DE69636917T2

DE69636917T2 - Nucleinsäuresonden und Amplifizierungsoligonukleotide für Neisseria Spezies

Info

Publication number: DE69636917T2
Application number: DE69636917T
Authority: DE
Inventors: Yeasing San Diego Yang; Gary Bee; Sherrol San Diego MCDONOUGH
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: JP2008131952A; EP0747489A3; CA2222305A1; WO1996041017A2; EP0747489A2; EP0747489B1; JP4280788B2; KR19990022595A; WO1996041017A3; AU6174496A; JP4293635B2; AU707691B2; ES2281077T3; JPH11507239A; DE69636917D1; JP2008131951A; ATE354670T1; JP4280789B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindungen betreffen das Design und die Verwendung von Amplifikationsoligonukleotiden und Nukleinsäuresonden für Neisseria gonorrhoeae, die das Detektieren dieses Organismus in Testproben erlauben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Gattung Neisseria schließt zwei Gram-negative Arten pyogener Kokken ein, die für den Menschen pathogen sind und die in keinem anderen Reservoir bekannt sind: die Meningokokken (Neisseria meningitidis) und die Gonokokken (Neisseria gonorrhoeae). Etliche nicht pathogene Arten bewohnen ebenfalls den Respirationstrakt von Menschen und können leicht mit Meningokokken verwechselt werden. Die meningokokken Meningitis wurde im frühen 19. Jahrhundert als ansteckende Erkrankung erkannt und ist besonders häufig bei militärischem Personal. Das verursachende Agens der meningokokken Meningitis ist Neisseria meningitidis.
Neisseria gonorrhoeae ist einer der Hauptgründe für eine epidemische, sexuell übertragene Erkrankung und ist in den Vereinigten Staaten vorherrschend. Eine Infektion mit Neisseria gonorrhoeae verursacht viele bekannte Symptome, einschließlich der Urethritis, Cervicitis und Proctitis. Zusätzlich kann eine chronische Infektion mit Neisseria gonorrhoeae eine Adnexitis verursachen.
Neisseria sind Gram-negative Kokken, die in Paaren oder gegebenenfalls in Tetraden oder Clustern wachsen. Viele Meningokokken weisen polysaccharidhaltige Kapseln auf. Gonokokken können auch Kapseln besitzen, jedoch ist die genaue chemische Zusammensetzung einer solchen Kapsel unbekannt.
Zusätzlich können sowohl Gonokokken als auch Meningokokken Pili aufweisen, die eine Rolle bei der Virulenz spielen.
Meningokokken und Gonokokken sind schwierig zu kultivieren und erfordern spezielle Techniken, damit die Organismen aus Körperflüssigkeiten wachsen. Zusätzlich ist ein selektives Kulturmedium (z.B. Thayer-Martin-Medium) und ein Wachstum unter 3-10 Kohlendioxid bei etwa 35°C erforderlich, um die Kultur der Organismen zu maximieren.
Zusätzlich zur schwierigen Kultivierung fehlt es bei der Detektion von Gonokokkus und Meningokokkus mittels eines Immunoassays an der Empfindlichkeit und Spezifität. Dies scheint eine Folge der Kreuzreaktion zwischen verschiedenen anderen pathogenen und nicht-pathogenen Mikroorganismen zu sein, die häufig in den gleichen klinischen Proben gefunden werden.
Oligonukleotide für die Amplifikation einer Nukleinsäure zum Detektieren von Neisseria sind beschrieben worden. Bikenmeyer und Armstrong, J. Clin. Microbiol. 30:3089-3094 (1992), beschreiben Probensätze für die Verwendung bei der Ligasekettenreaktion, die auf Opa- und Pilin-Gene von Neisseria gonorrhoeae gerichtet sind. Kristiansen et al. Lancet 340:1432-1434 (1992) beschreiben Primer, die auf ein Insertionselement gerichtet sind, das als IS1106 bezeichnet wird, zum Amplifizieren und Detektieren von Neisseria meningitidis. McLaughlin et al., Mol. and Cell Probes 7:7-17 (1993) beschreiben Primer für die Verwendung in der Polymerasekettenreaktion, die auf den 16S-23S rRNA internen transkribierten Spacer gerichtet sind und einen Satz von Primern, der auf einen Unterbereich der 16S rRNA von Neisseria meningitidis gerichtet ist. Sonden für die Detektion von rRNA oder rDNA-Sequenzen von Neisseria gonorrhoeae und/oder Neisseria meningitidis sind von Granato und Franz, J. Clin. Microbiol., 28:944-948, (1990); Wolff, U.S. Patent 5,173,401 (22. Dez. 1992); Rossau und Van Heuverswijn, Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 0 337 896; Hogan et al. PCT/US87/03009 und Barns et al., U.S. Patent 5,217,862 (8. Jun. 1993) beschrieben worden.
EP 318245 offenbart Sonden, die auf bestimmte Bereiche der 16S ribosomalen Nukleinsäure von Neisseria gonorrhoeae abzielen. EP 552931 offenbart die Verwendung von verzweigten Nukleinsäuren zum Detektieren ribosomaler RNA aus Neisseria gonorrhoeae. WO 90/14442 offenbart Sonden zum Binden der 16S und 23S ribosomalen Nukleinsäure von Neisseria gonorrhoeae.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die dargestellte Erfindung offenbart und beansprucht neue und nützliche Sätze von Amplifikationsoligonukleotiden gemäß den Ansprüchen 1–16, ein Kit, das Helfer-Oligonukleotide und Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden gemäß den Ansprüchen 17–31 umfasst, wobei die Oligonukleotide und Sonden entworfen worden sind, damit sie zu spezifischen Bereichen der rRNA(ribosomale RNA) oder rDNA-(ribosomale DNA)-Nukleotidsequenzen von Neisseria gonorrhoeae komplementär sind oder Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen einem spezifischen Abschnitt der Neisseria gonorrhoeae rRNA- oder rDNA-Nukleotidsequenz oder seinem Komplement entspricht. Da diese Amplifikationsoligonukleotide, Helfer-Oligonukleotide und Hybridisationsassaysonden von der rRNA pathogener Neisseria gonorrhoeae stammen, wird aufgrund des höheren Niveaus an RNA, die von diesen rRNA-Genen exprimiert wird und dem Fehlen einer lateralen Übertragung der rRNA-Sequenzen zwischen den Organismen ein überlegenes Detektionsassay erhalten.
Die Amplifikationsoligonukleotide und Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden arbeiten durch Hybridisieren mit Ziel-Neisseria gonorrhoeae 16S- und 23S- rRNA und/oder rDNA Gensequenzenen unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen. In bevorzugten Ausführungsformen können die Sonden und Amplifikationsoligonukleotide, die hierin beschrieben werden, wenn sie zusammen verwendet werden, Neisseria gonorrhoeae von anderen Mikroorganismen, die in klinischen Proben, wie zum Beispiel Blut oder Geweben, gefunden werden, voneinander unterschieden werden. Demnach können die Amplifikationsoligonukleotide und Hybridisierungsassaysonden in einem Assay zum spezifischen Detektieren und/oder Amplifizieren von Nukleinsäuren die von Neisseria gonorrhoeae stammen verwendet werden. In den bevorzugten Ausführungsformen können die Hybridisierungsassaysonden, die hierin beschrieben werden, mit Nukleinsäuren von Neisseria gonorrhoeae aber nicht mit solchen, die von Neisseria meningitidis stammen, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen selektiv hybridisieren. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Hybridisierungsassaysonde ein Oligonukleotid, das eine Reportergruppe, wie zum Beispiel einen Acridiniumester oder ein Radioisotop, enthält, um das Feststellen der Hybridisierung der Sonde mit seiner Ziel-Sequenz zu unterstützen. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das Amplifikationsoligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuresequenz auf, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, oder die die Transkriptionsinitiation durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Hybridisierungsassaysonden, die für das Detektieren von Neisseria gonorrhoeae-Nukleinsäuren nützlich sind. Bevorzugt weisen diese Hybridisierungsassaysonden eine Nukleotidsequenz auf, die aus einer der folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt wird:
SEQ ID NO 3: GCCAATATCG GCGGCCGATG
SEQ ID NO 30: CATCGGCCGC CGATATTGGC
SEQ ID NO 32: GCCAUAUCG GCGGCCGAUG
SEQ ID NO 34: CAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
Es werden bevorzugt Helfer-Oligonukleotide verwendet, um die spezifische Hybridisierung der Assaysonde mit seiner Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern; Helfer-Oligonukleotide werden von Hogan und Milliman U.S. Patent Nr. 5,030,557 beschrieben. Oligonukleotide, die als Helfersonden in dieser Erfindung verwendet werden, schließen die folgenden Sequenzen ein:
SEQ ID NO: 4 ACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
SEQ ID NO: 40 ACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUG
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Zusammensetzungen gemäß der Ansprüche 32–33 zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae ein, die Nukleinsäurehybride sind, die zwischen einem Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung und einem spezifischen Bereich eines Nukleotidpolymers aus Neisseria gonorrhoeae gebildet werden. Im Allgemeinen enthält das Nukleotidpolymer eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Oligonukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder seinem Komplement übereinstimmt und von der rRNA oder der rDNA, die für die ribosomale RNA von Neisseria gonorrhoeae kodiert, stammt. Die in diesen Zusammensetzungen vorhandenen Oligonukleotide können die Sätze von Amplifikationsoligonukleotiden aus einem der Ansprüche 1–15 sein und die Hybridisierungsassaysonde aus einem der Ansprüche 17–28. Diese Zusammensetzungen können weiter ein Helfer-Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 29–31 umfassen.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die eine Sonde enthalten, die mit ihrer Ziel-Sequenz hybridisiert ist, sind für das Detektieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz nützlich. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, das mit seiner Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert ist, sind für das zur Verfügungsstellen eines bestimmten Abschnittes der Ziel-Nukleinsäure für die Hybridisierung nützlich. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einen Oligonukleotidprimer enthalten, der mit seiner Ziel-Sequenz hybridisiert ist, sind für das Erzeugen einer Initiationsstelle für eine Polymerase am 3'-Ende des Primers und/oder Bereitstellen einer Matrize für die Verlängerung des 3'-Endes der Ziel-Sequenz nützlich.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae entsprechend der Ansprüche 34–37. In diesen Verfahren wird eine Testprobe mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungsassaysonde unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen in Kontakt gebracht, wobei die Nukleinsäure-Hybridisierungsassaysonde mit Neisseria gonorrhoeae-Ziel-Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann aber nicht mit den Nukleinsäuresequenzen von Neisseria meningitidis. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Oligonukleotide und die Äquivalente davon, die in diesen Verfahren verwendet werden, die wahlweise ein Reportermolekül enthalten, das das Feststellen der Hybridisierung der Sonde mit seiner Ziel-Sequenz unterstützt. Diese Erfindung ist für das Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae-Nukleinsäuren in Testproben vom Menschen, wie zum Beispiel Blut, aus dem Blut erhaltene Proben, Geweben, vom Gewebe erhaltene Proben, anderen Körperflüssigkeiten und Körperproben nützlich.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae, in denen die Nukleinsäure mit wenigstens einem Amplifikationsoligonukleotid der vorliegenden Erfindung amplifiziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen folgt dieser Amplifikation dann ein Detektionsschritt, in dem die amplifizierte Nukleinsäure mittels einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde der vorliegenden Erfindung detektiert wird. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen auch die Verwendung von Amplifikationsoligonukleotiden, die die Nukleotidsequenz für einen RNA-Promotor einschließen.
In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung Amplifikationsoligonukleotide, die für die Detektion von Organismen der Art Neisseria gonorrhoeae in einem Amplifikationsassay nützlich sind. Solche Oligomere entsprechen bevorzugt im Wesentlichen einer der folgenden Nukleotidsequenzen:
SEQ ID NO: 7 GCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
SEQ ID NO: 9 CGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
SEQ ID NO: 45 CGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
und
SEQ ID NO: 43 GCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG,
wobei das Oligomer modifiziert sein kann oder eine Modifikation, wie zum Beispiel das Hinzufügen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz an das 5'-Ende, das durch eine RNA-Polymerase (einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf die Promotorsequenz für T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase) erkannt wird und/oder Sequenzen, die die Initiation der RNA-Transkription durch eine RNA-Polymerase verstärken, enthalten. Ein Beispiel für eine Promotorsequenz schließt die Sequenz der SEQ ID NO: 53 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' ein. Andere Beispiele für nützliche Promotorsequenzen sind in zahlreichen kommerziell erhältlichen Vektoren, die zum Beispiel die pBluescript^®-Vektoren von Stratagene Cloning Systems (San Diego, CA) oder die pGEM^TM-Vektoren von Promega Corp. (Madison, WI) einschließen, enthalten.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung binden die Amplifikationsoligonukleotide an oder verursachen eine Verlängerung durch Sequenzen, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmen:
SEQ ID NO: 19 CTGAAGAATA AGCACCGGCT AACTACGTGC AGCAGC
SEQ ID NO: 20 AACGGCCTTT TCTTCCCTGA CAAAAGTCCT TTACAACCCG
SEQ ID NO: 49 CUGAAGAAUA AGCACCGGCU AACUACGUGC AGCAGC
SEQ ID NO: 51 AACGGCCUUU UCUUCCCUGA CAAAAGUCCU UUACAACCCG
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Kits gemäß den Ansprüchen 16–31 ein, die ein oder mehrere der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, die Amplifikationsoligonukleotide, Helfer-Oligonukleotide und Hybridisierungsassaysonden einschließen, enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen schließt ein Kit der vorliegenden Erfindung wenigstens ein Amplifikationsoligonukleotid und eine Hybridisierungsassaysonde ein, die Neisseria gonorrhoeae von anderen Mikroorganismen unterscheiden können.
Hintergrundbeschreibungen zur Verwendung der Nukleinsäurehybridisierung zum Detektieren bestimmter Nukleinsäuresequenzen werden von Kohne im U.S. Patent Nr. 4,851,330, das am 25. Juli 1989 erteilt wurde, und von Hogan et al., internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US87/03009, mit dem Titel "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms" gegeben. Hogan et al., siehe oben, beschreibt Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines nicht viralen Organismus oder einer Gruppe von nicht viralen Organismen in einer Probe (z.B., Sputum, Urin, Blut und Gewebeschnitte, Nahrungsmittel, Boden und Wasser).
In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen weisen die Zusammensetzungen, Sonden, Amplifikationsprimer, Helferoligonukleotide und ähnliche vielmehr eine Nukleotidsequenz auf, die aus der spezifischen Nukleinsäuresequenz besteht anstatt mit der Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen übereinzustimmen. Diese am meisten bevorzugten Ausführungsformen verwenden die Sequenzen, die in den Ansprüchen beschrieben werden und in der Sequenzliste aufgeführt sind, die einen Teil der vorliegenden Offenbarung bildet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
Die folgenden Begriffe haben die angegebene Bedeutung in der Beschreibung, soweit nicht ausdrücklich angegeben wird, dass sie eine andere Bedeutung haben.
Mit "Ziel-Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure mit einer Ziel-Nukleotidsequenz gemeint.
Mit "Oligonukleotid" ist ein einzelsträngiges Nukleotidpolymer gemeint, das aus mehr als 2 Nukleotiduntereinheiten zusammengesetzt ist, die kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt sind zwischen 10 und 100 Nukleotideinheiten vorhanden, noch bevorzugter sind zwischen 12 und 50 Nukleotideinheiten miteinander verbunden. Die Zuckergruppen der Nukleotiduntereinheiten können Ribose, Desoxyribose oder modifizierte Derivate davon sein, wie zum Beispiel 2'-O-Methylribose. Die Nukleotiduntereinheiten eines Oligonukleotids können über eine Phosphordiesterverknüpfung, Phosphorthioatverknüpfung, Methylphosphonatverknüpfung oder durch andere seltene oder nicht natürlich auftretende Verknüpfungen miteinander verbunden sein, welche die Hybridisierung des Oligonukleotids nicht verhindern. Darüber hinaus kann ein Oligonukleotid ungewöhnliche Nukleotide oder Nicht-Nukleotidreste aufweisen. Ein Oligonukleotid, wie es hierin definiert wird, ist eine Nukleinsäure, bevorzugt DNA, kann aber auch RNA sein oder eine Kombination aus Ribo- und Desoxyribonukleotiden aufweisen, die kovalent miteinander verknüpft sind. Oligonukleotidsonden und Amplifikationsoligonukleotide einer definierten Sequenz können durch Techniken, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel durch chemische oder biochemische Synthesen und durch in vitro oder in vivo-Expression von rekombinaten Nukleinsäuremolekülen, z.B. bakterielle oder retrovirale Vektoren, erzeugt werden. Wie durch diese Offenbarung beabsichtigt, besteht ein Oligonukleotid nicht aus Wildtyp chromosomaler DNA oder den in vivo Transkriptionsprodukten davon. Eine Verwendung einer Sonde ist die einer Hybridisierungsassaysonde; Sonden können auch als in vivo oder in vitro therapeutische Amplifikationsoligomere oder Antisense-Agenzien verwendet werden, um die Gentranskription oder Translation in erkrankten, infizierten oder pathogenen Zellen zu blockieren oder inhibieren.
Mit "Ziel-Nukleinsäuresequenz", "Ziel-Nukleotidsequenz" oder "Ziel-Sequenz" ist eine spezifische Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz gemeint, welche die gesamte oder einen Teil der Nukleotidsequenz eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und die Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz, die dazu komplementär ist, umfasst.
Nukleinsäurehybridisierung ist das Verfahren, bei dem zwei Nukleinsäurestränge mit vollständig oder teilweise komplementären Nukleotidsequenzen unter vorbestimmten
Reaktionsbedingungen zusammenkommen, um ein stabiles, doppelsträngiges Hybrid mit spezifischen Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Jeder Nukleinsäurestrang kann eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), eine Ribonukleinsäure (RNA) oder ein Analogon einer dieser Nukleinsäuren sein; daher kann die Hybridisierung RNA:RNA-Hybride, DNA:DNA-Hybride oder RNA:DNA-Hybride einschließen.
Der Begriff "Hybridisierung", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezeichnet die Fähigkeit von zwei vollständig oder teilweise komplementären Einzelnukleinsäuresträngen in einer antiparallelen Orientierung zusammenzukommen, um eine stabile Struktur mit einem doppelsträngigen Bereich zu bilden. Die beiden Strangbestandteile dieser doppelsträngigen Struktur, manchmal auch Hybrid genannt, werden über Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten. Auch wenn sich diese Wasserstoffbrückenbindungen für gewöhnlich zwischen Nukleotiden ausbilden, die die Basen Adenin und Thymin oder Uracil (A und T oder U) oder Cytosin und Guanin (C und G) auf Einzelnukleinsäuresträngen ausbilden, kann die Basenpaarung sich zwischen Basen ausbilden, die keine Mitglieder dieser "kanonischen" Paare sind. Nicht kanonische Basenpaarungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z.B., The Biochemistry of the Nucleic Acids (Adams et al., Hrsg., 1992).
"Stringente" Hybridisierungsassaybedingungen betreffen Bedingungen, bei denen eine spezifische Hybridisierungssassaysonde mit Ziel-Nukleinsäuren (bevorzugt rRNA oder rDNA von Neisseria gonorrhoeae) in Anwesenheit anderer Nukleinsäuren, die in der Testprobe, die entweder von anderen Mikroorganismen oder von Menschen stammt, vorhanden sind, hybridisieren kann. Es wird davon ausgegangen, dass diese Zustände abhängig von Faktoren, die den GC-Gehalt und die Länge der Sonde, die Hybridisierungstemperatur, die Zusammensetzung des Hybridisierungsreagenzes oder der Lösung und dem Grad der Hybridisierungsspezifität, die angestrebt wird, einschließt, variieren können. Spezifische stringente Hybridisierungszustände werden in der unten stehenden Offenbarung bereitgestellt.
Als Beispiel für spezifische stringente Hybridisierungsbedingungen, die zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae geeignet sind, für die Hybridisierungsassaysonden dieser Erfindung wurde eine Reihe von bevorzugten stringenten Hybridisierungsassaybedingungen verwendet. Eine bevorzugte Reihe umfasste das Hybridisieren der Ziel-Nukleinsäure und der Hybridisierungssonde zusammen in 100 μl 0,05 M Lithiumsuccinat (pH 5,0), 6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlauryl-sulfat, (L.L.S) 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM Ethylenglycolbis(beta-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) bei 60°C für 15 Minuten, dann wurden 300 μl 0,15 M Natriumtetraborat (pH 8,5), 1% (v/v) TRITON^® X-100 bei 60°C für 5–7 Minuten zugegeben. Zusätzliche Möglichkeiten stringenter Hybridisierungbedingungen können nach dem Lesen der vorliegenden Offenbarung vom Fachmann bestimmt werden.
Mit "Sonde" ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz gemeint, die teilweise oder vollständig komplementär mit einer Nukleinsäuresequenz ist, die man zu detektieren wünscht, damit man mit ihr unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren kann. Der Begriff "Sonde" bedeutet, dass Nukleinsäuren, die normalerweise in der Natur existieren, ausgeschlossen werden. Gereinigte Oligonukleotidsonden können durch im Stand der Technik bekannte Techniken, wie zum Beispiel die chemische Synthese und durch in vitro oder in vivo Expression von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, z.B. retrovirale Vektoren, erzeugt werden. Bevorzugte Sonden sind 10-100 Nukleotide lang. Sonden können Bereiche, die zu einer Ziel-Sequenz nicht komplementär sind, aufweisen oder nicht aufweisen, solange wie solche Sequenzen die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht wesentlich beeinflussen. Wenn solche Bereiche existieren, können die 5'-Promotorsequenz und/oder eine Bindungsstelle für die RNA Transkription, eine Restriktionsendonukleaseerkennungsstelle aufweisen, oder können Sequenzen enthalten, die eine gewünschte Sekundär- oder Tertiärstruktur verleihen, wie zum Beispiel eine katalytische aktive Stelle oder eine Haarnadelstruktur in der Sonde, auf der Ziel-Nukleinsäure oder beiden. Eine Sonde kann mit einem Reportergruppenrest, wie zum Beispiel einem Radioisotop, einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzrest, mit einem Enzym oder einem Liganden, der zum Detektieren oder Bestätigen, dass die Sonde mit der Ziel-Sequenz hybridisiert hat, verwendet wird, markiert werden.
Gemäß der Verwendung in dieser Offenbarung bedeutet die Phrase "eine Sonde (oder Oligonukleotid) mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die ausgewählt wird aus" einer Gruppe von spezifischen Sequenzen, dass die Sonde, als ein grundlegendes und neues Charakteristikum mit einer Nukleinsäure mit dem exakten Komplement einer der aufgelisteten Nukleinsäuresequenzen der Gruppe unter stringenten Hybrisierungsbedingungen hybrisieren kann. Ein exaktes Komplement schließt die entsprechende DNA- oder RNA-Sequenz ein.
Die Phrase "im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmen" bedeutet, dass die in Bezug genommene Nukleinsäure ausreichend ähnlich zur Nukleinsäuresequenz ist, so dass die in Bezug genommene Nukleinsäure insofern vergleichbare Hybrisierungseigenschaften mit einer Nukleinsäuresequenz aufweist, dass sie mit den gleichen Ziel-Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren würde. Der Fachmann wird verstehen, dass die im Wesentlichen übereinstimmenden Sonden und Primer der Erfindung von der in Bezug genommenen Sequenz abweichen können und immer noch mit der gleichen Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisieren können. Diese Abweichung von der Nukleinsäure kann in Begriffen wie Prozentsatz der identischen Basen innerhalb der Sequenz oder der Prozentsatz der vollständig komplementären Basen zwischen der Sonde oder dem Primer und seiner Ziel-Sequenz angegeben werden. Der Fachmann wird auch verstehen, dass diese Abweichung mit der Anzahl von Basen in einer Sonde oder Primer oder der Anzahl von fehlgepaarten Basen einer Sonde, die mit einer entsprechenden Base einer Ziel-Nukleinsäuresequenz nicht hybridisieren können, ausgedrückt werden kann. Sonden oder Primer der vorliegenden Erfindung stimmen im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz überein, wenn diese Prozentsätze von 100% bis 80% oder von 0 Basenfehlgepaarungen in einer 10 Nukleotide langen Ziel-Sequenz bis zu 2 fehlgepaarten Basen in einer 10 Nukleotide langen Ziel-Sequenz liegen.
In bevorzugten Ausführungsformen liegt der Prozentsatz von 100% bis 85%. In noch bevorzugteren Ausführungsformen liegt dieser Prozentsatz von 90% bis 100%; in anderen bevorzugten Ausführungsformen liegt dieser Prozentsatz von 95% bis 100%. Der Fachmann wird die verschiedenen Modifikationen der Hybridisierungsbedingungen verstehen, die bei verschiedenen Prozentsätzen der Komplementarität erforderlich sein können, um die Hybridisierung mit einer spezifischen Ziel-Sequenz zu ermöglichen ohne ein nicht akzeptables Niveau nicht-spezifischer Hybridisierungen zu verursachen.
Mit "Nukleinsäurehybrid" oder "Hybrid" ist eine Nukleinsäurestruktur gemeint, die einen doppelsträngigen Wasserstoffbindungsbereich, bevorzugt von zwischen 10 und 100 Nukleotiden in der Länge, am meisten bevorzugt von zwischen etwa 12 und 50 Nukleotiden in der Länge enthält, wobei jeder Strang komplementär zum anderen ist und wobei der Bereich unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ausreichend stabil ist, um durch Mittel, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzlichtdetektion, Autoradiographie oder Gelelektrophorese detektiert zu werden. Solche Hybride können RNA:RNA, RNA:DNA oder DNA:DNA Duplexmoleküle oder Duplexmoleküle, die Analoga dieser Nukleinsäuren enthalten, umfassen.
Mit "komplementär" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenzen vergleichbarer Bereiche von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren oder zwei verschiedenen Bereichen der gleichen einzelsträngigen Nukleinsäure eine Nukleotidbasenzusammensetzung aufweisen, die es ermöglicht, dass die Einzelstränge in einem stabilen doppelsträngigen Was serstoffbrückenbindungsbereich unter stringenten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren. Wenn ein aufeinanderfolgende Sequenz von Nukleotiden eines einzelsträngigen Bereichs eine Reihe von "kanonischen" Wasserstoffbrückenbindungsbasenpaaren mit einer analogen Sequenz von Nukleotiden des anderen einzelsträngigen Bereichs bilden kann, so dass A mit U oder T gepaart ist und C mit G gepaart ist, sind die Nukleotidsequenzen "perfekt" komplementär.
Mit "konservativ modifizierten Varianten" sind Nukleinsäuren oder Oligonukleotide gemeint, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die mit einem Nukleinsäurebereich einer anderen Nukleinsäure komplementär sind, wobei der Bereich umgekehrt wiederum perfekt komplementär zu einer Referenznukleinsäure ist. Solche konservativ modifizierten Varianten können mit einem Ziel-Nukleinsäurebereich, der eine Neisseria gonorrhoeae-Nukleotidsequenz aufweist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
Mit "Amplifikationsoligonukleotid" ist ein Oligonukleotid gemeint, das mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann und als Primer für die Nukleinsäuresynthese oder als Promotor-Matrize (z.B., zur Synthese eines komplementären Stranges, wodurch eine funktionale Promotorsequenz gebildet wird) oder beides dienen kann, für die Initiierung einer Nukleinsäuresynthese. Wenn das Amplifikationsoligonukleotid zum Initiieren der RNA-Synthese entworfen wird, kann das Oligonukleotid Nukleotidsequenzen enthalten, die nicht komplementär zur Ziel-Sequenz sind, die jedoch durch eine RNA-Polymerase (wie zum Beispiel T7, T3 und SP6 RNA-Polymerase) erkannt werden. Ein Amplifikationsoligonukleotid kann oder kann nicht einen 3'-Bereich aufweisen, der so modifiziert ist, um die Menge der Primerverlängerung zu verhindern oder zu verringern. Ein Amplifikationsoligonukleotid, wie es hierin definiert wird, wird bevorzugt zwischen 10 und 100 Nukleotiden lang sein; noch bevorzugter zwischen etwa 12 und 50 Nukleotiden lang. Während die Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung chemisch synthetisiert oder von einem Vektor stammen können, sind solche Oligonukleotide keine natürlich auftretenden Nukleinsäuren.
Mit "Nukleinsäureamplifikation" oder "Ziel-Amplifikation" ist das Steigern der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen gemeint, die wenigstens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen.
Mit "Antisense" oder "negativer Sinn" ist gemeint, dass eine Nukleinsäure vorhanden ist, die zu der einen Referenznukleinsäuresequenz komplementär ist.
Mit "Sinn", "gleicher Sinn" oder "positiver Sinn" ist gemeint, dass eine Nukleinsäuresequenz vorhanden ist, die zu der einen Referenznukleinsäuresequenz analog ist.
Mit "Helfer-Oligonukleotid" ist eine Nukleinsäuresonde gemeint, die entworfen worden ist, um mit der Ziel-Nukleinsäure an einer anderen Stelle als der einer markierten Sonde zu hybridisieren, wodurch entweder die Hybridisierungsrate der markierten Sonde erhöht wird, die Schmelztemperatur (T_m) des Zielmarkierte Sonde-Hybrids oder beides erhöht wird.
"Phylogenetisch nahe verwandt" bedeutet, dass die Organismen im evolutionären Sinne eng miteinander verwandt sind und daher eine höhere Gesamtnukleinsäuresequenzhomologie aufweisen als Organismen, die nicht so nah miteinander verwandt sind. Organismen, die benachbarte Positionen und die den benachbarten Positionen nachfolgenden auf dem phylogenetischen Baum besetzen, sind nahe miteinander Verwandte. Organismen, die Positionen weiter weg von den benachbarten oder nahe den benachbarten Positionen auf dem phylogenetischen Baum besetzen, werden immer noch als nahe verwandt angesehen, wenn sie eine signifikante Gesamtnukleinsäuresequenzhomologie aufweisen.
B. Hybridisierungsbedingungen und Sonden-/Primer-Design
Hybridisierungsreaktionsbedingungen, am wichtigsten die Temperatur der Hybridisierung und die Konzentration des Salzes in der Hybridisierungslösung können ausgewählt werden, damit die Amplifikationsoligonukleotide oder Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung bevorzugt mit Nukleinsäuren hybridisieren können, die eine Ziel-Neisseria gonorrhoeae-Nukleotidsequenz aufweisen und nicht an andere Nicht-Ziel-Nukleinsäuren, von denen man vermutet, dass sie in der Test-Probe vorhanden sind. Bei verringerten Salzkonzentrationen und/oder erhöhten Temperaturen (genannt erhöhte Stringenz) verringert sich das Ausmaß der Nukleinsäurehybridisierung, da die Wasserstoffbrückenbindung zwischen gepaarten Nukleotidbasen im doppelsträngigen Hybridmolekül zerstört wird; dieser Prozess wird "Aufschmelzen" genannt.
Allgemein gesagt, sind die stabilsten Hybride jene, welche die größte Anzahl von nebeneinander liegenden perfekt übereinstimmenden (d.h. über Wasserstoffbrücken gebundenen) Nukleotidbasenpaaren aufweisen. Daher würde man von solchen Hybriden im Allgemeinen erwarten, dass sie die letzten sind die aufschmelzen, wenn die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen sich erhöht. Jedoch kann ein doppelsträngiger Nukleinsäurebereich, der ein oder mehrere nicht gepaarte, "nicht kanonische" oder nicht perfekte Basenpaare enthält (was zu einer schwächeren oder nicht existierenden Basenpaarung in der Position in der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure führt) unter Bedingungen relativ hoher Stringenz immer noch ausreichend stabil sein, damit das Nukleinsäurehybrid in einem Hybridisierungsassay ohne Kreuzreaktion mit anderen nicht ausgewählten Nukleinsäuren, die in der Testprobe vorhanden sind, detektiert werden kann.
Demnach werden, abhängig vom Grad der Ähnlichkeit zwischen den Nukleotidsequenzen der Ziel-Nukleinsäure und denen von Nicht-Ziel-Nukleinsäuren, die zu phylogenetisch verschiedenen, jedoch nah verwandten Organismen gehören, auf der einen Seite und dem Grad der Komplementarität zwischen den Nukleotidsequenzen eines bestimmten Amplifikationsoligonukleotides oder Hybridisierungssonde und denen der Ziel- und Nicht-Ziel-Nukleinsäuren auf der anderen Seite, eine oder mehrere Fehlpaarungen nicht notwendigerweise die Fähigkeit des Oligonukleotids zerstören mit der Nukleinsäure zu hybridisieren und nicht mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren.
Die Hybridisierungsassaysonden der vorliegenden Erfindung wurden ausgewählt, selektiert und/oder entworfen, um den Unterschied zwischen den Schmelztemperaturen des Sonde:Ziel-Hybrids (T_m wird definiert als die Temperatur, bei der die Hälfte der potentiellen doppelsträngigen Moleküle in einer gegebenen Reaktionsmischung in einem einzelsträngigen denaturierten Zustand vorliegen) und der T_m eines fehlgepaarten Hybrids, das zwischen der Sonde der rRNA oder rDNA der phylogenetisch am nächsten verwandten Organismen, von denen man erwartet, dass sie in der Probe vorhandenen sind, die man jedoch nicht zu detektieren sucht, gebildet wird, zu maximieren. Während die unmarkierten Amplifikationoligonukleotide und Helfer-Oligonukleotide ein solch extrem hohen Grad der Spezifität wie die markierte Hybridisierungsassaysonde nicht aufweisen müssen, um in der vorliegenden Erfindung nützlich zu sein, werden sie auf vergleichbare Weise entworfen, um bevorzugt mit einer oder mehreren Ziel-Nukleinsäuren gegenüber anderen Nukleinsäuren zu hybridisieren.
Sonden, die für Neisseria meningitidis spezifisch sind, wurden unter Verwendung von Sequenzen entworfen, die in in Betracht gezogenen Zielbereichen mittels Primern, die mit den 16S rRNA's von Stämmen von Neisseria, die Neisseria gonorrhoeae (ATCC Nr. 19424), Neisseria meningitidis Serogruppe A (ATCC Nr. 13077, Serogruppe C (ATCC Nr. 23248) und Serogruppe L (ATCC Nr. 43828), klinischen Isolaten von Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica (ATCC Nr. 29193), Neisseria cinerea (ATCC Nr. 14685), Neisseria mucosa (ATCC Nr. 19696), Neisseria sicca (ATCC Nr. 29193) und Kingella kingae (ATCC Nr. 23330) einschließen, bestimmt wurden. Die Nukleinsäuresequenz von phylogenetisch nahen Nachbarn, einschließlich der publizierten Sequenz von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375, Rossau et al. Nuc. Acids Res. 16:6227 wurden ebenfalls als Vergleiche mit den Nukleinsäuresequenzen von Neisseria meningitidis verwendet, um die variablen Bereiche zu bestimmen.
Um die Identifikation von Nukleinsäuresequenzen, die als Sonden und Amplifikationsoligonukleotide verwendet werden sollen, zu erleichtern, wurden die Nukleotidsequenzen verschiedener Spezies von Organismen als erstes aneinander ausgerichtet, um die Homologie zu maximieren. Innerhalb des rRNA-Moleküls gibt es eine enge Beziehung zwischen der allgemeinen Struktur und der Funktion. Dies führt zu Beschränkungen und evolutionären Veränderungen in der Primärsequenz, so dass die Sekundärstruktur beibehalten wird.
Wenn zum Beispiel eine Base auf einer Seite einer Helix verändert wird, könnte eine kompensierende Veränderung auf der anderen Seite in der Evolution durchgeführt werden, um die Komplementarität zu erhalten (dies bezeichnet man als Kovarianz). Dies erlaubt es zwei sehr verschiedene Sequenzen unter Verwendung der primären konservierten Sequenz als auch der konservierten Sekundärstrukturelemente als Referenzpunkte auszurichten. Mögliche Ziel-Sequenzen für die Hybridisierungssonden wurden durch das Feststellen von Abwandlungen in der Homologie der ausgerichteten Sequenzen in bestimmten diskreten Bereichen (variable Bereiche) der rRNA- und rDNA-Sequenzen identifiziert.
Die Sequenzevolution in jedem variablen Bereich ist sehr divergent. Aufgrund der Divergenz tendieren entferntere phylogenetisch Verwandte von Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae dazu, eine größere Variabilität in einem gegebenen variablen Bereich zu zeigen, als phylogenetisch engere Verwandte. Die beobachtete ausreichende Variation zwischen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae-Arten wurde verwendet, um bevorzugte Ziel-Stellen zu identifizieren und verwendbare Sonden zu entwerfen.
Wir haben Sequenzen identifiziert, die zwischen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, zwischen diesen und anderen Neisseria-Spezies und zwischen Mitgliedern der Gattung Neisseria und anderen Organismen variieren, durch Vergleichen der Analysen der rRNA-Sequenzen, die in der Literatur veröffentlicht sind oder im Labor bestimmt worden sind. Computer und Computerprogramme, die man zum hierin offenbarten Zwecke verwendet oder anpasst, sind kommerziell erhältlich. Wir haben eine ausreichende Variation zwischen den Ziel-Organismen und den engsten phylogenetisch Verwandten gesehen, die mit großer Wahrscheinlichkeit in der gleichen Probe gefunden werden, um die vorliegenden Sonden zu entwerfen. Die Neisseria meningitidis Stämme sind in drei Sequenzgruppen im Sondenbereich, der durch die Serogruppen A, C und L repräsentiert wird, klassifiziert.
Das lediglich Identifizieren möglicherweise einzigartiger potentieller Ziel-Nukleotidsequenzen garantiert nicht, dass eine funktionale artspezifische Hybridisierungsassaysonde hergestellt werden kann, um mit Neisseria rRNA oder rDNA, die diese Sequenz umfasst, zu hybridisieren. Verschiedene andere Faktoren bestimmen die Eignung eines Nukleinsäurelokus als Zielstelle für artspezifische Sonden. Da das Ausmaß und die Spezifität der Hybridisierungsreaktionen, wie zum Beispiel jene, die hierin beschrieben werden, durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden, wird die Manipulation eines oder mehrerer dieser Faktoren die genaue Empfindlichkeit und Spezifität eines bestimmten Oligonukleotids bestimmen, egal ob es perfekt komplementär mit seinem Ziel ist oder nicht. Die Bedeutung und Wirkung verschiedener Assaybedingungen sind dem Fachmann gut bekannt, wie es von Hogan et al., PCT/US87/03009, und Hogan und Hammond, U.S. Patent Nr. 5,216,143 und Kohne, U.S. Patent Nr. 4,851,330, die von den gleichen Anmelder der vorliegenden Anmeldung stammen, beschrieben wird.
Die gewünschte Hybridisierungstemperatur und die Hybridisierungslösungszusammensetzung (wie zum Beispiel die Salzkonzentration, Detergenzien und andere Lösungen) können ebenfalls die Stabilität der doppelsträngigen Hybride wesentlich beeinflussen. Bedingungen, wie zum Beispiel die Innenstärke und die Temperatur, bei der man eine Sonde mit dem Ziel hybridisieren lässt, müssen beim Konstruieren einer Gruppen- oder artspezifischen Sonde berücksichtigt werden. Die thermische Stabilität von Hybridnukleinsäuren erhöht sich im Allgemeinen mit der Innenstärke der Reaktionsmischung. Auf der anderen Seite können chemische Reagenzien, die die Wasserstoffbrückenbindungen zerstören, wie zum Beispiel Formamid, Harnstoff, Dimethylsulfoxid und Alkohole, die thermische Stabilität der Hybride stark verringern.
Um die Spezifität einer Sonde für ihr Ziel zu maximieren, wurden die vorliegenden Sonden der vorliegenden Erfindung entworfen, um mit ihren Zielen unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren. Unter solchen Bedingungen werden nur einzelne Nukleinsäurestränge, die einen hohen Komplementaritätsgrad aufweisen, miteinander hybridisieren; einzelne Nukleinsäurestränge ohne einen solchen hohen Grad an Komplementarität werden keine Hybride bilden. Dementsprechend bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen die Menge der Komplementarität, die zwischen den zwei Nukleinsäuresträngen existieren sollte, um ein Hybrid zu bilden. Die Stringenz wird so ausgewählt, um die Differenz in der Stabilität zwischen dem Hybrid, dass zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäure und den potentiellen Hybriden zwischen der Sonde und allen vorhandenen Nicht-Ziel-Nukleinsäuren gebildet werden, zu maximieren.
Die geeignete Spezifität kann durch Minimieren der Länge der Sonde, die eine perfekte Komplementarität zu Sequenzen von Nicht-Ziel-Organismen aufweist, durch Vermeiden von G und C reichen homologen Bereichen zu Nicht-Ziel-Sequenzen, und mittels Konstruieren der Sonde in der Art, das sie so viele destabilisierende Fehlpaarung zu Nicht-Ziel-Sequenzen wie möglich enthält, erreicht werden. Ob eine Sondensequenz für das Detektieren nur eines spezifischen Typs von Organismen verwendbar ist, hängt größtenteils von den thermischen Stabilitätsunterschieden zwischen den Sonde:Ziel-Hybriden gegenüber den möglichen Sonde:Nicht-Ziel-Hybriden ab. Beim entwerfen von Sonden sollte der Unterschied in den T_m-Werten zwischen diesen Hybriden so groß wie möglich gemacht werden (bevorzugt etwa 5°C oder mehr). Die Manipulation der T_m kann durch Verändern der Sondenlänge und durch die Sondenzusammensetzung (GC Gehalt vs. AT Gehalt) erzielt werden.
Im Allgemeinen liegt die optimale Hybridisierungstemperatur für Oligonukleotidsonden von etwa 10-50 Nukleotiden Länge bei etwa 5°C unter der Schmelztemperatur einer gegebenen Duplex. Die Inkubation bei Temerpaturen unterhalb der optimalen Temperatur kann fehlgepaarten Rasensequenzen das Hybridisieren ermöglichen und kann daher die Spezifität verringern. Je Länger die Sonde desto mehr Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Rasenpaaren und im Allgemeinen desto höher die T_m. Das Erhöhen des Prozentsatzes von G und C erhöht auch die T_m, da G-C Rasenpaare eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung ausbilden und daher eine größere thermische Stabilität aufweisen als die A-T Rasenpaare.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der T_m misst die Hybridisierung mittels eines Hybridisierungsschutzassays (HPA) gemäß Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174, die eine exklusive Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt. T_m kann mittels HPA auf folgende Weise gemessen werden. Ein Sonde-Ziel-Hybrid wird in Lithiumsuccinat gepufferter Lösung (0,1 M Lithiumsuccinatpuffer, pH 5,0, 2 mM Ethylendiamintetra-essigsäure (EDTA), 2 mM Ethylenglykolbis(β-amino-ethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), 10% (w/v) Lithiumlaurylsulfat) unter Verwendung eines Überschusses des Ziels gebildet. Aliquots des Hybrids werden dann in der Lithiumsuccinat gepufferten Lösung verdünnt und für fünf Minuten bei verschiedenen Temperaturen, die unterhalb der vermutlichen T_m anfängt, zum Beispiel 55°C und in 2–5°C Schritten erhöht, inkubiert. Diese Lösung wird dann mit einem milden alkalischen Boratpuffer (0,15 M Natriumtetraborat, pH 7,6, 5% (v/v) TRITON^® X-100) verdünnt und bei einer niedrigeren Temperatur (zum Beispiel 50°C) für zehn Minuten inkubiert.
Unter diesen Bedingungen wird der Acridiniumester, der mit einer einzelsträngigen Sonde verbunden ist, hydrolysiert, während der Acridiniumester, der mit der hybridisierten Sonde verbunden ist, vor der Hydrolyse relativ geschützt ist. Daher ist die Menge des verbleibenden Acridiniumesters proportional zur Menge des Hybrids und kann durch die Chemilumineszenz, die vom Acridiniumester nach der Zugabe des Wasserstoffperoxids gefolgt von Alkali erzeugt wird, gemessen werden. Die Chemilumineszenz kann in einem Luminometer (z.B. Gen-Probe LEADER^® I oder LEADER^® 50) gemessen werden. Sich daraus ergebenden Daten werden als Prozentsatz des Maximalsignals (für gewöhnlich von der niedrigsten Temperatur) gegen die Temperatur aufgetragen. Die T_m wird als die Temperatur definiert, bei der 50% des maximalen Signals verbleiben. Zusätzlich zum obigen Verfahren kann die T_m durch isotopen Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind (z.B. Hogan et al., siehe oben) bestimmt werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass die T_m für ein gegebenes Hybrid abhängig von der verwendeten Hybridisierungslösung variiert. Faktoren, wie zum Beispiel die Salzkonzentration, Detergenzien und andere Lösungen, können die Hybridstabilität während der thermischen Denaturierung beeinflussen (J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, 2. Molecular Cloning, Kapitel 11 (2. Ausgabe 1989)). Bedingungen, wie zum Beispiel die Innenstärke und die Inkubationstemperatur bei der eine Sonde zum Hybridisieren mit einem Ziel verwendet wird, sollten bei der Konstruktion der Sonde berücksichtigt werden. Auf der anderen Seite können chemische Reagenzien, die die Wasserstoffbrückenbindungen zerstören, wie zum Beispiel Formamid, Harnstoff, Dimethylsulfoxid und Alkohole, die thermische Stabilität der Hybride stark verringern. Um sicherzustellen, dass die Sonde für ihr Ziel spezifisch ist, ist es wünschenswert nur Sonden zu haben, die nur unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren. Unter Bedingungen hoher Stringenz werden sich nur hoch komplementäre Nukleinsäurehybride bilden; Hybride ohne einen ausreichenden Komplementaritätsgrad werden sich nicht bilden. Demgemäß bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen die Menge der Komplementarität, die zwischen zwei Nukleinsäuresträngen erforderlich ist, um ein Hybrid zu bilden. Die Stringenz wird so ausgewählt, um den Unterschied in der Stabilität zwischen dem Hybrid, das sich mit dem Ziel bildet, und anderen Nukleinsäuresequenzen zu maximieren.
Die Länge der Ziel-Nukleinsäuresequenz und demgemäß die Länge der Sondensequenz kann ebenfalls wichtig sein. In einigen Fällen kann es mehrere Sequenzen eines bestimmten Bereiches geben, zum Beispiel ein variabler Bereich, der in der Lokation und Länge variiert und der Sonden mit den gewünschten Hybridisierungscharakteristika ergibt. In anderen Fällen kann eine Sonde signifikant besser sein als eine andere Sonde mit einer Nukleotidsequenz, die sich in einer Base unterscheidet. Während es möglich ist, dass Nukleinsäuren hybridisieren, die nicht perfekt komplementär sind, wird der längste Abschnitt der perfekt homologen Rasensequenz im Allgemeinen die Hybridstabilität bestimmen, wobei die Zusammensetzung der Rasenpaarungen auch eine Rolle spielt.
Bereiche von rRNA, die starke interne Strukturen bilden, die für die Hybridisierung inhibitorisch sind, sind weniger bevorzugte Ziel-Bereiche, wenigstens in Assays in denen Helfersonden nicht verwendet werden. Desgleichen sollten Sondenentwürfe, die zu einer extensiven Selbstkomplementarität führen, vermieden werden. Wenn einer der zwei Stränge ganz oder teilweise in einem intramolekularen oder intermolekularen Hybrid involviert ist, wird er weniger dazu in der Lage sein an der Bildung eines neuen intermolekularen Sonde:Ziel-Hybrids teilzunehmen. Ribosomale RNA-Moleküle sind dafür bekannt, dass sie sehr stabile intramolekulare Helizes und Sekundärstrukturen durch Was serstoffbrückenbindung ausbilden. Mit dem Entwerfen eines Hybrisierungsassays mit dem ein wesentlicher Abschnitt der Ziel-Sequenz in einem einzelsträngigen Zustand verbleibt, bis die Hybridisierung mit der Sonde stattfindet, kann die Rate und das Ausmaß der Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Ziel stark erhöht werden. Ein Weg auf dem dies erreicht werden kann, ist durch das Auswählen einer Sequenz als Ziel-Nukleotidsequenz, die relativ wenig an der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung beteiligt ist. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Hybridisierungsassaysonde in einer Probenmischung mit Helfer-Oligonukleotiden verwendet werden, die die Zielstelle für die Hybridisierung mit der Hybridisierungsassaysonde zugänglicher machen.
Ein DNA-Ziel tritt natürlicherweise in einer doppelsträngigen Form auf, so wie das Produkt der Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese doppelsträngigen Ziele sind natürlicherweise für die Hybridisierung inhibitorisch mit einer Sonde und erfordern die Denaturierung vor der Hybridisierung. Geeignete Denaturierungs- und Hybridisierungsbedingungen sind im Stand der Technik bekannt (z.B., E. M. Southern, J. Mol. Bio. 98:503 (1975)).
Etliche Formeln sind verfügbar, die eine Abschätzung der Schmelztemperatur für perfekt übereinstimmende Oligonukleotide mit ihren Ziel-Nukleinsäuren bereitstellen. Eine solche Formel Tm = 81,5 + 16,6 (log10[NA+]) + 0,41 (Fraktion G + C) – (600/N) (wobei N = die Länge der Oligonukleotide als Anzahl der Nukleotide) stellt eine gute Schätzung für die T_m von Oligonukleotiden zwischen 14 und 60 oder 70 Nukleotiden Länge bereit. Von solchen Berechnungen können nachfolgende impirische Verifizierungen oder "Feinabstimmungen" der T_m unter Verwendung von Screening-Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, durchgeführt werden. Für weitere Informationen zur Hybridisierung und zu Oligonukleotidsonden siehe, z.B., Sambrook et al., 2 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) (in Kapitel 11). Diese Referenz und andere im Stand der Technik gut bekannten, stellen auch Abschätzungen bezüglich der Wirkung von Fehlpaarungen auf die T_m eines Hybrids dar. Daher können von der bekannten Nukleotidsequenz eines gegebenen Bereiches der ribosomalen RNA (oder rDNA) von zwei oder mehreren Organismen Oligonukleotide entworfen werden, die diese Organismen voneinander unterscheiden.
C. Nukleinsäureamplifikation
Bevorzugt sind die Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung Oligodesoxynukleotide und sind ausreichend lang, um als Substrat für die Synthese von Verlängerungsprodukten durch eine Nukleinsäurepolymerase verwendet zu werden. Die optimale Primerlänge sollte verschiedene Faktoren berücksichtigen, die die Temperatur der Reaktion, die Struktur und Basenzusammensetzung des Primers und wie der Primer verwendet werden soll, berücksichtigen. Für die optimale Spezifität sollte zum Beispiel der Oligonukleotidprimer abhängig von der Komplexität der Ziel-Nukleinsäuresequenz im Allgemeinen wenigstens etwa 12 Nukleotide enthalten. Wenn eine solche Spezifität nicht essentiell ist, können kürzere Primer verwendet werden; in einem solchen Fall kann es wünschenswert sein die Reaktion bei einer niedrigeren Temperatur auszuführen, um stabile Hybridkomplexe mit der Matrizen-Nukleinsäure zu bilden.
Nützliche Richtlinien zum Entfernen von Amplifikationsoligonukleotiden und Sonden mit gewünschten Charakteristika sind hierin beschrieben. Unsere Ziel-Bereiche gemäß der besten Ausführungsform enthalten wenigsten zwei und bevorzugt drei konservierte Bereiche der Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure. Diese Bereiche sind etwa 15–350 lang, bevorzugt 15–150 Nukleotide lang.
Der Amplifikationsgrad, der mit einem Satz von Primern oder Promotor-Primern beobachtet wird, hängt von zahlreichen Faktoren ab, die die Fähigkeit der Oligonukleotide mit ihren komplementären Sequenzen zu hybridisieren und ihre Fähigkeit enzymatisch verlängert und kopiert zu werden, einschließt. Während Nukleotide unterschiedlicher Längen und Basenzusammensetzungen verwendet werden können, weisen Oligonukleotide, die in dieser Erfindung verwendet werden, Ziel-Bindungsbereiche von 18–40 Basen mit einer vorhergesagten T_m zum Ziel von etwa 65°C auf.
Parameter, die die Hybridisierung einer Sonde beeinflussen, wie zum Beispiel die T_m, Komplementarität und Sekundärstruktur der Ziel-Sequenz beeinflussen auch die Primerhybridisierung und daher auch die Durchführungsqualität. Der Grad der nicht-spezifischen Verlängerung (kopieren des Primer-Dimers oder des Nicht-Ziels) kann auch die Amplifikationseffizienz beeinflussen, daher werden Primer so ausgewählt, dass sie eine niedrige Selbst- oder Kreuzkomplementarität, insbesondere an den 3'-Enden der Sequenzen aufweisen. Lange homopolymere Abschnitte und ein hoher GC-Gehalt werden vermieden, um eine fehlerhafte Primerverlängerung zu vermeiden. Computerprogramme sind verfügbar, um bei diesem Aspekt des Designs zu helfen.
Eine Nukleinsäurepolymerase, die in Verbindung mit den Amplifikationsoligonukleotiden der vorliegenden Erfindung verwendet wird, betrifft eine Chemikalie, ein physikalisches oder biologisches Agens, das entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide oder beides in ein Nukleinsäurepolymer oder -Strang in Matrizen abhängigen Weise einführt. Beispiele von Nukleinsäurepolymerasen schließen auf DANN gerichtete DNA Polymerasen, auf RNA gerichtete DNA-Polymerasen und auf RNA gerichtete RNA-Polymerasen ein. DNA-Polymerasen haben eine Nukleinsäuresynthese in Matrizen abhängiger Weise und in 5' bis 3'-Richtung zur Folge. Aufgrund der antiparallelen Orientierung der zwei Stränge in einer doppelsträngigen Nukleinsäure geht diese Richtung vom 3'-Bereich der Matrize zum 5'-Bereich der Matrize. Beispiele von auf DNA gerichtete DNA-Polymerasen schließen die E. coli DNA-Polymerase I, die thermostabile Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) und das große Fragment der DNA-Polymerase I von Bacillus stearothermophilus (Bst) ein. Beispiele für auf RNA gerichtete DNA-Polymerasen schließen verschiedene retrovirale reverse Transkriptasen, wie zum Beispiel die Moloney murine leukemia virus (MMLV) reverse Transkriptase oder die Avian Myeoloblastosis Virus (AMV) reserve Transkriptase ein.
Während der meisten Nuleinsäureamplifikationsreaktionen fügt eine Nukleinsäurepolymerase Nukleotidreste an das 3'-Ende des Primers an, wobei die Ziel-Nukleinsäure als Matrize verwendet wird, wobei ein zweiter Nukleinsäurestrang mit einer Nukleotidsequenz synthetisiert wird, der teilweise oder vollständig komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäure ist. In vielen Nukleinsäureamplifikationsreaktionen müssen die beiden Stränge, die die sich dabei ergebende Doppelstrangstruktur umfassen, durch chemische oder physikalische Mittel voneinander getrennt werden, damit die Amplifikationsreaktion voranschreiten kann. Alternativ dazu kann der neu synthetisierte Matrizenstrang für die Hybridisierung mit einem zweiten Primer oder Promotor-Primer durch andere Mittel verfügbar gemacht werden – z.B. durch Strangverdrängung oder die Verwendung eines nukleolytischen Enzyms, die/das einen Teil oder den gesamten ursprünglichen Ziel-Strang verdaut. Auf diese Weise kann der Prozess durch eine Anzahl von Zyklen wiederholt werden, was zu einer erhöhten Zunahme der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen mit der Ziel-Nukleotidsequenz führt.
Entweder das erste, oder das zweite Amplifikationsoligonukleotid oder beide können ein Promotor-Primer sein. Solch ein Promotor-Primer enthält für gewöhnlich Nukleotidsequenzen, die nicht komplementär zu denen des Ziel-Nukleinsäuremoleküls oder des/der Primer-Verlängerungsprodukte(s) ist/sind. Zum Beispiel beschreiben Kacian und Fultz, U.S. Patent Nr. 5,399,491 verschiedene dieser Oligonukleotide. Diese nicht komplementären Sequenzen können 5' zu den komplementären Sequenzen auf dem Amplifikationsoligonukleotid angeordnet sein und können einen Lokus für die Initiation der RNA-Synthese bereitstellen, wenn sie durch die Wirkung einer Nukleinsäurepolymerase doppelsträngig gemacht werden. Der Promotor, der dadurch bereitgestellt wird, kann die in vitro Transkription von mehreren RNA-Kopien der Ziel-Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Es wird geschätzt, dass, wenn in dieser Beschreibung ein Bezug zu einem Primer hergestellt wird, dieser Bezug den Primeraspekt eines Promotor-Primers ebenfalls einschließt, solange der Kontext des Bezugs nicht eindeutig etwas anderes andeutet.
In einigen Amplifikationssystemen, zum Beispiel das Amplifikationsverfahren von Dattagupta et al., siehe oben, können die Amplifikationsoligonukleotide 5' nicht komplementäre Nukleotide enthalten, die bei der Strangverdrängung helfen. Wenn darüber hinaus die Amplifikationsoligonukleotide in Verbindung mit einer Nukleinsäurepolymerase mit 5' Exonukleaseaktivität verwendet werden, können diese Modifikationen an ihrem 5'-Ende aufweisen, um die enzymatische Verdauung zu verhindern.
Alternativ dazu kann die Nukleinsäurepolymerase durch Entfernen der 5' Exonukleaseaktivität, wie zum Beispiel durch Behandeln mit einer Protease, die ein aktives Polymerasefragment mit keiner solchen Nukleaseaktivität erzeugt, modifiziert werden. In einem solchen Fall müssen die Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende modifiziert werden.
1. Herstellung von Oligonukleotiden
Alle Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung können einfach durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt werden die Primer mittels Festphasenverfahren hergestellt. Zum Beispiel beschreibt Caruthers et al. die Verwendung der Standardphosphoramiditfestphasenchemie, um Nukleotide mittels Phosphordiesterverknüpfungen zu verbinden. Eine automatische Festphasenchemiesynthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramiditvorläufern ist von Barone, et al., Nucleic Acids Research, 12:405 (1984) beschrieben worden. (Methods in Enyzmology, Band 143, S. 287 (1987)). Desgleichen beschreibt Bhatt ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden, das Phosphorthioatverknüpfungen enthält. (WO 92/04358 mit dem Titel "Method and Reagent for Sulphurization of Organophosphorous Compounds", die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt). Auch Klem et al., mit dem Titel "Improved Process for the Synthesis of Oligomers", PCT WO 92/07864 beschreibt die Synthese von Oligonukleotiden mit verschiedenen Verknüpfungen, die Methylphosphonatverknüpfungen einschließen. Zusätzlich sind Verfahren zur organischen Synthese von Oligonukleotiden dem Fachmann bekannt und werden von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben.
Nach der Synthese und Reinigung eines bestimmten Oligonukleotids können zahlreiche verschiedene Verfahren zum Reinigen und zur Kontrolle der Qualität des Oligonukleotids verwendet werden. Geeignete Verfahren schließen die Polyacrylamidgelelektrophorese oder di Hochdruckflüssigkeitschromatographie ein. Diese beiden Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt.
Alle Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung egal ob Hybridisierungsassaysonden, Amplifikationsoligonukleotide oder Helfer-Oligonukleotide können mit chemischen Gruppen modifiziert werden, um die Qualität zu erhöhen oder um die Charakterisierung der Amplifikationsprodukte zu erleichtern. Zum Beispiel können am Rückgrat modifizierte Oligonukleotide, wie zum Beispiel jene mit Phosphorthioat- oder Methylphosphonat-Gruppen, die die Oligonukleotide resistent gegenüber der nukleolytischen Aktivität bestimmter Polymerasen oder gegenüber Nukleaseenzymen machen, die Verwendung solcher Enzyme in einer Amplifikation oder einer anderen Reaktion ermöglichen. Ein anderes Beispiel der Modifikation schließt die Verwendung von Nicht-Nukleotidlinkern (z.B. Arnold et al., "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" EP 0 313 219 ) ein, die zwischen Nukleotiden in der Nukleinsäurekette eingebaut werden, die nicht mit der Hybridisierung oder der Verlängerung des Primers interferieren. Amplifikationsoligonukleotide können auch Mischungen der gewünschten und natürlichen Nukleotide enthalten.
Das 3'-Ende eines Amplifikationsoligonukleotides kann blockiert werden, um die Initiation einer DNA-Synthese zu verhindern, wie es von McDonough et al., mit dem Titel "Nucleic Acid Sequence Amplification" in der WO 94/03472, die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießt, beschrieben wurde. Eine Mischung verschiedener 3' blockierter Amplifikationsoligonukleotide oder 3' blockierter und unblockierter Oligonukleotide kann die Effizienz der Nukleinsäureamplifikation, wie hierin beschrieben, erhöhen.
Wie weiter oben offenbart, kann das 5'-Ende der Oligonukleotide so modifiziert werden, das sie gegenüber der 5'-Exonukleaseaktivität, die einige Nukleinsäurepolymerasen aufweisen, widerstandfähig werden. Solche Modifikationen können durch Hinzufügen einer Nicht-Nukleotidgruppe an das terminale 5'-Nukleotid des Primers unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel solchen, die von Arnold et al., siehe oben, mit dem Titel "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" beschrieben worden sind, durchgeführt werden.
Sobald sie einmal synthetisiert worden sind, können die ausgewählten Oligonukleotidsonden durch eines der verschiedenen bekannten Verfahren markiert werden (z.B., J. Sambrook, siehe oben). Nützliche Marker schließen Radioisotope als auch nicht-radioaktive Reportergruppen ein. Isotope Marker schließen ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I, ⁵⁷Co und ¹⁴C ein. Isotope Marker können durch im Stand der Technik bekannte Techniken, wie zum Beispiel Bruchtranslation, Endmarkierung, Zweitstrangsynthese, die Verwendung der reversen Transkription und durch chemische Verfahren eingebracht werden. Wenn radioaktiv markierte Sonden verwendet werden, kann die Hybridisation durch Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gammazählung detektiert werden. Das ausgewählte Detektionsverfahren wird von dem für die Markierung verwendeten einzelnen Radioisotop abhängen.
Nicht-isotope Materialien können ebenfalls zum Markieren verwendet werden und können intern in die Nukleinsäuresequenz oder am Ende der Nukleinsäuresequenz eingebracht werden. Modifizierte Nukleotide können enzymatisch oder chemisch eingebracht werden. Chemische Modifikationen der Sonde können während oder nach der Synthese der Sonde durchgeführt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Nicht-Nukleotidlinker-Gruppen, wie von Arnold et al., siehe oben "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" beschrieben. Nicht-isotope Marker schließen fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, Kofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden ein.
Bevorzugt werden die Sonden mit einem Acridiniumester markiert. Acridiniumestermarkierung kann wie von Arnold et al., im U.S. Patent Nr. 5,185,439, mit dem Titel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", das am 9. Februar 1993 erteilt wurde, beschrieben, durchgeführt werden.
2. Amplifikation von Neisseria rRNA und rDNA
Die Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind auf bestimmte Neisseria gonorrhoeae 16S rRNA Nukleotidsequenzen oder ihre rDNA Gegenstücke gerichtet. Diese Amplifikationsoligonukleotide können innerhalb von wenigstens einer der Ziel-Nukleotidsequenzen, die als Hybridisierungsassaysonde verwendet werden, um die Gegenwart von Neisseria gonorrhoeae in einem Nukleinsäureamplifikationsassay zu detektieren, flankieren, überlappen oder enthalten sein. Die beschriebenen und hierin beanspruchten Amplifikationsoligonukleotide umfassen zwei Sätze von Amplifikationsoligonukleotiden. Mitglieder der Sätze von Amplifikationsoligonukleotiden der vorliegenden Erfindung können mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die aus der Sequenz der SEQ ID NOs: 19, 20, 49 oder 51 besteht, wohingegen andere Oligonukleotide, die hierin beschrieben werden, mit einer Nukleinsäure hybridisieren können, die mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen im Wesentlichen übereinstimmt oder dieser entspricht:
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen diese Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung die Sequenz der SEQ ID NOs: 7, 9, 43 oder 45, wohingegen andere hierin beschriebene Oligonukleotide die folgenden Sequenzen haben oder im Wesentlichen mit diesen übereinstimmen:
Diese Oligonukleotide können auch zusätzliche nicht-komplementäre Basen an ihrem 5'-Ende umfassen, die eine Promotorsequenz aufweisen, die eine RNA-Polymerase binden und die RNA-Transkription mittels der Ziel-Nukleinsäure als Matrize steuern können. Zum Beispiel kann der Promotor der SEQ ID NO: 53 AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGA verwendet werden.
Alle Amplifikationsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung können Sequenzen aufweisen, die keine Modifikationen oder Hinzufügungen in den Sequenzen enthalten. Die Amplifikationsoligonukleotide können auch oder alternativ dazu Modifikationen aufweisen, wie zum Beispiel blockierte 3'- und/oder 5'-Enden oder -Hinzufügungen, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf die Hinzufügung einer spezifischen Nukleotidsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird (z.B. die Promotorsequenz der T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase), die Hinzufügung von Sequenzen, die die Initiation oder Verlängerung der RNA-Transkription durch eine RNA-Polymerase erhöhen oder Sequenzen, die eine intramolekulare Basenpaarung bereitstellen und die Bildung von sekundären oder tertiären Nukleinsäurestrukturen befördern.
Amplifikationsoligonukleotide werden in einem Nukleisäureamplifikationsverfahren, wie zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion, oder einer Amplifikationsreaktion mittels RNA-Polymerase, DNA-Polymerase und RNAse H oder seinem Äquivalent verwendet, wie es von Kacian und Fultz, siehe oben, Dattagupta et al., siehe oben, und von Sninsky et al., U.S. Patent Nr. 5,079,351, wobei die ersten zwei davon gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Erfindung genießen, beschrieben worden ist.
Eine große Auswahl von Verfahren ist für das Detektieren einer amplifizierten Ziel-Sequenz verfügbar. Zum Beispiel können die Substrate oder die Primer einen detektierbaren Marker einschließen, der in die neu synthetisierte DNA eingebracht wurde. Das sich daraus ergebende markierte Amplifikationsprodukt wird dann von den nicht verwendeten Nukleotiden oder Primern abgetrennt und der Marker wird in der abgetrennten Produktfraktion detektiert.
Substanzen, die als verwendbare detektierbare Marker dienen können, sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, Chromophore als auch Liganden, wie zum Beispiel Biotin und Haptene ein, die, obwohl sie nicht direkt detektierbar sind, einfach durch eine Reaktion mit einer markierten Form ihres spezifischen Bindungspartners, z.B. Avidin bzw. Antikörpern, detektiert werden.
Ein anderer Ansatz ist der, das Amplifikationsprodukt durch Hybridisieren mit einer detektierbar markierten Nukleinsäuresonde und Messen der sich ergebenden Hybride auf irgendeine konventionelle Art und Weise zu detektieren. Insbesondere kann das Produkt durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresonde, die chemilumineszierend mit einem Acridiniumester markiert ist, mit der Ziel-Sequenz, selektivem Hydrolysieren des Acridiniumesters, der an der unhybridisierten Sonde vorhanden ist und Messen der Chemilumineszenz, die vom verbleibenden Acridiniumester in einem Luminometer erzeugt wird, untersucht werden (siehe, z.B.
Arnold et al., siehe oben, U.S. Patent Nr. 5,283,174 und Nelson et al., "Non-Isotopic DNA Probe Technologies", Academic Press, San Diego (Kricka, Ausgabe 1992).
D. Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden für Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae rRNA und rDNA
Die Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden, die hierin offenbart werden, können mit Ziel-Nukleinsäuren von Neisseria meningitidis rRNA- oder rDNA-Nukleotidsequenzen gegenüber Nukleinsäuren von phylogenetisch nah verwandten bakteriellen Arten hybridisieren. Diese Hybridisierungsassaysonden wurden basierend auf einem Vergleich der Nukleotidsequenzen und übereinstimmender Bereiche der ribosomalen RNA von Neisseria meningitidis und der phylogenetisch nah verwandten Art entworfen, selektiert und/oder ausgewählt. In bevorzugten Ausführunsformen hybridisieren diese Sonden selektiv mit den Nukleinsäuren von Neisseria meningitidis gegenüber den Nukleinsäuren von Neisseria gonorrhoeae.
Offenbart sind Oligonukleotidhybridisierungssonden, die mit den Nukleinsäuren von Neisseria meningitidis und nicht mit den Nukleinsäuren von Neisseria gonorrhoeae selektiv hybridisieren und schließen Neisseria meningitidis Nukleinsäuresequenzen ein, die den folgenden Nukleinsäuresequenzen entsprechen oder im Wesentlichen übereinstimmen:
Etliche Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden der vorliegenden Erfindung hybridisieren bevorzugt mit Ziel-Nukleinsäuren, die Neisseria gonorrhoeae rRNA oder rDNA Nukleotidsequenzen enthalten gegenüber Nukleinsäuren anderer phylogenetisch nah verwandter bakterieller Arten. In bevorzugten Ausführungsformen können diese Hybridisierungsassaysonden Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren von Neisseria meningitidis unterscheiden.
Die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung, die mit von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäuren selektiv hybridisieren und nicht mit den Nukleinsäuren von Neisseria meningitidis, die in den Ansprüchen 17–27 beschrieben werden, wohingegen andere Hybridisierungssonden, die hierin beschrieben werden, den folgenden Nukleotidsequenzen entsprechen oder im Wesentlichen übereinstimmen:
Die Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt mit einem Reportergruppenrest, wie zum Beispiel einem Radioisotop, einem fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Rest, mit einem Enzym oder anderen Liganden markiert, der für die Detektion oder Bestätigung, dass die Sonde mit der Ziel-Sequenz hybridisiert hat, verwendet werden kann. Die Anmelder bevorzugt am meisten die Verwendung von chemilumineszierenden Acridiniumestern als Marker. Siehe z.B. Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,185,439. Die Assaysonde wird mit einer Probe gemischt, von der man vermutet, dass sie eine Nukleinsäure mit der Ziel-Sequenz enthält, unter Hybridisierungsbedingungen, die das Anbinden der zwei Stränge durch Wasserstoffbrückenbindung im Bereich der Komplementarität ermöglichen.
Die Sonde kann auch mit einem oder mehreren unmarkierten Helfer-Oligonukleotiden kombiniert werden, um das Anbinden an die Nukleinsäure mit der Ziel-Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae Nukleotidsequenz zu erleichtern. Die Sonde hybrisiert dann mit der Ziel-Nukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist; die sich daraus ergebende Hybridduplex kann durch verschiedene Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel die Hydroxylapatitadsorption und die radioaktive Kontrolle, abgetrennt und detektiert werden. Von diesen Techniken ebenfalls umfasst sind jene, die das selektive Abbauen des auf der unhybridisierten Sonde vorhandenen Markers und das anschließende Messen der Menge des Markers, der mit der verbleibenden hybridisierten Sonde verbunden ist, einschließen, wie es von Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174, das gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt, offenbart wird. Die zuletzt genannte Technik wird derzeit von den Anmeldern bevorzugt.
E. Helferoligonukleotide, die bei der Detektion von Neisseria verwendet werden
Spezifische Helfer-Oligonukleotide wurden verwendet, um das Hybridisieren der Hybridisierungsassaysonden mit der Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern. Helfer-Oligonukleotide werden von Hogan und Milliman, U.S. Patent Nr. 5,030,557 mit dem Titel "Means and Method for Enhancing Nucleic Acid Hybridization", die gemeinsame Eigentümerschaft mit der vorliegenden Anmeldung genießt, beschrieben.
Helfersonden werden ausgewählt, damit sie mit den Nukleinsäuresequenzen, die nahe dem Bereich liegen, der von der Hybridisierungsassaysonde angesteuert wird, hybrisieren. Die Hybridisierung der Helfersonde verändert die Sekundär- und Tertiärstruktur der Ziel-Nukleinsäure, was die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-Nukleinsäure erleichtert.
Spezifische Helfer-Oligonukleotide zum Erleichtern der spezifischen Detektion von Neisseria meningitidis Nukleinsäuren weisen auf oder stimmen im Wesentlichen mit einer dieser Nukleotidsequenzen überein:
Hybridisierungssonden, die auf Neisseria meningitidis Nukleinsäuren gerichtet sind, stimmen im Wesentlichen mit den
SEQ ID NOs: 11, 12, 25 oder 26
überein, die in einer Probenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet werden, das die Nukleotidsequenz aufweist oder im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 13, 14, 35 und 36.
Eine andere Hybridisierungsassaysonde, die auf Neisseria meningitidis Nukleinsäuren gerichtet ist, die im Wesentlichen mit den
SEQ ID NOs: 15, 16, 27 oder 28
übereinstimmen, wird in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, das eine Nukleotidsequenz aufweist oder im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 und 38.
Eine andere Hybridisierungssonde, die auf Neisseria gonorrhoeae ribosomale Nukleinsäure gerichtet ist, die im Wesentlichen mit den
SEQ ID NOs: 1 oder 31
übereinstimmt, wird in einer Mischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, das eine Nukleotidsequenz aufweist oder im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 2 oder 39.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungssonde, die auf Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren gerichtet ist, die im Wesentlichen mit den
SEQ ID NOs: 3 oder 32
übereinstimmt, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, das eine Nukleotidsequenz aufweist oder im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 4 oder 40.
Helfer-Oligonukleotide können im Allgemeinen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, sind jedoch nicht notwendigerweise artspezifisch.
F. Nukleinsäurezusammensetzungen
In einem anderen zugehörigen Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, wie sie in den Ansprüchen 32 und 33 beschrieben werden. Diese Zusammensetzungen umfassen ein Nukleinsäurehybrid zwischen einer Hybridisierungsassaysonde und einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentliche komplementär dazu ist (Sonde:Ziel). Eine Verwendung des Hybrids, das zwischen der Sonde und dem Ziel gebildet wird, ist das detektieren des Vorhandenseins einer Ziel-Sequenz. Zum Beispiel ist ein Acridiniumester ("AE"), der in Hybriden vorhanden ist, resistent gegenüber einer Hydrolyse in alkalischen Lösungen, wohingegen AE, der in einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorliegt, in einer alkalischen Lösung hydrolysiert wird (Arnold et al., mit dem Titel "Homogenous Protection Assay", EPO Veröffentlichungsnummer 88308767.8, Veröffentlichungsnummer 309230 und im U.S. Patent Nr. 5,238,174.
Demnach kann das Vorhandensein von Ziel-Nukleinsäuren nach der Hydrolyse der ungebundenen AE-markierten Sonde durch Messen der Chemilumineszenz des Acridiniumesters, der mit dem Nukleinsäurehybrid verbunden geblieben ist, detektiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, die ein Nukleinsäurehybrid zwischen einem Amplifikationsoligonukleotid und einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen komplementär dazu ist (Primer:Ziel), umfasst. Eine Verwendung des Nukleinsäurehybrids, das zwischen dem Primer und dem Ziel gebildet wird, ist das Bereitstellen einer Initiationsstelle für eine Nukleinsäurepolymerase am 3'-Ende des Amplifikationsoligonukleotides. Zum Beispiel können die Hybride eine Initiationsstelle für die reverse Transkriptase, DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die Taq-Polymerase oder die T4 DNA-Polymerase, und RNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die T7-Polymerase, SP6-Polymerase, T3-Polymerase und ähnliche, bilden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die Nukleinsäurehybride zwischen einem Helfer-Oligonukleotid und einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen komplementär dazu ist (Helfer-Oligonukleotid:Ziel) umfassen. Eine Verwendung des Hybrids zwischen dem Helfer-Oligonukleotid und dem Ziel ist das Verfügbar machen einer bestimmten Nukleinsäuresequenz für die Hybridisierung. Zum Beispiel kann ein Hybrid zwischen einem Helfer-Oligonukleotid und seinem Ziel eine Nukleinsäuresequenz in die Lage versetzen, mit der Ziel-Sequenz, die für die Hybridisierung mit einer Hybridisierungssonde zur Verfügung steht, zu hybridisieren. Eine vollständige Beschreibung der Verwendung von Helfer-Oligonukleotiden wird von Hogan und Milliman, U.S. Patent Nr. 5,030,557 bereitgestellt.
Hierin beschriebene Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis Nukleinsäure ein, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das zwischen einer Nukleinsäure, die von Neisseria meningitidis stammt, und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
ID NO: 11 GGCTGTTGCT AATATCAGCG
Andere hierin beschriebene Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis ein, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das zwischen einer Nukleinsäure, die von Neisseria meningitidis abstammt, und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gebildet wird, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
Ebenfalls beschrieben werden Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis, die ein Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria meningitidis abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID NO: 25
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 13, 14, 35 oder 36.
Weiterhin werden Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria meningitidis abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 26
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, dass mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 13, 14, 35 oder 36.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die ein Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria meningitidis abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 27
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, das mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Ebenfalls beschrieben sind Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis, die ein Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria meningitidis abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 28
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, das mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Ebenfalls beschrieben sind Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae, die ein Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 31
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 2 oder 39.
Die vorliegende Erfindung umfasst Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae, die ein Nukleinsäurehybrid aufweisen, das zwischen einer von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäure und einer Hybridisierungsassaysonde gebildet wird, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 32
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das mit der Nukleinsäure hybridisiert ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 4 oder 40.
Ebenfalls beschrieben sind Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 7 oder 43
und/oder ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 9 oder 45
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria meningitidis Nukleinsäure hybridisieren kann und die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 11, 15, 25 oder 27
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 13, 14, 35 oder 36.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 7 oder 43
und/oder die auch ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen wenigstens mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 9 oder 45
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit Neisseria meningitidis Nukleinsäuren hybridisieren kann und die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 12, 16, 26 oder 28
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 13, 14, 35 oder 36.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 7 oder 43
und/oder die ebenfalls ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 9 oder 45
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria meningitidis Nukleinsäure hybridisieren kann, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 15, 11, 27 oder 25
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 7 oder 43
und/oder die ebenfalls ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 9 oder 45
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria meningitidis Nukleinsäure hybridisieren kann, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 16, 12, 28 oder 20
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 8 oder 44
und/oder die ebenfalls ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 10 oder 46
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria meningitidis Nukleinsäure hybridisieren kann, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 15, 11, 27 oder 25
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria meningitidis beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria meningitidis abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 8 oder 44;
und/oder die ebenfalls ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 10 oder 46;
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria meningitidis Nukleinsäure hybridisieren kann, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 16, 12, 28 oder 26
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 17, 18, 37 oder 38.
Bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen 32 und 33 beschrieben, wohingegen andere Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae einschließen, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das zwischen einer Nukleinsäure, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
Andere hierin beschriebene Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae ein, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das zwischen einer Nukleinsäure, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 5 oder 41
und/oder die ebenfalls wahlweise ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 6 oder 42
und wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure hybridisieren kann und die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 1, 29, 31 oder 33
und die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 2 oder 39.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 7 oder 42
und/oder die wahlweise ein Oligonukleotidnukleinsäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 9 oder 45
und die wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit einer Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure hybridisieren kann und die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 3, 30, 32 oder 34
und die wahlweise ebenfalls ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 4 oder 40
und die ebenfalls wahlweise ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz hat, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 8 oder 44.
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae beschrieben, die eine Nukleinsäure aufweisen, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, und ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen übereinstimmt mit:
SEQ ID NOs: 10 oder 46
und die wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde aufweisen, die mit Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren hybridisieren kann und die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 3, 30, 32 oder 34
und/oder die ebenfalls wahlweise ein Helfer-Oligonukleotid enthalten können, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 4 oder 40.
Es werden ebenfalls Nukleinsäurehybride beschrieben, die Sonden und ebenfalls wenigstens ein Helfer-Oligonukleotid umfassen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit wenigstens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NO: 39 GGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
Es werden ebenfalls Zusammensetzungen zum Amplifizieren von Neisseria Nukleinsäuren beschrieben, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das zwischen einer Neisseria Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
G. Assayverfahren
Die vorliegende Erfindung umfasst verschiedene Verfahren zum Untersuchen des Vorhandenseins einer Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure in einer Probe. Der Fachmann wird verstehen, dass die genauen Assaybedingungen, Sonden oder Primer, die verwendet werden, abhängig vom einzelnen verwendeten Assayformat und der Quelle der Probe abhängen werden.
Ebenfalls offenbart werden Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria meningitidis durch in Kontakt bringen einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungsassaysonde, die unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen mit einer Neisseria meningitidis Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart von Nukleinsäuren von Neisseria gonorrhoeae bevorzugt hybridisieren kann, wobei die Ziel-Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
Andere Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria meningitidis schließen den Schritt des in Kontakt bringens einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hhybridisierungsassaysonde, die unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen mit einer Neisseria meningitidis Ziel-Nukleinsäuresequenz in Gegenwart von Nukleinsäuresequenzen von Neisseria gonorrhoeae bevorzugt hybridisieren kann, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO: 11 GGCTGTTGCT AATATCAGCG
SEQ ID NO: 12 GGCTGTTGCT AATACCAGCG
SEQ ID NO: 15 CGCTGATATT AGCAACAGCC
SEQ ID NO: 16 CGCTGGTATT AGCAACAGCC
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae werden in den Ansprüchen 34–37 beschrieben. Andere Verfahren, die hierin offenbart werden, schließen den Schritt des in Kontakt bringens einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungsassaysonde ein, die unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen mit einer Neisseria qonorrhoeae Ziel-Nukleinsäuresequenz in Gegenwart einer Nukleinsäuresequenz von Neisseria meningitidis bevorzugt hybridisieren kann, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GAACGTACCG GGTAGCGG
SEQ ID NO 29: CCGCTACCCG GTACGTTC
SEQ ID NO 31: GAACGUACCG GGUAGCGG
SEQ ID NO 33: CCGCUACCCG GUACGUUC
Ebenfalls hierin beschrieben sind Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae Mikroorganismen durch in Kontak bringen einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungsassaysonde, die unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen mit einer Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuresequenz in Gegenwart von Nukleinsäuresequenzen von Neisseria meningitidis bevorzugt hybridisieren kann, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GAACGTACCG GGTAGCGG
SEQ ID NO 31: GAACGUACCG GGUAGCGG
Ebenfalls hierin beschrieben sind Verfahren zum Detektieren von Neisseria, wobei als erstes ein Abschnitt der Neisseria Nukleinsäure amplifiziert wird und dann wahlweise eine Hybridisierungsassaysonde zum Untersuchen auf eine spezifische von Neisseria abstammende Nukleinsäure, die durch die Primer amplifiziert wird, verwenden wird. Die amplifizierte Nukleinsäure kann durch etliche Verfahren, einschließlich Gelelektrophorese, detektiert werden.
Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Detektieren von von Neisseria abstammenden Nukleinsäuren, wobei als erstes die Nukleinsäure mit wenigstens einem Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine oder mehrere der folgenden Sequenzen:
eine Verlängerung verursachen wird, amplifiziert wird, wobei das Amplifikationsoligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation der Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Diesem ersten Verfahrensschritt folgt dann wahlweise das Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, die im Amplifikationsschritt erzeugt wurde, mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die mit Nukleinsäuren, die von Neisseria-Arten, Neisseria cinerea, Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae stammen, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren kann.
Das Amplifikationsoligonukleotid, das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, zum Beispiel eine Promotorsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation durch RNA-Polymerase verstärkt.
Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Amplifizieren von Neisseria Nukleinsäuren in einer Testprobe durch Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit den folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 19 oder 49,
SEQ ID NOs: 21 oder 50
eine Verlängerung verursachen, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen einer der folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NOs: 20 oder 51
SEQ ID NOs: 22 oder 52
eine Verlängerung verursachen wird oder beide der Amplifikationsoligonukleotide, wobei wenigstens eines dieser Amplifikationsoligonukleotide wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
In anderen noch bevorzugteren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren von von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäuren in einer Testprobe, die das Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden umfasst, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 19 oder 49
verlängert werden, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 20 oder 51
eine Verlängerung verursachen wird, oder beide der Amplifikationsoligonukleotide, wobei wenigstens eines der Amplifikationsoligonukleotide wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Erhöhen der Anzahl von von Neisseria abstammenden Nukleinsäurensequenzen in einer Testprobe, die das Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden umfasst, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 21 oder 50
eine Verlängerung verursachen, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 22 oder 52
eine Verlängerung verursachen, oder beide der Amplifikationsoligonukleotide, wobei wenigstens eines der Amplifikationsoligonukleotide wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Die obigen Verfahren können ebenfalls den weiteren Schritt des Detektierens der amplifizierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde einschließen, die mit Neisseria meningitidis Nukleinsäuren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren kann.
Die Verfahren können besonders Neisseria meningitidis unter Verwendung von Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonden detektieren, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren werden, die im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Erhöhen der Anzahl von von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäuren in einer Testprobe durch Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer oder mehreren der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 23 oder 47
SEQ ID NOs: 24 oder 48
eine Verlängerung verursachen und wobei das Amplifikationsoligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweisen kann, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch RNA-Polymerase erhöht.
Zusätzliche Verfahren zum Amplifizieren von von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäuren in einer Testprobe mit einem ersten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 23 oder 47
eine Verlängerung verursachen, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 24 oder 48
eine Verlängerung verursachen oder mit beiden der ersten und zweiten Amplifikationsoligonukleotide, wobei eines der Amplifikationsoligonukleotide wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase erhöht, werden ebenfalls beschrieben.
Diesem Verfahren zum Amplifizieren einer von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäure kann der Schritt des Detektierens der amplifizierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die mit Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren kann, folgen.
Bevorzugt weist die Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde eine Nukleinsäuresequenz auf, die im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NOs: 1, 29, 31 und 33.
Das Detektieren von Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure kann die Verwendung eines Helfer-Oligonukleotids einschließen, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO: 2 und
SEQ ID NO: 39.
Andere Verfahren zum Detektieren von Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure werden von der vorliegenden Erfindung durch Erhöhen der Anzahl von von Neisseria gonorrhoeae abstammenden Nukleinsäuren in einer Testprobe durch Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer oder mehreren der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 19 oder 49, SEQ ID NOs: 20 oder 51, eine Verlängerung verursachen, und wobei das Amplifikationsoligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase erhöht, umfasst.
Andere Verfahren zum Amplifizieren von Neisseria Nukleinsäuren in einer Testprobe, die hierin beschrieben werden, schließen das Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden ein, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 19 oder 49
eine Verlängerung verursachen, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 20 oder 51
eine Verlängerung verursacht wird oder mit beiden dieser ersten und zweiten Amplifikationsoligonukleotide.
Alternativ dazu wird weiterhin die Amplifikation von Neisseria Nukleinsäuren in einer Testprobe beschrieben, die das Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikationsoligonukleotiden umfasst, die binden werden oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 21 oder 50
eine Verlängerung verursachen, oder mit einem zweiten Amplifikationsoligonukleotid, das binden wird oder durch eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer der folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 22 oder 52
eine Verlängerung verursacht, oder mit beiden den ersten und zweiten Amplifikationsoligonukleotide.
Der Amplifikation der Neisseria Nukleinsäure folgt bevorzugt das Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die mit Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren kann. Die Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde, die bevorzugt verwendet wird, hat eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NOs: 3, 32, 30, 34.
H. DIAGNOSTISCHE SYSTEME
Die vorliegende Erfindung umfasst auch diagnostische Systeme in Kitform, wie in den Ansprüchen 16–31 beansprucht. Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung kann ein Kit einschließen, das Amplifikationsprimer und/oder Hybridisierungsassaysonden der vorliegenden Erfindung in einer Menge, die für wenigstens ein Assay ausreichend ist, in einem Verpackungsmaterial enthält. Typischerweise würden die Kits auch Instruktionen für die Verwendung der verpackten Primer und/oder Sonden einschließen.
Die verschiedenen Komponenten des diagnostischen Systems können in verschiedenen Formen bereitgestellt werden. Zum Beispiel können die erforderlichen Enzyme, die Nukleotidtriphosphate, die Primer und Sonden als lyophilisiertes Reagenz bereitgestellt werden. Diese lyophilisierten Reagenzien können vor der Lyophilisierung vorgemischt werden, so dass sie, wenn sie rekonstituiert werden, eine vollständige Mischung mit dem geeigneten Verhältnis jeder Komponente fertig für die Verwendung im Assay bilden. Zusätzlich können die diagnostischen Systeme der vorliegenden Erfindung ein Rekonstituierungsreagenz zum Rekonstituieren der lyophilisierte Reagenzien des Kits enthalten. In bevorzugten Kits werden die Enzyme, Nukleotide, Triphosphate und erforderlichen Kofaktoren für die Enzyme als ein einzelnes lyophilisiertes Reagenz bereitgestellt, so dass sie, wenn sie rekonstituiert werden, ein geeignetes Reagenz für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren bilden. In diesen bevorzugten Kits kann auch ein lyophilisiertes Primeragenz bereitgestellt werden. In anderen bevorzugten Kits werden lyophilisierte Sondenreagenzien bereitgestellt.
Typische Verpackungsmateralien würden feste Matrizen, wie zum Beispiel Glas, Plastik, Papier, Folie, Mikropartikel und ähnliches einschließen, die innerhalb festgelegter Grenzen eine Hybridisierungsassaysonde oder Amplifikationsprimer der vorliegenden Erfindung aufnehmen können. Daher kann eine Verpackung, die zum Beispiel aus Verpackungsmaterialien hergestellt wurde, ein Glasfläschchen sein, das dazu dient Sub-Milligramm (d.h. Picogramm, Nanogramm etc.) Mengen eines umfassten Primers oder Hybridisierungsassaysonde aufzunehmen, oder es könnte eine Mikrotiterplattenkammer sein, an die die Sonden und/oder Primer der vorliegenden Erfindung operativ gebunden worden sind, d.h. angebunden, damit sie an einem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung teilnehmen können.
Instruktionen für die Verwendung schließen üblicherweise einen greifbaren Ausdruck ein, auf dem die verschiedenen Reagenzien und/oder Konzentrationen der Reagenzien und wenigstens ein Assayverfahrensparameter beschrieben wird, der zum Beispiel die relativen Mengen von Reagenzien, die pro Menge einer Probe verwendet werden, wiedergibt. Zusätzlich können solche Spezifitäten, wie die Haltbarkeit, Zeiträume, Temperatur und Pufferbedingungen ebenfalls aufgenommen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst diagnostische Systeme oder Kits, die die Oligonukleotide einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfassen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch diagnostische Systeme oder Kits, die die Oligonukleotide enthalten, die für das Durchführen eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.
Dieses Verfahren verwendet bevorzugt auch ein Helfer-Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID Nr: 4 und
SEQ ID Nr: 40.
Die vorliegende Erfindung umfasst diagnostische Systeme oder ein Kit, wie es in den Ansprüchen 16–31 beschrieben wird. Andere diagnostische Systeme oder ein Kit enthalten wenigstens ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NOs: 1, 11, 12, 15, 16, 29, 33, 27, 28, 25, 26.
Die vorliegende Erfindung umfasst diagnostische Systeme oder ein Kit mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsassaysonde mit wenigstens einer Helfer-Sonde, wie in den Ansprüchen 29–31 beschrieben. Andere Helfer-Sonden weisen eine Nukleinsäuresequenz auf, die im Wesentlichen mit der Sequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NOs: 2 oder 39,
wenn das Oligonukleotid im Wesentlichen mit der
SEQ ID NOs: 1 oder 31, oder
SEQ ID NOs: 13 oder 35, oder
SEQ ID NOs: 14 oder 36 übereinstimmt,
wenn das Oligonukleotid im Wesentlichen mit der
SEQ ID NOs: 11 oder 25, oder
SEQ ID NOs: 12 oder 26, oder
SEQ ID NOs: 17 oder 37,
SEQ ID NOs: 18 oder 38 übereinstimmt,
wenn das Oligonukleotid im Wesentlichen mit der
SEQ ID NOs: 15 oder 27, oder
SEQ ID NOs: 16 oder 28 übereinstimmt.
Die vorliegende Erfindung umfasst diagnostische Systeme oder ein Kit, wie es in den Ansprüchen 16–31 beschrieben wird. Andere diagnostische Systeme oder ein Kit enthalten zwei Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Nukleinsäuresequenz übereinstimmt, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO: 8 GTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
SEQ ID NO: 10 GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
SEQ ID NO: 44 GUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
SEQ ID NO: 46 GAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
wobei sie wahlweise eine 5'-Sequenz aufweist, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Die vorliegende Erfindung umfasst diagnostische Systeme oder ein Kit, wie es in den Ansprüchen 16–31 beschrieben wird. Andere diagnostische Verfahren oder ein Kit, die hierin beschrieben werden, enthalten Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 7 oder 43
SEQ ID NOs: 9 oder 45
SEQ ID NOs: 11 oder 25
SEQ ID NOs: 13 oder 35
SEQ ID NOs: 14 oder 36.
Ebenfalls beschrieben sind diagnostische Systeme oder ein Kit, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 15 oder 27
SEQ ID NOs: 16 oder 26
SEQ ID NOs: 17 oder 37
SEQ ID NOs: 18 oder 38.
Ebenfalls beschrieben sind diagnostische Systeme oder ein Kit, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 7 oder 43,
SEQ ID NOs: 9 oder 45,
SEQ ID NOs: 15 oder 27,
SEQ ID NOs: 16 oder 28,
SEQ ID NOs: 17 oder 37,
SEQ ID NOs: 18 oder 38.
Ebenfalls beschrieben sind diagnostische Systeme oder ein Kit, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 5 oder 41,
SEQ ID NOs: 6 oder 42,
SEQ ID NOs: 2 oder 39,
SEQ ID NOs: 1 oder 31.
Ebenfalls beschrieben sind diagnostische Systeme oder ein Kit, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen mit den folgenden Sequenzen übereinstimmt:
SEQ ID NOs: 5 oder 41,
SEQ ID NOs: 2 oder 39,
SEQ ID NOs: 1 oder 31.
BEISPIELE
Weiter unten werden Beispiele zur Veranschaulichung verschiedener Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Diese Beispiele sollen in keinsterweise dazu dienen, um die offenbarte Erfindung, die nur durch die Ansprüche begrenzt wird, zu begrenzen.
Für Neisseria meningitidis spezifische Sonden wurden unter Verwendung von Sequenzen entworfen, die in voraussichtlichen Zielbereichen unter Verwendung von Primern bestimmt wurden, die mit den 16S rRNAs von Neisseria gonorrhoeae (ATCC Nr. 19424), Neisseria meningitidis Serogruppe A (ATCC Nr. 13077), Serogruppe C (ATCC Nr. 23248) und Serogruppe L (ATCC Nr. 43828) und klinischen Isolaten, Neisseria lactamica (ATCC Nr. 23970), Neisseria cinerea (ATCC Nr. 14685), Neisseria mucosa (ATCC Nr. 19696) Neisseria sicca (ATCC Nr. 29193) und Kingella kingae (ATCC Nr. 23330) komplementär sind. Die Nukleinsäuresequenz von phylogenetisch engen Nachbarn, einschließlich der publizierten Sequenz von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375 Rossau et al., Nuc. Acids Res. 16:6227, wurden für Vergleiche mit der Nukleinsäuresequenz von Neisseria meningitidis zur Bestimmung variabler Bereiche ebenfalls verwendet.
Es folgt ein Beispiel für eine solches Ausrichten: Eine spezifische Sequenz, in der sich Neisseria meningitidis von E.coli und Neisseria gonorrhoeae unterschied, wurde für das Sondendesign ausgewählt. Zwei verschiedene Sonden wurden für Neisseria meningitidis, (SEQ ID NO: 11) und (SEQ ID NO: 12) entworfen. Die rRNA-Sequenzen werden unten dargestellt:
In den unten beschriebenen Beispielen werden die folgenden Hybridisierungsassaysondensequenzen beschrieben:
Beispiel 1
In diesem Experiment wurde gereinigte N. gonorrhoeae rRNA (ATCC Nr. 19424) unter Verwendung von Techniken, die von Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,399,491 beschrieben worden sind, mit Oligonukleotiden amplifiziert, die Sequenzen enthielten, die mit der N. gonorrhoeae rRNA komplementär sind. Zwei Promotor-Primer wurden synthetisiert, wobei jeder eine T7 RNA-Polymerase Promotorsequenz 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' (SEQ ID NO: 53) am 5'-Ende enthält, die kovalent an eine zum Ziel komplementäre Sequenz am 3'-Ende 5'-GTCCCCTGCTTTCCCTCTCAAGAC-3' (SEQ ID NO: 5) gebunden ist. Ein Promotor-Primer wurde mit einer freien 3' OH-Gruppe synthetisiert und wurde mit 2 pmol pro Reaktion verwendet. Der zweite Promotor-Primer wurde mit einer Alkandiolgruppe am 3'-Ende synthetisiert und wurde mit 13 pmol pro Reaktion verwendet. Die Ziel-Nukleinsäure und die Primer wurden für 15 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf 42°C abgekühlt. Moloney Murine Leukemia Virus reverse Transkriptase (MMLV RT), 900 Einheiten und 400 Einheiten der T7 RNA-Polymerase wurden zugegeben. Die letztendliche Amplifikationsmischung enthielt 50 mM Tris HCl (pH 8,5), 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl₂, 20 mM N-Acetyl-L-Cystein und 5% (w/v) Glycerol. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 42°C wurden die gesamten 100 μl der Amplifikationsreaktion durch Hybridisieren mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde der Sequenz 5'-GAACGTACCGGGTAGCGG-3' (SEQ ID NO: 1) und einer unmarkierten Helfer-Sonde mit der Sequenz 5'-GGGATAACTGATCGAAAGATCAGCTAATACCGCATACG-3' (SEQ ID NO: 2) untersucht. Die Hybridisierung wurde bei 60°C für 10 min in 200 μl einer Lösung, die 0,05 M Lithiumsuccinat (pH 5), 0,6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA enthielt, durchgeführt, gefolgt von der Zugabe von 300 μl 0,15 M Natriumtetraborat, pH 8,5 und 1% TRITON^® X-100. Diese Mischung wurde bei 60°C für 10 min inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die verbleibende Chemilumineszenz in jedem Röhrchen wurde in einem Gen-Probe LEADER^® I Luminometer untersucht, der mit einer automatischen Injektion für 1 mM Salpetersäure und 0,1% (v/v) Wasserstoffperoxid gefolgt von der Injektion einer Lösung, die 1 N Natriumhydroxid enthielt, eingerichtet war. Die Ergebnisse wurden in relativen Lichteinheiten (RLU) dargestellt, eine Maßeinheit der Photonen, die durch den Luminometer detektiert wurden.
Tabelle 1 Amplifikation von Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäure mit Amplifikationsoligonukleotiden, die die SEQ ID NO: 5 umfassen, gefolgt von der Detektion mit einer Sonde, die die SEQ ID NO: 1 umfasst.

*pg = Picogramm

Beispiel 2
Dieses Experiment verdeutlicht die Amplifikation von N. gonorrhoeae rRNA mit zwei Primern mit entgegengesetztem Sinn. Der im Beispiel 1 beschriebene Promotor-Primer, der eine T7 RNA-Polymerase Promotorsequenz und einen 3'-Ziel-Hybridisierungsbereich mit der Sequenz 5'-GTCCCCTGCTTTCCCTCTCAAGAC-3' (SEQ ID NO. 5) enthält, wurde mit 15 pmol pro Reaktion verwendet und ein Primer, der eine Sequenz des gleichen Sinns enthielt wie N. gonorrhoeae rRNA, 5'-GGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATA-3' (SEQ ID NO. 6), wurde mit 15 pmol pro Reaktion verwendet. Die Reaktionen wurden in dreifacher Wiederholung durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben, und die Proben wurden für 5 min auf 95°C erhitzt und dann auf 42°C abgekühlt. Enzyme wurden zugegeben und nach einer zweistündigen Inkubation bei 42°C wurden 20 μl aus der Amplifikationsreaktion durch Hybridisieren mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz der SEQ ID NO: 1 synthetisiert worden ist, und einer unmarkierten Helfer-Sonde, die mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 synthetisiert worden ist, untersucht. Die Primer amplifizierten die N. gonorrhoeae RNA und ermöglichten die Detektion von weniger als 100 Kopien des Ziels.
Tabelle 2 Amplifikation von N. gonorrhoeae rRNA mit Primern, die die SEQ ID NOs: 5 und 6 umfassen, und die Detektion mit einer Sonde, die die SEQ ID NO: 1 umfasst.
Beispiel 3
In diesem Experiment wurden wiederum zwei Promotor-Primer mit identischer Sequenz verwendet. Jeder Promotor-Primer wurde mit einer 5' T7 RNA-Polymerase Promotorsequenz 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' SEQ ID NO: 53 am 5'-Ende und einem Ziel-Hybridisierungsbereich 5'-GCTGCTGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 7) am 3'-Ende synthetisiert. Die Promotor-Primer wurden entweder mit einer 3'-Hydroxylgruppe synthetisiert und mit 2 pmol pro Reaktion verwendet oder mit einem 3'-Alkandiol und wurden dann mit 13 pmol pro Reaktion verwendet. Die Proben wurden für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und vor dem Hinzufügen des Enzyms auf 42°C abgekühlt. Die Amplifikationsbedingungen waren wie die im Beispiel 1 beschriebenen. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 42°C wurden 100 μl aus der Amplifikationsreaktion durch Hybridisieren mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 3) synthetisiert worden ist, und einer unmarkierten Helfer-Sonde mit der Sequenz 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO: 4) unter Verwendung der im Beispiel 1 beschrieben Bedingungen untersucht.
Tabelle 3 Amplifikation von N. gonorrhoeae rRNA unter Verwendung von Primern, die die SEQ ID NO: 7 umfassen.
Beispiel 4
In diesem Experiment wurde N. gonorrhoeae rRNA mit einer Mischung aus zwei Oligonukleotiden, einer ein Promotor-Primer, der mit N. gonorrhoeae rRNA komplementär ist und ein Primer des gleichen Sinns wie die N. gonorrhoeae rRNA amplifiziert. Der Promotor-Primer enthielt eine T7 RNA-Polymerase Promotorsequenz am 5'-Ende und einen Ziel-Hybridisierungsbereich 5'-GCTGCTGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 7) am 3'-Ende und wurde mit einem Primer der Sequenz 5'-CGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGCCGTT-3' (SEQ ID NO: 9) mit 30 pmol pro Reaktion verwendet. Alternativ dazu wurde ein Promotor-Primer, der einen Ziel-Hybridisierungsbereich der Sequenz 5'-GTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAGGTACCGTCATCG-3' (SEQ ID NO: 8) enthielt, mit 15 pmol pro Reaktion zusammen mit dem Promotor-Primer mit einer Sequenz 5'-GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGAC-3' (SEQ ID NO: 10) mit 15 pmol pro Reaktion verwendet. Die Amplifikationsbedingungen entsprachen den im Beispiel 1 beschriebenen. Zwanzig μl des Produktes wurden durch Hybridisieren mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 3) synthetisiert worden ist und einer unmarkierten Helfersonde, die mit der Sequenz 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO: 4) synthetisiert worden ist, wie im Beispiel 1 beschrieben, untersucht.
Tabelle 4 Amplifikation von N. gonorrhoeae rRNA unter Verwendung von Primern, die die SEQ ID NOs: 7 und 9 oder 8 und 10 umfassen.
Beispiel 5
Dieses Beispiel verdeutlicht die Reaktivität der Amplifikation und des Detektionsassays. Frische Kulturen von dreizehn Stämmen von N. gonorrhoeae wurden in 0,9% Natriumchlorid bei einer Dichte von etwa 10¹⁰ Zellen/ml suspendiert und in einer Lösung, die 3% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 30 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA und 1 mM EGTA enthält, lysiert. Das Freisetzen der Nukleinsäure wurde durch Hybridisieren mit einer Sonde, die auf einen konservierten Bereich der ribosomalen RNA aller Bakterien gerichtet war, bestätigt. Die Zelllysate wurden weiter in Wasser verdünnt und zu den Amplifikationsreaktionen gegeben, die 30 pmol eines Promotor-Primers, der eine 5' T7 RNA-Promotorsequenz der SEQ ID NO: 53 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3', und eine 3'-Ziel-Bindungssequenz, die die SEQ ID NO: 7 umfasst, und 30 pmol eines Primers, der die Sequenz der SEQ ID NO: 9 umfasst, enthält. Es wurden zweifach Reaktionen, die das Lysat von wenigstens 10⁵ Zellen enthielten, unter Verwendung einer Amplifikationsmischung, die 50 mM Tris HCl (pH 8,5), 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl₂, 20 mM N-Acetyl-L-cystein, 5% (v/v) Glycerol und die oben beschriebenen Oligonukleotidprimer enthielt, durchgeführt. Die Mischung wurde für 5 min auf 95°C erhitzt, dann auf 42°C abgekühlt und 900 Einheiten der MMLV reversen Transkriptase und 400 Einheiten der T7 RNA-Polymerase wurden zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 42°C wurden 20 μl einer Amplifikationsreaktion durch Hybridisieren mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 3) synthetisiert wurde und einer unmarkierten Helfer-Sonde, die die Sequenz 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO: 4) enthielt, untersucht.
Tabelle 5 Amplifikation verschiedener Stämme von N. gonorrhoeae unter Verwendung von Primern, die SEQ ID NOs: 7 und 9 umfassen.
Beispiel 6
Sequenzanalysen anderer Neisseria Spezies ergaben, dass die Amplifikationsoligonukleotide dieser Erfindung Nukleinsäuren anderer Spezies amplifizieren konnten. Dieses Beispiel verdeutlicht die Anwendbarkeit der Amplifikationsoligonukleotide dieser Erfindung zum Amplifizieren von Nukleinsäure einer anderen Neisseria Spezies, N. meningitidis. Im Verlauf der Entwicklung einer spezifischen Sonde für N. meningitidis wurde deutlich, dass die Mitglieder der Spezies N. meningitidis im ausgewählten Sondenbereich nicht homogen waren. Die Sequenzen der 16S rRNAs repräsentativer N. meningitidis Spezies, die eine geringe Reaktivität gegenüber der anfänglichen Sonde zeigten, wurden bestimmt und eine zweite Sonde wurde entworfen. Diese Daten verdeutlichen die differenzielle Reaktivität dreier N. meningitidis Spezies gegenüber den zwei Sonden. In diesem Beispiel wurde gereinigte rRNA von Neisseria gonorrhoeae (ATCC Nr. 19424) oder Lysate von Neisseria meningitidis Serogruppe A (ATCC Nr. 13077), Serogruppe C (ATCC Nr. 13102) und Serogruppe L (ATCC Nr. 43828), die etwa 1000 Zellen repräsentieren, mit einem Promotor-Primer und einem Primer, der im Beispiel 5 beschrieben wurde, unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen, amplifiziert. Zehn μl Proben aus den 100 μl der Amplifikationsreaktionen wurden durch Hybridisierung mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 3) synthetisiert wurde, und einer unmarkierten Helfer-Sonde, die mit der Sequenz 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO: 4) synthetisiert wurde, oder einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GGCTGTTGCTAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO: 11) synthetisiert wurde und zwei unmarkierte Helfer-Sonden, wobei eine mit der Sequenz 5'-GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 13) synthetisiert wurde und eine mit der Sequenz 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGC-3' (SEQ ID NO: 14) synthetisiert wurde, oder einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GGCTGTTGCTAATACCAGCG-3' (SEQ ID NO: 12) synthetisiert wurde, mit unmarkierten Helfer-Sonden der SEQ ID NOs: 13 und 14 oder mit einer Kombination von markierten Sonden der SEQ ID NOs: 11 und 12, die mit unmarkierten Helfer-Sonden der SEQ ID NOs: 13 und 14 verwendet wurden, untersucht. Die Sequenzanalysen ergaben, dass andere Stämme von Neisseria mit diesen Primern ebenfalls amplifiziert werden.
Tabelle 6 Amplifikation von Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis Stämmen unter Verwendung von Primern, die die SEQ ID NOs. 7 und 9 umfassen.
Die Daten zeigen, dass Stämme von N. meningitidis und N. gonorrhoeae unter Verwendung von Primern amplifiziert werden können, die die SEQ ID NOs: 7 und 9 umfassen und mit Sonden der SEQ ID NOs: 3, 11 und 12 detektiert werden können.
Beispiel 7
Die Empfindlichkeit des Amplifikations- und des Detektionsassays für N. meningitidis wurde mit diesem Experiment nachgewiesen. In diesem Beispiel wurden N. meningitidis Serogruppe C Zellen kultiviert und in 0,9% Natriumchlorid bis zu einer Dichte von etwa 10⁹ Zellen pro ml suspendiert. Die Zellen wurden nach Zugabe eines gleichen Volumens einer Lösung, die 3% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 30 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA enthielt, lysiert und vor der Zugabe zur Amplifikationsreaktion mit Wasser verdünnt. Die Amplifikationen wurden wie im Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung des Promotor-Primers und des Primers, der im Beispiel 5 beschrieben wurde (SEQ ID NO: 7 bzw. 9), durchgeführt. Zwanzig μl aus der Reaktion wurden durch Hybridisierung im HPA Format unter Verwendung einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GGCTGTTGCTAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO: 11) synthetisiert wurde, und zwei unmarkierten Helfer-Sonden, wobei eine mit der Sequenz 5'-GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 13) synthetisiert wurde und die andere mit der Sequenz 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGC-3' (SEQ ID NO: 14) synthetisiert wurde, analysiert.
Tabelle 7 Amplifikation von N. meningitidis Serogruppe A mit den Amplifikationsoligomeren, die die SEQ ID NOs: 7 und 9 umfassen, gefolgt von der Detektion mit der Sonde der SEQ ID NO: 11.
Beispiel 8
Um die Reaktivität und Spezifität der gegen die N. meningitidis 16S rRNA gerichteten Sonden zu demonstrieren wurde eine Mischung aus Sonden, die mit einem Acridiniumester markierte Oligonukleotide enthielten, die mit der Sequenz 5'-CGCTGATATTAGCAACAGCC-3', (SEQ ID NO: 15) oder der Sequenz 5'-CGCTGGTATTAGCAACAGCC-3', (SEQ ID NO: 16) synthetisiert wurden, und der unmarkierten Helfer-Sonden, die mit der Sequenz 5'-TTTTCTTCCCTGACAAAAGTCCTTTACAACCCGAAGGC-3' (SEQ ID NO: 17) und 5'-GCCGGTGCTTATTCTTCAGGTACCGTCATCAG-3' (SEQ ID NO: 18) synthetisiert wurden, mit einer Nukleinsäure in Lysaten, die aus Zwischenkulturen der Neisseria Arten, die weiter unten aufgelistet werden, hergestellt wurden, hybridisiert. Jedes Lysat wurde mit einer Sonde getestet, die auf einen konservierten Bereich der 23S rRNA gerichtet war, um die Lyse der Organismen und die Integrität der rRNA zu bestätigen.
Tabelle 8 Reaktivität und Spezifität der Sonden, die auf die N. meningitidis 16S rRNA gerichtet sind.

*Sondenmischung, die mit einem Acridiniumester markierte Sonden enthielt, die mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 synthetisiert wurden, und unmarkierte Helfer-Sonden, die mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 synthetisiert wurden.

Die Daten zeigen, dass die Mischung der Sonden die Detektion aller getesteten N. meningitidis Stämme ermöglichte. Die Sondenmischung zeigte eine Kreuzreaktion mit N. cinerea, einem Organismus der nur mit sehr geringer Wahrscheinlichkeit in der gleichen klinischen Probe gefunden wird wie N. meningitidis. Die Behandlung von Patienten mit N. cinerea Infektionen wäre die gleiche wie für Patienten, die mit N. meningitidis infiziert sind.
Beispiel 9
Dieses Beispiel verdeutlicht die Spezifität des Amplifikations- und des Detektionsassays. Dreißig pmol des Promotor-Primers, der die SEQ ID NO: 7 umfasst, und 30 pmol des Primers, der die SEQ ID NO: 9 umfasst, wurden im Assay mit elf verschiedenen Neisseria Arten verwendet. Die Zelllysate wurden, wie im Beispiel 5 beschrieben, hergestellt und durch Hybridisierung unter Verwendung der im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen amplifiziert und analysiert. Zwanzig Mikroliter der Amplifikationsreaktionen wurden mit einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO: 3) synthetisiert wurde, und einer unmarkierten Helfer-Sonde, die mit der Sequenz 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO: 4) synthetisiert wurde, oder einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GGCTGTTGCTAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO: 11) synthetisiert wurde, in Gegenwart von unmarkierten Helfer-Sonden, die mit den Sequenzen synthetisiert wurden, die die SEQ ID NOs: 13 und 14 umfassen, oder einer mit einem Acridiniumester markierten Sonde, die mit der Sequenz 5'-GGCTGTTGCTAATACCAGCG-3' (SEQ ID NO: 12) synthetisiert wurde, in Gegenwart von unmarkierten Helfer-Sonden der SEQ ID NOs: 13 und 14 hybridisiert.
Tabelle 9 Spezifität eines Assays unter Verwendung einer Amplifikation mit Oligonukleotiden, die die SEQ ID NOs. 7 und 9 umfassen, gefolgt durch die Detektion mit Sonden, die die SEQ ID NOs. 3, 11 oder 12 umfassen.

*gereinigte RNA, die bei 500 pg pro Reaktion verwendet wurde. N.G. = Nicht getestet

Die Daten, die in den oben beschriebenen Beispielen gezeigt wurden, bestätigen, dass die neuen Amplifikationsoligonukleotide, die hierin beschrieben werden, Neisseria Nukleinsäure amplifizieren können und in einem Assay verwendet werden können, um Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae voneinander und den nächsten bekannten phylogenetischen Nachbarn zu unterscheiden. Keines der hierin beschriebenen Beispiele soll dazu dienen die vorliegende Erfindung auf die Ausführungsformen dieser Offenbarung zu beschränken; die Erfindung wird nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Satz von Amplifikationsoligonukleotiden, der für das Bestimmen des Vorhandenseins von Neisseria gonorrhoeae in einer Testprobe verwendbar ist, wobei der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden umfasst: ein erstes Amplifikationsoligonukleotid mit einer Länge von bis zu 100 Nukleotiden, das eine Primersequenz umfasst, die einen Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden mit 100% Basenidentität mit einem Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 aufweist, wobei das erste Amplifikationsoligonukleotid mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, die aus der Sequenz der SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 49 besteht, unter Bedingungen, die es dem ersten Amplifikationsoligonukleotid erlauben als Primer für die Nukleinsäuresynthese zu agieren, hybridisieren kann; und ein zweites Amplifikationsoligonukleotid mit einer Länge von bis zu 100 Basen, das eine Primersequenz umfasst, die einen Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden mit 100% Basenidentität mit einem Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 aufweist, wobei das zweite Amplifikationsoligonukleotid mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, die aus der Sequenz der SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 51 besteht, unter Bedingungen, die es dem zweiten Amplifikationsoligonukleotid ermöglichen als Primer für die Nukleinsäuresynthese zu agieren, hybridisieren kann.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei jeder der ersten und zweiten Amplifikationsoligonukleotide eine Länge von 12 bis 50 Nukleotiden aufweist.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1 oder 2, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides die Sequenz von SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 umfasst; und die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides die Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 umfasst.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer der ersten und zweiten Amplifikationsoligonukleotide eine Promotorsequenz einschließt, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 4, wobei die RNA-Polymerase eine T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase ist.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 5, wobei die Promotorsequenz aus der Sequenz der SEQ ID NO: 53 besteht.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 80% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 80% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; und die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 85% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 85% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; und die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 90% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 90% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; und die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 95% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz besteht, die wenigstens 95% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 aufweist, und wahlweise einer Promotorsequenz; und die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 1, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 besteht, und wahlweise einer Promotorsequenz; die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus einer Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 und wahlweise einer Promotorsequenz besteht; und die Promotorsequenz durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA-Polymerase steigert.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 11, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 und der Promotorsequenz besteht; und die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 besteht.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 11, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 besteht; und die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 und der Promotorsequenz besteht.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach Anspruch 11, wobei: die Sequenz des ersten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 43 besteht; und die Sequenz des zweiten Amplifikationsoligonukleotides aus der Sequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 45 besteht.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei einer der Amplifikationsoligonukleotide ein 3'-Ende aufweist, das modifiziert ist, um die Primerverlängerung zu verhindern oder den Umfang der Primerverlängerung des Amplifikationsoligonukleotides zu verringern.
Der Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das in Kitform verpackt ist.
Das Kit nach Anspruch 16, das weiter eine Hybridisierungsassaysonde mit einer Länge von bis zu 100 Nukleotiden einschließt und ein Oligonukleotid umfasst, das einen Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden mit 100% Basenidentität mit einem Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist, wobei die Sonde mit einer Nukleinsäure unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen hybridisiert, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt und nicht mit einer Nukleinsäuren, die von Neisseria meningitidis abstammt.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz des Oligonukleotides eine wenigstens 80% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz des Oligonukleotides eine wenigstens 85% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz des Oligonukleotides eine wenigstens 90% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz des Oligonukleotids eine wenigstens 95% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sonde die Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 umfasst.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz der Sonde eine wenigstens 80% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz der Sonde eine wenigstens 85% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz der Sonde eine wenigstens 90% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz der Sonde eine wenigstens 95% Basenidentität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 aufweist.
Das Kit nach Anspruch 17, wobei die Sequenz der Sonde aus der Sequenz der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 besteht.
Das Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 27, wobei die Sonde einen Marker einschließt.
Das Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 28, das weiter ein Helfer-Oligonukleotid mit einer Länge von bis zu 100 Nukleotiden einschließt und einen Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden mit einer wenigstens 80% Basenidentität mit einem Bereich von wenigstens 10 Nukleotiden der Sequenz der SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 40 umfasst.
Das Kit nach Anspruch 29, wobei das Helfer-Oligonukleotid die Sequenz der SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 40 umfasst.
Das Kit nach Anspruch 29, wobei die Sequenz des Helfer-Oligonukleotids aus der Sequenz der SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 40 besteht.
Eine Zusammensetzung, die den Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und der Hybridisierungsassaysonde nach einem der Ansprüche 17 bis 28 umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, die weiter das Helfer-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 29 bis 31 umfasst.
Ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Sequenz, die in einer Nukleinsäure vorhanden ist, die von Neisseria gonorrhoeaee abstammt, in einer Testprobe, wobei das Verfahren umfasst: a) In Kontakt bringen der Probe mit dem Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 15; und b) Aussetzen der Probe gegenüber Bedingungen, die es der Ziel-Sequenz ermöglichen in Gegenwart des Satzes von Amplifikationsoligonukleotiden amplifiziert zu werden.
Ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins einer Ziel-Sequenz, die in der Nukleinsäure vorhanden ist, die von Neisseria gonorrhoeae abstammt, in einer Testprobe, wobei das Verfahren umfasst: a) In Kontakt bringen der Probe mit dem Satz von Amplifikationsoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 15; b) Aussetzen der Probe gegenüber Bedingungen, die es der Ziel-Sequenz ermöglichen in Gegenwart des Satzes von Amplifikationsoligonukleotiden amplifiziert zu werden; und c) Bestimmen, ob die Ziel-Sequenz oder ein Amplikon davon in der Probe vorhanden ist, als ein Hinweis auf das Vorhandensein von Neisseria gonorrhoeae in der Probe.
Das Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Schritt zum Bestimmen das Bereitstellen der Hybridisierungsassaysonde nach einem der Ansprüche 17 bis 28 für die Probe umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 36, das weiter das Helfer-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 29 bis 31 einschließt.