムを企図する。本発明の診断システムは、本発明の増幅プライマーおよび／またはハイブリダイゼーションアッセイプローブを少なくとも１つのアッセイに十分な量で包装材料中に含むキットを含む。典型的には、キットは、包装されるプライマーおよび／またはプローブを使用するための指針も含む。

診断システムの種々の成分は種々の形態で提供することができる。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プライマーおよびプローブは、凍結乾燥された試薬として提供してもよい。これらの凍結乾燥試薬は、再構成したときにアッセイにおいてすぐに用いることができる各成分の正しい比率を有する完全な混合物を形成するように、凍結乾燥前に予め混合してもよい。さらに、本発明の診断システムは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含んでいてもよい。好ましいキットにおいては、酵素、ヌクレオチド三リン酸および必要な酵素の補助因子は、再構成したときに本発明の方法において用いるのに正しい試薬を形成するように、単一の凍結乾燥試薬として提供される。これらの好ましいキットにおいては、凍結乾燥プライマー試薬もまた提供される。他の好ましいキットにおいては、凍結乾燥プローブ試薬が提供される。

典型的な包装材料は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーを固定範囲中に保持することができる固体マトリクス、例えばガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子等を含む。すなわち、例えば、包装材料から作られた包装は、ミリグラム以下（すなわち、ピコグラム、ナノグラム等）の量の本発明のプライマーまたはハイブリダイゼーションアッセイプローブを含有するために用いられるガラスバイアルであってもよく、または本発明のプローブおよび／またはプライマーが作用可能なように固定された、すなわち、本発明の検出方法に関与することが可能なように結合されたマイクロタイタープレートウエルであってもよい。

使用の指針は、典型的には、種々の試薬および／または試薬の濃度および少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ、例えば、単位量の試料あたりに用いる試薬の相対量を記載する明白な表現を含む。さらに、保存、時間、温度および緩衝液条件等の明細が含まれるであろう。

本発明は、本発明の組成物のオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。本発明はまた、本発明の方法を実施するのに必要なオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

この方法は、好ましくは、配列番号４および配列番号４０からなる群より選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを使用する。
本発明は、配列番号：１、３、１１、１２、１５、１６、２９、３０、３３、３４、２７、２８、２５、２６からなる群より選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列からなる群：
前記オリゴヌクレオチドが
配列番号：１または３１に実質的に対応する場合、
配列番号：２または３９；
または
前記オリゴヌクレオチドが
配列番号：３または３２に実質的に対応する場合、
配列番号：４または４０；
または
前記オリゴヌクレオチドが
配列番号：１１または２５、または
配列番号：１２または２６に実質的に対応する場合、
配列番号：１３または３５、または
配列番号：１４または３６；
または
前記オリゴヌクレオチドが
配列番号：１５または２７、または
配列番号：１６または２８に実質的に対応する場合、
配列番号：１７または３７、
配列番号：１８または３８；
より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を有する少なくとも１つのヘルパープローブを有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを有する診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列からなる群：
配列番号７ GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
配列番号８ GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
配列番号９ CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
配列番号１０ GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
配列番号４３ GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
配列番号４４ GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
配列番号４５ CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
配列番号４６ GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
より選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する５’配列を随意に有する２つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列：
配列番号：７または４３、
配列番号：９または４５、
配列番号：１１または２５、
配列番号：１３または３５、
配列番号：１４または３６
に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列：
配列番号：１５または２７、
配列番号：１６または２６、
配列番号：１７または３７、
配列番号：１８または３８
に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列：
配列番号：７または４３、
配列番号：９または４５、
配列番号：１５または２７、
配列番号：１６または２８、
配列番号：１７または３７、
配列番号：１８または３８
に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列：
配列番号：５または４１、
配列番号：６または４２、
配列番号：２または３９、
配列番号：１または３１
に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明は、以下の配列：
配列番号：５または４１、
配列番号：２または３９、
配列番号：１または３１
に実質的に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図する。

本発明の各種の観点および態様を示すために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、いかなる意味においても開示される発明を制限することを意図するものではなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。

淋菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）、髄膜炎菌血清群Ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３０７７）、血清群Ｃ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２４８）および血清群Ｌ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３８２８）、および臨床単離物、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３９７０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４６８５）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｕｃｏｓａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９６９６）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９１９３）およびＫｉｎｃｒｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３３３０）の１６Ｓ ｒＲＮＡに相補的なプライマーを用いて、予測標的領域中で決定された配列を用いて髄膜炎菌に特異的なプローブを設計した。系統発生的に近縁の種、例えば淋菌ＮＣＴＣ８３７５の公開されている配列（Ｒｏｓｓａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６２２７）からの核酸配列もまた、髄膜炎菌からの核酸配列との比較に用いて可変領域を決定した。

そのような並列の例は、以下のものである：髄膜炎菌がＥ．ｃｏｌｉおよび淋菌と異なる特異的配列をプローブ設計のために選択した。髄膜炎菌に対する２つの異なるプローブ（配列番号１１）および（配列番号１２）を設計した。ｒＲＮＡ配列は以下に示される通りである。

以下に記載する実施例においては、次のハイブリダイゼーションアッセイプローブ配列を特徴とする。
配列番号１：ＧＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧ，
配列番号３：ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ，
配列番号１１：ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧ，
配列番号１２：ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣＧ，
配列番号１５：ＣＧＣＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣ、および
配列番号１６：ＣＧＣＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣ

実施例１
この実験においては、Ｋａｃｉａｎら、米国特許５，３９９，４９１に記載される技術を用いて、精製した淋菌ｒＲＮＡ（ＡＴＣＣ ＮＯ．１９４２４）を、淋菌ｒＲＮＡに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドで増幅した。２つのプロモータープライマーを合成した。それぞれは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号５３）を５’末端に有し、これを、３’末端の標的相補的配列５’−ＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号５）に共有結合させた。１つのプロモータープライマーは、遊離３’ＯＨ基を有するように合成し、反応あたり２ｐｍｏｌで用いた。第２のプロモータープライマーは、３’末端にアルカンジオールを有するように合成し、反応あたり１３ｐｍｏｌで用いた。標的核酸およびプライマーを９５℃で１５分間加熱し、４２℃に冷却した。９００ユニットのモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）、および４００ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および５％（ｗ／ｖ）グリセロールを含んでいた。４２℃、２時間のインキュベーションの後、１００μｌの増幅反応の全部を、配列５’−ＧＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧ−３’（配列番号１）のアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＧＧＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧ−３’（配列番号２）の未標識ヘルパープローブでハイブリダイゼーションすることによりアッセイした。ハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０．６ＭＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００μｌの溶液中で、６０℃で１０分間実施し、次に３００μｌの０．１５Ｍテトラホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトン（商標）Ｘ−１００を加えた。この混合物を６０℃で１０分間インキュベートし、室温に冷却した。各チューブの残留化学ルミネセントを、１ｍＭ硝酸および０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎ水酸化ナトリウムを含む溶液の注入を備えたＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ(R) Ｉ ルミノメーターでアッセイした。結果は、相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ：ＲＬＵ）、すなわちルミノメーターで検出された光子の測定値で表した。

実施例２
この実験は、反対のセンスの２つのプライマーを用いる淋菌ｒＲＮＡの増幅を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列および配列５’−ＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号５）の３’標的ハイブリダイズ領域を含む、実施例１に記載したプロモーター−プライマーを反応あたり１５ｐｍｏｌで用い、淋菌ｒＲＮＡと同じセンスの配列５’−ＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号６）を含むプライマーを反応あたり１５ｐｍｏｌで用いた。反応は三重に実施した。増幅条件は実施例に記載したとおりであり、試料を９５℃で５分間加熱し、次に４２℃に冷却した。酵素を加え、４２℃、２時間のインキュベーション後、２０μｌの増幅反応を、配列番号１の配列で合成したアクリジニウムエステル標識プローブ、および配列番号２の配列で合成した未標識ヘルパープローブを用いてハイブリダイゼーションによりアッセイした。プライマーは淋菌ＲＮＡを増幅し、１００コピーより少ない標的の検出を可能とした。

実施例３
この実験においては、同一の配列の２つのプロモータープライマーを再び用いた。各プロモータープライマーは、５’Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列 ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号５３）を５’末端に、標的ハイブリダイズ領域 ５’−ＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号７）を３’末端に有するように合成した。プロモータープライマーは、３’−ヒドロキシル基を有するように合成して、反応あたり２ｐｍｏｌで用いるか、または３’−アルカンジオールを有するように合成して、反応あたり１３ｐｍｏｌで用いた。試料を９５℃で５分間加熱し、酵素を加える前に４２℃に冷却した。増幅条件は実施例１に記載のとおりであった。４２℃、２時間のインキュベーションの後、１００μｌの増幅反応を、配列５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ−３’（配列番号４）を有する未標識ヘルパープローブでのハイブリダイゼーションにより、実施例１に記載される条件を用いてアッセイした。

実施例４
この実験においては、淋菌ｒＲＮＡを、２つのオリゴヌクレオチド、１つは淋菌ｒＲＮＡに相補的なプロモータープライマーであり、１つは淋菌ｒＲＮＡと同じセンスのプライマーである、の混合物で増幅した。プロモータープライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を５’末端に、標的ハイブリダイズ領域５’−ＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号７）を３’末端に含み、配列５’−ＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴ−３’（配列番号９）のプライマーとともに反応あたり３０ｐｍｏｌで用いた。あるいは、配列５’−ＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号８）の標的ハイブリダイズ領域を含むプロモータープライマーを反応あたり１５ｐｍｏｌで、配列５’−ＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）を有する反応あたり１５ｐｍｏｌのプロモータープライマーとともに用いた。増幅条件は、実施例１に記載したとおりである。２０μｌの生成物を、配列５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ−３’（配列番号４）で合成した未標識ヘルパープローブを用いて、実施例１に記載のようにハイブリダイゼーションによりアッセイした。

実施例５
この例は、増幅および検出アッセイの反応性を示す。１３株の淋菌の新鮮な培養物を約１０^１０細胞／ｍｌの密度で０．９％塩化ナトリウムに懸濁し、３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、３０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＥＧＴＡを含む溶液中で溶解させた。核酸の脱離は、すべての細菌のリボソームＲＮＡの保存領域に対するプローブでのハイブリダイゼーションにより確認した。細胞溶解物をさらに水で希釈して、３０ｐｍｏｌの５’Ｔ７ＲＮＡプロモーター配列、すなわち配列番号５３ ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’および配列番号７を含む３’標的結合配列を含むプロモーター−プライマー、および３０ｐｍｏｌの配列番号９を含むプライマーを含む増幅反応に加えた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび上述のオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅混合物を用いて、少なくとも１０^５細胞からの溶解物を含む二重の反応を実施した。混合物を９５℃に５分間加熱し、４２℃に冷却し、９００ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素および４００ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。４２℃、１時間のインキュベーションの後、２０μｌの増幅反応を、配列５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ−３’（配列番号４）を含む未標識ヘルパープローブを用いるハイブリダイゼーションによりアッセイした。

実施例６
他のナイセリア種の配列分析は、本発明の増幅オリゴヌクレオチドが他の種の核酸を増幅しうることを示す。この例は、本発明の増幅オリゴヌクレオチドの、他のナイセリア種である髄膜炎菌からの核酸を増幅する用途を示す。髄膜炎菌用の特異的プローブの開発の間に、髄膜炎菌種のメンバーは選択したプローブ領域において均一ではないことが明らかになった。最初のプローブに対して低い反応性を示した代表的髄膜炎菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡの配列を決定し、第２のプローブを設計した。これらのデータは、３つの髄膜炎菌種が２つのプローブに対して異なる反応性を有することを示す。この例においては、淋菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９４２４）からの精製したＲＮＡ、または約１，０００個の細胞に相当する髄膜炎菌血清群Ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３０７７）、血清群Ｃ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３１０２）および血清群Ｌ、（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３８２８）からの溶解物を、実施例５に記載されるプロモーター−プライマーおよびプライマーで、実施例５に記載される条件下で増幅した。１００μｌの増幅反応の１０μｌの試料を、配列５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ−３’（配列番号４）で合成した未標識ヘルパープローブ、または配列５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１１）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび、１つは配列５’−ＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡ−３’（配列番号１３）で合成し、１つは配列５’−ＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣ−３’（配列番号１４）で合成した２つの未標識ヘルパープローブ、または配列５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１２）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列番号１３および１４の未標識ヘルパープローブ、または配列番号１１および１２の標識プローブの組み合わせおよび配列番号１３および１４の未標識ヘルパープローブを用いて、ハイブリダイゼーションによりアッセイした。配列分析は、ナイセリアの他の株もまた、これらのプライマーで増幅することを示した。

データは、髄膜炎菌および淋菌の株を配列番号７および９を含むプライマーを用いて増幅することができ、配列番号３、１１、および１２のプローブで検出しうることを示す。

実施例７
この実験では、髄膜炎菌についての増幅および検出アッセイの感度を示した。この例においては、髄膜炎菌血清群Ｃの細胞を培養し、０．９％塩化ナトリウムに１ｍｌあたり約×１０^９細胞の密度で懸濁した。３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、３０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡを含む等量の溶液を加えて細胞を溶解させ、増幅反応に加える前に水で希釈した。増幅は、実施例５に記載されるプロモータープライマーおよびプライマー（それぞれ配列番号７および９）を用いて、実施例５に記載されるように実施した。２０μｌの反応を、配列５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１１）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブ、および、１つは配列５’−ＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡ−３’（配列番号１３）で合成し、１つは配列５’−ＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣ−３’（配列番号１４）で合成した２つの未標識ヘルパープローブを用いて、ＨＰＡ形式でハイブリダイゼーションにより分析した。

実施例８
髄膜炎菌１６Ｓ ｒＲＮＡに対するプローブの反応性および特異性を示すために、配列５’−ＣＧＣＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１５）または配列５’−ＣＧＣＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１６）で合成したアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドおよび配列５’−ＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１７）および５’−ＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１８）で合成した未標識ヘルパープローブを含むプローブの混合物を、以下に挙げたナイセリア種の新鮮培養物から調製した溶解物中の核酸にハイブリダイズさせた。各溶解物を２３Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に対するプローブで試験して、生物の溶解およびｒＲＮＡの完全性を確認した。

＊ プローブ混合物は、配列番号１５および配列番号１６の配列で合成したアクリジニウムエステル標識プローブ、および配列番号１７および配列番号１８の配列で合成した未標識ヘルパープローブを含有していた。

データは、プローブの混合物により試験したすべての髄膜炎菌株の検出が可能であったことを示す。プローブ混合物は、髄膜炎菌と同一の臨床試料中に見いだされることがありそうもない生物であるＮ．ｃｉｎｅｒｅａとの交叉反応を示した。Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａで感染した患者の処置は、髄膜炎菌で感染した患者のものと同じであろう。

実施例９
この例は、増幅および検出アッセイの特異性を示す。配列番号７を含む３０ｐｍｏｌのプロモーター−プライマーおよび配列番号９を含む３０ｐｍｏｌのプライマーを、１１種の異なるナイセリア種でのアッセイにおいて用いた。細胞溶解物を実施例５に記載したように調製し、実施例１に記載した条件を用いて増幅し、ハイブリダイゼーションにより分析を行った。２０μｌの増幅反応を、配列５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列５’−ＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧ−３’（配列番号４）で合成した未標識ヘルパープローブと、または配列５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１１）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブを配列番号１３および１４を含む配列で合成した未標識ヘルパープローブの存在下で、または配列５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１２）で合成したアクリジニウムエステル標識プローブを配列番号１３および１４の未標識ヘルパープローブの存在下で、ハイブリダイズさせた。

上述の実施例において示されたデータは、本明細書に記載され特許請求される新規増幅オリゴヌクレオチドが、ナイセリア核酸を増幅することができ、アッセイにおいて淋菌と髄膜炎菌（最も近い既知の系統発生的近縁体）を互いに区別するために用いることができることを確証する。本明細書に記載される例のいずれも、本発明をこの開示の態様に限定することを意図するものではなく、前記発明は、もっぱら以下の特許請求の範囲によって限定される。
配列表

Claims (8)

1. 試料中の淋菌の存在を検出することに用いるハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、前記プローブの塩基配列が、配列番号３、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３４で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせを含み、かつ、前記プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、淋菌に由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成し、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ又はＬに由来する核酸とは前記ハイブリッドを形成しない、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
2. プローブの塩基配列が、配列番号３、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３４で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせからなる、請求項１記載のプローブ。
3. プローブが検出可能な標識を含む、請求項１又は２記載のプローブ。
4. 請求項１〜３のいずれか１項記載のプローブと淋菌に由来する核酸との間に形成された核酸ハイブリッドを含む組成物。
5. 試験試料中の淋菌の存在を検出する方法であって、前記方法が、以下の：
   （ａ）前記試験試料を請求項１〜３のいずれか１項記載のプローブとストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で接触させる工程；及び
   （ｂ）前記試験試料中に淋菌の存在を示すような、検出可能なハイブリッドが前記試験試料中に存在するか否かを決定する工程；
   を含む、前記方法。
6. プローブ混合物であって、
   試料中の淋菌の存在を検出することに用いるハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、前記プローブの塩基配列が、配列番号３、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３４で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせを含み、かつ、前記プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、淋菌に由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成し、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ又はＬに由来する核酸とは前記ハイブリッドを形成しない、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、及び
   ヘルパープローブであって、前記ヘルパープローブの塩基配列が、配列番号４、配列番号４０で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせを含み、かつ、前記プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、淋菌に由来する核酸と安定してハイブリダイズする、前記ヘルパープローブ
   を含む、前記プローブ混合物。
7. ハイブリダイゼーションアッセイプローブの塩基配列が、配列番号３、配列番号３２、配列番号３０、配列番号３４で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせからなり、かつ、ヘルパープローブの塩基配列が、配列番号４、配列番号４０で示される塩基配列又は前記配列のいずれかのＲＮＡ／ＤＮＡの同等物の組み合わせからなる、請求項６記載のプローブ混合物。
8. プローブが検出可能な標識を含む、請求項６又は７記載のプローブ。