DE3752172T3 - Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen - Google Patents

Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen Download PDF

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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindungen betreffen Sonden und Assays, die auf der Verwendung von genetischem Material, wie RNA, basieren. Genauer gesagt, betreffen die Erfindungen den Entwurf und die Konstruktion von Nukleinsäuresonden und die Hybridisierung solcher Sonden an genetisches Material von nicht-viralen Zielorganismen in Assays zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung davon in Testproben von z.B. Sputum, Urin, Blut und Gewebeschnitten, Nahrung, Boden und Wasser.
  • 2. Einführung
  • Zwei einzelne Stränge von Nukleinsäure, bestehend aus Nukleotiden, können assoziieren ("hybridisieren"), um eine doppelhelikale Struktur zu bilden, in der die zwei in entgegengesetzten Richtungen laufenden Polynukleotidketten durch Wasserstoffbrücken bzw. -bindungen (eine schwache Form von chemischer Bindung) zwischen Paaren zueinanderpassender, zentral gelegener als "Basen" bekannter Verbindungen zusammengehalten werden. In der doppelhelikalen Struktur von Nukleinsäuren ist zum Beispiel im allgemeinen die Base Adenin (A) über Wasserstoffbrücken mit der Base Thymin (T) oder Uracil (U) verknüpft, während die Base Guanin (G) über Wasserstoffbrücken mit der Base Cytosin (C) verknüpft ist. An jedem Punkt entlang der Kette kann man deshalb die Basenpaare AT oder AU, TA oder UA, GC oder CG finden. Man kann auch AG- und GU-Basenpaare zusätzlich zu den traditionellen ("kanonischen") Basenpaaren finden. Unter der Annahme, daß ein erster einzelner Nukleinsäurestrang ausreichend komplementär zu einem zweiten ist und daß die zwei unter Bedingungen zusammengebracht werden, welche ihre Hybridisierung fördern werden, wird eine doppelsträngige Nukleinsäure resultieren. Unter geeigneten Bedingungen können DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybride gebildet werden.
  • Im weiten Sinne gibt es zwei grundlegende Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren. In einem, bekannt als "in Lösung"-Hybridisierung, befinden sich sowohl eine "Sonden"-Nukleinsäuresequenz als auch Nukleinsäuremoleküle aus einer Testprobe frei in Lösung. Bei dem anderen Verfahren ist die Proben-Nukleinsäure gewöhnlicherweise auf einem festen Träger immobilisiert und die Sondensequenz liegt frei in Lösung vor.
  • Eine Sonde kann eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz sein, die zu einem bestimmten Ausmaß komplementär zu den Nukleinsäuresequenzen ist, welche nachgewiesen werden sollen ("Zielsequenzen"). Sie kann auch markiert sein. Eine Hintergrundbeschreibung der Anwendung von Nukleinsäure-Hybridisierung als Verfahren zum Nachweis bestimmter Nukleinsäuresequenzen ist in der EP-A-0 131 052 beschrieben.
  • Die WO 84/02721 betrifft ein Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung und Quantifizierung von Organismen und Viren. Die Druckschrift enthält eine Beschreibung der Anwendung von Nukleinsäuresonden-Assays. Sie enthält breit gefaßte Ansprüche, welche sich auf eine Sonde richten, die "an die rRNA der Gruppe von nicht-viralen Organismen hybridisiert und nicht nachweisbar an rRNA aus anderen nicht-viralen Organismen hybridisiert ...". Die PCT-Anmeldung beschreibt Verfahren zum Erhalt derartiger Sonden, einschließlich der Vorgehensweise A, die sich auf den Erhalt von Klonen mit potentiellen Sonden richtet und ein Screening durch Hybridisierung zum Auswählen der Sonde verwendet, der Vorgehensweise B, welche das biologische Synthetisieren einer Sondengruppe und das Auswählen einer Sonde durch Hybridisierungsverfahren beschreibt, und der Vorgehensweise C, die das Auswählen von Sonden auf Grundlage eines Sequenzvergleichs beinhaltet.
  • Die EP-A-0 133 671 betrifft ein Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren zum Nachweis von Bakterien in einer Testprobe, welches eine Polynukleotidsonde mit einer Basensequenz anwendet, die homolog mit mindestens einer Basensequenz in der Nukleinsäure von im wesentlichen allen Bakterien, von denen vermutet wird, vorhanden zu sein, ist.
  • Die EP-A-0 232 085 beschreibt eine DNA-Sonde, welche eine im wesentlichen zu einem Teil der rRNA einer Campylobacter-Art komplementäre DNA-Sequenz umfaßt, die fähig zur Hybridisierung an die rRNA einer Campylobacter-Art und nicht fähig zur Hybridisierung an die rRNA einer von Campylobacter verschiedenen Art ist.
  • Die EP-A-0 245 129 beschreibt eine Hybridisierungssonde zum Nachweis des Vorhandenseins von Bakterien in einer Probe, die besondere Pentadecadesoxyribonukleotide und Bereiche davon umfaßt.
  • Die EP-A-0 250 662 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines prokaryotischen Organismus durch Kontaktieren einer den Organismus enthaltenden Probe mit einem Nukleinsäurefragment aus dem Organismus und Nachweisen des Vorhandenseins von hybridisierten Oligonukleotiden.
  • Die EP-A-0 277 237 betrifft ein Verfahren zum Testen von Bakterien in einer Probe unter Anwendung einer durch Markieren einer DNA oder RNA hergestellten Sonde, wobei die DNA oder RNA eine zu einer Sequenz von mindestens zwölf Basen ribosomaler RNA aus E.coli komplementäre Basensequenz enthält.
  • In diesen Anmeldungen werden ebenfalls Verfahren zur Bestimmung des Vorliegen RNA-enthaltender Organismen in einer Probe, welche solche Organismen enthalten könnte, beschrieben, umfassend die Schritte des Zusammenbringens von Nukleinsäuren aus einer Probe und einer Sonde, umfassend Nukleinsäuremoleküle, die kürzer sind als die der rRNA-Untereinheit-Sequenz, aus der sie abgeleitet wurde, und die ausreichend komplementär sind, um an die rRNA von einem oder mehreren nicht-viralen Organismus(en) oder Gruppen nicht-viraler Organismen zu hybridisieren, des Inkubierens der Mischung unter spezifizierten Hybridisierungsbedingungen, und des Testens der resultierenden Mischung hinsichtlich der Hybridisierung der Sonde und irgendeiner Testproben-rRNA. Die Erfindung ist unter Einbeziehung des Anwendens einer Sonde beschrieben, welche nur rRNA-Untereinheiten-Subsequenzen nachweist, welche in besonderen Organismen oder Organismengruppen gleich oder ausreichend ähnlich sind, und von welcher angegeben wird, das Vorhandensein oder die Abwesenheit irgendeines oder mehrerer dieser besonderen Organismen in einer Probe, selbst in Gegenwart vieler nicht-verwandter Organismen, nachzuweisen.
  • Wir haben festgestellt und beschreiben hier ein Verfahren und Mittel zum Entwerfen und Konstruieren von DNA-Sonden zur Verwendung beim Nachweis einzigartiger rRNA-Sequenzen in einem Assay zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung einer Gruppe von nicht-viralen Organismen. Einige der Sonden der hierin beschriebenen Erfindung können verwendet werden, um eine einzelne Art oder einen einzelnen Stamm eines nicht-viralen Organismus nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, und andere können verwendet werden, um Mitglieder einer gesamten Gattung oder gewünschten phylogenetischen Gruppierung nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
  • Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Sonde nach Anspruch 1 bereitgestellt.
  • Die Erfindung stellt weiterhin eine Hybridisierungsassay-Sonde nach Anspruch 38 oder Anspruch 39 bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Verfahren der Herstellung und Anwendung einer Sonde wird ein einzelsträngiges Desoxyoligonukleotid mit einer bestimmten Sequenz und einer definierten Länge in einem Hybridisierungsassay verwendet, um die Gegenwart oder Menge von rRNA aus bestimmten nicht-viralen Zielorganismen zu ermitteln, um sie von ihren bekannten nächsten phylogenetischen Nachbarn zu unterscheiden. Es werden Sondensequenzen, welche jeweils für die variablen 16S-rRNA-Untersequenzen von Mycobacterium avium, Mycobacterium intra.-cellulare bzw. Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Bakterien spezifisch sind und welche nicht mit Nukleinsäuren untereinander oder mit irgendeiner anderen Bakterienart oder einem anderen die Atemwege infizierenden Agens kreuzreagieren, beschrieben und beansprucht. Eine für eine variable 23S-rRNA-Region-Untersequenz aus den Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Bakterien spezifische Sonde wird ebenfalls beschrieben und beansprucht, wie auch variable rRNA-Region-Sonden, die in Hybridisierungsassays für die Gattung Mycobacterium (für 23S-rRNA spezifisch), für Mycoplasma pneumomiae (spezifisch für 5S- und 16S-rRNA), Chlamydia trachomatis (spezifisch für 16S- und 23S-rRNA), Enterobacter cloacae (spezifisch für 23S-rRNA), Escherichia coli (spezifisch für 16S-rRNA), Legionella (spezifisch für 16S- und 23S-rRNA), Salmonella (spezifisch für 16S- und 23S-rRNA), Enterococci (spezifisch für 16S-rRNA), Neisseria gonorrhoeae (spezifisch für 16S-rRNA), Campylobacter (spezifisch für 16S-rRNA), Proteus mirabilis (spezifisch für 23S-rRNA), Pseudomonas (spezifisch für 23S-rRNA), Pilze (spezifisch für 18S- und 28S-rRNA) und Bakterien (spezifisch für 16S- und 23S-rRNA) verwendbar sind.
  • In einer Ausführungsform des Assayverfahrens wird eine Testprobe zuerst Bedingungen unterzogen, welche rRNA aus jeglichem, in dieser Probe vorhandenen, nicht-viralen Organismus freisetzen. rRNA ist einzelsträngig und deshalb, sobald in dieser Art freigesetzt, für eine Hybridisierung mit ausreichend komplementärem genetischen Material verfügbar. Der Kontakt zwischen einer Sonde, welche markiert sein kann, und dem rRNA-Ziel kann in Lösung unter Bedingungen durchgeführt werden, welche die Hybridisierung zwischen den zwei Strängen fördern. Die Reaktionsmischung wird dann hinsichtlich des Vorhandenseins von hybridisierter Sonde geassayt. Zahlreiche Vorteile des vorliegenden Verfahrens für den Nachweis nicht-viraler Organismen gegenüber Techniken nach dem Stand der Technik, einschließlich Genauigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit und Geschwindigkeit, werden aus der ausführlichen Beschreibung, welche nachfolgt, vollständiger deutlich.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1 ist eine Darstellung der Primärstruktur der bakteriellen 16S-rRNA für Escherichia coli, welche für die Basenpaare Standardbezugszahlen angibt.
  • Die 2 ist eine Darstellung der Primärstruktur der bakteriellen 23S-rRNA für Escherichia coli, welche für die Basenpaare Standardbezugszahlen zeigt.
  • 3 ist eine Darstellung der Primärstruktur der bakteriellen 5S-rRNA für Escherichia coli, welche für die Basenpaare Standardbezugszahlen angibt.
  • 4 ist eine Darstellung der Primärstruktur der 18S-rRNA für Saccharomyces cerevisiae, welche für die Basenpaare Standardbezugszahlen anzeigt.
  • 5 ist eine Darstellung der Primärstruktur der 28S-rRNA für Saccharomyces cerevisiae, welche für die Basenpaare Standardbezugszahlen angibt.
  • Die 6 ist ein Diagramm, welches die Stellen in der 16S-rRNA (unter Verwendung von E. coli-Referenzzahlen) zeigt, die zwischen 12 unterschiedlichen Sätzen verwandter Organismen verschieden sind. Im Beispiel 1 bezieht sich zum Beispiel 99,7 auf die Ähnlichkeit der 16S-rRNA zwischen Clostridium botulinium und Clostridium subterminale.
  • Die 7 ist ein Diagramm, welches die Stellen in den ersten 1500 Basen von 23S-rRNA (unter Verwendung von E. coli-Referenzzahlen) zeigt, die zwischen 12 unterschiedlichen Sätzen verwandter Organismen verschieden sind.
  • Die 8 ist ein Diagramm, das die Stellen in den terminalen Basen von 23S-rRNA (unter Verwendung von E. coli-Referenzzahlen) zeigt, die zwischen 12 unterschiedlichen Sätzen verwandter Organismen verschieden sind.
  • Die 9 ist eine schematische Darstellung der Lage von Sonden, die fähig sind, an die 16S-rRNA zu hybridisieren.
  • Die 10 ist eine schematische Darstellung der Lage von Sonden, die fähig sind, an die ersten 1500 Basen der 23S-rRNA zu hybridisieren.
  • Die 11 ist eine schematische Darstellung der Lage von Sonden, die fähig sind, an die terminalen Basen von 23S-rRNA zu hybridisieren.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Die nachstehenden Begriffe, wie in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, werden wie folgt definiert:
    Nukleotid: Untereinheit einer Nukleinsäure, bestehend aus einer Phosphatgruppe, einem 5'-Kohlenstoff-Zucker und einer stickstoffhaltigen Base. In RNA ist der 5'-Kohlenstoff-Zucker Ribose. In DNA ist er eine 2-Desoxyribose. Der Begriff schließt ebenfalls Analoge derartiger Untereinheiten ein.
    Nukleotidpolymer: Mindestens zwei Nukleotide, verknüpft durch Phosphodiesterbindungen.
    Oligonukleotid: Nukleotidpolymer von im allgemeinen etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden Länge, welches aber größer als 100 Nukleotide Länge sein kann.
    Nukleinsäuresonde: Einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, welche mit einer komplementären einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäuresequenz kombinieren wird, um ein doppelsträngiges Molekül (Hybrid) zu bilden. Eine Nukleinsäuresonde kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleotidpolymer sein.
    Hybrid: Komplex, gebildet zwischen zwei einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen durch Watson-Crick-Basenpaarungen oder nicht-kanonische Basenpaarungen zwischen den komplementären Basen.
    Hybridisierung: Vorgang, durch den zwei komplementäre Stränge von Nukleinsäuren kombinieren, um doppelsträngige Moleküle (Hybride) zu bilden.
    Komplementarität: Eigenschaft, vermittelt durch die Basensequenz eines Einzelstrangs von DNA oder RNA, welcher ein Hybrid oder doppelsträngige DNA:DNA, RNA:RNA oder DNA:RNA über Wasserstoffbindung zwischen Watson-Crick-Basenpaaren auf den jeweiligen Strängen bilden kann. Adenin (A) komplementiert gewöhnlich mit Thymin (T) oder Uracil (U), während Guanin (G) gewöhnlich mit Cytosin (C) komplementiert.
    Stringenz: Begriff, verwendet um die Temperatur und Lösungsmittelzusammensetzung zu beschreiben, die während einer Hybridisierung und den anschließenden Verfahrensschritten vorliegen. Unter hochstringenten Bedingungen werden sich nur hoch homologe Nukleinsäurehybride bilden; Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität werden sich nicht bilden. Demgemäß bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen das Ausmaß der zwischen zwei Nukleinsäuresträngen, die ein Hybrid bilden, benötigten Komplementarität. Die Stringenz wird gewählt, um den Stabilitätsunterschied zwischen dem Ziel und dem Nicht-Ziel zu maximieren.
    Sondenspezifität: Merkmal einer Sonde, das deren Fähigkeit beschreibt, zwischen Ziel- und Nicht-Ziel-Sequenzen zu unterscheiden. Sie ist abhängig von der Sequenz und den Assaybedingungen. Die Sondenspezifität kann absolut sein (d.h., die Sonde ist fähig, zwischen Zielorganismen und jeglichen Nicht-Zielorganismen zu unterscheiden), oder sie kann funktional sein (d.h. die Sonde ist fähig, zwischen dem Zielorgansimus und irgendwelchen anderen normalerweise in einer bestimmten Probe vorhandenen Organismen zu unterscheiden). Viele Sondensequenzen können entweder für breite oder enge Spezifität in Abhängigkeit von den Anwendungsbedingungen eingesetzt werden.
    variable Region: Nukleotidpolymer, das sich zwischen dem Zielorganismus und in einer Probe enthaltenen Nicht-Zielorganismen um mindestens eine Base unterscheidet.
    konservierte Region: Region, die nicht variabel ist.
    Sequenzdivergenz: Vorgang, durch den Nukleotidpolymere während der Evolution weniger ähnlich werden.
    Sequenzkonvergenz: Vorgang, durch den Nukleotidpolymere während der Evolution ähnlicher werden.
    Bakterien: Mitglieder der phylogenetischen Gruppe Eubacteria, welche als eines der drei Haupt-Reiche angesehen wird.
    Tm: Temperatur, bei der 50 % einer Sonde in Gegenwart eines Ziels von der hybridisierten in die nicht-hybridisierte Form umgewandelt werden.
    Wärmestabilität: Eine Bedingung der Hybridisierungsinkubation oder Trennungsinkubation, bei der sich stabile Sonde:Ziel-Hybride bilden werden, und bei der sich aufgrund ihrer Instabilität keine Sonde-Nichtziel-Hybride bilden können. Faktoren, die die Wärmestabilität beeinflußen, können die Sondenspezifität beeinflussen und müssen deshalb reguliert werden. Ob eine Sondensequenz nützlich ist, um nur einen spezifischen Organismustyp nachzuweisen, hängt in großem Maße von dem Wärmestabilitätsunterschied zwischen Sonde:Ziel-Hybriden ("P:T") und Sonde:Nicht-Ziel-Hybriden ("P:NT") ab. Beim Entwurf der Sonden sollte die Tm von P:T minus der Tm von P:NT so groß wie möglich sein.
  • Zusätzlich zu einem neuen Verfahren zum Auswählen von Sondensequenzen haben wir herausgefunden, daß es möglich ist, eine DNA-Sonde zu erzeugen, die komplementär zu einer bestimmten rRNA-Sequenz ist, welche aus einem einzelnen Zielmikroorganismus erhalten wird, und diese Sonde erfolgreich in einem nicht kreuzreagierenden Assay zum Nachweis dieses einzelnen Mikroorganismus, selbst in Gegenwart seiner bekannten, am nächsten verwandten taxonomischen oder phylogenetischen Nachbarn, zu verwenden. Mit der Ausnahme von Viren enthalten alle prokaryotischen Organismen rRNA-Moleküle, wobei 5S-rRNA, 16S-rRNA und ein größeres als 23S-rRNA bekanntes rRNA-Molekül eingeschlossen sind. Eukaryoten besitzen bekannterweise 5,0S-, 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA-Moleküle oder analoge Strukturen. (Der Begriff "16S-artig" bzw. "-ähnlich" wird manchmal verwendet, um die in der kleinen ribosomalen Untereinheit gefundene rRNA, einschließlich 18S- und 17S-rRNA, zu bezeichnen. Gleichermaßen wird der Begriff "23S-ähnliche" rRNA manchmal verwendet, um die in der großen ribosomalen Untereinheit gefundene rRNA zu bezeichnen. "5S-ähnliche" rRNA wird manchmal verwendet, um in der großen ribosomalen Untereinheit zu findende rRNA zu bezeichnen. 5,8S-rRNA ist äquivalent zum 5'-Ende der 23S-ähnlichen rRNA.) Diese rRNA-Moleküle enthalten Nukleotidsequenzen, die unter allen bislang untersuchten Organismen hoch konserviert sind. Es gibt bekannte Verfahren, die ermöglichen, einen bedeutenden Teil dieser rRNA-Sequenzen zu bestimmen. Zum Beispiel können komplementäre Oligonukleotid-Primer von etwa 20-30 Basen Länge an universell konservierte Regionen in gereinigter rRNA hybridisiert werden, welche spezifisch für die 5S-, 16S- oder 23S-Untereinheiten sind, und mit dem Enzym "Reverse Transkriptase" verlängert werden. Chemischer Abbau oder Didesoxynukleotid-terminierte Sequenzierungsreaktionen können verwendet werden, um die Nukleotidsequenz des verlängerten Produktes zu bestimmen; Lane, D.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6955-6959 (1985).
  • In unserer Erfindung wird der Vergleich einer oder mehrerer sequenzierter variabler rRNA-Regionen aus einem Zielorganismus zu einer oder mehreren variablen rRNA-Regionsequenzen aus einer nahe verwandten Bakterienart angewandt, um eine für die rRNA des Zielorganismus einzigartige Sequenz auszuwählen. rRNA ist als ein Sonden-Ziel gegenüber DNA aufgrund ihrer verhältnismäßig großen Häufigkeit und Stabilität in der Zelle und wegen ihrer phylogenetischen Konservierungsmuster zu bevorzugen.
  • Ungeachtet der hochkonservierten Natur von rRNA haben wir festgestellt, daß eine Anzahl von Regionen des rRNA-Moleküls, welche in der Sequenz variieren können, sogar zwischen nahe verwandten Arten variieren können und deshalb verwendet werden können, um zwischen derartigen Organismen zu unterscheiden. Die Unterschiede im rRNA-Molekül sind nicht zufällig über das gesamte Molekül verteilt, sondern sind vielmehr in spezifischen Regionen gehäuft. Das Ausmaß der Konservierung variiert ebenfalls, wodurch ein einzigartiges Muster der Konservierung über die ribosomalen RNA-Untereinheiten hinweg erzeugt wird. Der Grad der Variation und deren Verteilung können analysiert werden, um Zielstellen für diagnostische Sonden zu lokalisieren. Dieses Verfahren der Sondenwahl kann verwendet werden, um mehr als eine Sequenz auszuwählen, welche für die rRNA eines Zielorganismus einzigartig ist.
  • Wir haben variable Regionen durch Vergleichsanalyse von sowohl in der Literatur veröffentlichten rRNA-Sequenzen als auch von Sequenzen, die wir selbst unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt haben, identifiziert. Wir verwenden einen Computer von Sun MicrosystemsTM für die Vergleichsanalyse. Der Compiler ist zur gleichzeitigen Behandlung vieler Sequenzdaten fähig. Computer dieses Typs und Computerprogramme, welche für die hier beschriebenen Zwecke verwendet oder angepaßt werden können, sind im Handel erhältlich.
  • Im allgemeinen sind nur wenige Regionen zur Unterscheidung zwischen nahe verwandten Arten einer phylogenetisch konservierten Gattung verwendbar, zum Beispiel die Region 400-500 Basen vom 5'-Ende des 16S-rRNA-Moleküls. Eine Analyse von nah verwandten Organismen (6, 7 und 8) enthüllt die spezifischen Positionen (variable Regionen), welche zwischen nahe verwandten Organismen variieren. Diese variablen Regionen von rRNA-Molekülen sind die wahrscheinlichen Kandidaten für den Sondenentwurf.
  • Die 6, 7 und 8 zeigen die Variationen in 16S- und 23S-rRNAs zwischen zwei verschiedenen Bakterien bei sinkenden Ähnlichkeitsgraden zwischen ihnen. Eine nähere Analyse dieser Figuren enthüllt einige subtile Muster zwischen diesen nahe verwandten Organismen. In allen untersuchten Fällen haben wir eine ausreichende Variation zwischen dem Zielorganismus und dem in derselben Probe gefundenen nächsten phylogenetischen Verwandten beobachtet, um die Sonde von Interesse zu entwerfen. Darüber hinaus betrug in allen bislang untersuchten Fällen die prozentuale Ähnlichkeit zwischen dem Zielorganismus (oder -organismen) und den in der gleichen Probe gefundenen phylogenetisch nahesten verwandten Organismen zwischen 90 % und 99 %. Interessanterweise bestand genug Variation sogar zwischen den rRNAs von Neisseria gonorrhoeae und meningitidis (siehe Beispiel 21), um Sonden zu entwerfen – ungeachtet der Tatsache, daß DNA:DNA-Homologieuntersuchungen nahelegten, daß diese zwei Arten tatsächlich ein und dieselbe sein könnten.
  • Diese Figuren zeigen auch, daß die Unterschiede über die gesamten 16S- und 23S-rRNAs verteilt sind. Viele der Unterschiede häufen sich nichtsdestoweniger in einigen wenigen Regionen. Diese Stellen in der rRNA sind gute Kandidaten für den Sondenentwurf bei unseren vorliegenden Assaybedingungen. Wir bemerken ebenfalls, daß die Stellen dieser erhöhten Variationsdichten gewöhnlicherweise in den gleichen Regionen der 16S- und 23S-rRNA für vergleichbare prozentuale Ähnlichkeitswerte gelegen sind. Auf diese Weise haben wir beobachtet, daß bestimmte Regionen der 16S- und 23S-rRNA die wahrscheinlichsten Stellen sind, an denen eine signifikante Variation zwischen dem Zielorganismus und den in einer Probe gefundenen nähesten phylogenetischen Verwandten vorliegt. Wir haben speziespezifische Sonden beschrieben und beansprucht, welche in diesen Regionen signifikanter Variation zwischen dem Zielorganismus und dem in einer Probe gefundenen nächsten phylogenetischen Verwandten hybridisieren.
  • Die 9, 10 und 11 sind eine schematische Darstellung der Lage der hierin beschriebenen und beanspruchten Sonden. Da 16S- und 23S-RNAs, als Regel, keine längeren Duplikationssequenzen als etwa 6 Nukleotide Länge enthalten, sind durch diese Verfahren entworfene Sonden spezifisch für eine oder wenige Positionen auf der Zielnukleinsäure.
  • Die Sequenzevolution an jeder der variablen Regionen (überspannend zum Beispiel ein Minimum von 10 Nukleotiden) ist für den Großteil divergent, nicht konvergent. Somit können wir zuverlässig Sonden auf Grundlage einiger weniger rRNA-Sequenzen, die sich zwischen dem Zielorganismus und seinen phylogenetisch nächsten Verwandten unterscheiden, entwerfen. Biologische und strukturelle Forderungen an das rRNA-Molekül, die eine homologe Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur während der gesamten Evolution aufrechterhalten, und die Anwendung derartiger Anforderungen auf die Sondendiagnostik sind der Gegenstand gegenwärtiger Untersuchung. Je größer die evolutionäre Distanz zwischen Organismen, desto größer die Anzahl variabler Regionen, welche verwendet werden können, um die Organismen zu unterschieden.
  • Sobald die variablen Regionen identifiziert sind, werden die Sequenzen parallel übereinandergestellt bzw. aligniert, um Gebiete maximaler Homologie oder "Entsprechung" zu enthüllen. An diesem Punkt werden die Sequenzen untersucht, um potentielle Sondenregionen zu identifizieren. Zwei wichtige Ziele beim Entwurf einer Sonde bestehen darin, die Homologie zu den Zielsequenz(en) zu maximieren (empfohlen werden mehr als 90 % Homologie) und die Homologie zu Nicht-Zielsequenz(en) zu minimieren (empfohlen werden weniger als 90 % Nicht-Homologie zu Nicht-Zielen). Wir haben die nachfolgenden nützlichen Richtlinien zum Entwurf von Sonden mit den gewünschten Merkmalen identifiziert.
  • Erstens sollten Sonden so gelegen sein, daß die Stabilität des Sonde:Nicht-Ziel-Nukleinsäurehybrids minimiert wird. Dies kann durch Minimieren der Länge der perfekten Komplementarität zu Nicht-Zielorganismen, Vermeiden von G- und C-reichen Homologieregionen zu Nicht-Zielsequenzen, und durch Positionieren der Sonde, um so viele destabilisierende Fehlpaarungen wie möglich zu überspannen (zum Beispiel sind dG:rU-Basenpaare weniger destabilisierend als manche anderen), erreicht werden.
  • Zweitens sollte die Stabilität des Sonde:Ziel-Nukleinsäurehybrids maximiert werden. Dies kann durch Vermeiden langer A- und T-reicher Sequenzen, durch Terminieren der Hybride mit G:C-Basenpaaren und durch Entwerfen der Sonde mit einer angemessenen Tm erreicht werden. Die Anfangs- und Endpunkte der Sonde sollten so gewählt werden, daß die Länge und der %G und %C zu einer Tm führen, welche etwa 2-10°C höher ist als die Temperatur, bei der der letztliche Assay durchgeführt werden wird. Die Bedeutung und Auswirkung verschiedener Assaybedingungen wird hierin weiter erklärt werden. Drittens werden Regionen der rRNA, welche bekanntermaßen starke, für die Hybridisierung inhibitorische Strukturen bilden, weniger bevorzugt. Schließlich sollten Sonden mit ausgedehnter Selbst-Komplementarität vermieden werden.
  • In manchen Fällen kann es mehrere Sequenzen aus einer bestimmten Region geben, welche Sonden mit den gewünschten Hybridisierungsmerkmalen ergeben werden. In anderen Fällen kann eine Sequenz signifikant besser als eine andere sein, welche sich lediglich um eine einzelne Base unterscheidet.
  • Die folgende Tabelle zeigt wie, für eine Ausführungsform der Erfindung, die nützlich beim Nachweis einer Nukleinsäure in Gegenwart von nahe verwandten Nukleinsäuresequenzen ist, einzigartige Sequenzen ausgewählt werden können. In diesem Beispiel sind rRNA-Sequenzen für die Organismen A-E bestimmt worden und ihre Sequenzen, numerisch repräsentiert, werden wie gezeigt parallel übereinandergestellt: Es ist ersichtlich, daß die Sequenz 1 allen Organismen A-E gemeinsam ist. Die Sequenzen 2-6 werden nur in den Organismen A, B und C gefunden, während die Sequenzen 8, 9 und 10 für den Organismus A einzigartig sind. Deshalb würde eine zu den Sequenzen 8, 9 oder 10 komplementäre Sonde spezifisch an Organismus A hybridisieren.
    Beispielhaftes Muster der Sequenzbeziehungen zwischen verwandten Bakterien
    Organismus rRNA-Sequenz
    A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    B 1 2 3 4 5 6 7 11 12 13
    C 1 2 3 4 5 6 14 15 16 17
    D 1 18 19 20 21 22 23 24 25 26
    E 1 18 19 20 21 27 28 29 30 31
  • In Fällen, in denen die Variationsmuster eines Makromoleküls, zum Beispiel rRNA, bekannt sind, kann man sich auf spezifische Regionen als wahrscheinliche Kandidaten für den Sondenentwurf konzentrieren. Es ist jedoch nicht immer notwendig, die gesamte Nukleinsäuresequenz zu bestimmen, um eine Sondensequenz zu erhalten. Eine Verlängerung von einem beliebigen einzelnen Oligonukleotidprimer aus kann bis zu 300-400 Basen der Sequenz ergeben. Wenn ein einzelner Primer verwendet wird, um die Sequenz der rRNA des Zielorganismus und von zum Ziel nah verwandter Organismen teilweise zu sequenzieren, kann eine Übereinanderstellung, wie obenstehend angegeben, vorgenommen werden. Wenn eine nützliche Sondensequenz gefunden ist, ist es offensichtlich nicht notwendig, die rRNA-Sequenzierung unter Verwendung anderer Primer fortzusetzen. Wenn andererseits aus der Sequenzierung mit einem ersten Primer keine nützliche Sondensequenz erhalten wird, oder wenn eine höhere Empfindlichkeit erwünscht ist, können andere Primer verwendet werden, um mehr Sequenzen zu erhalten. In jenen Fällen, in denen Variationsmuster für ein Molekül nicht gut verstanden werden, können mehr Sequenzdaten vor dem Sondenentwurf erforderlich sein.
  • So wurden in den nachstehenden Beispielen 1-3 zwei 16S-abgeleitete Primer verwendet. Der erste Primer ergab keine Sondensequenzen, welche die hierin aufgezählten Kriterien erfüllten. Der zweite Primer ergab Sondensequenzen, von welchen im Anschluß an Charakterisierung und Testen hinsichtlich der Spezifität wie beschrieben festgestellt wurde, nützlich zu sein. Im Beispiel 4 wurden sechs 23S-Primer vor der Lokalisierung der dargestellten Sondensequenz eingesetzt.
  • Sobald eine vermutliche einzigartige Sequenz identifiziert worden ist, wird ein komplementäres DNA-Oligonukleotid synthetisiert. Dieses einzelsträngige Oligonukleotid wird als die Sonde in der DNA/rRNA-Assay-Hybridisierungsreaktion dienen. Definierte Oligonukleotide können mittels jeglichem von mehreren gutbekannten Verfahren synthetisiert werden, einschließlich automatisierter chemischer Festphasen-Synthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramidit-Vorläufern; Barone, A.D. et al., Nucleic Acids Research 12, 4051-4060 (1984). Bei diesem Verfahren werden Desoxyoligonukleotide auf festen Polymerträgern synthetisiert. Die Freisetzung des Oligonukleotids von dem Träger wird durch 16 Stunden lange Behandlung mit Ammoniumhydroxid bei 60°C bewerkstelligt. Die Lösung wird getrocknet und das Rohprodukt wird in Wasser aufgelöst und auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt, welche im allgemeinen in Abhängigkeit von der Länge des Fragments von 10-20 % variieren können. Die Hauptbande, welche durch Ultraviolett-Hintergrundsbeleuchtung sichtbar gemacht wird, wird mit einer Rasierklinge aus dem Gel geschnitten und mit 0,1M Ammoniumacetat, pH 7,0, 8-12 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. Im Anschluß an eine Zentrifugation wird der Überstand durch einen 0,4 Mikron-Filter filtriert und auf einer P-10-Säule (Pharmacia) entsalzt. Natürlich können andere gut bekannte Verfahren zur Konstruktion synthetischer Oligonukleotide angewandt werden.
  • Derzeitige DNA-Synthesizer können große Mengen synthetischer DNA herstellen. Nach der Synthese wird die Größe der neu hergestellten DNA durch Gelfiltration untersucht, und im allgemeinen werden Moleküle variierender Größe nachgewiesen. Einige dieser Moleküle repräsentieren Synthese-Abbruchereignisse, welche während des Synthesevorgangs stattfinden. Als Teil der Aufreinigung nach der Synthese wird die synthetische DNA gewöhnlicherweise nach der Größe fraktioniert, und nur diejenigen Moleküle, die die richtige Länge aufweisen, werden beibehalten. Somit ist es möglich, eine Population synthetischer DNA-Moleküle von einheitlicher Größe zu erhalten.
  • Es ist jedoch im allgemeinen angenommen worden, daß synthetische DNA inhärent aus einer gleichförmigen Molekülpopulation, alle von derselben Größe und Basensequenz, zusammengesetzt ist, und daß die Hybridisierungsmerkmale jedes Moleküls in der Präparation gleich sein sollten. In Wirklichkeit sind die Präparationen synthetischer DNA-Moleküle heterogen und bestehen aus bedeutenden Zahlen von Molekülen, welche, obwohl von dergleichen Größe, auf irgendeine Weise voneinander verschieden sind und verschiedene Hybridisierungsmerkmale aufweisen. Selbst verschiedene Präparationen der gleichen Sequenz können manchmal unterschiedliche Hybridisierungsmerkmale besitzen.
  • Demgemäß können Präparationen der gleichen synthetischen Sondensequenz verschiedene Hybridisierungsmerkmale aufweisen. Deswegen kann die Spezifität von Sondenmolekülen aus verschiedenen Präparationen unterschiedlich sein. Die Hybridisierungsmerkmale jeder Präparation sollten untersucht werden, um die Hybridisierungsbedingungen zu bestimmen, welche verwendet werden müssen, um die gewünschte Sondenspezifität zu erhalten. Zum Beispiel besitzt die im nachstehenden Beispiel 4 beschriebene synthetische Sonde das in der Tabelle 14 beschriebene Spezifitätsprofil. Diese Daten wurden unter Verwendung der beschriebenen Hybridisierungs- und Assaybedingungen erhalten. Eine separate Präparation dieser Sonde, welche unterschiedliche Hybridisierungsmerkmale besitzt, kann nicht genau dasselbe Spezifitätsprofil besitzen, wenn unter den im Beispiel 4 angegebenen Bedingungen geassayt wird. Solche Sondenpräparationen wurden hergestellt. Um die gewünschte Spezifität zu erhalten, können diese Sonden unter unterschiedlichen Bedingungen, einschließlich Salzkonzentration und/oder Temperatur, hybridisiert und geassayt werden. Die tatsächlichen Bedingungen, unter denen die Sonde eingesetzt werden soll, müssen für jede Sondencharge bestimmt, oder an noch bestehende Anforderungen angepaßt werden, da das Gebiet der DNA-Synthese etwas unperfekt ist.
  • Im Anschluß an die Synthese und Reinigung einer bestimmten Oligonukleotidsequenz können mehrere Verfahren angewandt werden, um die Annehmbarkeit des Endprodukts zu bestimmen. Das erste ist die Polyacrylamidgelelektrophorese, die zur Bestimmung der Größe verwendet wird. Das Oligonukleotid wird, zum Beispiel, unter Verwendung von 32P-ATP und T4-Polynucleotidkinase markiert. Die markierte Sonde wird in Ethanol gefällt, zentrifugiert, und das getrocknete Pellet wird in Auftragspuffer (80 % Formamid, 20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1 % Bromphenolblau und 0,1 % Xylencyanol) resuspendiert. Die Proben werden 5 Minuten lang bei 90°C erwärmt und auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Elektrophorese wird 1-2 Stunden lang bei 1000 Volt in TBE-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,08 M Borsäure, 0,002 M EDTA) durchgeführt. Im Anschluß an die Elektrophorese des Oligonukleotids wird das Gel auf Röntgenfilm exponiert. Die Größe des Oligonukleotids wird dann aus der Migration von gleichzeitig pherographierten bzw. laufen gelassenen Oligonukleotidstandards berechnet.
  • Die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids kann auch durch Markieren desselben am 5'-Ende mit 32P-ATP und T4-Polynucleotidkinase, Unterziehen desselben unter chemische Standard-Abbautechniken, Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1980), und Analysieren der Produkte auf Polyacrylamidgelen überprüft werden. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz der Sonde vollständig komplementär zu der zuvor identifizierten einzigartigen rRNA-Sequenz, obwohl dies nicht der Fall sein muß.
  • Das Schmelzprofil, einschließlich der Schmelztemperatur (Tm) der Oligonukleotid/rRNA-Hybride, sollte ebenfalls ermittelt werden. Ein Weg zur Bestimmung der Tm besteht darin, ein 32P-markiertes Oligonukleotid bei 50°C in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,8, an seine komplementäre Ziel-Nukleinsäure zu hybridisieren. Die Hybridisierungsmischung wird verdünnt und über eine 2 cm große Hydroxyapatit-Säule bei 50°C gegeben. Die Säule wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, 0,02 % SDS, gewaschen, um alle nicht-hybridisierten, einzelsträngigen Sonden zu eluieren. Die Säulentemperatur wird dann 15°C gesenkt und in 5°C-Erhöhungsschritten angehoben, bis die gesamte Sonde (einzelsträngig) eluiert ist. Bei jeder Temperatur wird nicht-hybridisierte Sonde eluiert und die Impulse bzw. Zähleinheiten pro Minute (cpm) in jeder Fraktion werden bestimmt. Die cpm- Zahl, von der gezeigt wurde, daß sie an dem Hydroxyapatit gebunden war, geteilt durch die auf die Säule gegebenen Gesamt-cpm, ist gleich dem Prozentsatz der Hybridisierung der Sonde an die Zielnukleinsäure.
  • Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung der Wärmestabilität eines Hybrids wird nachstehend dargestellt. Ein Aliquot von Hybrid-Nukleinsäure wird entweder in 1 ml 0,12 M Phosphatpuffer, 0,2 % SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, oder einem geeigneten Hybridisierungspuffer verdünnt. Die 1 ml große Lösung wird 5 Minuten lang auf 45°C erwärmt und 5 Minuten lang in ein Wasserbad bei Raumtemperatur gebracht, um abzukühlen. Diese 1 ml große Hybrid-enthaltende Lösung wird über eine Hydroxyapatitsäule geassayt, wodurch das Hybrid zurückgehalten und ungebundene Sonde ausgewaschen wird. Wenn eine andere Hybridisierungslösung als der 0,12 M Phosphatpuffer verwendet wird, dann wird eine Verdünnung der Hybridisierungslösung in den 0,12 M Phosphatpuffer-Cocktail hinein für die Bindung notwendig sein. Es wird damit fortgefahren, Aliquots des vorher gebildeten Hybrides zu entnehmen und in 1 ml Hybridisierungslösung oder in der obenstehend beschriebenen 0,12 M Phosphatpuffer-Standardlösung zu verdünnen, während die Erwärmungstemperatur um jeweils 5°C erhöht wird. Damit wird fortgefahren, bis das gesamte Hybrid dissoziiert ist. Der Punkt an dem die Hälfte des Hybrids in die dissoziierte Form umgewandelt wird, wird als die Tm betrachtet. Die Tm für ein gegebenes Hybrid wird in Abhängigkeit von der verwendeten Hybridisierungslösung variieren, weil die Wärmestabilität von der Konzentration verschiedener Salze, Detergenzien und anderer gelöster Stoffe, welche die relative Hybridstabilität unter Wärmedenaturierungsbedingungen beeinflussen, abhängt.
  • Da das Ausmaß und die Spezifität von Hybridisierungsreaktionen, wie den hierin beschriebenen, von einer Anzahl von Faktoren beeinflußt wird, wird die Manipulation von einem oder mehreren dieser Faktoren die genaue Empfindlichkeit und Spezifität einer bestimmten Sonde festlegen, egal ob diese vollständig komplementär zu ihrem Ziel ist oder nicht. Zum Beispiel kann die Basenzusammensetzung der Sonde bedeutend sein, weil G-C-Basenpaare aufgrund einer zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindung eine größere Wärmestabilität im Vergleich zu A-T-Basenpaaren aufweisen. Somit wird eine Hybridisierung, welche komplementäre Nukleinsäuren eines höheren G-C-Gehalts beinhaltet, bei höheren Temperaturen stabil sein.
  • Wir haben herausgefunden, daß die Länge der Zielnukleinsäuresequenz und folglich die Länge der Sondensequenz ebenfalls wichtig sein können. Während es für Nukleinsäuren, welche nicht vollständig komplementär sind, möglich ist, zu hybridisieren, wird die längste Strecke von perfekt homologer Basensequenz normalerweise hauptsächlich die Hybridstabilität bestimmen. Während Oligonukleotidsonden von unterschiedlichen Längen und unterschiedlicher Basenzusammensetzung verwendet werden können, sind die in dieser Erfindung bevorzugten Oligonukleotidsonden zwischen etwa 15 und etwa 50 Basen lang und sind zu mindestens etwa 75-100 % homolog zu der Zielnukleinsäure. Für die meisten Anwendungen werden 95-100 % Homologie zu der Zielnukleinsäure bevorzugt.
  • Bei der Konstruktion einer Sonde sollten auch die Innenstärke und die Inkubationstemperatur berücksichtigt werden. Es ist bekannt, daß die Hybridisierungsrate bei einer Erhöhung der Innenstärke des Reaktionsgemischs steigen wird, und daß die Wärmestabilität von Hybriden mit zunehmender Innenstärke erhöht wird. Im allgemeinen findet eine optimale Hybridisierung für synthetische Oligonukleotidsonden von etwa 15-50 Basen Länge bei etwa 5°C unter der Schmelztemperatur für einen gegebenen Doppelstrang statt. Eine Inkubation bei Temperaturen unterhalb des Optimums kann ermöglichen, daß fehlgepaarte Basensequenzen hybridisieren, und kann deswegen zu einer verminderten Spezifität führen.
  • Was die Nukleinsäurekonzentration betrifft, ist es bekannt, daß die Hybridisierungsrate proportional zur Konzentration der zwei wechselwirkenden Nukleinsäurespezies ist. So nimmt man an, daß das Vorhandensein von Verbindungen, wie Dextran und Dextransulfat, die lokale Konzentration von Nukleinsäurespezies erhöht und dadurch zu einer erhöhten Hybridisierungsrate führt. Andere Mittel, welche zu erhöhten Hybridisierungsraten führen, sind in der EP-A-0 229 442 angegeben. Andererseits werden chemische Reagenzien, welche die Wasserstoffbrückenbindungen unterbrechen, wie Formamid, Harnstoff und Alkohole, die Stringenz der Hybridisierung erhöhen.
  • Ausgewählte Oligonukleotidsonden können durch irgendeines von mehreren gut bekannten Verfahren markiert werden. Nützliche Markierungen schließen Radioisotope als auch nichtradioaktive Reportergruppen ein. Isotopen-Markierungen schließen 3H, 35S, 32P, 125I, Cobalt und 14C ein. Die meisten Isotopenmarkierungsverfahren beinhalten die Anwendung von Enzymen und schließen bekannte Verfahren der Nick-Translation, Endmarkierung, Zweitstrang-Synthese und der reversen Transkription ein. Bei Verwendung radioaktiv markierter Sonden kann eine Hybridisierung mittels Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gamma-Zählung nachgewiesen werden. Das gewählte Nachweisverfahren wird von den Hybridisierungsbedingungen und dem besonderen für die Markierung eingesetzten Radioisotop abhängen.
  • Auch Nicht-Isotopen-Materialien können für die Markierung verwendet werden und können durch den Einbau modifizierter Nukleotide über die Verwendung von Enzymen oder durch chemische Modifikation der Sonde, zum Beispiel durch Anwendung von Nicht-Nukleotid-Linkergruppen, eingeführt werden. Nicht-Isotopen-Markierungen schließen fluoreszente Moleküle, chemolumineszente Moleküle, Enzyme, Cofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden ein. Wir bevorzugen derzeit die Verwendung von Acridiniumestern.
  • In einer Ausführungsform der DNA/rRNA-Hybridisierungsassay-Erfindung werden eine markierte Probe und bakterielle Zielnukleinsäuren in Lösung kontaktiert. rRNA kann aus Bakterienzellen mittels eines Ultraschall-Aufbruchverfahrens freigesetzt werden. Andere bekannte Verfahren zum Aufbrechen von Zellen schließen die Verwendung von Enzymen, einem osmotischen Schock, chemische Behandlung und Vortexen mit Glasperlen ein. Im Anschluß oder gleichzeitig mit der Freisetzung von rRNA kann markierte Sonde in Gegenwart von beschleunigenden Mitteln zugesetzt und bei der optimalen Hybridisierungstemperatur während einer Zeitdauer, die notwendig zur Erreichung einer signifikanten Hybridisierung ist, inkubiert werden. Im Anschluß an diese Inkubationsdauer kann dem Reaktionsgemisch Hydroxyapatit zugesetzt werden, um die Sonde/rRNA-Hybride von den nicht-hybridisierten Sondenmolekülen zu trennen. Das Hydroxyapatit-Pellet wird gewaschen, erneut zentrifugiert, und die Hybride werden durch der verwendeten Markierung gemäße Methoden nachgewiesen.
  • Nachstehend werden 21 Ausführungsformen, welche die beanspruchten Erfindungen veranschaulichen, dargestellt, in denen eine synthetische, zu einer einzigartigen rRNA-Sequenz aus einem Zielorganismus oder -organismengruppe komplementäre Sonde oder Sonden bestimmt, konstruiert und in einem Hybridisierungsassay verwendet werden.
  • Beschreibung der besonderen Ausführungsformen
  • Mycobakterien sind säurebeständige, alkoholbeständige, aerobe nicht-bewegliche Bacilli bzw. Stäbchen. Ihr Lipidgehalt ist hoch und ihr Wachstum ist langsam. Mycobacterium avium und Mycobacterium intracellulare werden zusammen als M.avium-intracellulare bezeichnet, weil sie so schwierig zu unterscheiden sind. Kürzlich wurde gezeigt, daß der M. avium-Komplex, welcher M. intracellulare einschließt, das zweithäufigst isolierte, klinisch bedeutsame Mycobacterium ist; Good, R.C. et al., J. Infect. Dis. 146, 829-833 (1982). Neuere Beweise zeigen, daß diese Organismen eine häufige Ursache opportunistischer Infektionen bei Patienten mit AIDS ("acquired immune deficiency syndrome", erworbenes Immunschwächesyndrom) sind; Gill, V.J. et al., J. Clin. Microbio. 22, 543-546 (1985). Die Behandlung derartiger Infektionen in AIDS-Patienten ist schwierig, weil diese Organismen gegenüber den meisten Antituberculose-Arzneimitteln resistent sind. Oftmals wird eine Kombination von fünf Arzneimitteln in der Therapie angewandt. Die Schwere dieser Infektionen macht ebenfalls eine rasche Diagnose erforderlich, welche, vor der hierin beschriebenen Erfindung, nicht verfügbar war.
  • Mitglieder des Mycobacterium tuberculosis-Komplex (Mtb) schließen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum und Mycobacterium microti ein. Die ersten drei sind für Menschen pathogen, während das letzte ein Tierpathogen ist. Diese Organismen erzeugen sich langsam entwickelnde Granulome auf der Haut oder sie können in innere Organe eindringen. Eine Lungentuberkulose kann auf andere Teile des Körpers durch das Kreislaufsystem, das Lymphsystem oder den Intestinaltrakt übertragen werden. Trotz Fortschritten des öffentlichen Gesundheitswesens und dem Aufkommen effektiver Chemotherapie, repräsentiert die Erkrankung an Mycobakterien, insbesondere die Tuberkulose, fortwährend ein weltweites Hauptgesundheitsproblem.
  • Das klassische Verfahren zum Nachweis von Bakterien in einer Testprobe beinhaltet das Kultivieren der Probe, um die Anzahl von vorhandenen Bakterienzellen zu einem beobachtbaren Koloniewachstum zu vergrößern, welches identifiziert und ausgezählt werden kann. Falls gewünscht, können die Kulturen auch weiteren Tests unterzogen werden, um die Empfänglichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln zu bestimmen. Derzeitig sind die weitest verbreitet angewandten Verfahren zum Nachweis, zur Isolierung und Identifizierung von Mycobacterium-Arten der Ausstrich von säurebeständigen Bacilli bzw. Acid-Fast-Bacilli(AFB)-Smear (entweder unter Verwendung der Ziehl-Neelsen- oder Fluorochrom-Techniken), Kultivierungsverfahren unter Verwendung von Lowenstein-Jensen-Medien und Middlebrook-Medien, und biochemische Tests. Der AFB beruht auf dem hohen Lipidgehalt von Mycobacterium, um einen Farbstoff nach Exposition an Säure-Alkohol zurückzuhalten. Während der AFB-Ausstrich-Test verhältnismäßig schnell und einfach durchzuführen ist, weist er nicht immer Mycobacteria nach und wird nicht zwischen Mycobacterium avium und Nicht-Tuberkulose-Arten, zwischen Mycobacterium intracellulare und Nicht-Tuberkulose-Arten, oder zwischen Bacilli des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Nicht-Tuberkulose-Arten unterscheiden. Für eine genaue Identifizierung der infizierenden Mycobacterium-Art muß sich der Arzt auf Kultivierungsergebnisse verlassen, welche etwa 3 bis 8 Wochen Wachstum, gefolgt von umfassenden biochemischen Tests, erfordern können. Es sind andere Tests auf Grundlage des Nachweises von Stoffwechselprodukten aus Mycobacterium unter Verwendung von mit Kohlenstoff-14 markierten Substraten entwickelt worden. Insbesondere kann das Bactec(TM)-Instrument das Vorhandensein von Mycobacterium innerhalb von 6 bis 10 Tagen nach der Zeit des Animpfens nachweisen; Gill, V.J., siehe oben. Der Test unterscheidet allerdings nicht zwischen Mycobacterium-Arten. Es ist oftmals wichtig, diese Feststellung vorzunehmen, so daß besondere Arzneimittel, gegen die der Organismus anfällig ist, verschrieben werden können. Für herkömmliche Kulturverfahren erfordert dies zusätzlich 2 bis 3 Wochen und für das Bactec-Verfahren zusätzlich 6 bis 10 Tage.
  • Im weiteren werden spezifische Ausführungsformen für Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter, Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, E. coli, Pseudomonas-Gruppe I, Bakterien, Pilze und Neisseria gonorrhoeae in den nachstehenden Beispielen dargestellt.
  • Wie durch die nachstehenden Beispiele gezeigt, besitzt die vorliegende Erfindung bedeutende Vorteile gegenüber jedem dieser Verfahren nach dem Stand der Technik nicht nur hinsichtlich der gesteigerten Genauigkeit, Spezifität und Einfachheit des Testes, sondern auch hinsichtlich der großen Zeitersparnis, um eine Diagnose zu erreichen. Die Erfindung macht eine definitive Diagnose und die Einleitung einer wirksamen Behandlung am gleichen Tag, an dem der Test erfolgt, möglich.
  • Beispiel 1
  • Nachstehend beschrieben wird die Herstellung eines einzelsträngigen Desoxyoligonukleotids von einzigartiger Sequenz und definierter Länge, welches markiert und als eine Sonde in einem Lösungs-Hybridisierungsassay verwendet wird, um die Gegenwart von rRNA aus Mycobacterium avium nachzuweisen. Diese einzigartige Sequenz ist für die rRNA von Mycobacterium avium spezifisch und geht unter den Hybridisierungsbedingungen dieses Beispiels keine signifikante Kreuzreaktion mit Nukleinsäuren aus irgendeiner anderen Bakterienart oder aus einem respiratorisch infektiösen Agent, einschließlich dem nahe verwandten Mycobacterium intracellulare, ein. Diese Sonde ist fähig, die zwei Arten zu unterscheiden, ungeachtet einer etwa 98%igen rRNA-Näherungshomologie zwischen den beiden Arten. In diesem Beispiel, als auch in den Beispielen 2 und 3, wurden Sequenzen für M. avium, den M. tuberculosis-Komplex, M. intracellulare und verwandte Organismen erhalten, indem ein spezifischer Primer gegen eine hochkonservierte Region in der 16S-rRNA verwendet wurde. Die Sequenz dieses Primers, abgeleitet aus E. coli-rRNA, war 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'. 5 Nanogramm Primer wurden mit 1 Mikrogramm jeder zu sequenzierenden rRNA in Gegenwart von 0,1 M KCl und 20 mM Tris-HCl, pH 8,3, in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern vermischt. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 45°C erwärmt und dann auf Eis gebracht. 2,5 Mikroliter 3 5S-dATP und 0,5 Mikroliter reverse Transkriptase wurden zugegeben. Die Probe wurde in 4 Röhrchen aliquotiert, wobei jedes Röhrchen entweder Didesoxy-A, -G, -T, oder -C enthielt. Die Konzentrationen dieser Nukleotide sind in Lane et al., siehe oben, dargestellt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 40°C inkubiert und wurden dann in Ethanol gefallt, zentrifugiert, und die Pellets wurden bis zur Trockenheit lyophilisiert. Die Pellets wurden in 10 Mikrolitern Formamid-Farbstoffen (100 % Formamid, 0,1 % Bromphenolblau und 0,1 % Xylencyanol) resuspendiert, und auf 80 cm große 8%ige Polyacrylamidgele aufgetragen. Die Gele wurden 2-4 Stunden lang bei 2000 Volt laufen gelassen.
  • So wurden die Nukleotidsequenzen für die 16S-rRNA von Mycobacterium avium und für jene, welche als dessen nächste phylogenetische Nachbarn angesehen wurden, Mycobacterium intracellulare und Mycobacterium tuberculosis, durch das Verfahren von Lane, D.J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:6955 (1985), bestimmt. Zusätzlich zur Bestimmung der rRNA-Sequenzen für die obenstehend angegebenen Organismen wurde auch ein klinisch bedeutsames Mycobacterium-Spektrum sequenziert. Dieses schloß M. fortuitum, M. scrofulaceum und M. chelonae ein. Ausgewählte Vertreter mehrerer nahe zu Mycobacterium verwandter Gattungen wurden ebenfalls sequenziert, einschließlich Rhodococcus bronchialis, Corynebacterium xerosis und Norcardia asteroides.
  • Partielle rRNA-Sequenzen aus den obenstehenden Organismen wurden hinsichtlich der maximalen Nukleotidhomologie übereinandergestellt, wobei im Handel erhältliche Software von Intelligenetics, Inc., 1975 El Camino Real West, Mountain View, California 94040-2216 (IFIND-Programm) eingesetzt wurde. Aus diesem Alignment bzw. dieser Übereinanderstellung wurden für Mycobacterium avium einzigartige Sequenzregionen bestimmt. Die Sonde wurde so ausgewählt, daß sie perfekt komplementär zu einer Zielnukleinsäuresequenz war, und daß sie eine 10%ige oder größere Fehlpaarung mit der alignierten rRNA aus ihrem bekannten nächsten phylogenetischen Nachbarn aufwies. Es wurde eine Sequenz von 38 Basen Länge gewählt. Die Anzahl fehlgepaarter Basen im Verhältnis zur Mycobacterium avium-Sequenz waren die folgenden: Mycobacterium tuberculosis (8); Mycobacterium intracellulare (5); Mycobacterium scrofulaceum (6); Mycobacterium chelonae (12); und Mycobacterium fortuitum (10).
  • Die folgende cDNA-Sequenz wurde mittels der Kriterien Länge, Tm und Sequenzanalyse wie obenstehend, vor der Tabelle mit der Überschrift 'Beispielhafte Muster der Sequenzbeziehungen zwischen verwandten Bakterien" beschrieben, charakterisiert und es wurde festgestellt, daß sie für die rRNA von Mycobacterium avium spezifisch ist:
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG.
  • Diese Sequenz ist komplementär zu einem, in der 16S-rRNA von Mycobacterium avium gefundenen, einzigartigen Segment. Die Größe der Sonde beläuft sich auf 38 Basen. Die Sonde besitzt eine Tm von 74°C und die Sequenzanalyse mittels des Verfahrens von Maxam & Gilbert (1980), siehe oben, bestätigte, daß die Sonde korrekt synthetisiert wurde. Die Sonde ist fähig, an rRNA von M. avium in der den Basen 185-225 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren.
  • Um die Reaktivität dieser Sequenz für Mycobacterium avium zu verdeutlichen, wurde sie als Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonden wurden mit 1 Mikrogramm (7 × 10–13 Mol) gereinigter rRNA aus Mycobacterium avium vermischt und in 0,12 M PB-Hybridisierungspuffer (äquimolare Mengen von Na2HPO4 und NaH2PO4), 1 mM EDTA und 0,02 % SDS (Natriumdodecylsulfat) 60 Minuten lang bei 65°C in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern umgesetzt. In getrennten Röhrchen wurde die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer sowohl mit als auch ohne vorhandenes Ziel vermischt. Im Anschluß an eine Abtrennung auf Hydroxyapatit, wie in den auf Seite 2, siehe oben, angegebenen Patenten dargestellt, wurden die Hybride durch Szintillationszählung quantifiziert. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt, wobei gezeigt wird, daß die Sonde ein hohes Ausmaß der Reaktion an das homologe Ziel und eine sehr geringe nicht-spezifische Bindung an das Hydroxyapatit aufweist.
    Tabelle 1 Hybridisierung der M. avium-Sonde an homologe Ziel-rRNA*
    M. avium-Sonde plus rRNA / 85-95 % minus rRNA / 0,5 %
    *% Hybrdisierung = an Hydroxyapatit gebundene cpm / der Reaktion zugesetzte Gesamt-cpm
  • Die Spezifität der Sonde für M. avium wurde durch Vermischen der 32P-markierten Sonde mit rRNA getestet, welche aus Zellen von 29 anderen Arten von Mycobakterien durch Ultraschall-Aufbruchtechniken freigesetzt wurde. 1 × 108 Zellen wurden in 0,1 ml 5% SDS suspendiert und 10 Minuten lang bei 50-60°C ultraschallbehandelt. Es wurden 1,0 ml Hybridisierungspuffer (45% Natriumdiisobutylsulfosuccinat, 40 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, und 1 mM EDTA) zugegeben und die Mischung wurde 60 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 4,0 ml Hydroxyapatitlösung (0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 0,02 % SDS und 1,0 Gramm Hydroxyapatit pro 50 ml Lösung) zugegeben und 5 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. 4,0 ml Waschlösung (0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8) wurden zugegeben und die Probe wurde gevortext, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die an das Hydroxyapatit gebundene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt und machen deutlich, daß die Sonde spezifisch für Mycobacterium avium ist und nicht mit irgendeiner anderen Mycobakterienart, einschließlich Mycobacterium intracellulare, reagiert.
    Tabelle 2 Hybridisierung der M. avium-Sonde an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 1,0
    M. asiaticum 25276 1,2
    M. avium 25291 87,6
    M. bovis 19210 1,2
    M. bovis (BCG) 19015 1,0
    M. chelonae 14472 0,9
    M. flavescens 14474 0,9
    M. fortuitum 6841 1,0
    M. gastri 15754 1,2
    M. gordonae 14470 1,2
    M. haemophilum 29548 1,3
    M. intracellulare 13950 1,5
    M. kansasii 12478 1,2
    M. malmoense 29571 1,2
    M. marinum 827 1,2
    M. nonchromogenicum 1930 1,1
    M. phlei 11758 1,3
    M. scrofulaceum 19981 1,2
    M. shimoidei 27962 2,3
    M. simiae 25275 1,2
    M. smegmatis e14468 1,0
    M. szulgai 23069 1,0
    M. terrae 15755 1,2
    M. thermoresistibile 19527 1,3
    M. triviale 23292 1,2
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 1,4
    M. tuberculosis (virulent) 27294 1,1
    M. ulcerans 19423 1,4
    M. vaccae 15483 1,2
    M. xenopi 19971 1,5
  • Wie in der Tabelle 3 gezeigt, reagierte die Sonde auch nicht mit der rRNA aus irgendeinem der Atemwegspathogene, die ebenfalls mittels des eben beschriebenen Verfahrens getestet wurden. Genauso wenig reagierte die Sonde mit irgendeiner anderen nahe verwandten oder phylogenetisch weiter entfernten Bakterienart, die auch durch dieses Verfahren getestet wurde (Tabelle 4).
  • Tabelle 3 Hybridisierung der M. avium-Sonde an Atemwegspathogene
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 0,7
    Fusobacterium nucleatum 25586 1,3
    Haemophilum influenzae 19418 1,3
    Klebsiella pneumoniae 23357 1,8
    Legionella pneumophila 33152 0,0
    Mycoplasma pneumoniae 15531 3,0
    Neisseria meningitidis 13090 0,0
    Pseudomonas aeruginosa 25330 0,0
    Propionibacterium acnes 6919 1,1
    Streptococcus pneumoniae 6306 0,0
    Staphylococcus aureus 25923 1,5
    Tabelle 4 Hybridisierung der M. avium-Sonde an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,0
    Branhamella catarrhalis 25238 0,6
    Bacillus subtilis 6051 0,9
    Bacteroides fragilis 23745 1,0
    Campylobacter jejuni 33560 0,4
    Chromobacterium violaceum 29094 1,7
    Clostridium perfringens 13124 2,1
    Deinococcus radiodurans 35073 0,8
    Derxia gumiosa 15994 0,3
    Enterobacter aerogenes 13048 0,6
    Escherichia coli 11775 0,3
    Mycobacterium gordonae 14470 1,9
    Mycoplasma hominis 14027 3,3
    Proteus mirabilis 29906 0,0
    Pseudomonas cepacia 11762 1,0
    Rahnella aquatilis 33071 2,1
    Rhodospirillum rubrum 11170 0,6
    Streptococcus mitis 9811 0,9
    Vibrio parahaemolyticus 17802 1,2
    Yersinia enterocolitica 9610 0,4
  • Beispiel 2
  • Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Alignment wurde die folgende Sequenz durch die vorstehend erwähnten Kriterien der Länge, Tm und Sequenzanalyse charakterisiert, und es wurde festgestellt, daß sie für Mycobacterium intracellulare spezifisch ist:
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG
  • Die Sequenz ist komplementär zu einem in der 16S-rRNA von Mycobacterium intracellulare gefundenen einzigartigen Segment. Die Größe der Sonde belief sich auf 38 Basen. Die Sonde besitzt eine Tm von 75°C, und die Sequenzanalyse bestätigte, daß die Sonde korrekt synthetisiert worden war. Die Sonde hybridisiert an RNA aus M. intracellulare in der den Basen 185-225 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region.
  • Um die Reaktivität dieser Sequenz für die rRNA von Mycobacterium intracellulare aufzuzeigen, wurde die Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. Die 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit 1 Mikrogramm (7 × 10–13 Mol) gereinigter rRNA aus Mycobacterium intracellulare vermischt und in 0,12 M PB-Hybridisierungspuffer (äquimolare Mengen von Na2HPO4 und NaH2PO4), 1 mM EDTA und 0,2 % SDS (Natriumdodecylsulfat) 60 Minuten lang bei 65°C in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern umgesetzt. In getrennten Röhrchen wurde die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer sowohl mit als auch ohne vorhandene Mycobacterium intracellulare-Ziel-rRNA vermischt. Im Anschluß an eine, wie vorstehend dargestellte, Abtrennung auf Hydroxyapatit wurden die Hybride durch Szintillationszählung quantifiziert. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt.
    Tabelle 5 Hybridisierung der M. intracellulare-Sonde an homologe Ziel-rRNA*
    M. intracellulare-Sonde plus rRNA / 85-95 % minus rRNA / 0,5 %
    *%Hybridisierung = an Hydroxyapatit gebundene cpm / der Reaktion zugesetzte Gesamt-cpm
  • Diese Daten zeigen, daß die Sonde ein hohes Ausmaß der Reaktion an ihr homologes Ziel und eine sehr geringe nicht-spezifische Bindung an das Hydroxyapatit aufweist.
  • Die Spezifität der Mycobacterium intracellulare-Sonde wurde durch Vermischen der 32P-markierten Sonde mit rRNA getestet, welche aus Zellen von 29 anderen Arten von Mycobakterien durch Ultraschall-Aufbruchtechniken freigesetzt wurde. Alle Hybridisierungsassays wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Tabelle 6 zeigt, daß die Sonde spezifisch für Mycobacterium intracellulare ist und nicht mit irgendeiner anderen Mycobakterienart, einschließlich Mycobacterium avium, reagiert. Diese Ergebnisse sind angesichts der 98%igen rRNA-Homologie zu M. avium, der 98%igen Homologie zu M. kansasii, 98%igen Homologie zu M. asiaticum und 97%igen Homologie zu M. tuberculosis beeindruckend.
    Tabelle 6 Hybridisierung der M. intracellulare-Sonde an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 0,9
    M. asiaticum 25276 1,1
    M. avium 25291 1,3
    M. bovis 19210 1,1
    M. bovis (BCG) 19015 1,2
    M. chelonae 14472 1,0
    M. flavescens 14474 1,2
    M. fortuitum 6841 1,3
    M. gastri 15754 1,3
    M. gordonae 14470 1,3
    M. haemophilum 29548 0,9
    M. intracellulare 13950 78,8
    M. kansasii 12479 1,1
    M. malmoense 29571 1,0
    M. marinum 827 0,9
    M. nonchromogenicum 1930 1,0
    M. phlei 11758 1,1
    M. scrofulaceum 19981 1,0
    M. shimoidei 27962 1,3
    M. simiae 25275 1,1
    M. smegmatis e14468 1,3
    M. szulgai 23068 1,0
    M. terrae 15755 1,4
    M. thermoresistibile 19527 1,6
    M. triviale 23292 1,3
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 1,2
    M. tuberculosis (virulent) 27294 1,2
    M. ulcerans 19423 1,1
    M. vaccae 15483 1,0
    M. xenopi 19971 1,2
  • Wie in der Tabelle 7 gezeigt, reagierte die Sonde nicht mit der rRNA aus irgendeinem der Atemwegspathogene, die in dem Hybridisierungsassay getestet wurden. Genauso wenig reagierte die Sonde mit irgendeiner anderen nahe verwandten oder phylogenetisch weiter entfernten Bakterienart, die getestet wurde (Tabelle 8).
    Tabelle 7 Hybridisierung der M.intracellulare-Sonde an Atemwegspathogene
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 2,2
    Fusobacterium nucleatum 25586 1,5
    Haemophilum influenzae 19418 1,3
    Klebsiella pneumoniae 23357 1,2
    Legionella pneumophila 33152 1,2
    Mycoplasma pneumoniae 15531 3,2
    Neisseria meningitidis 13090 1,1
    Pseudomonas aeruginosa 25330 1,0
    Propionibacterium acnes 6919 2,9
    Streptococcus pneumoniae 6306 1,6
    Staphylococcus aureus 25923 1,3
    Tabelle 8 Hybridisierung der M. intracellulare-Sonde an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,5
    Branhamella catarrhalis 25238 1,8
    Bacillus subtilis 6051 1,7
    Bacteroides fragilis 23745 1,9
    Campylobacter jejuni 33560 1,9
    Chromobacterium violaceum 29094 1,4
    Clostridium perfringens 13124 2,1
    Deinococcus radiodurans 35073 2,1
    Derxia gummosa 15994 1,6
    Enterobacter aerogenes 13048 1,3
    Escherichia coli 11775 1,2
    Mycobacterium gordonae 14470 2,3
    Mycoplasma hominis 14027 2,6
    Proteus mirabilis 29906 1,2
    Pseudomonas cepacia 11762 1,7
    Rahnella aquatilis 33071 1,5
    Rhodospirillum rubrum 11170 1,4
    Streptococcus mitis 9811 1,4
    Vibrio parahaemolyticus 17802 2,5
    Yersinia enterocolitica 9610 1,1
  • Beispiel 3
  • Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Alignment wurde die folgende Sequenz durch die vorstehend erwähnten Kriterien der Größe, Sequenz und Tm charakterisiert, und es wurde festgestellt, daß sie spezifisch für den Mtb-(Mycobacterium tuberculosis)-Organismenkomplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, und Mycobacterium microti, ist:
    • 1. TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG.
  • Die Sequenz ist komplementär zu einem einzigartigen Segment, das in der 16S-rRNA der Mtb-Komplex-Bakterien gefunden wird. Die Größe der Sonde beläuft sich auf 35 Basen. Die Sonde besitzt eine Tm von 72°C, und die Sequenzanalyse bestätigte, daß die Sonde korrekt synthetisiert worden war. Sie ist in der Lage, in der den Basen 185-225 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren.
  • Um die Reaktivität dieser Sequenz für den Mtb-Komplex aufzuzeigen, wurde die Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurden mit 1 Mikrogramm (7 × 10–13 Mol) gereinigter rRNA aus Mycobacterium tuberculosis vermischt und 60 Minuten lang in 0,12 M PB-Hybridisierungspuffer (äquimolare Mengen von Na2HPO4 und NaH2PO4), 1 mM EDTA und 0,2 % SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 65°C in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern umgesetzt. In getrennten Röhrchen wurde die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer sowohl mit als auch ohne vorhandener Ziel-rRNA aus Mycobacterium tuberculosis vermischt. Im Anschluß an die Abtrennung auf Hydroxyapatit, wie vorstehend angegeben, wurden die Hybride durch Szintillationszählung quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 gezeigt.
    Tabelle 9 Hybridisierung der Mtb-Komplex-16S-rRNA-DNA-Sonde an homologe Ziel-rRNA*
    Mtb-Komplex-Sonde plus rRNA / 85-95 % minus rRNA / 0,5 %
    *%Hybridisierung = an Hydroxyapatit gebundene cpm / der Reaktion zugesetzte Gesamt-cpm
  • Diese Daten zeigen, daß die Sonde ein hohes Ausmaß der Reaktion zum homologen Ziel und eine sehr geringe nicht-spezifische Bindung an das Hydroxyapatit aufweist.
  • Die Spezifität der Sonde für den Mtb-Komplex wurde durch Vermischen der 32P-markierten Sonde mit rRNA getestet, welche aus Zellen der 4 MTB-Komplex-Bacilli und 25 anderen Mycobakterienarten durch Ultraschall-Aufbruchtechniken freigesetzt wurde. Alle Hybridisierungsassays wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Tabelle 10 zeigt, daß die Sonde spezifisch für Organismus innerhalb des Mtb-Komplex ist und nicht mit irgendeiner anderen Mycobakterienart reagiert.
    Tabelle 10 Hybridisierung der Mtb-Komplex-16S-rRNA-DNA-Sonde an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 68,1
    M. asiaticum 25276 3,4
    M. avium 25291 0,9
    M. bovis 19210 63,1
    M. chelonae 14472 1,1
    M. flavescens 14474 0,9
    M. fortuitum 6841 1,1
    M. gastri 15754 0,8
    M. gordonae 14470 1,1
    M. haemophilum 29548 0,8
    M. intracellulare 13950 1,1
    M. kansasii 12479 1,3
    M. malmoense 29571 0,9
    M. marinum 827 1,1
    M. nonchromogenicum 1930 1,1
    M. phlei 11758 1,3
    M. scrofulaceum 19981 1,1
    M. shimoidei 27962 1,0
    M. simiae 25275 1,2
    M. smegmatis e14468 0,9
    M. szulgai 23069 1,1
    M. terrae 15755 1,0
    M. thermoresistibile 19527 1,0
    M. triviale 23292 1,2
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 66,2
    M. tuberculosis (virulent) 27294 62,4
    M. ulcerans 19423 0,9
    M. vaccae 15483 0,8
    M. xenopi 19971 2,6
  • Wie in der Tabelle 11 gezeigt, reagierte die Sonde nicht mit der rRNA aus irgendeinem der Atemwegspathogene, die in dem Hybridisierungsassay getestet wurden. Ebenso wenig reagierte die Sonde mit irgendeiner anderen nahe verwandten oder phylogenetisch weiter entfernten Bakterienart, welche getestet wurde (Tabelle 12).
    Tabelle 11 Hybridisierung der Mtb-Komplex-16S-rRNA-DNA-Sonde an Atemwegspathogene
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 1,3
    Fusobacterium nucleatum 25586 1,0
    Haemophilum influenzae 19418 1,6
    Klebsiella pneumoniae 23357 1,2
    Legionella pneumophila 33152 1,4
    Mycoplasma pneumoniae 15531 1,1
    Neisseria meningitidis 13090 1,0
    Pseudomonas aeruginosa 25330 1,7
    Propionibacterium acnes 6919 1,2
    Streptococcus pneumoniae 25923 0,9
    Tabelle 12 Hybridisierung der Mtb-Komplex-16S-rRNA-DNA-Sonde an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,3
    Branhamella catarrhalis 25238 1,5
    Bacillus subtilis 6051 1,3
    Bacteroides fragilis 23745 1,3
    Campylobacter jejuni 33560 1,1
    Chromobacterium violaceum 29094 1,0
    Clostridium perfringens 13124 1,2
    Deinococcus radiodurans 35073 1,0
    Derxia gummosa 15994 1,0
    Enterobacter aerogenes 13048 1,0
    Escherichia coli 11775 1,0
    Mycobacterium gordonae 14470 1,3
    Mycoplasma hominis 14027 0,5
    Proteus mirabilis 29906 1,0
    Pseudomonas cepacia 11762 2,6
    Rahnella aquatilis 33071 1,9
    Rhodospirillum rubrum 11170 1,0
    Streptococcus mitis 9811 1,1
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0,9
    Yersinia enterocolitica 9610 1,1
  • Es wurden zwei Derivate der Sonde von Beispiel 3 (nachstehend mit der Numerierung 2-3) hergestellt und getestet:
    • 2. CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG
    • 3. ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC.
  • Alle drei Sonden besitzen ähnliche Tm's (72°C; 73,5°C; bzw. 72,3°C) und ähnliche Hybridisierungsmerkmale.
  • Die Hybridisierung an Organismen des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes belief sich auf 68-75 % und die nicht-spezifische Hybridisierung an Hydroxyapatit war geringer als 2 %. Die Ergebnisse von Hybridisierungsassay-Tests für diese Derivate sind nachstehend angegeben.
    Tabelle 13 Hybridisierung der Sondenderivat-Beispiele 3 und 2 an Mycobakterienarten
    Beispiel
    % Sonde 1 % Sonde 2 % Sonde 3
    Organismus ATCC-Nr. gebunden gebunden gebunden
    Mycobacterium africanum 25420 68,1 69,4 70,6
    M. asiaticum 25274 3,4 5,3 1,8
    M. avium 25291 0,9 1,6 1,4
    M. bovis 19210 63,1 75,3 74
    M. chelonae 14472 1,1 1,5 1,6
    M. flavescens 14474 0,9 2,7 1,4
    M. fortuitum 6841 1,1 3,6 1,5
    M. gastri 15754 0,8 3,6 1,7
    M. gordonae 14470 1,1 1,6 1,4
    M. haemophilum 29548 0,8 3,2 1,7
    M. intracellulare 13950 1,1 1,6 1,4
    M. kansasii 12478 1,3 2,1 2,0
    M. malmoense 29571 0,9 2,8 1,5
    M. marinum 827 1,1 2,1 1,5
    M. nonchromogenicum 1930 1,1 3,0 1,5
    M. phlei 11758 1,3 1,3 1,1
    M. scrofulaceum 19981 1,1 3,4 1,6
    M. shimoidei 27962 1,0 2,7 1,6
    M. simiae 25275 1,2 2,9 1,8
    M. smegmatis e14468 0,9 1,5 1,2
    M. szulgai 23069 1,1 3,6 1,1
    M. terrae 15755 1,0 3,7 2,0
    M. thermoresistibile 19527 1,0 1,6 1,3
    M. triviale 23292 1,2 1,6 2,0
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 66,2 75 68
    M. tuberculosis (virulent) 27294 62,4 74 75
    M. ulcerans 19423 0,9 1,7 3,0
    M. vaccae 15483 0,8 1,4 1,2
    M. xenopi 19971 2,6 1,4 1,2
  • Beispiel 4
  • Die für die 23S-rRNA des M. tubercolosis-Komplex spezifische Sonde wurde durch Anwendung eines Primers erhalten, der zu einer hochkonservierten Region der 23S-rRNA komplementär war. Die Sequenz dieses Primers, abgeleitet aus E. coli-rRNA, war 5'-AGG AAC CCT TGG GCT TTC GG-3'. Fünf Nanogramm dieses Primers wurden mit 1 Mikrogramm rRNA aus M. tuberculosis und anderen nahe verwandten Mycobakterien vermischt, und das Verfahren, wie für die Beispiele 1, 2 und 3 beschrieben, wurde befolgt. Nach parallelem Übereinanderstellen, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde festgestellt, daß die folgende Sequenz für den Mtb-Organismenkomplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis und Mycobacterium microti spezifisch war:
    TGCCCTACCCACACCCACCACAAGGTGATGT.
  • Die Sequenz ist komplementär zu einem einzigartigen Segment, das in der 23S-rRNA der Mtb-Komplex-Bakterien gefunden wird. Die Oligonukleotidsonde wurde wie zuvor beschrieben mittels der Kriterien Länge, Tm und Sequenzanalyse charakterisiert. Die Größe der Sonde beläuft sich auf 31 Basen. Die Sonde besitzt eine Tm von 72,5°C und die Sequenzanalyse bestätigte, daß die Sonde korrekt synthetisiert worden war. Sie ist fähig, in der den Basen 1155-1190 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren.
  • Um die Reaktivität dieser Sequenz für den Mtb-Komplex aufzuzeigen, wurde die Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonden wurden mit 1 Mikrogramm (7 × 10–13 Mol) gereinigter rRNA aus Mycobacterium tuberculosis vermischt und 60 Minuten lang in 0,12 M PB-Hybridisierungspuffer (äquimolare Mengen von Na2HPO4 und NaH2PO4), 1 mM EDTA und 0,2 % SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 65°C in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern umgesetzt. In getrennten Röhrchen wurde die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer sowohl mit als auch ohne vorhandene Ziel-rRNA aus Mycobacterium tuberculosis vermischt. Im Anschluß an die Abtrennung auf Hydroxyapatit, wie vorstehend angegeben, wurden die Hybride durch Szintillationszählung quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 14 gezeigt.
    Tabelle 14 Hybridisierung der Mtb-Komplex-23S-rRNA-DNA-Sonde an homologe Ziel-rRNA
    Mtb-Komplex-Sonde plus rRNA / 94 % minus rRNA / 1,2 %
  • Diese Daten zeigen, daß die Sonde ein hohes Ausmaß der Reaktion zum homologen Ziel und eine sehr geringe nicht-spezifische Bindung an das Hydroxyapatit aufweist.
  • Die Spezifität der Sonde für den Mtb-Komplex wurde durch Vermischen der 32P-markierten Sonde mit rRNA getestet, welche aus Zellen der vier Mtb-Komplex-Bacilli und 25 anderen Mycobakterienarten durch Ultraschall-Aufbruchtechniken freigesetzt wurde. Alle Hybridisierungsassays wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Tabelle 14 zeigt, daß die Sonde spezifisch für Organismen innerhalb des Mtb-Komplex ist und nicht mit irgendeiner anderen Mycobakterienart reagiert.
    Tabelle 15 Hybridisierung der Mtb-Komplex-23S-rRNA-DNA-Sonde an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 33,6
    M. asiaticum 25276 1,2
    M. avium 25291 1,0
    M. bovis 19210 32,0
    M. chelonae 14472 1,2
    M. flavescens 14474 1,2
    M. fortuitum 6841 1,3
    M. gastri 15754 1,1
    M. gordonae 14470 1,2
    M. haemophilum 29548 1,2
    M. intracellulare 13950 1,1
    M. kansasii 12479 1,3
    M. malmoense 29571 1,3
    M. marinum 827 1,2
    M. nonchromogenicum 1930 1,0
    M. phlei 11758 1,0
    M. scrofulaceum 19981 1,1
    M. shimoidei 27962 1,2
    M. simiae 25275 1,3
    M. smegmatis e14468 1,1
    M. szulgai 23069 1,1
    M. terrae 15755 1,0
    M. thermoresistibile 19527 1,2
    M. triviale 23292 1,0
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 33,7
    M. tuberculosis (virulent) 27294 38,1
    M. ulcerans 19423 1,3
    M. vaccae 15483 1,0
    M. xenopi 19971 1,3
  • Beispiel 5
  • Drei zusätzliche Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Sonden, Beispiel 5-7 hierin, wurden unter Verwendung zweier einzigartiger, zu 23S-rRNA komplementärer, Primer identifiziert. Die erste Sequenz ist die folgende: CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG
  • Die Sequenz von diesem Beispiel 5 wurde unter Einsatz eines 23S-Primers mit der Sequenz 5'-GGC CAT TAG ATC ACT CC-3' erhalten. Sie wurde charakterisiert und man zeigte, daß sie für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex, einschließlich Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum und Mycobacterium bovis, spezifisch ist. Diese Sequenz, aus 23S-rRNA, ist 31 Basen lang und weist eine Tm von 72°C auf. Diese Sonde ist dazu in der Lage, an RNA der zuvor erwähnten Organismen in der den Basen 540-575 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren.
  • Um die Reaktivität und Spezifität dieser Sonde für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex aufzuzeigen, wurde sie als Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit rRNA vermischt, welche aus Zellen von 30 Mycobakterienarten durch Ultraschall-Aufschlußtechniken freigesetzt wurde. 3 × 107 Zellen wurden in 0,1 ml 5 % SDS suspendiert und 15 Minuten lang bei 50-60°C ultraschallbehandelt. Bin ml Hybridisierungspuffer (45 % Diisobutylsulfosuccinat, 40 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) wurde zugegeben und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 72°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 4 ml 2 % (w/v) Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 0,02 % SDS, 0,02 % Natriumazid zugegeben und 5 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Vier ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 0,02 % SDS, 0,02 % Natriumazid) wurden zugegeben und die Probe wurde gevortext, zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die an das Hydroxyapatit gebundene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 16 gezeigt und deuten darauf hin, daß die Sonde für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex spezifisch ist.
    Tabelle 16 Hybridisierung der M. tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 5 an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 18,0
    M. asiaticum 25274 2,6
    M. avium 25291 3,4
    M. bovis 19210 21,7
    M. bovis (BCG) 35734 35,3
    M. chelonae 14472 3,8
    M. flavescens 14474 2,3
    M. fortuitum 6841 1,8
    M. gastri 15754 2,2
    M. gordonae 14470 2,8
    M. haemophilum 29548 2,8
    M. intracellulare 13950 2,1
    M. kansasii 12478 1,6
    M. malmoense 29571 2,3
    M. marinum 827 2,1
    M. nonchromogenicum 1930 2,3
    M. phlei 11758 2,1
    M. scrofulaceum 19981 2,2
    M. shimoidei 27962 1,9
    M. simiae 25275 2,2
    M. smegmatis e14468 2,0
    M. szulgai 23069 2,2
    M. terrae 15755 2,2
    M. thermoresistible 19527 2,2
    M. triviale 23292 2,0
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 26,4
    M. tuberculosis (virulent) 27294 36,6
    M. ulcerans 19423 2,5
    M. vaccae 15483 2,4
    M. xenopi 19971 2,8
  • Die Tabelle 16 zeigt, daß die Sonde ebenfalls nicht mit RNA aus irgendeinem der durch das eben beschriebene Verfahren getesteten nahe verwandten Organismen kreuzreagierte.
  • Tabelle 17 Hybridisierung der M. tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 5 an phylogenetisch nah verwandte Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Actinomadura madurae 19425 2,1
    Actinoplanes italicus 10049 3,1
    Arthrobacter oxidans 14358 2,1
    Brevibacterium linens e9172 1,9
    Corynebacterium xerosis 373 2,2
    Dermatophilus congolensis 14367 2,2
    Microbacterium lacticum 8180 2,1
    Nocardia asteroides 19247 2,0
    Nocardia brasiliensis 19296 2,2
    Nocardia otitidis-caviarum 14629 2,0
    Nocardioposis dassonvillei 23218 4,0
    Oerskovia turbata 33225 2,2
    Oerskovia xanthineolytica 27402 2,0
    Rhodococcus aichiensis 33611 1,9
    Rhodococcus aurantiacus 25938 2,0
    Rhodococcus bronchialis 25592 2,1
    Rhodococcus chubuensis 33609 2,3
    Rhodococcus equi 6939 2,4
    Rhodococcus obuensis 33610 2,2
    Rhodococcus sputi 29627 2,3
  • Beispiel 6
  • Die zweite Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Sonde wurde unter Verwendung eines 23S-Primers mit der Sequenz 5' CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3' erhalten. Ihre Sequenz ist:
    CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC
  • Diese Sequenz, aus 23S-rRNA, ist 38 Basen lang und hat eine Tm von 75°C. Sie hybridisiert in der den Basen 2195-2235 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region.
  • Wie die Komplex-Sonde in Beispiel 5, wurde diese Sequenz charakterisiert und es wurde gezeigt, daß sie für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex, einschließlich Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum und Mycobacterium bovis, spezifisch ist.
  • Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde aus diesem Beispiel 6 für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex aufzuzeigen, wurde sie als Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen, die für die Sonde in Beispiel 5 beschrieben wurden, getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 18 gezeigt und deuten darauf hin, daß die Sonde für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex spezifisch ist, mit der Ausnahme von Mycobacterium thermoresistibile, einem seltenen Isolat, das kein Pathogen beim Menschen ist.
    Tabelle 18 Hybridisierung der M. tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 6 an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 56,0
    M. asiaticum 25274 3,1
    M. avium 25291 2,6
    M. bovis 19210 48,0
    M. bovis (BCG) 35734 63,0
    M. chelonae 14472 2,8
    M. flavescens 14474 2,8
    M. fortuitum 6841 3,0
    M. gastri 15754 3,2
    M. gordonae 14470 3,0
    M. haemophilum 29548 3,0
    M. intracellulare 13950 3,6
    M. kansasii 12478 3,9
    M. malmoense 29571 2,9
    M. marinum 827 2,9
    M. nonchromogenicum 1930 4,8
    M. phlei 11758 2,9
    M. scrofulaceum 19981 2,6
    M. shimoidei 27962 3,6
    M. simiae 25275 3,3
    M. smegmatis e14468 3,0
    M. szulgai 23069 2,8
    M. terrae 15755 2,8
    M. thermoresistibile 19527 11,7
    M. triviale 23292 3,2
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 65,0
    M. tuberculosis (virulent) 27294 53,0
    M. ulcerans 19423 2,5
    M. vaccae 15483 2,8
    M. xenopi 19971 3,3
  • Die Tabelle 19 zeigt, daß die Sonde ebenfalls nicht mit RNA aus irgendeinem der mittels des eben beschriebenen Verfahrens getesteten phylogenetisch nahe verwandten Organismen kreuzreagierte.
    Tabelle 19 Hybridisierung der M. tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 6 an phylogenetischnah verwandte Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Actinomadura madurae 19425 1,3
    Actinoplanes italicus 10049 0,6
    Arthrobacter oxidans 14358 1,1
    Brevibacterium linens e9172 0,8
    Corynebacterium xerosis 373 1,0
    Dermatophilus congolensis 14367 0,6
    Microbacterium lacticum 8180 1,9
    Nocardia asteroides 19247 0,9
    Nocardia brasiliensis 19296 0,8
    Nocardia otitidis-caviarum 14629 1,5
    Nocardioposis dassonvillei 23218 0,5
    Oerskovia turbata 33225 0,3
    Oerskovia xanthineolytica 27402 0,8
    Rhodococcus aichiensis 33611 1,6
    Rhodococcus aurantiacus 25938 0,7
    Rhodococcus bronchialis 25592 1,5
    Rhodococcus chubuensis 33609 0,8
    Rhodococcus equi 6939 0,3
    Rhodococcus obuensis 33610 0,8
    Rhodococcus sputi 29627 1,4
  • Beispiel 7
  • Die folgende weitere Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Sonde ist ebenfalls unter Verwendung eines 23S-Primers mit derselben Sequenz wie der von Beispiel 6, nämlich 5'-CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3 identifiziert worden:
    AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC.
  • Diese Sequenz, aus 23S-rRNA ist 31 Basen lang und hat eine Tm von 71°C. Sie hybridisiert in der den Basen 2195-2235 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region. Wie es mit den Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Sonden der Beispiele 5 und 6 hierin der Fall ist, wurde diese Sequenz ebenfalls charakterisiert, und es wurde gezeigt, daß sie für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex, einschließlich Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum und Mycobacterium bovis, spezifisch ist.
  • Um die Reaktivität und Spezifität dieser Sonde für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex aufzuzeigen, wurde sie als Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den für die Sonde von Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen getestet. Die Tabelle 20 zeigt, daß die Sonde für den Mycobacterium tuberculosis-Organismenkomplex spezifisch ist.
    Tabelle 20 Hybridisierung der Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 7 an Mycobakterienarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Mycobacterium africanum 25420 43,0
    M. asiaticum 25274 0,6
    M. avium 25291 0,7
    M. bovis 19210 43,0
    M. bovis (BCG) 35734 46,0
    M. chelonae 14472 0,6
    M. flavescens 14474 0,6
    M. fortuitum 6841 0,5
    M. gastri 15754 0,9
    M. gordonae 14470 0,7
    M. haemophilum 29548 0,6
    M. intracellulare 13950 0,6
    M. kansasii 12478 0,9
    M. malmoense 29571 0,8
    M. marinum 827 0,7
    M. nonchromogenicum 1930 0,8
    M. phlei 11758 0,6
    M. scrofulaceum 19981 0,7
    M. shimoidei 27962 0,8
    M. simiae 25275 0,7
    M. smegmatis e14468 0,6
    M. szulgai 23069 0,6
    M. terrae 15755 0,7
    M. thermoresistibile 19527 0,9
    M. triviale 23292 0,7
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 40,0
    M. tuberculosis (virulent) 27294 50,0
    M. ulcerans 19423 0,7
    M. vaccae 15483 0,4
    M. xenopi 19971 0,6
  • Die Tabelle 21 zeigt, daß die Sonde ebenfalls nicht mit RNA aus irgendeinem der durch das eben beschriebene Verfahren getesteten nahe verwandten Organismen kreuzreagierte.
    Tabelle 21 Hybridisierung der M. tuberculosis-Komplex-Sonde von Beispiel 7 an phylogenetisch nah verwandte Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Actinomadura madurae 19425 1,0
    Actinoplanes italicus 10049 0,6
    Arthrobacter oxidans 14358 0,4
    Brevibacterium linens e9172 0,8
    Corynebacterium xerosis 373 0,6
    Dermatophilus congolensis 14367 0,8
    Microbacterium lacticum 8180 0,5
    Nocardia asteroides 19247 0,7
    Nocardia brasiliensis 19296 0,5
    Nocardia otitidis-caviarum 14629 0,6
    Nocardioposis dassonvillei 23218 0,6
    Oerskovia turbata 33225 0,8
    Oerskovia xanthineolytica 27402 0,6
    Rhodococcus aichiensis 33611 0,7
    Rhodococcus aurantiacus 25938 0,7
    Rhodococcus bronchialis 25592 0,6
    Rhodococcus chubuensis 33609 0,6
    Rhodococcus equi 6939 0,6
    Rhodococcus obuensis 33610 0,6
    Rhodococcus sputi 29627 0,9
  • Bemerkenswerterweise können überlappende Sonden eine identische Spezifität aufweisen. Es seien zum Beispiel die Sonden von Beispiel 6 und 7 verglichen:
    Bsp. 6 CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC
    Bsp. 7 AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC
  • Es können mehrere Sequenzen aus einer besonderen Region existieren, welche Sonden mit den gewünschten Hybridisierungsmerkmalen ergeben werden. In anderen Fällen kann eine Sondensequenz bedeutend besser als eine andere, sich durch eine einzelne Base unterscheidende Sonde sein. Je größer der Sequenzunterschied (% Fehlpaarung) zwischen einem Ziel- und Nicht-Zielorganismus ist, desto wahrscheinlicher ist es im allgemeinen, daß man in der Lage ist, die Sonde zu verändern ohne ihre Nützlichkeit für eine spezifische Anwendung zu beeinflussen. Dieses Phänomen wurde auch durch die abgewandelten Sonden im Beispiel 3 verdeutlicht.
  • Im Beispiel 7 wurden 5 Basen an das 5'-Ende der Sonde in Beispiel 6 angehängt und 12 Basen vom 3'-Ende entfernt. Die zwei Sonden besitzen im wesentlichen identische Hybridisierungsmerkmale.
  • Beispiel 8
  • Die Gattung Mycobacterium ist besonders schwierig von Nocardia, Corynebacterium und Rhodococcus zu unterscheiden. Diese Gattungen besitzen gemeinsame Antigene, Präzipitine und G & C-Werte. Ungeachtet der Tatsache, daß diese Organismen ebenfalls eine 92-94%ige rRNA-Homologie zu den obenstehend aufgelisteten Organismen aufweisen, haben wir Sonden entworfen, die alle Mitglieder der Gattung Mycobacterium nachweisen, ohne mit den verwandten Gattungen Kreuzreaktionen einzugehen.
  • Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Mycobacterium-Arten-Sonden wurden unter Verwendung eines zu 16S-rRNA komplementären Primers und eines zu 23S-rRNA komplementären Primers vier Sonden, die für Mitglieder der Gattung Mycobacterium spezifisch sind, identifiziert. Die Sequenz 1 wurde unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-3' erhalten. Die Sequenzen 2, 3 und 4 wurden unter Verwendung eines 23S-Primers mit der Sequenz 5'-GTG TCG GTT TTG GGT ACG-3' erhalten. Die Sequenz 1 ist dazu fähig, an RNA der Gattung Mycobacterium in der den Basen 1025-1060 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren. Die Sequenzen 2-4 hybridisieren in Regionen, welche in unserem Numerierungssystem (siehe 2) den folgenden Basen von E. coli-23S-rRNA entsprechen: 1440-1475; 1515-1555; 1570-1610 in unserem Numerierungssystem.
  • Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert, und man zeigte daß sie für die Gattung Mycobacterium spezifisch sind:
    • 1. CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG
    • 2. GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG
    • 3. CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC
    • 4. GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC
  • Die Sequenz 1, aus 16S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 73°C. Die Sequenz 2, aus 23S-rRNA, ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 75°C. Die Sequenz 3, aus 23S-rRNA, ist 35 Basen lang und hat eine Tm von 76°C. Die Sequenz 4, aus 23S-rRNA, ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 73°C.
  • Um die Reaktivität und Spezifität von Sonde 1 für Mitglieder der Gattung Mycobacterium aufzuzeigen, wurde sie als Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 125I-markierte Oligonukleotidsonden wurden mit rRNA vermischt, welche aus Zellen von 30 Mycobakterienarten durch Ultraschall-Aufschlußtechniken freigesetzt wurde. 3 × 107 Zellen wurden in 0,1 ml 5 % SDS suspendiert und 15 Minuten lang bei 50-60°C ultraschallbehandelt. Bin ml Hybridisierungspuffer (45 % Diisobutylsulfosuccinat, 40 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) wurde zugegeben und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 72°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 2 g/l Abtrennlösung (enthaltend 2,5 g/l kationische magnetische Mikrokügelchen, 0,17 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 7,5 % Triton X-100TM, 0,02 % Natriumazid) zugegeben und 5 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die an die Magnetteilchen gebundenen RNA:Sonde-Hybride wurden aufgefangen und der Überstand wurde entfernt. Ein ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 14 % Diisobutylsulfosuccinat, 5 % Triton X-100, 0,02 % Natriumazid) wurde zugegeben, die Teilchen wurden abgesammelt und der Überstand wurde entfernt. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Die an die magnetischen Teilchen gebundene Radioaktivität wurde in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 22 gezeigt und deuten darauf hin, daß die Sonden an Organismen der Gattung Mycobacterium hybridisieren und daß eine Kombination von Sonden alle Mitglieder der Gattung nachweisen wird. Die Tabelle 23 zeigt, daß die Sonden nicht mit anderen nahe verwandten Bakterien kreuzreagieren.
    Tabelle 22 Hybridisierung der Mycobacterium-Sonden 1-4 an Mycobakterienarten
    % Sonde % Sonde % Sonde % Sonde
    Organismus ATCC-Nr. 1 gebunden 2 gebunden 3 gebunden 4 gebunden
    Mycobacterium africanum 25420 41,5 14,7 17,9 26,7
    M. asiaticum 25274 31,8 20,2 7,9 0,1
    M. avium 25291 11,7 34,7 10,1 1,6
    M. bovis 19210 19,4 28,4 44,6 20,9
    M. bovis (BCG) 35734 30,0 35,5 17,8 5,6
    M. chelonae 14472 8,6 0,7 6,3 0,2
    M. flavescens 14474 29,8 17,7 2,3 0,9
    M. fortuitum 6841 34,7 2,2 4,8 0,2
    M. gastri 15754 27,6 65,1 9,6 22,3
    M. gordonae 14470 50,7 55,2 3,1 0,4
    M. haemophilum 29548 40,7 60,7 0,4 12,4
    M. intracellulare 13950 38,8 48,3 0,9 5,4
    M. kansasii 12478 53,4 27,3 24,5 27,8
    M. malmoense 29571 3,1 38,4 0,8 1,5
    M. marinum 827 41,7 4,1 4,8 0,1
    M. nonchromogenicum 1930 35,0 42,9 0,5 16,4
    M. phlei 11758 23,7 0,6 1,8 0,6
    M. scrofulaceum 19981 35,1 66,9 0,9 26,4
    M. shimoidei 27962 34,6 1,4 1,3 4,8
    M. simiae 25275 45,9 44,0 5,3 0,1
    M. smegmatis e14468 31,3 4,0 5,6 0,1
    M. szulgai 23069 19,4 22,3 1,5 3,0
    M. terrae 15755 25,6 21,7 0,4 12,3
    M. thermoresistibile 19527 20,3 34,5 3,1 17,6
    M. triviale 23292 37,3 4,6 4,3 0,1
    M. tuberculosis (avirulent) 25177 38,5 26,3 11,3 23,0
    M. tuberculosis (virulent) 27294 13,8 12,4 38,4 22,3
    M. ulcerans 19423 33,9 28,7 0,4 8,9
    M. vaccae 15483 8,8 36,2 4,8 3,2
    M. xenopi 19971 38,4 2,1 3,8 0,2
    Tabelle 23 Hybridisierung der Mycobacterium-Sonden 1-4 an phylogenetisch nah verwandte Organismen
    % Sonde % Sonde % Sonde % Sonde
    Organismus ATCC-Nr. 1 gebunden 2 gebunden 3 gebunden 4 gebunden
    Actinomadura madurae 19425 0,2 0,3 0,2 0,1
    Actinoplanes italicus 10049 0,4 0,5 0,3 0,2
    Arthrobacter oxidans 14358 0,2 0,4 0,3 0,1
    Brevibacterium linens e9172 0,3 0,3 0,3 0,1
    Corynebacterium xerosis 373 0,4 0,3 0,3 0,1
    Dermatophilus congolensis 14367 0,4 0,6 0,3 0,2
    Microbacterium lacticum 8180 0,2 0,3 0,2 0,1
    Nocardia asteroides 19247 0,3 0,3 0,4 0,1
    Nocardia brasiliensis 19296 0,4 0,3 0,6 0,1
    Nocardia otitidis-caviarum 14629 0,4 0,4 1,0 0,3
    Nocardioposis dassonvillei 23218 0,3 0,2 0,3 0,1
    Oerskovia turbata 33225 0,2 0,2 0,3 0,1
    Oerskovia xanthineolytica 27402 0,2 0,3 0,3 0,1
    Rhodococcus aichiensis 33611 0,4 0,2 0,3 0,2
    Rhodococcus aurantiacus 25938 0,3 0,4 0,3 0,2
    Rhodococcus bronchialis 25592 0,4 0,3 0,3 0,1
    Rhodococcus chubuensis 33609 0,6 0,4 0,3 0,3
    Rhodococcus equi 6939 0,4 0,4 0,4 0,5
    Rhodococcus obuensis 33610 0,5 0,5 0,3 0,1
    Rhodococcus sputi 29627 0,4 0,5 0,4 0,3
  • Beispiel 9
  • Mycoplasmen sind kleine, aerobe Bakterien ohne Zellwände. Man nimmt an, daß Mycoplasma pneumoniae 8-15 Millionen Infektionen jährlich verursacht. Die Infektionen können asymptomatisch sein oder hinsichtlich der Schwere im Bereich von milder bis zu ernster Bronchitis und Lungenentzündung liegen. Man nimmt an, daß der Organismus etwa 10 % der Lungenentzündungen in der Gesamtbevölkerung und 10-50 % der Lungenentzündungen bei Mitgliedern von Gruppen in längerem engen Kontakt, wie "College"-Studenten und Militärpersonal, verursacht.
  • Die Diagnose erforderte bislang die Isolierung des Organismus in Kultur oder das Aufzeigen einer Erhöhung des Antikörpertiters. Die Kultivierung des Organismus beinhaltet das Animpfen von Atmungsweg-Proben auf Agar oder biphasischen Medien, welche Bakterienwachstumsinhibitoren enthalten. Die Untersuchung hinsichtlich des Wachstums nach 3-4 und 7-10 Tagen wird benutzt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von irgendwelchen Mycoplasma festzustellen. Mycoplasma pneumoniae muß dann durch Hämadsorption (die Fähigkeit von M. pneumoniae, an Schaf- oder Meerschweinchen-Erythrozyten zu haften), Hämolyse (Fähigkeit von M. pneumoniae, eine β-Hämolyse von Schaf- oder Meerschweinchenerythrozyten in Blutagar hervorzurufen), Wachstumsinhibition durch spezifische Antikörper oder Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern identifiziert werden. Die vorliegende Erfindung besitzt bedeutende Vorteile gegenüber jedem dieser Verfahren nach dem Stand der Technik sowohl aufgrund der Einfachkeit des Tests als auch aufgrund der stark verringerten Zeit, welche nötig ist, um eine Diagnose zu erzielen.
  • Eine für die 5S-rRNA von M. pneumoniae spezifische Sonde wurde durch einen Vergleich bekannter rRNA-Sequenzen erhalten. Die parallel übereinandergestellten einzelnen Sequenzen stammten aus M. pneumoniae, M. gallisepticum und Ureaplasma urealyticum (Rogers, M.J. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1160-1164), M. capricolum (Hori, H. et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 5407-5410) und Spiroplamsa-Arten (Walker, R.T. et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 6363-6367). Die Übereinanderstellungen wurden wie obenstehend beschrieben und auf Seite 6 angegeben durchgeführt. 5S-rRNA kann, wie in Rogers et al. angegeben, isoliert und sequenziert werden, oder es kann ein Primer hergestellt werden, der komplementär zu einer konservierten Region in der 5S-rRNA ist, und eine Sequenzierung wie in den Beispielen 1-4 dargestellt durchgeführt werden. Die konservierte Region von 5S-rRNA ist in Fox, G.E. und Woese, C.R., 1975, Nature 256: 505-507 dokumentiert. Es wurde festgestellt, daß die folgende Sequenz spezifisch für Mycoplasma pneumoniae ist:
    GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC.
  • Die Sequenz ist komplementär zu einem einzigartigen Segment, gefunden in der 5S-rRNA von Mycoplasma pneumoniae in der den Basen 65-108 von E. coli-5S-rRNA entsprechenden Region, und wurde durch Vergleich zu 5S-rRNA-Sequenzen aus Mycoplasma gallisepticum, Spiroplasma mirum und Ureaplasma urealyticum ausgewählt. Die Oligonukleotidsonde wurde wie obenstehend beschrieben charakterisiert. Die Größe der Sonde belief sich auf 42 Basen. Die Sonde hatte eine Tm von 71,5°C.
  • Um die Reaktivität dieser Sequenz für Mycoplasma pneumoniae zu verdeutlichen, wurde die Sonde in Hybridisierungsreaktionen unter den folgenden Bedingungen getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit 1 Mikrogramm (7 × 10–13 Mol) gereinigter rRNA aus Mycoplasma pneumoniae vermischt und in 0,12 M PB (äquimolare Mengen von Na2HPO4 und NaH2PO4), 1 mM EDTA und 0,2 % SDS (Natriumdodecylsulfat) 60 Minuten lang bei 65°C in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern umgesetzt. In getrennten Röhrchen wurde die Sonde mit dem Hybridisierungspuffer mit und ohne vorhandene Mycoplasma pneumoniae-Ziel-rRNA vermischt. Im Anschluß an eine Abtrennung auf Hydroxyapatit, wie vorstehend angegeben, wurden die Hybride durch Szintillationszählung quantifiziert. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 24 gezeigt
    Tabelle 24 Hybridisierung der an homologe Ziel-rRNA*
    M. pneumoniae-5S-Sonde plus rRNA / 85-95 % minus rRNA / 0,5 %
    *%Hybridisierung = an Hydroxyapatit gebundene cpm / der Reaktion zugesetzte Gesamt-cpm
  • Diese Daten zeigen, daß die Sonde ein hohes Ausmaß der Reaktion an ihr homologes Ziel und eine sehr geringe nicht-spezifische Bindung an das Hydroxyapatit aufweist.
  • Die Spezifität der M. pneumoniae-5S-Sonde wurde durch Vermischen der 32P-markierten Sonde mit rRNA getestet, welche aus Zellen von anderen Mycoplasma-Arten freigesetzt wurde. Alle Hybridisierungsassays wurden wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Tabelle 25 zeigt, daß die Sonde für Mycoplasma pneumoniae spezifisch ist und nicht mit jedweden anderen Mycoplasma-Arten reagiert.
    Tabelle 25 Hybridisierung der M. pneumoniae-Sonde an andere Mycoplasmaarten
    Acholeplasma laidlawii 14089 3,3
    M. buccale 23636 1,7
    M. capricolum 23205 2,4
    M. columbinsale 33549 1,4
    M. faucium 25293 1,4
    M. fermentans 15474 1,0
    M. gallisepticum 19610 1,8
    M. gallopavonis 33551 1,6
    M. genitalium 3353c 1,7
    M. hominis 14037 1,3
    M. orale 23714 1,8
    M. pneumoniae 15531 78,0
    M. primatum 15497 1,6
    M. salivarium 23064 0,6
    Spiroplasma mirum 2,3
  • Wie in der Tabelle 26 gezeigt, reagierte die Sonde nicht mit irgendeiner anderen nah verwandten oder phylogenetisch unterschiedlichen Bakterienart.
    Tabelle 26 Hybridisierung der M. pneumoniae-Sonde an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterien
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 1,4
    Haemophilus influenzae 19418 1,4
    Klebsiella pneumoniae 23357 1,3
    Legionella pneumophila 33152 1,8
    Mycobacterium tuberculosis (avir) 25177 1,6
    Mycoplasma pneumoniae 15531 52,0
    Neisseria meningitidis 13077 0,6
    Propionibacterium acnes 6919 2,0
    Pseudomonas aeruginosa 25330 1,6
    Staphylococcus aureus 12598 2,0
    Streptococcus pneumoniae c6306 1,9
  • Vier zusätzliche für Mycoplasma pneumoniae spezifische Sondensequenzen (nachstehend unter der Numerierung 2-5) wurden unter Verwendung von vier einzigartigen, zu konservierten Regionen auf 16S-rRNA komplementären Primern erhalten. Die Regionen entsprechen jeweils den Basen 190-230, 450-490, 820-860 bzw. 1255-1290 von E. coli-16S-rRNA. Die Sondensequenz 1 wurde unter Verwendung eines Primers mit der Sequenz 5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3' erhalten. Die Sondensequenz 2 wurde unter Verwendung eines Primers mit der Sequenz 5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3' erhalten. Die Sondensequenz 3 wurde unter Verwendung eines Primers mit der Sequenz 5'-CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3' erhalten. Die Sondensequenz 4 wurde unter Verwendung eines Primers mit der Sequenz 5'-CGATTACTAGCGATTCC-3 erhalten. Sequenzierungsreaktionen wurden wie in den vorstehenden Beispielen angegeben durchgeführt. Die M. pneumoniae-Sequenzen wurden mit Sequenzen aus Mycoplasma genitalium, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma gallisepticum und Spiroplasma mirum verglichen.
  • Die folgenden Sondensequenzen wurden durch die im Beispiel 1 der Patentanmeldung beschriebenen Kriterien charakterisiert und es wurde gezeigt, daß sie spezifisch für Mycoplasma pneumoniae sind:
    • 2. AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT
    • 3. CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT
    • 4. TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT
    • 5. CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC.
  • Die Sonde Nr. 2 ist 35 Basen lang und weist eine Tm von 67°C auf. Die Sonde Nr. 3 ist 35 Basen lang und weist eine Tm von 66°C auf. Die Sonde Nr. 4 ist 30 Basen lang und weist eine Tm von 69°C auf. Die Sonde Nr. 5 ist 35 Basen lang und weist eine Tm von 66°C auf.
  • Bei Vermischen und Anwenden der vier Sonden in Hybridisierungsassays bei 60°C auf die gleiche Weise wie bei den vorstehenden Beispielen stellte man fest, daß sie spezifisch für M. pneumoniae sind. Die Sonden zeigen keine Kreuzreaktion mit anderen Atemwegspathogenen oder mit irgendeinem den phylogenetischen Stamm Bacteria repräsentierenden Organismus (Tabelle 28).
    Tabelle 27 Hybridisierung der Mycoplasma pneumoniae-Sonden 2-5 an Mycoplasmaarten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acholeplasma axanthum 27378 0,34
    Acholeplasma laidlawii 14089 0,30
    Mycoplasma arginini 23838 0,20
    Mycoplasma arthritidis 19611 0,49
    Mycoplasma bovigenitalium 19852 0,18
    Mycoplasma bovis 25523 0,43
    Mycoplasma buccale 23636 0,37
    Mycoplasma californicurn 33451 0,79
    Mycoplasma capricolum 23205 0,38
    Mycoplasma columbinasale 33549 0,54
    Mycoplasma columborale 29258 0,50
    Mycoplasma faucium 25293 0,45
    Mycoplasma fermentans 15474 0,27
    Mycoplasma gallisepticum 19610 0,25
    Mycoplasma gallopavonis 33551 0,47
    Mycoplasma genitalium 33530 2,5
    Mycoplasma hominis 14027 0,52
    Mycoplasma hyorhinis 17981 0,46
    Mycoplasma orale 23714 0,56
    Mycoplasma pneumoniae 15531 34,0
    Mycoplasma primatum 15497 0,71
    Mycoplasma pulmonis 19612 0,68
    Mycoplasma salivarium 23064 0,46
    Spiroplasma citri 29416 0,60
    Spiroplasma mirum 29335 0,52
    Tabelle 28 Hybridisierung der Mycoplasma pneumoniae-Sonden 2-5 mit anderen Bakterien
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Actinomyces israelii 10049 1,0
    Bacteroides fragilis 23745 1,4
    Bifidobacterium breve 15700 1,0
    Bordetella bronchiseptica 10580 0,9
    Clostridium inocuum 14501 1,0
    Clostridium pasteurianum 6013 0,9
    Clostridium perfringens 13124 1,1
    Clostridium ramosum 25582 1,0
    Corynebacterium xerosis 373 0,8
    Erysipelothrix rhusiopathiae 19414 1,1
    Escherichia coli 11775 1,0
    Haemophilus influenzae 19418 0,9
    Klebsiella pneumoniae 15531 1,0
    Lactobacillus acidophilus 4356 1,4
    Legionella pneumophila 33154 0,8
    Listeria monocytogenes 15313 1,2
    Moraxella osloensis 19976 1,1
    Mycobacterium tuberculosis 25177 1,0
    Neisseria meningitidis 13077 1,0
    Pasteurella multocida 6529 1,6
    Peptococcus magnus 14955 0,9
    Propionibacterium acnes 6919 1,1
    Pseudomonas aeruginosa 25330 1,0
    Staphylococcus aureus 12600 1,0
    Streptococcus faecalis 19433 1,5
    Streptococcus mitis 9811 1,0
    Streptococcus pneumoniae 6306 1,0
    Streptococcus pyogenes 19615 1,1
  • Beispiel 10
  • Die Gattung Legionella enthält 22 Arten, welche für Menschen alle potentiell pathogen sind. Diese Organismen verursachen die Legionärskrankheit, eine akute Lungenentzündung, oder das Pontiac-Fieber, eine akute, nicht-pneumonische, fieberhaltige Erkrankung, welche nicht verhängnisvoll ist.
  • Man hat ebenfalls gezeigt, daß Legionella-Arten verantwortlich für Krankenhaus-Lungenentzündung sind, die vorwiegend unter immunologisch beeinträchtigten Patienten auftritt.
  • Legionellose, welche die Legionärskrankheit und das Pontiac-Fieber einschließt, wird auf Grundlage klinischer Symptome, direkter oder indirekter Fluoreszenz-Antikörpertests, und durch Kultivieren unter Anwendung eines gepufferten Aktivkohle-Hefe-Extrakt(BCYE)-Agars, enthaltend selektive antimikrobielle Mittel, diagnostiziert. Im Stand der Technik ist kein einziger definitiver Gattungs-Test bekannt (siehe Bergey's Manual of Systematic Bacteriology auf Seite 283, Auflage von 1984). Die Fluoreszenz-Antikörpertests sind nicht in der Lage, alle Arten von Legionella zu identifizieren, sondern nur die wenigen, für die Antikörper existieren. Das Kulturverfahren ist nicht definitiv diagnostisch für Legionella-Arten.
  • Die nachstehend beschriebenen Oligonukleotidsequenzen identifizieren bei Verwendung als Sonden in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay akkurat alle Legionella-Arten. Dieser Assay ist empfindlicher als Kultivierung oder Antikörpertests und verkürzt die Identifizierungszeit und somit die Diagnose signifikant. Der Assay stellt deshalb eine bedeutende Verbesserung gegenüber früheren diagnostischen Verfahren dar.
  • Drei für die Gattung Legionella spezifische Sondensequenzen wurden unter Verwendung dreier einzigartiger Primer, die komplementär zu konservierten Regionen sowohl auf 16S- als auch 23S-rRNA waren, erhalten. Die Sequenz 1 wurde unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3' erhalten. Die Sondensequenz 2 wurde mit einem 23S-Primer der Sequenz 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3' erhalten. Die Sondensequenz 3 wurde mit einem 16S-Primer der Sequenz 5'-GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC ACC AT-3' erhalten. Die Sequenzierung mit diesen Primer wurde wie für die vorstehenden Beispiele beschrieben durchgeführt.
  • Die folgenden drei Sequenzen wurden durch die im Beispiel 1 beschriebenen Kriterien charakterisiert, und man zeigte, daß sie spezifisch für die Gattung Legionella waren. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus und Acinetobacter calcoaceticus wurden für Vergleiche mit Sequenzen aus Legionella-Arten herangezogen.
    • 1. TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC
    • 2. GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC
    • 3. CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG.
  • Die Sequenz 1, aus 16S-rRNA, ist 40 Basen lang und hat eine Tm von 72°C. Die Sequenz 2, aus 23S-rRNA, ist 42 Basen lang und hat eine Tm von 73°C. Die Sequenz 3, aus 16S-rRNA, ist 40 Basen lang und hat eine Tm von 68°C. Diese Sequenzen sind in der Lage, an RNA der Gattung Legionella in den Regionen zu hybridisieren, die jeweils zu 630-675 von E. coli-16S-rRNA; 350-395 von E.coli-23S-rRNA bzw. 975-1020 von E. coli-16S-rRNA entsprechend sind. Wenn sie zusammen gemischt wurden, wiesen die Sonden eine kombinierte mittlere Tm von 73°C auf. Eine Analyse auf Polyacrylamidgelen zeigte, daß jede Sonde die korrekte Länge besaß, und die Sequenzanalyse zeigte, daß jede die korrekte Rasensequenz aufwies.
  • Bei Vermischen der drei Sonden und Verwendung in einem Hybridisierungsassay stellte man fest, daß sie für die Gattung Legionella spezifisch waren (Tabellen 29 und 30) und nicht mit anderen Atemwegspathogenen oder mit irgendeinem gewählten Organismus aus dem phylogenetischen Stamm kreuzreagierten (Tabellen 31 und 32). Die Anwendung von mehr als einer Sonde, d.h. eines Sondengemischs, kann zu einer erhöhten Assayempfindlichkeit und/oder zu einer Erhöhung der Anzahl nachweisbarer nicht-viraler Organismen führen.
    Tabelle 29 Hybridisierung von Legionella-Sonden an homologe Ziel-rRNA
    Legionella-Sonde plus rRNA / 80 % minus rRNA / 1,0 %
    Tabelle 30 Hybridisierung von Legionella-Sonden an Legionella-Arten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    L. anisa 35292 42,0
    L. bozemanii 33217 58,0
    L. cherrii 35252 69,0
    L. dumoffii 33279 57,0
    L. erythra CDC#9P1W044C 26,0
    L. feeleii 35303 59,0
    L. hackeliae 35250 47,0
    L. jamestowniensis 35298 20,0
    L. jordanis 33623 50,6
    L. longbeachae 33484 48,0
    L. maceachernii 35300 25,0
    L. micdadei 33704 38,0
    L. oakridgensis 33761 44,0
    L. parisiensis 9060 69,0
  • L. pneumophila 1* 6736 75,0
    " 2 64,0
    " 3 73,0
    " 4 73,0
    " 5 78,0
    " 6 75,0
    " 7 73,0
    " 8 63,0
    " 11 75,0
    L. rubrilucens 35304 12,0
    L. sainthelensi 35248 61,0
    L. sainticrucis 35301 24,0
    L. spiritensis CDC#MSH9 55,0
    L. steigerwaltii 7430 56,0
    L. wadsworthii 33877 37,0
    * Die Nummern 1-8 und 11 sind Serotypen von L. pneumophila.
    Tabelle 31 Hybridisierung von Legionella-Sonden an Atemwegspathogene
    Organismen ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 2,1
    Haemophilus influenzae 19418 2,3
    Klebsiella pneumoniae 23357 2,0
    Mycoplasma pneumoniae 15531 2,3
    Neisseria meningitidis 13090 2,2
    Pseudomonas aeruginosa 25330 1,2
    Propionibacterium acnes 6919 1,6
    Streptococcus pneumoniae 6306 0,8
    Staphylococcus aureus 25923 1,6
    Tabelle 32 Hybridisierung von Legionella-Sonden an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterienarten
    Organismen ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,4
    Branhamella catarrhalis 25238 2,0
    Bacillus subtilis 6051 1,9
    Bacteroides fragilis 23745 2,2
    Campylobacter jejuni 33560 1,2
    Chromobacterium violaceum 29094 1,3
    Clostridium perfringens 13124 1,9
    Deinoccoccus radiodurans 35073 1,8
    Derxia gummosa 15994 2,0
    Enterobacter aerogenes 13048 1,4
    Escherichia coli 11775 1,2
    Mycoplasma hominis 14027 1,1
    Proteus mirabilis 29906 1,4
    Pseudomonas cepacia 11762 1,1
    Rahnella aquatilis 33071 1,7
    Rhodospirillum rubrum 11170 2,0
    Streptococcus mitis 9811 2,0
    Vibrio parahaemolyticus 17802 2,0
    Yersinia enterocolitica 9610 1,2
  • Drei zusätzliche für die Gattung Legionella spezifische Sondensequenzen (numeriert 4-6) wurden durch Verwendung zweier zu konservierten Regionen auf 23S-rRNA komplementärer Primer erhalten. Die Sequenz 4 wurde aus einem 23S-Primer mit der Sequenz 5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3' hergestellt. Die Sondensequenzen 5 und 6 wurden aus einem 23S-Primer der Sequenz 5'-AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT TTT-3' hergestellt. Die Sequenzierung mit diesen Primern wurde wie für die vorstehenden Beispiele beschrieben durchgeführt.
  • Die folgenden drei Sequenzen wurden mittels der zuvor beschriebenen Kriterien charakterisiert, und man zeigte, daß sie spezifisch für die Gattung Legionella sind. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus und Actinetobacter calcoaceticus wurden für Vergleiche mit Sequenzen aus Legionella-Arten herangezogen.
    • 4. GCG GTA CGG TTC TCT ATA AGT TAT GGC TAG C
    • 5. GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T
    • 6. CAC TCT TGG TAC GAT GTC CGA C
  • Die Sonde 4, komplementär zu 23S-rRNA in der den Basen 1585-1620 von E. coli-23S rRNA entsprechenden Region, ist 31 Basen lang und hat eine Tm von 67°C. Die Sonde 5, komplementär zu 23S-rRNA in der den Basen 2280-2330 von E. coli-23S rRNA entsprechenden Region, ist 22 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sonde 6, komplementär zu 23S-rRNA in derselben Region wie die Sonde 5, ist 22 Basen lang und hat eine Tm von 63°C.
  • Als die drei Sonden mit der oben genannten Sonde 3 gemischt und in einem Hybridisierungsassay, wie beschrieben für die Sonden 1-3, verwendet wurden, stellte man fest, daß sie spezifisch für die Gattung Legionella waren (Tabelle 33) und nicht mit anderen Atemwegspathogenen oder mit irgendeinem gewählten Organismus aus dem phylogenetischen Stamm kreuzreagierten (Tabellen 34 und 35). Die Anwendung von mehr als einer Sonde, d.h. eines Sondengemischs, kann die Assayempfindlichkeit verbessern und/oder die Anzahl nachgewiesener nicht-viraler Organismen erhöhen.
    Tabelle 33 Hybridisierung von Legionella-Sonden an Legionell-Arten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    L. anisa 35292 29,6
    L. bozemanii 33217 35,5
    L. cherrii 35252 29,2
    L. dumoffii 33279 26,0
    L. erythra 35303 32,0
    L. feelii CDC#9P1W044C 32,0
    L. hackeliae 35250 39,0
    L. jamestowniensis 35298 31,2
    L. jordanis 33623 25,7
    L. longbeachae 33484 27,6
    L. maceahernii 35300 39,3
    L. micdadei 33204 31,0
    L. oakridgensis 33761 24,4
    L. parisiengi 35299 31,2
    L. pneumophilia 1* 33153 40,0
    " 2 33154 38,5
    " 3 33155 44,6
    " 4 33156 48,6
    " 5 33216 32,0
    " 6 33215 43,0
    " 7 33823 29,5
    " 8 35096 37,6
    " 11 43130 44,5
    L. rubrilucens 35304 30,1
    L. sainthelensis 35248 27,0
    L. sainticrucis 35301 22,0
    L. spiritensis CDC#MSH9 40,5
    L. steigerwaltii 35302 31,7
    L. wadsworthii 33877 30,0
    * Die Nummern 1-8 und 11 sind Serotypen von L. pneumophilia.
    Tabelle 34 Hybridisierung von Legionella-Sonden an Atemwegspathogene
    Organismen ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Corynebacterium xerosis 373 0,13
    Haemophilum influenzae 19418 0,12
    Klebsiella pneumoniae 23357 0,13
    Neisseria meningitidis 13090 0,14
    Pseudomonas aeruginosa 25330 0,13
    Propionibacterium acnes 6919 0,11
    Streptococcus pneumoniae 6306 0,08
    Staphylococcus aureus 25923 0,15
    Tabelle 35 Hybridisierung von Legionella-Sonden an einen phylogenetischen Querschnitt von Bakterienarten
    Organismen ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,12
    Branhamella catarrhalis 25238 0,13
    Bacillus subtilis 6051 0,09
    Bacteroides fragilis 23745 0,12
    Campylobacter jejuni 33560 0,06
    Chromobacterium violaceum 29094 0,33
    Clostridium perfringens 13124 0,07
    Deinoccoccus radiodurans 35073 0,11
    Derxia gummosa 15994 0,15
    Enterobacter aerogenes 13048 0,26
    Escherichia coli 11775 0,09
    Mycoplasma hominis 14027 0,09
    Proteus mirabilis 29906 0,09
    Pseudomonas cepacia 17762 0,20
    Rahnella aquatilis 33071 0,15
    Rhodospirillum rubrum 11170 0,13
    Streptococcus mitis 9811 0,07
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0,11
    Yersinia enterocolitica 9610 0,19
  • Beispiel 11
  • Chlamydien sind gramnegative, nicht-bewegliche, obligat intrazelluläre Bakterien. Die Art C. trachomatis steht in Zusammenhang mit endemischem Trachom (der häufigsten vermeidbaren Form der Erblindung), Inklusions-Bindehautentzündung und Lymphogranuloma venereum (LGV). Sie ist eine Hauptursache von nicht-gonokokkaler Harnleiterentzündung bei Männern und kann Gebärmutterhalsentzündung und akute Salpingitits bei Frauen verursachen. Eine Augenerkrankung oder Chlamydien-Pneumonie kann sich bei Neugeborenen ausprägen, die durch einen infizierten Geburtskanal zur Welt gekommen sind.
  • Es gibt mehrere im Fachgebiet bekannte Verfahren zur Identifizierung von C. trachomatis im Urogenitaltrakt, zum Beispiel durch direkte Immunfluoreszenz-Färbung oder Enzymimmunoassay von klinischen Proben. Das Verfahren der Wahl bleibt jedoch die Kultivierung des Organismus in mit Cycloheximid behandelten McCoy-Zellen. An die Zellkultur schließt sich eine morphologische oder Fluoreszenzantikörper-Färbung zur Bestätigung der Identität des Organismus an.
  • Die nachstehend beschriebenen Oligonukleotidsequenzen identifizieren bei Verwendung als Sonden in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay auf akkurate Weise Chlamydia trachomatis-Isolate. Dieser Assaytest ist hinsichtlich der Empfindlichkeit gleichwertig zu Kultivierungs- oder Antikörper-Tests und verkürzt, im Falle der Kultivierung, die Zeit zur Identifizierung, und somit zur Diagnose, bedeutend.
  • Kingsbury, D.T. und E. Weiss, 1968, J. Bacteriol. 96: 1421-23 (1968); Moulder, J.W. ASM News, Band 50, Nr. 8 (1984), berichten über eine nur 10%ige DNA-Homologie zwischen C. trachomatis und C. psittaci. Darüber hinaus zeigen diese Berichte, daß sich verschiedene C. trachomatis-Stämme hinsichtlich der DNA-Homologie unterscheiden. Weisberg, W.G. et al., J. Bacteriol. 167: 570-574 (1986), veröffentlichten die 16S-rRNA-Sequenzen von C. psittaci und bemerkten, daß C. trachomatis und C. psittaci eine mehr als 95%ige rRNA-Homologie gemeinsam haben. Aus diesen Berichten kann gefolgert werden, daß es schwierig ist, (1) Sonden, die fähig sind, an alle Stämme von C. trachomatis zu hybridisieren, und (2) Sonden, die fähig sind zwischen C. trachomatis und C. psittaci zu unterscheiden, zu erfinden. Die folgenden Sonden erreichen beide Ziele.
  • Zehn für Chlamydia trachomatis spezifische Sondensequenzen wurden unter Verwendung von sieben einzigartigen, zu konservierten Regionen sowohl von 16S- als auch 23S-rRNA komplementären Primern hergestellt. Die Sondensequenz 1 wurde aus einem 16S-Primer der Sequenz 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3' erhalten. Die Sondensequenz 2 wurde mit einem 16S-Primer der Sequenz 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3' erhalten. Die Sequenzen 3 und 4 wurden unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3' erhalten. Die Sondensequenzen 5 und 6 wurden mit einem 23S-Primer der Sequenz 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3 erhalten. Die Sondensequenzen 7 und 8 wurden mit einem 23S-Primer der Sequenz 5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG-3' erhalten. Die Sondensequenz 9 wurde mit einem 23S-Primer der Sequenz 5'-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT TC-3' erhalten. Die Sondensequenz 10 wurde mit einem Primer der Sequenz 5'-CTA CTT TCC TGC GTC A-3' erhalten.
  • Die folgenden zehn Sequenzen wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Kriterien charakterisiert und man zeigte, daß sie spezifisch für die rRNA von Chlamydia trachomatis sind. Der phylogenetisch nächste Nachbar, Chlamydia psittaci, wurde zum Vergleich mit der Chlamydia trachomatis-Sequenz herangezogen.
    • 1. CCG ACT CGG GGT TGA GCC CAT CTT TGA CAA
    • 2. TTA CGT CCG ACA CGG ATG GGG TTG AGA CCA TC
    • 3. CCG CCA CTA AAC AAT CGT CGA AAC AAT TGC TCC GTT CGA
    • 4. CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG
    • 5. CAT CCA TCT TTC CAG ATG TGT TCA ACT AGG AGT CCT GAT CC
    • 6. GAG GTC GGT CTT TCT CTC CTT TCG TCT ACG
    • 7. CCG TTC TCA TCG CTC TAC GGA CTC TTC CAA TCG
    • 8. CGA AGA TTC CCC TTG ATC GCG ACC TGA TCT
    • 9. CCG GGG CTC CTA TCG TTC CAT AGT CAC CCT AAA AG
    • 10. TAC CGC GTG TCT TAT CGA CAC ACC CGC G
  • Die Sequenz 1, aus 16S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sequenz 2, aus 16S-rRNA, ist 32 Basen lang und hat eine Tm von 67°C. Die Sequenz 3, aus 16S-rRNA, ist 39 Basen lang und hat eine Tm von 70°C. Die Sequenz 4, aus 16S-rRNA, ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 69°C. Die Sequenz 5, aus 23S-rRNA, ist 41 Basen lang und hat eine Tm von 71°C. Die Sequenz 6, aus 23S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 72°C. Die Sequenz 7, aus 23S-rRNA, ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 72°C. Die Sequenz 8, aus 23S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 71°C. Die Sequenz 9, aus 23S-rRNA, ist 35 Basen lang und hat eine Tm von 74°C. Die Sequenz 10 ist 28 Basen lang und hat eine Tm von 72°C.
  • Die Reaktivität und Spezifität der Sonden wurde in Hybridisierungsassays getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonden 1 und 2 wurden mit gereinigter RNA oder RNA vermischt, welche aus mindestens 107 Organismen in 0,55 ml 41 % Diisobutylsulfosuccinat, 3 % Natriumdodecylsulfat, 0,03 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA bei 60°C (Sonde 1) oder 64°C (Sonde 2) 1 Stunde lang freigesetzt worden war. Die Hybride wurden wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben an Hydroxyapatit gebunden und die Menge der gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Tabelle 36 zeigt, daß die Sonden 1 und 2 gut an alle getesteten Serotypen von C. trachomatis hybridisieren. Die Sonde 1 reagiert nicht mit irgendeinem getesteten Stamm von C. psittaci, und die Sonde 2 reagiert nicht mit zweien der Stämme. Die Sonde 2 reagiert mit dem Schaf-Polyarthritis-Stamm von C. psittaci, einem Organismus der bekanntermaßen Menschen infiziert. Die Tabelle 37 zeigt die Reaktivität und Spezifität der Sonden 3-9 bei Markierung mit 125I und Anwendung als Gemisch. In diesem Fall wurden die Hybride an kationische magnetische Teilchen gebunden. Diese Sonden hybridisierten gut an alle getesteten Stämme von C. trachomatis und nicht an jedewede Stämme von C. psittaci. Die Sonden 3-9 wurden weiter gegen eine Auswahl von Organismen, welche gewöhnlich im Urogenitaltrakt zu finden sind (Tabelle 38), und gegen einen phylogenetischen Querschnitt von Organismen (Tabelle 39) getestet. In allen Fällen wurde gezeigt, daß die Sonden spezifisch waren. Die Sonde 10 ist zu 25 % nicht-homolog zu C. psittaci und sollte ebenfalls spezifisch für C. trachomatis sein.
    Tabelle 36 Hybridisierung der Chlamydia trachomatis-Sonden 1 und 2 an Chlamydia-RNA
    % gebundene
    Organismus ATCC-Nr. Sonde 1 Sonde 2
    Chlamydia trachomatis Serotyp C VR578 22 39
    Chlamydia trachomatis Serotyp E VR348B 27 48
    Chlamydia trachomatis Serotyp G VR878 20 44
    Chlamydia trachomatis Serotyp I VR880 20 42
    Chlamydia trachomatis Serotyp K VR887 28 45
    Chlamydia psittaci, Meerschweinchen-Bindehautentzündung-Stamm VR813 1,2 1,4
    Chlamydia psittaci, Schaf-Fehlgeburt-Stamm VR656 1,0 3,0
    Chlamydia psittaci, Schaf-Polyarthritis-Stamm VR619 1,1 35,3
    Tabelle 37 Hybridisierung der Chlamydia trachomatis-Sonden 3-9 mit Chlamydia-rRNA
    Organismus Serovariante ATCC-Nr. Verhältnis gebundene Einheiten*
    C. trachomatis A 689
    C. trachomatis B 560
    C. trachomatis Ba 1066
    C. trachomatis C VR548 962
    C. trachomatis D 1192
    C. trachomatis E VR348 1022
    C. trachomatis F 391
    C. trachomatis G VR878 874
    C. trachomatis H 954
    C. trachomatis I VR880 943
    C. trachomatis J 482
    C. trachomatis K VR887 999
    C. trachomatis L1 638
    C. trachomatis L2 501
    C. trachomatis L3 VR903 821
    C. psittaci VR125 1,6
    C. psittaci VR629 0,9
    C. psittaci VR656 1,3
    C. psittaci VR813 1,2
    * Verhältnis = Zähleinheiten (gebunden) bei Gegenwart von RNA / Zähleinheten (gebunden) bei Abwesenheit von RNA
    Tabelle 38 Hybridisierung der Chlamydia trachomatis-Sonden 3-9 an im Urogenitaltrakt gefundene Organismen
    Organismus ATCC-Nr. Verhältnis gebundene Einheiten*
    Achromobacter xylosoxidans 27061 1,9
    Acinetobacter lwoffii 15309 1,2
    Branhamella catarrhalis 25238 1,2
    Candida albicans 18804 2,4
    Flavobacterium meningosepticum 13253 1,1
    Gardnerella vaginalis 14018 1,3
    Lactobacillus acidophilus 4356 0,8
    Listeria monocytogenes 15313 0,7
    Mycobacterium smegmatis 14468 1,1
    Moraxella osloensis 19976 1,3
    Neisseria gonorrhoeae 19424 2,3
    Pasteurella multocida 6529 1,0
    Peptostreptococcus anaerobius 27337 1,2
    Streptococcus agalactiae 13813 4,0
    Streptococcus faecalis 19433 2,6
    * Verhältnis = Zähleinheiten (gebunden) bei Gegenwart von RNA / Zähleinheten (gebunden) bei Abwesenheit von RNA
    Tabelle 39 Hybridisierung der Chlamydia trachomatis-Sonden 3-9 an phylogenetisch unterschiedliche Organismen
    Organismus ATCC-Nr. Verhältnis gebundene Einheiten*
    Bacillus subtilis 6051 2,2
    Bacteroides fragilis 23745 1,6
    Campylobacter jejuni 33560 1,4
    Chromobacterium violaceum 29094 1,4
    Deinococcus radiodurans 35073 1,8
    Derxia gummosa 15994 1,3
    Enterobacter aerogenes 13048 1,9
    Escherichia coli 11775 1,9
    Mycoplasma hominis 14027 1,3
    Pseudomonas cepacia 17762 2,2
    Proteus mirabilis 29906 2,2
    Rahnella aquatilis 33071 1,9
    Rhodospirillum rubrum 11170 1,9
    Vibrio parahaemolyticus 17802 2,0
    Yersinia enterocolitica 9610 2,5
    * Verhältnis = Zähleinheiten (gebunden) bei Gegenwart von RNA / Zähleinheten (gebunden) bei Abwesenheit von RNA
  • Beispiel 12
  • Campylobacter sind bewegliche, mikroaerophile, gramnegative gekrümmte Stäbchen. Die Gattung ist ziemlich vielfältig und unterschiedlich von anderen Gattungen. Obwohl die Gattung gut definiert ist, findet auf der Ebene der Arten eine gewisse Revision statt (Romaniuk, P.J. et al., J. Bacteriol. 169: 2137-2141 (1987)). Drei Campylobacter-Arten, Campylobacter jejuni, C. coli und C. laridis verursachen Enteritits beim Menschen. Die Krankheit schließt Durchfall, Fieber, Übelkeit, Unterleibsschmerzen und in manchen Fällen Erbrechen ein. Diese Organismen verursachen schätzungsweise 2 Millionen Infektionen jährlich in den USA (Schätzung auf Grundlage der Anzahl von durch Salmonella und Shigella hervorgerufenen Fällen von Durchfallerkrankungen). Andere Mitglieder der Gattung verursachen Septikämien bzw. Blutvergiftungen bei Menschen und Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit bei Schafen und Rindern.
  • Die Diagnose von Campylobacter enteritis ist derzeitig abhängig vom Wachstum und der Isolierung des Organismus in Kultur, gefolgt von einer Anzahl biochemischer Tests. Das optimale Wachstum von Campylobactern erfordert spezielle Bedingungen, wie eine niedrige Sauerstoff-belastung und eine hohe Temperatur (42°C). Es wird kein einzelner Satz von Bedingungen für die Isolierung aller Campylobacter-Arten empfohlen.
  • Die nachstehend aufgelisteten Oligonukleotidsequenzen hybridisieren bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay an die 16S-rRNA der Campylobacter-Art von Interesse. Die vorliegende Erfindung hat bedeutende Vorteile gegenüber Nachweisverfahren für Campylobacter nach dem Stand der Technik, weil eine Sonde alle Campylobacter von Interesse nachweisen kann; die anderen zwei Sonden detektieren die Darm-Campylobacter, und eine kann Campylobacter-Isolate aus Menschen detektieren. Darüber hinaus haben die Sonden Vorteile gegenüber dem Stand der Technik hinsichtlich der Einfachheit des Assays und vermindern in großem Maße die Zeit für die Identifizierung und somit für die Diagnose.
  • Die vier Sonden, die an die 16S-rRNA von Campylobacter-Arten von Interesse hybridisieren, wurden unter Verwendung dreier zu 16S-rRNA komplementärer einzigartiger Primer konstruiert. Die Sequenzen 1 und 2 wurden unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3' hergestellt. Die Sequenz 3 wurde unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3' hergestellt. Die Sequenz 4 wurde mit einem 16S-Primer mit der Sequenz 51 GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT-3' hergestellt.
  • Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert und man zeigte, daß sie an Campylobacter jejuni, C. coli und C. laridis hybridisierten. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn, Vibrio parahaemolyticus und Wollinella succinogenes wurden zum Vergleich mit den Campylobacter-Sequenzen herangezogen.
    • 1. CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC
    • 2. CCT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC
    • 3. GCC TTC GCA ATG GGT ATT CTT GGT G
    • 4. GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG
  • Die Sequenz 1, aus 16S-rRNA, ist 23 Basen lang und hat eine Tm von 65°C. Die Sequenz 2, aus 16S-rRNA, ist 26 Basen lang und hat eine Tm von 64°C. Die Sequenz 3, aus 16S-rRNA, ist 25 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sequenz 4, aus 16S-rRNA, ist 24 Basen lang und hat eine Tm von 61°C. Die Sequenz 1 ist in der Lage, in der den Basen 405-428 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren; die Sequenz 2 ist in der Lage, in der den Basen 440-475 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren; die Sequenz 3 ist in der Lage, in der den Basen 705-735 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren; die Sequenz 4 ist in der Lage, in der den Basen 980-1010 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren.
  • Die Reaktivität und Spezifität der Sonden für Campylobacter wurde in Hybridisierungsassays getestet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonden wurden mit gereinigter RNA oder RNA vermischt, welche aus Zellen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat freigesetzt worden war. Es wurden 0,5 ml Hybridisierungslösung (41% Diisobutylsulfosuccinat, 30 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 0,7 % Natriumdodecylsulfat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) zugegeben und die Mischung wurde 1 bis 1,5 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 2 bis 2,5 ml Trennungslösung (2% Hydroxyapatit, 0,12 M Natrumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) zugegeben und die Mischung wurde fünf Minuten lang bei 60°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. 2,5 ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben und die Probe wurde gemischt, zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die an das Hydroxyapatit gebundene Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt.
  • Die Tabelle 40 zeigt, daß die Sonden gut an die Campylobacter-Arten von Interesse, C. jejuni, C. coli und C. laridis, hybridisieren. Sonde 1 detektiert alle der getesteten Campylobacter-Arten, die Sonden 2 und 4 detektieren nur die im Darm vorkommenden Campylobacter-Arten, und die Sonde 3 detektiert alle der Campylobacter-Arten außer C. sputorum, einem aus Rindern isolierten Organismus. Somit sind alle Sonden für die Identifizierung von Campylobacter in Stuhlproben verwendbar. Die Wahl, welche Sonde für andere Anwendungen verwendet wird, ist vom Grad der erforderlichen Spezifität abhängig (d.h. Darm-Campylobacter oder alle Campylobacter-Arten).
    Tabelle 40 Hybridisierung der Campylobacter-Sonden 1-4 an Campylobacter-Arten
    % gebundene Sonde (*)
    Organismus ATCC-Nr. 1 2 3 4
    Campylobacter coli 33559 64 70 52 49
    C. fetus subsp. fetus 27374 68 0,1 66 0,5
    C. fetus subsp. venerealis 19438 66 0,7 54 1,2
    C. jejuni 33560 63 76 51 56
    C.laridis 35221 74 73 64 52
    C. sputorum subsp. bubulus 33562 71 3,0 2,5 0
    (*) % gebundene Sonde = an Hydroxyapatit gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Die Tabelle 41 zeigt, daß die Sonden nicht an nah verwandte Organismen oder im Magendarmtrakt gefundene Organismen hybridisieren.
    Tabelle 41 Hybridisierung der Campylobacter-Sonden 1-4 an nah verwandte Organismen und im Magendarmtrakt anzutreffende Organismen
    % gebundene Sonde (*)
    Organismus ATCC-Nr. 1 2 3 4
    Bacteroides fragilis 25285 0 0,2 0,7 0
    Escherichia coli 11775 1,3 0,5 0,5 0
    Salmonella typhimurium 14028 0 0 0,3 0
    Shigella boydii 29929 0 0,2 0,5 0
    Shigella dysenteriae 13313 0 0,7 0,2 0
    Shigella flexneri 29903 0 0 0,5 0
    Shigella sonnei 29930 0 0 0,1 0
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0 1,9 0,1 0
    Wollinella succinogenes 29543 0,4 2,1 2,2 0
    Yersinia pseudotuberculosis 29833 0,6 0,2 1,7 0,3
    (*) % gebundene Sonde = an Hydroxyapatit gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Die für die Darm-Campylobacter spezifischen Sonden 2 und 4 wurden weiter getestet, und man zeigte, daß nicht mit rRNAs anderer im Magendarmtrakt gefundener Organismen reagieren.
    Tabelle 42 Hybridisierung der Campylobacter-Sonden 2 und 4 an im Magendarmtrakt anzutreffende Organismen
    % gebundene Sonde (*)
    Organismus ATCC-Nr. Sonde 2 Sonde 4
    Citrobacter diversus 27156 0 0
    Clostridium perfringens 13124 0 0
    Enterobacter cloacae 13047 0 0
    Klebsiella pneumoniae 23357 0 0,5
    Proteus mirabilis 25933 0 0
    Serratia marcescens 13880 0 0
    Staphylococcus aureus e12600
    Staphylococcus epidermidis 14990 0 0,3
    Streptococcus bovis 33317 0 0
    (*) % gebundene Sonde = an Hydroxyapatit gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Beispiel 13
  • Streptokokken sind grampositive, Oxidase-negative kokkoide Bakterien. Die Gattung ist auf der Grundlage gruppenspezifischer Kohlenhydrate in 18 Gruppen, A-R, eingeteilt worden. Die Streptokokken der Gruppe D werden weiter in die Enterokokken (S. faecium, S. faecalis, S. avium und S. gallinarum) und die Nicht-Enterokokken S. bovis und S. equinus unterteilt. S. faecium, S. faecalis und S. avium werden als medizinisch bedeutsame Enterokokken angesehen. Einige Streptokokkenarten sind Pathogene beim Menschen; andere sind die normale Flora in Mund und Darm, sind aber fähig, bei Einführung an andere Stellen Krankheiten zu verursachen. Zwei Beispiel sind S. faecium und S. faecalis, die normalerweise im Darm anzutreffen sind, sich aber ausbreiten können, wodurch Bakterämie, Wundinfektionen und sogar 10 % der Harnwegsinfektionen in den USA verursacht werden.
  • Derzeitige Verfahren zum Nachweis von Enterococci erfordern die 18-72 Stunden lange Kultivierung der Probe, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests. Die nachstehend gezeigte Oligonukleotidsequenz detektiert bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay akkurat Streptococcus faecalis, S. avium und S. faecium. Die Sonde der Erfindung geht keine Kreuzreaktion mit anderen Streptococci oder Staphylococci, die hinsichtlich der DNA-Homologie sehr nah verwandt sind (Kiepper-Baez, 1981, 1982, Schliefer, 1984), ein. Die vorliegende Erfindung vermindert auch die Anzahl von Tests, die an einer Probe durchgeführt werden müssen, und verringert in großem Maße die Zeit bis zur Identifizierung und somit zur Diagnose. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die Sondensequenz wurde unter Verwendung eines zu 16S-rRNA komplementären Primers mit der Sequenz 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3' identifiziert. Die folgende Sequenz wurde charakterisiert und man zeigte, daß sie spezifisch für die drei Enterococci S. faecium, S. faecalis und S. avium ist. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn S. agalactiae, S. bovis, S. pneumoniae und S. pyrogenes wurden zum Vergleich mit den Sequenzen von Interesse herangezogen.
    • 1. TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA
  • Die Sequenz ist 35 Basen lang und hat eine Tm von 72°C. Sie ist fähig, in der den Basen 825-860 von E. coli-16S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde aufzuzeigen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay mit gereinigter RNA oder aus Zellen freigesetzter RNA verwendet. Eine Suspension mit mindestens 107 Zellen in 2 % Natriumdodecylsulfat wurde in Gegenwart von Glasperlen gevortext. 0,1 ml der Suspension wurden mit 0,1 ml Hybridisierungspuffer (0,96 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,002 M EDTA, 0,002 M EGTA) gemischt und 2 Stunden lang bei 65°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 ml 2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Phosphatpuffer, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben und die Proben wurden gevortext, zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt. Die Tabelle 43 zeigt, daß die Sonde gut mit S. faecium, S. faecalis und S. avium reagiert und nicht mit anderen nah verwandten Organismen reagiert.
    Tabelle 43 Hybridisierung der Enterococcus-Sonde an nah verwandte Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Staphylococcus aureus 12600 1,4
    Streptococcus agalactiae 13813 1,5
    Streptococcus avium 14025 22,7
    Streptococcus bovis 33317 1,4
    Streptococcus faecalis 19433 45,3
    Streptococcus faecium 19434 43,0
    Streptococcus mitis 9811 1,5
    Streptococcus pneumoniae 6306 1,5
    Streptococcus pyogenes 19615 1,3
  • Beispiel 14
  • Pseudomonaden sind gramnegative, nicht-sporenbildende, nicht-fermentative Bacilli bzw. Stäbchen. Pseudomonaden sind häufige Bewohner des Bodens und des Wassers und infizieren gesunde Personen selten. Wenn die Organismen auf bereits beeinträchtigte Patienten treffen, können sie eine Vielzahl von klinischen Syndromen verursachen, einschließlich Wundinfektionen, Infektionen nach chirurgischen Eingriffen, Septikämie, Durchfall bei Kindern und Infektionen der Atem- und Harnwege. Wegen der Resistenz der Organismen gegen Antibiotika ist es besonders wichtig, Mitglieder der Gattung Pseudomonas in einer klinischen Probe zu identifizieren. Nukleinsäurehomologieuntersuchungen haben die Gattung in fünf Homologieklassen unterteilt, die als RNA-Gruppen I-V bekannt sind. 83 % aller klinischen Isolate von Pseudomonas sind aus der RNA-Gruppe I, und Pseudomonas aeruginosa ist bei weitem die häufigste isolierte Art.
  • Derzeitige Verfahren zum Nachweis von Pseudomonas erfordern die 24-72 Stunden lange Kultivierung einer Patienten-Probe, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests. Die nachstehende Oligonukleotidsequenz detektiert bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay die klinisch bedeutsame Pseudomonas-Gruppe I. Die vorliegende Erfindung vermindert die Anzahl von Tests, die an einer einzelnen Probe durchgeführt werden müssen, und verringert die Zeit für den Nachweis. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die Sequenz wurde mit einem zu einer konservierten Region auf 23S-rRNA komplementären Primer mit der Sequenz 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3' erhalten. Von der folgenden Sequenz wurde gezeigt, daß sie Pseudomonaden der Gruppe I detektiert:
    • 1. CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT
  • Die Sequenz ist 35 Basen lang und hat eine Tm von 70°C. Sie ist fähig, an die RNA von Gruppe I-Pseudomonas in der den Basen 365-405 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde aufzuzeigen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. 32P-endmarkiertes Oligonukleotid wurde mit RNA vermischt, welche aus mindestens 107 Organismen durch Standardverfahren in 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 % Natriumdodecylsulfat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA freigesetzt worden war, und 2 Stunden lang bei 65°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die RNA:DNA-Hybride wie für die vorhergehenden Beispiele beschrieben an Hydroxyapatit gebunden und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt. Die Tabelle 44 zeigt, daß die Sonde gut mit allen 8 Arten der Gruppe I-Pseudomonaden, die getestet wurden, reagierte. Die Sonde reagierte nicht mit RNA aus Organismen der Gruppe II oder der Gruppe V. Eine geringe Reaktion war mit Pseudomonas acidovorans ersichtlich, einem Organismus der Gruppe III, der < 1% aller Isolate nicht-fermentativer Bacilli aus klinischen Proben darstellt. Die Tabelle 45 zeigt, daß die Sonde nicht mit anderen nah verwandten Organismen reagiert, die getestet wurden.
    Tabelle 44 Hybridisierung von Pseudomonas-Gruppe I-Sonde an Pseudomonas-RNAs
    Organismus Gruppe ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Pseudomonas alcaligenes I 14909 24
    Pseudomonas aeruginosa I 10145 83
    Pseudomonas denitrificans I 13867 83
    Pseudomonas fluorescens I 13525 82
    Pseudomonas mendocina I 25411 79
    Pseudomonas pseudoalcaligenes I 17440 78
    Pseudomonas putida I 12633 80
    Pseudomonas stutzeri I 17588 84
    Pseudomonas cepacia II 25416 0
    Pseudomonas pickettii II 27511 1,0
    Pseudomonas acidovorans III 15668 11
    Pseudomonas maltophilia V 13637 0,2
    (*) % gebundene Sonde = bei Gegenwart von RNA gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
    Tabelle 45 Hybridisierung von Pseudomonas-Gruppe I-Sonde an RNAs nahe verwandter Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 1,6
    Legionella pneumophila 33155 0,6
    Moraxella phenylpyruvica 23333 0,3
    Morganella morganii 25830 0
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0,6
    (*) % gebundene Sonde = bei Gegenwart von RNA gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Beispiel 15
  • Beispiel 15-18 beschreiben Sonden für die Enterobacteriaceae, von denen auf DNA-Ebene alle in hohem Maße verwandt sind. Auf rRNA-Ebene existieren noch weniger Unterschiede. Zum Beispiel ist Proteus vulgaris-16S-rRNA zu 93 % homolog zu E. coli. Diese Faktoren veranschaulichen die mit der Herstellung von für diese Organismengruppe spezifischen Sonden assoziierten Schwierigkeiten. Nichtsdestoweniger haben wir Sonden für Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Salmonella und E. coli erfunden.
  • Mitglieder der Gattung Enterobacter sind bewegliche, gramnegative, nicht-sporenbildende Bacilli, die zur Familie Enterobacteriaceae gehören. Die Gattung ist eine große und heterogene Gruppe. Acht Arten sind definiert worden, aber nur 5 sind klinisch bedeutsam. Enterobacter cloacae und E. aerogenes sind die häufigsten Isolate und werden mit Infektionen des Urogenitalsystems, der Lungen, des Bluts, des Zentralnervensystems und weicher Gewebe beim Menschen in Zusammenhang gebracht.
  • Das derzeitige Verfahren zur Identifizierung von Enterobacter cloacae aus Patientenproben beinhaltet die 18-24 Stunden lange Kultivierung der Probe auf Agarplatten, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests. Die nachstehend beschriebene Oligonukleotidsequenz identifiziert bei Anwendung als Sonde in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay akkurat Enterobacter cloacae. Die vorliegende Erfindung vermindert die Anzahl von Tests, die an einer einzelnen Probe durchgeführt werden müssen, die Zeit für die Identifizierung und dadurch für die Diagnose und stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die für Enterobacter cloacae spezifische Sonde wurde mit einem zu einer konservierten Region auf 23S-rRNA komplementären Primer mit der Sequenz 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3 erhalten.
  • Die folgende Sequenz wurde charakterisiert und man zeigte, daß sie spezifisch für E. cloacae ist. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis und Citrobacter freundii wurden als Vergleiche mit der Sequenz von E. cloacae herangezogen.
    • 1. GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC
  • Die Sonde ist 29 Basen lang und hat eine Tm von 68°C. Sie ist fähig, an RNA von E. cloacae in der den Basen 305-340 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde für E. cloacae aufzuzeigen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit RNA vermischt, welche aus mindestens 107 Organismen in 1 % Natriumdodecylsulfat, 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8 (0,2 ml Endvolumen) freigesetzt worden war, und 2 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 5 ml 2%iges Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 60°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben, die Probe gevortext, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 46 gezeigt und veranschaulichen, daß die Sonde gut mit E. cloacae reagiert und nicht mit der RNA von nahe verwandten Organismen reagiert.
    Tabelle 46 Hybridisierung der Enterobacter cloacae-Sonde an nah verwandte Organismen
    Organismen-Name ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Citrobacter freundii 8090 1,8
    Enterobacter aerogenes 13048 1,4
    Enterobacter cloacae 13047 27
    Escherichia coli 11775 1,0
    Klebsiella pneumoniae 13883 1,7
    Proteus mirabilis 29906 0,9
    Proteus vulgaris 13315 0,6
    Providencia stuartii 29914 1,1
  • Die Tabelle 47 zeigt, daß die Sonde nicht mit der RNA von im Urin gefundenen Organismen reagiert.
    Tabelle 47 Hybridisierung der Enterobacter cloacae-Sonde an im Urin gefundene Organismen.
    Organismen-Name ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Candida albicans 18804 0,8
    Candida krusei 34135 0,8
    Candida parapsilosis 22019 0,9
    Candida tropicalis 750 1,1
    Pseudomonas aeruginosa 10145 1,0
    Serratia marcescens 13880 1,6
    Staphylococcus aureus 12600 1,7
    Staphylococcus epidermidis 14990 1,4
    Streptococcus agalactiae 13813 2,5
    Streptococcus faecium 19434 1,5
    Tonilopsis glabrata 2001 0,9
  • Beispiel 16
  • Mitglieder der Gattung Proteus sind bewegliche, gramnegative, nicht-sporenbildende Bacilli, die zur Familie Enterobacteriaceae gehören. Vier Arten von Proteus sind beschrieben worden, und drei davon, Proteus mirabilis, P. vulgaris und P. penneri verursachen Erkrankungen beim Menschen.
  • Der häufigste Typ von Proteus-Infektion betrifft den Harntrakt, aber auch Septikämie, Lungenentzündung und Wundinfektionen treten auf. Proteus mirabilis ist die am häufigsten isolierte Art und kann für bis zu 10 % aller akuten nicht-komplizierten Harnwegsinfektionen verantwortlich gemacht werden. Eine Identifizierung des Verursacher-Organismus auf der Ebene der Art statt der Gattung ist wegen unterschiedlicher Antibiotikaempfindlichkeit unter den Arten wünschenswert.
  • Das derzeitige Verfahren zur Identifizierung von Proteus mirabilis aus Patientenproben beinhaltet die 18-24 Stunden lange Kultivierung der Probe auf Agarplatten, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests. Die nachstehend beschriebene Oligonukleotidsequenz identifiziert bei Anwendung als Sonde in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay akkurat Proteus mirabilis. Die vorliegende Erfindung vermindert die Anzahl von Tests, die an einer Probe durchgeführt werden müssen, die Zeit zur Identifizierung und dadurch bis zur Diagnose und Behandlung. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die für Proteus mirabilis spezifische Sonde wurde mit einem zu einer konservierten Region von 23S-rRNA komplementären Primer mit der Sequenz 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3 erhalten.
  • Die folgende Sequenz wurde charakterisiert und man zeigte, daß sie spezifisch für P. mirabilis ist. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, und Salmonella enteritidis wurden als Vergleiche mit der Sequenz von Proteus mirabilis herangezogen.
    • 1. CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC
  • Diese Sonde ist fähig, an RNA von P. mirabilis in der den Basen 270-305 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Region zu hybridisieren. Die Sonde ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde für P. mirabilis aufzuzeigen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit RNA vermischt, welche aus mindestens 107 Organismen in 1 % Natriumdodecylsulfat, 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (0,2 ml Endvolumen) freigesetzt worden war, und 2 Stunden lang bei 64°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 5 ml 2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 64°C inkubiert. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben, die Probe gevortext, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 48 gezeigt und demonstrieren, daß die Sonde gut mit P. mirabilis reagiert und nicht mit 27 anderen nahe verwandten Bakterien reagiert. Die Tabelle 49 zeigt, daß die Sonde nicht mit 24 anderen phylogenetisch unterschiedlichen Bakterien und zwei Hefen reagiert, welche auf dieselbe Weise wie die Organismen in Tabelle 48 getestet wurden.
    Tabelle 48 Hybridisierung von Proteus mirabilis-Sonde an nah verwandte Organismen
    Organismenname ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Citrobacter diversus 27156 1,1
    Citrobacter freundii 8090 1,1
    Citrobacter freundii 6750 1,0
    Enterobacter aerogenes 13048 1,0
    Enterobacter agglomerans 27155 1,0
    Enterobacter cloacae e13047 1,1
    Enterobacter gergoviae 33028 1,0
    Enterobacter sakazakii 29544 1,1
    Escherichia coli 10798 1,2
    Escherichia coli 11775 1,2
    Escherichia coli 29417 1,2
    Klebsiella oxytoca 13182 1,0
    Klebsiella ozaenae 11296 1,1
    Klebsiella planticola 33531 0,9
    Klebsiella pneumoniae 13883 1,3
    Klebsiella pneumoniae 23357 1,1
    Klebsiella rhinoscleromatis 13884 1,2
    Klebsiella terrigena 33257 1,1
    Klebsiella trevisanii 33558 1,0
    Kluyvera ascorbata 33433 0,9
    Proteus mirabilis 25933 69,0
    Proteus penneri 33519 2,5
    Proteus vulgaris 13315 1,7
    Providencia alcalifaciens 9886 1,1
    Providencia rettgeri 29944 1,3
    Providencia stuartii 29914 1,1
    Salmonella arizonae 29933 1,1
    Salmonella enteritidis 13076 0,8
    Tabelle 49 Hybridisierung von P. mirabilis-Sonde an phylogenetisch unterschiedliche Organismen
    Organismenname ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,8
    Bacillus subtilis 6051 1,2
    Bacteroides fragilis 23745 0,9
    Branhamella catarrhalis 25238 0,7
    Campylobacter jejuni 33560 1,0
    Candida krusei 34135 0,8
    Chromobacterium violaceum 29094 1,1
    Clostridium perfringens 13124 0,9
    Deinococcus radiodurans 35073 0,8
    Derxia gummosa 15994 0,8
    Hafnia alvei 13337 0,9
    Morganella morganii 25830 0,9
    Pseudomonas aeruginosa 10145 1,0
    Pseudomonas cepacia 17762 0,9
    Rahnella aquatilis 33071 0,9
    Rhodospirillum rubrum 11170 0,8
    Serratia marcescens 13880 0,9
    Serratia odorifera 33077 0,9
    Staphylococcus aureus e12600 0,8
    Staphylococcus epidermidis 14990 0,8
    Streptococcus mitis 9811 0,8
    Streptococcus pneumoniae e6306 0,9
    Torulopsis glabrata 2001 0,9
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0,8
    Xanthomonas maltophilia 13637 1,1
    Yersinia enterocolitica 9610 0,8
  • Beispiel 17
  • Mitglieder der Gattung Salmonella sind bewegliche, gramnegative, nicht-sporenbildende Bacilli, die zur Familie Enterobacteriaceae gehören. Alle Salmonellae sind hoch verwandt und manche Mikrobiologen betrachten sie als eine Art. Unter Anwendung von Nukleinsäure-Homologieuntersuchungen sind fünf Untergruppen identifiziert worden, und über 1400 verschiedene Serotypen sind beschrieben worden. Alle Serotypen sind mit menschlichen Darmerkrankungen in Zusammenhang gebracht worden, die von selbst-einschränkender (self limited) Gastroenteritis mit milden Symptomen zu schwerer Gastroenteritis mit Bakterämie bis zu typhoidem Fieber, einer potentiell lebensbedrohlichen Krankheit, reichen. S. cholerasuis, S. paratyphi A und S.typhi sind die am häufigsten mit schwerer Krankheit und Bakterämie assoziierten Serotypen. Die Diagnose von Salmonella-bedingter Enteritis ist abhängig vom Nachweis des Organismus in Stuhlproben. Da eine Infektion hauptsächlich durch Aufnahme kontaminierter Milch, Nahrung und Wasser stattfindet, sind Verfahren zur Identifizierung von Salmonella in diesen Produkten vor Freigabe an den Verbraucher von ausschlaggebender Bedeutung.
  • Derzeitige Verfahren zum Nachweis von Mitgliedern der Gattung Salmonella beinhalten die 1-3 Tage lange Kultivierung der Probe auf selektiven Medien, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests. Oft ist ein Anreicherungsschritt nötig, um Salmonella aus klinischen Proben oder Nahrungsprodukten zu isolieren. Die nachstehend gezeigten Oligonukleotidsequenzen identifizieren bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay akkurat Mitglieder der Gattung Salmonella. Die Sonden der vorliegenden Erfindung sind für alle Mitglieder der Gattung spezifisch und reagieren nicht mit den anderen nah verwandten Enterobacteriaceae-Gattungen. Diese Sonden vermindern die Anzahl von Tests, die an einer Probe durchgeführt werden müssen, und verringern in großem Maße die Zeit zur Identifizierung. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die für die Gattung Salmonella spezifischen Sonden wurden mit zwei zu 16S- und 23S-rRNA komplementären Primern erhalten. Die Sequenz 1 wurde unter Verwendung eines 16S-Primers mit der Sequenz 5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-3' erhalten. Die Sequenz 2 wurde unter Verwendung eines 23S-Primers mit der Sequenz 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3 erhalten. Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert und man zeigte, daß sie spezifisch für die Gattung Salmonella sind.
    • 1. CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC
    • 2. CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A
  • Die Sequenz 1, aus 16S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 73°C. Die Sequenz 2, aus 23S-rRNA, ist 34 Basen lang und hat eine Tm von 71°C. Diese Sonden sind fähig, in den den Basen 1125-1155 von E. coli-16S-rRNA bzw. 335-375 von E. coli-23S-rRNA entsprechenden Regionen zu hybridisieren. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde 1 für Mitglieder der Gattung Salmonella zu zeigen, wurde 32P-endmarkiertes Oligonukleotid als Sonde in einer Hybridisierungsreaktion getestet. Gereinigte RNA oder RNA, welche mittels Standardverfahren aus mindestens 107 Organismen freigesetzt worden war, wurde mit 1 ml Hybridisierungspuffer (Endkonzentration 43 % Diisobutylsulfosuccinat, 60 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) vermischt und 2-12 Stunden lang bei 72°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 5 ml Abtrennlösung (2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) zugegeben und die Probe wurde gemischt, 5 Minuten lang bei 72°C inkubiert, zentrifugiert, und die Überstande wurden entfernt. Vier ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben und die Proben wurden gevortext, zentrifugiert und die Überstande entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die in der Tabelle 50 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß eine Kombination der zwei Sonden an die 5 Untergruppen von Salmonella und an alle 31 Serotypen, die getestet wurden, hybridisierten.
    Tabelle 50 Hybridisierung der Salmonella-Sonden 1 und 2 an Mitglieder der Gattung Salmonella
    % gebundene
    Untergruppe Organismus ATCC-Nr. Sonde 1 Sonde 2
    I Salmonella choleraesuis 10708 24 40
    I Salmonella enteritidis 13076 15 67
    I Salmonella paratyphi A 9150 1,4 70
    I Salmonella sp. Serotyp Anatum 9270 40 26
    I Salmonella sp. Serotyp Cubana 12007 54 35
    I Salmonella sp. Serotyp Give 9268 12 40
    I Salmonella sp. Serotyp Heidelberg 8326 53 33
    I Salmonella sp. Serotyp Illinois 11646 36 46
    I Salmonella sp. Serotyp Montevideo 8387 35 32
    I Salmonella sp. Serotyp Newington 29628 52 34
    I Salmonella sp. Serotyp Newport 6962 3,4 36
    I Salmonella sp. Serotyp Putten 15787 34 39
    I Salmonella sp. Serotyp Saintpaul 9712 28 30
    I Salmonella sp. Serotyp Senftenberg 8400 38 43
    I Salmonella sp. Serotyp Simsbury 12004 29 29
    I Salmonella sp. Serotyp Sloterdijk 15791 34 30
    I Salmonella sp. Serotyp Thompson 8391 32 41
    I Salmonella sp. Serotyp Vellore 15611 35 2,6
    I Salmonella typhi 19430 7,0 21
    I Salmonella typhimurium 14028 69 69
    II Salmonella salamae 6959 3,0 46
    II Salmonella sp. Serotyp Maarssen 15793 6,6 30
    III Salmonella arizonae 33952 2,9 38
    III Salmonella arizonae 12324 5,5 42
    III Salmonella arizonae 29933 2,3 62
    III Salmonella arizonae 29934 63 12
    III Salmonella arizonae 12323 4,0 39
    III Salmonella arizonae 12325 51 1,9
    IV Salmonella sp. Serotyp Harmelen 15783 5,8 8,0
    IV Salmonella sp. Serotyp Ochsenzoll 29932 7,5 40
    V Salmonella sp. Serotyp Bongor cdc1319 60 1,8
  • Die Spezifität der Sonden für Mitglieder der Gattung Salmonella wurde mit Hybridisierungsreaktionen mit RNA aus nahe zu Salmonella verwandten Organismen gezeigt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 51 gezeigt.
    Tabelle 51 Hybridisierung der Salmonella-Sonden 1 und 2 an RNA von nah verwandten Organismen
    % gebundene
    Organismus ATCC-Nr. Sonde 1 Sonde 2
    Citrobacter freundii 6750 2,2 0
    Edwardsiella tarda 15947 0 0
    Enterobacter agglomerans 27155 0,6 0
    Enterobacter cloacae 13047 0 0
    Enterobacter sakazakii 29544 0 0
    Escherichia coli 10798 0 0
    Escherichia coli 29417 0 0
    Klebsiella pneumoniae 23357 0,7 0
    Kluyvera ascorbata 33433 0 0,5
    Proteus mirabilis 25933 0,2 0
    Shigella flexneri 29903 0 0
    * % gebundene Sonde = an Hydroxyapatit gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Die Tabelle 52 zeigt, daß die Salmonella-Sonden 1 und 2 nicht an phylogenetisch unterschiedliche Organismen hybridisieren
    Tabelle 52 Hybridisierung der Salmonella-Sonden 1 und 2 an RNA eines phylogenetischen Querschnitts von Organismen
    % gebundene*
    Organismus ATCC-Nr. Sonde 1 Sonde 2
    Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,1 0,1
    Bacillus subtilis 6051 0 0,5
    Bacteroides fragilis 23745 0,1 0
    Branhamella catarrhalis 25238 0,9 0
    Campylobacter jejuni 33560 0 0,2
    Candida krusei 34135 0,4 0,3
    Chromobacterium violaceum 29094 1,7 0
    Clostridium perfringens 13124 0,3 0
    Deinococcus radiodurans 35073 1,6 0,1
    Derxia gummosa 15994 1,2 0
    Hafnia alvei 13337 1,8 0
    Morganelli morganii 25830 0 1,1
    Pseudomonas aeruginosa 10145 0,5 0,7
    Pseudomonas cepacia 17762 0 0
    Pseudomonas maltophilia 13637 1,9 0
    Rahnella aquatilis 33071 1,2 0,3
    Rhodospirillum rubrum 11170 0,9 0
    Serratia marcescens 13880 0 0
    Serratia odorifera 33077 2,6 0,2
    Staphylococcus aureus e12600 0,2 0
    Staphylococcus epidermidis 14990 0 0
    Streptococcus mitis 9811 1,2 0,7
    Streptococcus pneumoniae e6306 0 0
    Torulopsis glabrata 2001 0 0
    Vibrio parahaemolyticus 17802 0 0,2
    Yersinia enterocolitica 9610 0 0
    * % gebundene Sonde = an Hydroxyapatit gebundene cpm – gebundene cpm bei Abwesenheit von RNA/im Assay eingesetzte Gesamt-cpm
  • Beispiel 18
  • Escherichia coli ist ein gramnegativer, nicht-sporenbildender Bacillus, der zur Familie Enterobacteriaceae gehört. Fünf Arten von Escherichia sind beschrieben worden: E. coli, der > 99% aller klinischen Isolate ausmacht, E. hermanii, E. blattae, E. vulneris und E. fergusonii. E. coli ist eine Hauptursache von Harntraktinfektionen, Bakterämie und Meningitidis bei Neugeborenen und kann einen als Tourista (Durchfall bei Touristen) bekannten Typ von Gastroenteritis verursachen.
  • Das derzeitige Verfahren zur Identifizierung von E. coli aus Patientenproben beinhaltet die 18-72 Stunden lange Kultivierung der Probe auf Agarplatten, gefolgt von einer Vielzahl biochemischer Tests an isolierten Kolonien. Die nachstehend beschriebene Oligonukleotidsequenz detektiert bei Anwendung als Sonde in einem Nukleinsäure-Hybridisierungsassay selbst bei Gegenwart anderer Organismen akkurat E. coli. Die vorliegende Erfindung vermindert die Anzahl von Tests, die an einer Probe durchgeführt werden müssen, und verringert die Zeit für die Identifizierung und dadurch für die Diagnose und Behandlung. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die für E. coli spezifische Sonde wurde aus der veröffentlichten E. coli-Sequenz (Brosius, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 4801-4805 (1978)) unter Heranziehung von Proteus vulgaris (Carbon et al., Nuc. Acids Res. 9: 2325-2333(1981)), Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Enterobacter gergoviae und Citrobacter freundii für Vergleiche abgeleitet. Die Sondensequenz ist nachstehend gezeigt:
    • 1. GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG
  • Sie hybridisiert an RNA von E. coli in der Region 995-1030 von 16S-rRNA. Die Sonde ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde für E. coli aufzuzeigen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. 32P-endmarkierte Oligonukleotidsonde wurde mit zwei unmarkierten Oligonukleotiden der Sequenz 5'-TGG ATG TCA AGA CCA GGT AAG GTT CTT CGC GTT GCA TCG-3' und 5'-CTG ACG ACA GCC ATG CAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC CGA AGG CA-3' und mit gereinigter RNA und RNA, welche aus Zellen mit Detergenz und Wärme in 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (0,2 ml Endvolumen) freigesetzt worden war, vermischt und 2 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 5 ml 2%iges Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 60°C inkubiert.
  • Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben, die Probe gevortext, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
  • Ein Anwendungsbeispiel für diese Sonde bestünde im Nachweis von E. coli in Urinproben. Die Tabelle 53 zeigt, daß die Sonde 7 von 8 getesteten E. coli-Stämmen nachweist. Die Sonde reagiert auch mit E. fergusonii, einem Organismus, der nur selten im Urin zu finden ist.
  • Die Tabelle 54 zeigt, daß die Sonde nicht mit irgendeiner anderen getesteten Gattung reagiert, außer Shigella, einem anderen selten aus Urin isoliertem Organismus. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Sonde nützlich beim Nachweis von E. coli aus Urinproben sein wird.
    Tabelle 53 Hybridisierung von E. coli an Escherichia-Arten
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Escherichia coli 10798 70
    E. coli 11775 67
    E. coli 23722 58
    E. coli 25404 68
    E. coli 25922 55
    E. coli 29417 72
    E. coli 33780 0,8
    E. coli 35150 45
    E. fergusonii 35469 55
    E. hermanii 33650 0,7
    E. vulneris 33821 0,8
    Tabelle 54 Hybridisierung der E. coli-Sonde an nah verwandte Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Citrobacter freundii 6750 0,8
    Citrobacter freundii 8090 0,9
    Citrobacter freundii 29221 0,6
    Citrobacter freundii 33128 0,6
    Enterobacter aerogenes 13048 1,2
    Enterobacter agglomerans 27155 0,9
    Enterobacter cloacae 13047 0,9
    Enterobacter gergoviae 33023 0,7
    Enterobacter sakazakii 29544 0,6
    Klebsiella oxytoca 13182 0,7
    Klebsiella pneumoniae 13883 0,7
    Proteus mirabilis 29906 0,7
    Proteus vulgaris 13315 0,8
    Shigella boydii 8700 76
    Shigella dysenteriae 13313 0,8
    Shigella flexneri 29903 71
    Shigella sonnei 29930 75
  • Beispiel 19
  • Die Bakterien überspannen eine morphologisch und physiologisch unterschiedliche Gruppe unizellulärer Organismen, welche die meisten natürlichen Umgebungen bewohnen. Obwohl viele Bakterien harmlos oder nutzbringend für ihre Umgebung oder ihren Wirt sind, sind manche schädlich und verursachen Krankheiten. Die Gegenwart jeglicher Bakterien an manchen Stellen ist unerwünscht oder deutet auf eine Erkrankung hin (z.B. Kulturmedien, pharmazeutische Produkte, Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin oder Cerebrospinalflüssigkeit, und Gewebebiopsien). Geringe Spiegel von Bakterien werden in anderen Produkten, wie Trinkwasser und Nahrungsprodukten, als annehmbar erachtet. Folglich besteht ein Bedarf nach einer Methode zum Nachweisen und Quantifizieren von Bakterien in einer Probe.
  • Das derzeitige Verfahren des Nachweisen und der Quantifizierung von Bakterien insgesamt in einer Probe erfordert die Kultivierung auf mehreren Typen von Medien unter verschiedenen Temperatur- und Atmosphärenbedingungen. Bis heute existiert kein Einzeltest zum Nachweis oder zur Quantifizierung aller Bakterien. Die nachstehend gezeigten Oligonukleotidsequenzen detektieren bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay einen breiten phylogenetischen Querschnitt von Bakterien. Die vorliegende Erfindung vermindert die Anzahl von Tests, die durchgeführt werden müssen, und verringert auch die für den Assay benötigte Zeit. Der Vergleich der Hybridisierungsergebnisse aus einer unbekannten Probe mit einem Satz von Standards wird eine gewisse Quantifizierung der Anzahl vorhandener Bakterien erlauben. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die bakteriellen Sonden wurden im Anschluß an die Untersuchung veröffentlichter rRNA-Sequenzen und bei Gen-Probe bestimmter Sequenzen entworfen. Die zum Vergleich verwendeten Sequenzen schließen Agrobacterium tumefaciens (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4443, (1985)), Anacystis nidulans (Tomioka und Sugiura, Mol. Gen. Genet. 191: 46 (1983), Douglas und Doolittle, Nuc. Acids Res. 12: 3373 (1984)), Bacillus subtilis (Green et al., Gene 37: 261, (1985)), Bacillus stearothermophilus (Kop et al., DNA 3: 347 (1984)), Bacteroides fragilis (Weisburg et al., J. Bacteriol. 164: 230, (1985)), Chlamydia psittaci (Weisburg et al., J. Bacteriol. 167: 570 (1986)), Desulfovibrio desulfuricans (Oyaizu und Woese, System. Appl. Microbiol. 6: 257, (1985)), Escherichia coli (Brosius, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 201 (1980)), Flavobacterium heparinum (Weisburg et al., J. Bacteriol. 164: 230, (1985)), Heliobacterium chlorum (Woese et al., Science 229: 762, (1985)), Mycoplasma PG50 (Frydenberg und Christiansen, DNA 4: 127 (1985)), Proteus vulgaris (Carbon et al., Nuc. Acids Res. 9: 2325 (1981)), Pseudomonas testosteroni (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4443, (1985)), Rochalimaea quintana (Weisburg et al., Science 230: 556, (1985)), Saccharomyces cerevisiae (Rubstov et al., Nuc. Acids Res. 8: 5779 (1980); Georgiev et al., Nuc. Acids Res. 9: 6953, (1981)) und den Menschen (Torczynski et al., DNA 4: 283, (1985); Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7666 (1985)) ein.
  • Es wurde gezeigt, daß die folgenden Sequenzen an einen breiten phylogenetischen Querschnitt von Bakterien hybridisieren und nicht an rRNA aus Hefe oder Menschen:
    • 1. CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC
    • 2. CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG
    • 3. GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT
    • 4. GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG
    • 5. GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG
    • 6. GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC
    • 7. GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C
  • Die Sonde 1 ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 70°C. Die Sonde 2 ist 33 Basen lang und hat eine Tm von 69°C. Die Sonde 3 ist 26 Basen lang und hat eine Tm von 67°C. Die Sonde 4 ist 27 Basen lang und hat eine Tm von 69°C. Die Sonde 5 ist 24 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sonde 6 ist 23 Basen lang und hat eine Tm von 62°C. Die Sonde 7 ist 34 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sonden 1-3 hybridisieren an 16S-rRNA jeweils in den folgenden Regionen (entsprechend zu den E. coli-Basen) 330-365; 675-715 bzw. 1080-1110. Die Sonden 4-7 hybridisieren an 23S-rRNA jeweils in den folgenden Regionen (entsprechend zu den E. coli-Basen) 460-490; 1050-1080 bzw. 1900-1960 (Sonden 6 und 7). Die Oligonukleotide interagieren mit Regionen auf der rRNA, die unter den Eubacteria hoch konserviert sind. Das heißt, daß sie als panbakterielle Sonden in einem Hybridisierungsassay eingesetzt werden können. Eine zweite Anwendung liegt im Einsatz als Werkzeug zum Erhalt einer rRNA-Sequenz vor. Zum Beispiel kann ein Oligonukleotid an die rRNA von Interesse hybridisiert werden und mit reverser Transkriptase verlängert werden. Die Sequenz der resultierenden DNA kann bestimmt und verwendet werden, um die komplementäre rRNA-Sequenz, wie in der "Ausführlichen Beschreibung der Erfindung" beschrieben, abzuleiten.
  • Eine Anwendung der Erfindung liegt im Nachweis von Bakterien im Urin (Bacteriurie). Um die Reaktivität und Spezifität der Sonden für im Urin gefundene Bakterien aufzuzeigen, wurden sie in Hybridisierungsassays verwendet. 32P-endmarkierte oder 125I-markierte Oligonukleotidsonden wurden mit durch Standardverfahren (z. B. Ultraschallaufbruchtechniken, Detergenz mit Glaskügelchen oder enzymatische Lyse) aus Zellen freigesetzter RNA vermischt. Die Sonde wurde mit RNA in 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Natriumdodecylsulfat (0,2 ml Endvolumen) vermischt und 2 Stunden lang bei 60°C hybridisiert. Fünf ml 2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 60°C inkubiert.
  • Die Mischung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat) wurden zugegeben und die Probe wurde gemischt, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Tabellen 55-68 verdeutlichen die Spezifität dieser Sonden und zeigen, daß eine Kombination von Sonden verwendet werden könnte, um alle Bakterien, die getestet wurden, nachzuweisen.
  • Die Tabelle 55 zeigt, daß Sonde 1 an die RNA von häufig aus Urin isolierten Bakterien hybridisiert und Hefe-RNA nicht nachweist. Die Tabelle 56 zeigt, daß die Sonde 1 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche RNA hybridisiert.
    Tabelle 55 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 1 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 2,6
    Candida krusei 34135 2,2
    Candida parapsilosis 22019 2,9
    Candida tropicalis 750 2,5
    Citrobacter freundii 8090 69
    Enterobacter aerogenes 13048 70
    Enterobacter cloacae 13047 71
    Escherichia coli 11775 67
    Klebsiella oxytoca 13182 70
    Klebsiella pneumoniae 13883 72
    Morganella morganii 25830 66
    Proteus mirabilis 29906 71
    Proteus vulgaris 13315 67
    Providencia stuartii 29914 69
    Pseudomonas aeruginosa 10145 76
    Pseudomonas fluorescens 13525 73
    Serratia marcescens 13880 66
    Staphylococcus aureus 12600 57
    Staphylococcus epidermidis 14990 68
    Streptococcus agalactiae 13813 68
    Streptococcus faecalis 19433 51
    Streptococcus faecium 19434 53
    Torulopsis glabrata 2001 2,3
    Ureaplasma urealyticum 27618 54
    Tabelle 56 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 1 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 65
    Bacillus subtilis 6051 73
    Bacteroides fragilis 23745 61
    Branhamella catarrhalis 25238 72
    Campylobacter jejuni 33560 64
    Chlamydia trachomatis VR878 14
    Chromobacterium violaceum 29094 71
    Clostridium perfringens 13124 74
    Corynebacterium xerosis 373 38
    Deinococcus radiodurans 35073 47
    Derxia gummosa 15994 65
    Gardnerella vaginalis 14018 67
    Hafnia alvei 13337 60
    Lactobacillus acidophilus 4356 56
    Moraxella osloensis 19976 61
    Mycobacterium smegmatis 14468 47
    Mycoplasma hominis 14027 58
    Neisseria gonorrhoeae 19424 58
    Rahnella aquatilis 33071 74
    Rhodospirillum rubrum 11170 73
    Vibrio parahaemolyticus 17802 75
    Mensch 2,5
  • Die Tabelle 57 zeigt, daß die Sonde 2 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert, mit der Ausnahme von Ureaplasma urealyticum, und nicht an Hefe-rRNA hybridisiert.
    Tabelle 57 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 2 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 2,5
    Candida krusei 34135 1,8
    Candida parapsilosis 22019 1,6
    Candida tropicalis 750 1,4
    Citrobacter freundii 8090 61
    Enterobacter aerogenes 13048 57
    Enterobacter cloacae 13047 61
    Escherichia coli 11775 67
    Klebsiella oxytoca 13182 67
    Klebsiella pneumoniae 13883 51
    Morganella morganii 25830 69
    Proteus mirabilis 29906 69
    Proteus vulgaris 13315 69
    Providencia stuartii 29914 66
    Pseudomonas aeruginosa 10145 59
    Pseudomonas fluorescens 13525 58
    Serratia marcescens 13880 64
    Staphylococcus aureus 12600 60
    Staphylococcus epidermidis 14990 60
    Streptococcus agalactiae 13813 54
    Streptococcus faecalis 19433 37
    Streptococcus faecium 19434 58
    Torulopsis glabrata 2001 1,5
    Ureaplasma urealyticum 27618 3,2
  • Die Tabelle 58 zeigt, daß die Sonde 2 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche rRNA hybridisiert.
    Tabelle 58 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 2 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 76
    Bacillus subtilis 6051 75
    Bacteroides fragilis 23745 2,0
    Branhamella catarrhalis 25238 70
    Campylobacter jejuni 33560 2,5
    Chlamydia trachomatis VR878 16
    Chromobacterium violaceum 29094 61
    Clostridium perfringens 13124 66
    Corynebacterium xerosis 373 3,8
    Deinococcus radiodurans 35073 6,0
    Derxia gummosa 15994 61
    Gardnerella vaginalis 14018 2,0
    Hafnia alvei 13337 72
    Lactobacillus acidophilus 4356 50
    Moraxella osloensis 19976 64
    Mycobacterium smegmatis 14468 19
    Mycoplasma hominis 14027 34
    Neisseria gonorrhoeae 19424 71
    Rahnella aquatilis 33071 77
    Rhodospirillum rubrum 11170 1,5
    Vibrio parahaemolyticus 17802 '73
    Yersinia enterocolitica 9610 76
    Mensch 2,0
  • Die Tabelle 59 zeigt, daß die Sonde 3 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert und Hefe-rRNA nicht detektiert.
    Tabelle 59 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 3 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 1,4
    Candida krusei 34135 1,5
    Candida parapsilosis 22019 2,2
    Candida tropicalis 750 2,6
    Citrobacter freundii 8090 79
    Enterobacter aerogenes 13048 40
    Enterobacter cloacae 13047 44
    Escherichia coli 11775 67
    Klebsiella oxytoca 13182 38
    Klebsiella pneumoniae 13883 45
    Morganella morganii 25830 57
    Proteus mirabilis 29906 40
    Proteus vulgaris 13315 51
    Providencia stuartii 29914 54
    Pseudomonas aeruginosa 10145 61
    Pseudomonas fluorescens 13525 56
    Serratia marcescens 13880 54
    Staphylococcus aureus 12600 37
    Staphylococcus epidermidis 14990 20
    Streptococcus agalactiae 13813 34
    Streptococcus faecalis 19433 20
    Streptococcus faecium 19434 47
    Torulopsis glabrata 2001 1,9
    Ureaplasma urealyticum 27618 26
  • Die Tabelle 60 zeigt, daß die Sonde 3 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche rRNA hybridisiert.
    Tabelle 60 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 3 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismusname ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 69
    Bacillus subtilis 6051 35
    Bacteroides fragilis 23745 1,2
    Branhamella catarrhalis 25238 43
    Campylobacter jejuni 33560 55
    Chlamydia trachomatis VR878 42
    Chromobacterium violaceum 29094 69
    Clostridium perfringens 13124 62
    Corynebacterium xerosis 373 23
    Deinococcus radiodurans 35073 30
    Derxia gummosa 15994 67
    Gardnerella vaginalis 14018 40
    Hafnia alvei 13337 56
    Lactobacillus acidophilus 4356 36
    Moraxella osloensis 19976 64
    Mycobacterium smegmatis 14468 77
    Mycoplasma hominis 14027 1,5
    Neisseria gonorrhoeae 19424 26
    Rahnella aquatilis 33071 66
    Rhodospirillum rubrum 11170 51
    Vibrio parahaemolyticus 17802 68
    Yersinia enterocolitica 9610 68
    Mensch 0,9
  • Die Tabelle 61 zeigt, daß die Sonde 4 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert und Hefe-rRNA nicht detektiert.
    Tabelle 61 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 4 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 4,5
    Candida krusei 34135 2,5
    Candida parapsilosis 22019 2,7
    Candida tropicalis 750 2,5
    Citrobacter freundii 8090 55
    Enterobacter aerogenes 13048 52
    Enterobacter cloacae 13047 57
    Escherichia coli 11775 70
    Klebsiella oxytoca 13182 70
    Klebsiella pneumoniae 13883 43
    Morganella morganii 25830 74
    Proteus mirabilis 29906 74
    Proteus vulgaris 13315 73
    Providencia stuartii 29914 73
    Pseudomonas aeruginosa 10145 76
    Pseudomonas fluorescens 13525 79
    Serratia marcescens 13880 74
    Staphylococcus aureus 12600 73
    Staphylococcus epidermidis 14990 73
    Streptococcus agalactiae 13813 70
    Streptococcus faecalis 19433 37
    Streptococcus faecium 19434 63
    Torulopsis glabrata 2001 2,2
    Ureaplasma urealyticum 27618 43
  • Die Tabelle 62 zeigt, daß die Sonde 4 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche rRNA hybridisiert.
    Tabelle 62 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 4 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismusname ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 69
    Bacillus subtilis 6051 55
    Bacteroides fragilis 23745 3,0
    Branhamella catarrhalis 25238 59
    Campylobacter jejuni 33560 65
    Chlamydia trachomatis VR878 50
    Chromobacterium violaceum 29094 61
    Clostridium perfringens 13124 57
    Corynebacterium xerosis 373 9,5
    Deinococcus radiodurans 35073 63
    Derxia gummosa 15994 65
    Gardnerella vaginalis 14018 57
    Hafnia alvei 13337 67
    Lactobacillus acidophilus 4356 68
    Moraxella osloensis 19976 68
    Mycobacterium smegmatis 14468 28
    Mycoplasma hominis 14027 74
    Neisseria gonorrhoeae 19424 76
    Rahnella aquatilis 33071 68
    Rhodospirillum rubrum 11170 59
    Vibrio parahaemolyticus 17802 75
    Yersinia enterocolitica 9610 74
    Mensch 2,8
  • Die Tabelle 63 zeigt, daß die Sonde 5 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert und Hefe-rRNA nicht detektiert.
    Tabelle 63 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 5 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 1,8
    Candida krusei 34135 1,7
    Candida parapsilosis 22019 2,2
    Candida tropicalis 750 1,8
    Citrobacter freundii 8090 39
    Enterobacter aerogenes 13048 38
    Enterobacter cloacae 13047 43
    Escherichia coli 11775 31
    Klebsiella oxytoca 13182 38
    Klebsiella pneumoniae 13883 66
    Morganella morganii 25830 50
    Proteus mirabilis 29906 44
    Proteus vulgaris 13315 52
    Providencia stuartii 29914 44
    Pseudomonas aeruginosa 10145 47
    Pseudomonas fluorescens 13525 25
    Serratia marcescens 13880 35
    Staphylococcus aureus 12600 26
    Staphylococcus epidermidis 14990 37
    Streptococcus agalactiae 13813 29
    Streptococcus faecalis 19433 14
    Streptococcus faecium 19434 33
    Torulopsis glabrata 2001 2,2
    Ureaplasma urealyticum 27618 73
  • Die Tabelle 64 zeigt, daß die Sonde 5 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche RNA hybridisiert.
    Tabelle 64 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 5 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 20
    Bacillus subtilis 6051 53
    Bacteroides fragilis 23745 44
    Branhamella catarrhalis 25238 22
    Campylobacter jejuni 33560 35
    Chromobacterium violaceum 29094 59
    Clostridium perfringens 13124 63
    Corynebacterium xerosis 373 1,7
    Deinococcus radiodurans 35073 5,7
    Derxia gummosa 15994 14
    Gardnerella vaginalis 14018 1,6
    Hafnia alvei 13337 44
    Lactobacillus acidophilus 4356 1,5
    Moraxella osloensis 19976 7,2
    Mycobacterium smegmatis 14468 39
    Mycoplasma hominis 14027 21
    Neisseria gonorrhoeae 19424 40
    Rahnella aquatilis 33071 55
    Rhodospirillum rubrum 11170 17
    Vibrio parahaemolyticus 17802 66
    Yersinia enterocolitica 9610 64
    Mensch 1,6
  • Die Tabelle 65 zeigt, daß die Sonde 6 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert und Hefe-rRNA nicht detektiert.
    Tabelle 65 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 6 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Candida albicans 18804 3,0
    Candida krusei 34135 2,0
    Candida parapsilosis 22019 2,2
    Citrobacter freundii 8090 54
    Enterobacter aerogenes 13048 50
    Enterobacter cloacae 13047 58
    Escherichia coli 11775 63
    Klebsiella oxytoca 13182 54
    Klebsiella pneumoniae 13883 55
    Morganella morganii 25830 60
    Proteus mirabilis 29906 64
    Proteus vulgaris 13315 67
    Providencia stuartii 29914 64
    Pseudomonas aeruginosa 10145 65
    Pseudomonas fluorescens 13525 31
    Serratia marcescens 13880 67
    Staphylococcus aureus 12600 53
    Staphylococcus epidermidis 14990 34
    Streptococcus agalactiae 13813 31
    Streptococcus faecium 19434 18
    Torulopsis glabrata 2001 2,5
  • Die Tabelle 66 zeigt, daß die Sonde 6 einige phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche rRNA hybridisiert.
    Tabelle 66 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 6 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 73
    Bacteroides fragilis 23745 7,0
    Branhamella catarrhalis 25238 4,0
    Deinococcus radiodurans 35073 5,5
    Derxia gummosa 15994 3,0
    Gardnerella vaginalis 14018 2,0
    Hafnia alvei 13337 3,5
    Lactobacillus acidophilus 4356 17
    Moraxella osloensis 19976 62
    Mycoplasma hominis 14027 44
    Rahnella aquatilis 33071 56
    Yersinia enterocolitica 9610 50
    Mensch 4,0
  • Die Tabelle 67 zeigt, daß die Sonde 7 an die RNA von häufig im Urin gefundenen Bakterien hybridisiert und Hefe-rRNA nicht detektiert.
    Tabelle 67 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 7 an RNA aus im Urin anzutreffenden Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Candida albicans 18804 2,1
    Candida krusei 34135 2,0
    Candida tropicalis 750 2,2
    Citrobacter freundii 8090 67
    Enterobacter aerogenes 13048 69
    Enterobacter cloacae 13047 78
    Escherichia coli 11775 75
    Klebsiella oxytoca 13882 79
    Klebsiella pneumoniae 13883 77
    Morganella morganii 25830 76
    Proteus mirabilis 29906 77
    Proteus vulgaris 13315 79
    Providencia stuartii 29914 64
    Pseudomonas aeruginosa 10145 76
    Pseudomonas fluorescens 13525 78
    Serratia marcescens 13880 66
    Staphylococcus aureus 12600 71
    Staphylococcus epidermidis 14990 75
    Streptococcus agalactiae 13813 70
    Streptococcus faecalis 19433 58
    Streptococcus faecium 19434 68
    Torulopsis glabrata 2001 2,4
    Ureaplasma urealyticum 27618 21
  • Die Tabelle 68 zeigt, daß die Sonde 7 phylogenetisch unterschiedliche Bakterien nachweist und nicht an menschliche rRNA hybridisiert.
    Tabelle 68 Hybridisierung der Bakterien-Sonde 7 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    Organismus ATCC-Nr. % gebundene Sonde*
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 86
    Bacillus subtilis 6051 83
    Bacteroides fragilis 23745 69
    Branhamella catarrhalis 25238 74
    Campylobacter jejuni 33560 5,3
    Chlamydia trachomatis VR878 41
    Chromobacterium violaceum 29094 69
    Clostridium perfringens 13124 68
    Corynebacterium xerosis 373 23
    Deinococcus radiodurans 35073 70
    Derxia gummosa 15994 69
    Gardnerella vaginalis 14018 68
    Hafnia alvei 13337 77
    Moraxella osloensis 19976 68
    Mycobacterium smegmatis 14468 64
    Mycoplasma hominis 14027 4,0
    Neisseria gonorrhoeae 19424 53
    Rahnella aquatilis 33071 72
    Rhodospirillum rubrum 11170 73
    Vibrio parahaemolyticus 17802 67
    Yersinia enterocolitica 9610 66
    Mensch 2,2
  • Beispiel 20
  • Die Pilze bzw. Fungi umfassen eine morphologisch und physiologisch diversifizierte Gruppe einfacher eukaryontischer Organismen. Wir schätzen unter Heranziehung veröffentlichter Sequenzen dreier Pilze, Neurospora crassa, Podospora und Saccharomyces, daß die rRNA von Pilzen zu 58-60 % homolog zu E. coli und zu 84-90 % homolog zueinander sind. Einige Pilze wachsen als Einzelzellen (Hefen), andere als vielkernige Filamente (Schleimpilze) und noch andere können entweder als Einzelzellen oder vielzellige Filamente wachsen (dimorphe Pilze). Obwohl viele Pilze harmlose Bewohner ihrer Umgebung sind, sind andere gefährlich und können Krankheiten verursachen. Die Gegenwart jeglicher Pilze an manchen Stellen ist unerwünscht oder deutet auf eine Erkrankung hin (z.B. Kulturmedien, pharmazeutische Produkte, Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin oder Cerebrospinalflüssigkeit, und Gewebebiopsien). Geringe Spiegel an Pilzen werden in anderen Produkten, wie Trinkwasser und Nahrungsprodukten, als annehmbar erachtet. Dies hat den Bedarf nach einer Methode zum Nachweis und Quantifizieren von Pilzen in einer Probe hervorgerufen.
  • Die derzeitigen Verfahren des Nachweises und der Quantifizierung von Pilzen beinhalten die mikroskopische Untersuchung von Proben und die Kultivierung auf verschiedenen Medien. Obwohl die meisten Hefen aus klinischen Proben in einigen Tagen herangezüchtet werden können, benötigen manche filamentösen Pilze bis zu vier Wochen Kulturzeit, wonach spezielle Färbungsverfahren, eine biochemische Analyse und Antigentests durchgeführt werden. Die nachstehenden Oligonukleotidsequenzen detektieren bei Anwendung in einem Hybridisierungsassay die fünf im klinischen Umfeld am häufigsten isolierten Hefen, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis und Candida krusei. Fünf andere, die Gattungen Trichosporon, Blastomyces, Cryptococcus and Saccharomyces repräsentierende Pilze werden ebenfalls nachgewiesen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Ein-Schritt-Nachweis dieser Organismen und vermindert im Verhältnis zur Kultivierung die Zeit zur Identifizierung oder Eliminierung dieser Pilze als Ursache einer Infektion. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.
  • Die vier Sonden, die an die Organismen von Interesse hybridisieren, wurde unter Verwendung von 3 zu konservierten Regionen auf 18S- oder 28S-rRNA komplementären Primern identifiziert. Die Sequenz 1 wurde unter Verwendung eines 18S-Primers mit der Sequenz 5'-AGA ATT TCA CCT CTG-3' erhalten. Die Sequenz 2 wurde unter Verwendung eines 28S-Primers mit der Sequenz 5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3' erhalten. Die Sequenzen 3 und 4 wurden mit einem 28S-Primer mit der Sequenz 5'-TTC CGA CTT CCA TGG CCA CCG TCC-3 erhalten. Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert und man zeigte, daß sie an Pilz-rRNA hybridisieren. Die Sequenzen von Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergiensis, Escherichia coli und menschlicher rRNA wurden zum Vergleich mit den Sequenzen von Interesse herangezogen.
    • 1. CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG
    • 2. CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TGT GG
    • 3. GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC AAC AAG G
    • 4. GCT CTG CAT TCA AAC GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC AGG G
  • Die Sequenz 1, aus 18S-rRNA, ist 30 Basen lang und hat eine Tm von 68°C. Die Sequenz 2, aus 23S-rRNA, ist 32 Basen lang und hat eine Tm von 67°C. Die Sequenz 3, aus 23S-rRNA, ist 40 Basen lang und hat eine Tm von 66°C. Die Sequenz 4, aus 23S-rRNA, ist 40 Basen lang und hat eine Tm von 68°C. Die Sequenz 1 hybridisiert in der zu Position 845-880 von Saccharomyces cerevisiae-18S-rRNA entsprechenden Region. Die Sequenz 2 hybridisiert in der zu Position 1960-2000 von Saccharomyces cerevisiae-28S-rRNA entsprechenden Region, und die Sequenzen 3 und 4 hybridisieren in der Region von 1225-1270 der 28S-rRNA.
  • Um die Reaktivität und Spezifität dieser Sonden für Pilz-RNA aufzuzeigen, wurden sie in Hybridisierungsassays verwendet. 32P- oder 125I-markierte Oligonukleotidsonden wurden mit gereinigter RNA oder RNA, die durch Standard-Lyse-Techniken aus Zellen freigesetzt worden war, in 0,2 ml 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 1 % Natriumdodecylsulfat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA vermischt und 2 Stunden lang bei 60°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 5 ml 2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat zugegeben, und die Proben wurden 10 Minuten lang bei 60°C inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstande entfernt. Fünf ml 0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,02 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben, die Proben wurden gemischt, zentrifugiert und die Überstande wurden entfernt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 69 gezeigt. Sonde 1 detektiert alle zehn Pilze, die getestet wurden, Sonde 2 detektiert alle sechs Hefen, die getestet wurden, Sonde 3 detektiert fünf der sechs Hefen, und die Sonde 4 detektiert nur C. krusei. Somit kann die Sonde 4 verwendet werden, um C. krusei in Proben zu detektieren und zu identifizieren, Sonde 1, 2 oder eine Kombination von 3 und 4 können verwendet werden, um die Hefen nachzuweisen, und die Sonde 1 kann verwendet werden, um jeden der zehn in Tabelle 69 aufgezählten Organismen zu detektieren.
  • Eine mögliche Anwendung für diese Sonden besteht darin, Hefen in Urinproben oder anderen normalerweise sterilen Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Die Sonden wurden an eine Auswahl von am häufigsten aus Urin isolierten Bakterien hybridisiert, und es wurde gezeigt, daß sie nicht reagieren (Tabelle 70). Die Tabelle 71 zeigt, daß die Sonden nicht an phylogenetisch verschiedene Bakterien oder an menschliche RNA hybridisieren.
    Tabelle 69 Hybridisierung von Hefe-Sonden an Hefe-RNA
    % gebundene Sonde
    Organismus ATCC-Nr. 1 2 3 4
    Blastomyces dermatitidis C.I. 25 1,4 1,5 1,5
    Candida albicans 18804 40 63 56 2,0
    C. krusei 34135 73 62 2,2 70
    C. parapsilosis 22019 71 63 65 2,0
    C. tropicalis 750 62 71 71 2,0
    Cryptococccus laurentii C.I. 43 1,4 1,5 1,5
    Cryptococcus neoformans C.I. 60 1,3 1,5 1,6
    Torulopsis glabrata 2001 61 44 62 2,0
    Trichosporon beigelii C.I. 57 1,3 2,1 1,5
    Saccharomyces cerevisiae C.I. 41 67 53 1,9
    C.I. = Klinisches Isolat
    Tabelle 70 Hybridisierung der Pilz-Sonden 1-4 an RNA von im Urin gefundenen Organismen
    % gebundene Sonde
    Organismus ATCC-Nr. 1 2 3 4
    Citrobacter freundii 8090 1,5 1,7 1,5 2,1
    Enterobacter aerogenes 13048 2,5 1,9 2,0 2,0
    Enterobacter cloacae 13047 2,5 1,6 2,6 2,0
    Escherichia coli 11775 3,0 2,0 1,6 1,5
    Klebsiella oxytoca 13182 2,5 2,2 2,5 2,0
    Klebsiella pneumoniae 13883 2,5 2,2 2,1 2,0
    Morganella morganii 25830 2,0 2,8 1,7 1,9
    Proteus mirabilis 29906 2,5 1,9 2,3 2,0
    Proteus vulgaris 13315 2,0 2,2 2,0 1,5
    Providencia stuartii 29914 3,0 1,7 2,8 2,0
    Pseudomonas aeruginosa 10145 2,0 1,9 1,3 2,0
    Pseudomonas fluorescens 13525 2,5 2,7 2,1 2,0
    Serratia marcescens 13880 2,5 1,7 1,8 2,0
    Staphylococcus aureus 12600 2,0 1,7 1,8 2,0
    Staphylococcus epidermidis 14990 3,0 1,5 1,3 2,0
    Streptococcus agalactiae 13813 2,5 1,9 1,3 2,5
    Streptococcus faecalis 19433 1,7 3,3 3,5 1,9
    Streptococcus faecium 19434 2,0 2,9 2,1 1,5
    Ureaplasma urealyticum 27618 2,1 3,1 2,4 1,8
    Tabelle 71 Hybridisierung der Pilzsonden 1-4 an RNAs eines Querschnitts phylogenetisch unterschiedlicher Organismen
    % gebundene Sonde
    Organismus ATCC-Nr. 1 2 3 4
    Acinetobacter calcoaceticus 23055 2,5 2,5 2,0 1,9
    Bacillus subtilis 6051 2,0 2,8 2,4 2,4
    Bacteroides fragilis 23745 2,0 2,2 2,5 2,3
    Branhamella catarrhalis 25238 2,5 3,2 1,8 1,7
    Campylobacter jejuni 33560 2,5 2,1 2,0 1,9
    Chlamydia trachomatis VR878 3,1 3,1 1,8 2,7
    Chromobacterium violaceum 29094 2,5 1,7 2,0 2,2
    Clostridium perfringens 13124 1,9 2,3 1,8 1,8
    Corynebacterium xerosis 373 1,6 4,8 1,8 1,1
    Deinococcus radiodurans 35073 2,0 1,6 2,1 0,8
    Derxia gummosa 15994 3,0 1,5 1,7 1,8
    Gardnerella vaginalis 14018 2,0 2,2 1,3 1,2
    Hafnia alvei 13337 1,0 2,5 1,7 1,6
    Lactobacillus acidophilus 4356 2,0 2,7 2,0 1,9
    Moraxella osloensis 19976 2,0 2,1 1,9 1,8
    Mycobacterium smegmatis 14468 1,6 1,8 1,8 1,7
    Mycoplasma hominis 14027 1,5 1,8 1,6 1,5
    Neisseria gonorrhoeae 19424 2,0 2,7 1,6 1,6
    Rahnella aquatilis 33071 2,0 2,7 2,3 2,1
    Rhodospirillum rubrum 11170 2,0 1,8 1,6 1,5
    Vibrio parahaemolyticus 17802 2,5 3,1 1,7 1,6
    Yersinia enterocolitica 9610 2,0 1,8 2,3 2,2
    Mensch 2,0 1,8 2,1 3,0
  • Es wurden auch zwei Derivate dieser Sonde hergestellt:
    CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC
    CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG
  • Das erste Derivat funktioniert gut bei 65°C, das zweite bei 60°C.
  • Beispiel 21
  • Gonorrhöe ist mit jährlich über zwei Millionen berichteten Fällen eine der am häufigsten berichteten bakteriellen Infektionen in den USA. Diese sexuell übertragene Krankheit führt gewöhnlich zu einer Entzündung der vorderen Harnröhre bei Männern und betrifft bei Frauen den Gebärmutterhals. Während bei unbehandelten Personen schwere Komplikationen und sogar Sterilität auftreten können, sind asymptomatische Infektionen häufig, was zu Trägern führt, die unwissentlich die Krankheit ausbreiten.
  • Das verursachende Agens, Neisseria gonorrhoeae, ist ein gramnegativer, Oxidase-positiver Diplococcus mit stringenten Wachstumsanforderungen. Das für die Diagnose angewandte Verfahren hängt vom Ort der Infektion und den Patientensymptomen ab. Gonokokkale Hamleiterentzündung bei Männern wird unter Anwendung der Gram-Färbung bei guter Empfindlichkeit und Spezifität diagnostiziert. Gewöhnlich muß eine Kultivierung, die 24-72 Stunden in Anspruch nimmt, durchgeführt werden, um die Diagnose der Gonorrhöe bei allen Frauen und asymptomatischen Männern zu bestätigen. Im Anschluß an den Nachweis des Organismus aus dem Wachstum in Kultur, muß Neisseria gonorrhoeae durch weitere Tests, wie Kohlenhydratabbau, Koagglutination, Fluoreszenzantikörper-Rasteruntersuchungen oder chromogene Enzymsubstratassays, identifiziert werden.
  • Neisseria gonorrhoeae ist unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde besonders schwierig nachzuweisen und zu unterscheiden, weil er sehr nah verwandt ist mit N. meningitidis. Die in Kingsbury, D.T., J. Bacteriol. 94: 870-874 (1967), veröffentlichten Daten zeigen eine DNA:DNA-Homologie für die zwei Arten von etwa 80-94%. Unter den vom "Ad Hoc-Comitee an Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics", Int'l J. System. Bacteriol. 37: 463-464 (1987), festgelegten Richtlinien bedeutet die phylogenetische Definition einer Art im allgemeinen eine 70%ige oder größere DNA:DNA-Homologie. Ungeachtet der Tatsache, daß diese Organismen unter festgelegten Prinzipien als dieselbe Art betrachtet werden können, waren wir in der Lage, Sonden herzustellen, die fähig sind, eine Unterscheidung zwischen ihnen zu treffen.
  • Wie erwartet ist die rRNA-Homologie zwischen N. gonorrhoeae und N. meningitidis aufgrund bekannter konservierter Regionen noch größer. Wir bemerkten einen Unterschied von 1,0 % zwischen den 16S- und einen Unterschied von 1,1 % zwischen den 23S-rRNA-Sequenzen von N. gonorrhoeae und N. meningitidis unter Anwendung unserer Sequenzierungsdaten.
  • Die Herstellung eine Sonde für N. gonorrhoeae wurde durch die Tatsache, daß an manchen Stellen, an denen sich N. meningitidis und N. gonorrhoeae unterschieden, andere Neisseria-Arten ähnlich zu N. gonorrhoeae waren, erschwert. Die wenigen Fehlpaarungen, die zwischen diesen beiden Arten existieren liegen in den am stärksten variablen Regionen, d.h. Regionen, die nicht nur zwischen Arten, sondern auch von Stamm zu Stamm variieren. Ungeachtet der Tatsache, daß manchmal angenommen wurde, daß die Arten überhaupt nicht unterschieden werden könnten, und andererseits angenommen wurde, daß rRNA zu konserviert sei, um nützlich bei der Sonden-Diagnostik zu sein, waren wir in der Lage, Sonden herzustellen, die fähig sind, eine Unterscheidung zwischen N. gonorrhoeae und N. meningitidis zu treffen.
  • Die vorliegende Erfindung hat bedeutende Vorteile gegenüber jedem der Verfahren nach dem Stand der Technik; die Sonden sind spezifischer und viel schneller als Kultivierungsverfahren. Es wird auch angenommen, daß die Sonden empfindlicher (d.h. fähig, eine kleinere Anzahl von Organismen in einer klinischen Probe nachzuweisen) sind als Verfahren nach dem Stand der Technik.
  • Die zur Identifizierung dieser Sondensequenzen verwendeten Primer hatten die folgenden Sequenzen:
    • 1. GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT
    • 2. GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC
    • 3. GCTCGTTGCGGGACTTAACCCACCAT
  • Jede der als Ziel gewählten rRNA-Stellen wies mindestens zwei Fehlpaarungen zu E. coli, N. meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N. mucosa und Kingella kingae auf.
  • Zu an den Sondenregionen angrenzenden Sequenzen komplementäre Oligonukleotide wurden synthetisiert und in der Hybridisierungsmischung eingesetzt.
  • Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert und es wurde gezeigt, daß sie für Neisseria gonorrhoeae spezifisch sind. Die phylogenetisch nächsten Nachbarn Neisseria meningitidis, N. lactamica, N. cinerea, N. mucosa und Kingella kingae wurden zum Vergleich mit der N. gonorrhoeae-Sequenz herangezogen.
    • 1. CCG CCG CTA CCC GGT AC
    • 2. TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
    • 3. GAG CAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA
  • Die Sequenz 1, komplementär zu 16S-rRNA in der Region 125-150, ist 17 Basen lang und hat eine Tm von 56°C. Die Sequenz 2, komplementär zu 16S-rRNA in der Region 455-485, ist 21 Basen lang und hat eine Tm von 63°C. Die Sequenz 3, komplementär zu 16S-rRNA in der Region 980-1015, ist 29 Basen lang und hat eine Tm von 57°C.
  • Die Reaktivität und Spezifität der Sonden für Neisseria gonorrhoeae wurde mit einem Hybridisierungsassay aufgezeigt. Die drei Oligonukleotidsonden wurden iodiert und mit nicht-markierten Oligonukleotiden der Sequenz 5'-CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CGG TAT TAG CTG ATC TTT CG-3', 5'-GCC TTT TCT TCC CTG ACA AAA GTC CTT TAC AAC CCG-3', 5'-GGC ACG TAG TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT AC-3' und 5'-GGT TCT TCG CGT TGC ATC GAA TTA ATC CAC ATC ATC CAC CGC-3', und mit gereinigter RNA in 0,48 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) gemischt und bei 60°C eine Stunde lang inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 4 ml 2 % Hydroxyapatit, 0,12 M Natriumphosphat pH 6,8, 0,02 % SDS zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 60°C inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände entfernt. Fünf ml Waschlösung (0,12 M Natriumphosphat, pH 6,8, 2 % SDS) wurden zugegeben und die Proben wurden gemischt, zentrifugiert und die Überstände entfernt.
  • Die Menge der an das Hydroxyapatit gebundenen Radioaktivität wurde in einem Gamma-Zähler ermittelt.
  • Die Tabelle 72 zeigt, daß die Sonden gut an N. gonorrhoeae-RNA hybridisieren und nicht an die anderen getesteten Arten hybridisieren.
    Tabelle 72 Hybridisierung der Neisseria gonorrhoeae-Sonden 1-3 an Neisseria- und Kingella-RNAs
    Organismen ATCC-Nr. % gebundene Sonde
    Kingella kingae 23332 0,09
    Neisseria cinerea 14685 0,04
    N. gonorrhoeae 19424 48,4
    N. lactamica 23970 0,07
    N. meningitidis Serumgruppe A 13077 0,04
    N. meningitidis Serumgruppe B 13090 0,04
    N. meningitidis Serumgruppe C 13102 0,04
    N. mucosa 19696 0,07
    N. subflava 14799 0,05
  • Es sind ebenfalls die folgenden Derivate von Neisseria-Sonden hergestellt und angewandt worden:
    GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG
    GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TAA
    CCC GCT ACC CGG TAC GTT C
    CCG CTA CCC GGT ACG TTC.
  • Obwohl die obenstehenden Leistungsbeispiele unter Anwendung des zuvor beschriebenen Standardassayformats ermittelt wurden, können die spezifischen Sonden unter einer breiten Vielzahl von experimentellen Bedingungen eingesetzt werden. Zum Beispiel können Zusatzstoffe in die Reaktionslösungen eingeschlossen werden, um optimale Reaktionsbedingungen für eine beschleunigte Hybridisierung vorzusehen. Derartige Zusatzstoffe können Puffer, Chelatbildner, organische Verbindungen und Nukleinsäurefällungsmittel, wie Detergenzien, Dihydroxybenzol, Natriumdodecylsulfat, Natriumdiisobutylsulfosuccinat, Natriumtetradecylsulfat, Sarkosyl und die Alkalimetallsalze und Ammoniumsalze von (SO4)2–, (PO4)3–, Cl– und HCOO– umfassen. Solche Zusatzstoffe können vom Fachmann verwendet werden, um optimale Bedingungen für die Hybridisierungsreaktion, die stattfinden soll, zur Verfügung zu stellen. Diese Bedingungen für die beschleunigte Hybridisierung von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zu doppelsträngigen Molekülen sind Gegenstand der EP-A-0 167 366 und der EP-A-0 229 442 .
  • Die vorliegende Erfindung kann an nicht-viralen Organismen aus gereinigten Proben oder nicht-gereinigten klinischen Proben, wie Sputum, Fäzes, Gewebe, Blut, Spinal- oder Synovialflüssigkeiten, Serum, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten, oder anderen Proben, wie Umwelt- oder Nahrungsproben durchgeführt werden. Vor dem Zellaufschluß und der Hybridisierung können die Zellen suspendiert oder in Lösung gebracht werden. Im Falle der obenstehend bezeichneten ungereinigten Proben können die Zellen vor dem Assay intakt und unbehandelt in ihrer eigenen biologischen Umgebung verbleiben.
  • Die Sonden der vorliegenden Erfindung können in einem Assay entweder allein oder in Kombination mit anderen Sonden angewandt werden. Mehrere individuelle Sonden können auch während der Nukleinsäuresynthese miteinander verknüpft werden. Dies führt zu einem Sondenmolekül, das mehrere Sondensequenzen und deshalb mehrere Spezifitäten enthält. Zum Beispiel kann ein einzelnes Nukleinsäuremolekül synthetisiert werden, das die in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Mycobacterium avium- als auch die Mycobacterium intracellulare-Sequenzen beide enthält. Bei Hybridisierung entweder mit M. avium- oder M. intracellulare-rRNA wird diese Sonde vollständig hybridisieren. Wenn die zwei Sondensequenzen separat in einem Assay kombiniert wurden, wird nur die Hälfte der gemischten individuellen Sonden entweder mit M. avium- oder M. intracellulare-rRNA hybridisieren. Andere Ausführungsformen können ebenfalls innerhalb des Umfangs der Patentansprüche durchgeführt werden. Zum Beispiel können Sonden unter Anwendung vielfaltiger Markierungen markiert werden, wie hierin beschrieben, und in diagnostische Kits eingeschlossen werden.

Claims (169)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Sonde zur Verwendung in einem qualitativen oder quantitativen Hybridisierungsassay, das das Konstruieren eines Oligonukleotids, das ausreichend komplementär ist, um unter Hybridisierungsbedingungen an eine Region von rRNA zu hybridisieren, die so gewählt wird, daß sie für einen nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe von nicht-viralen Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, einzigartig ist, wobei das Oligonukleotid ausgewählt wird durch: a) Identifizieren einer oder mehrerer variabler Kandidatenregionen durch Vergleichen einer oder mehrerer variabler rRNA-Region-Sequenz(en) eines nicht-viralen Zielorganismus oder einer Gruppe von nicht-viralen Zielorganismen mit einer oder mehreren variablen rRNA-Region-Sequenzen des bekannten nächstverwandten Organismus, um eine Sequenz auszuwählen, die für die rRNA des Zielorganismus oder der -organismen einzigartig ist, und b) Synthetisieren eines Oligonukleotids, welches zu der einzigartigen rRNA-Sequenz komplementär ist, wobei die Wärmestabilität der Sonde:Zielnukieinsäure-Hybride größer ist als die Wärmestabilität der Sonde:Nicht-Zielnukleinsäure-Hybride, wobei der Zielorganismus oder die -organismen aus einer oder mehreren Arten in einer Gattung oder einer oder mehreren Gattungen in einer Familie ausgewählt sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Region der rRNA so gewählt ist, daß sie mindestens etwa einen eine Base großen Sequenzunterschied von einer entsprechenden rRNA-Sequenz des bekannten nächstverwandten Organismus zu dem nicht-viralen Organismus oder der Gruppe nicht-viraler Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rRNA-Region so gewählt ist, daß sie einen mindestens etwa 10%-igen oder größeren Basensequenzunterschied von der entsprechenden rRNA-Sequenz des bekannten nächstverwandten Organismus zu dem nicht-viralen Organismus oder der Gruppe nicht-viraler Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rRNA-Region aus der 5S-, 16S- und 23S-rRNA umfassenden Gruppe gewählt ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rRNA-Region aus der 5,0S-, 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA umfassenden Gruppe gewählt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukieotid mindestens etwa 10 Nukleotide lang ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 15 Nukleotide lang ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 20 Nukleotide lang ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 30 Nukleotide lang ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid etwa 20 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid etwa 30 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 10 Nukleotide lang ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 15 Nukleotide lang ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 20 Nukleotide lang ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 30 Nukleotide lang ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid etwa 20 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid etwa 30 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 10 Nukleotide lang ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 15 Nukleotide lang ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 20 Nukleotide lang ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid mindestens etwa 30 Nukleotide lang ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid etwa 20 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid etwa 30 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sonde zu mindestens etwa 75% komplementär zu der rRNA-Region ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid zu mindestens etwa 75% komplementär zu der rRNA-Region ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid zu mindestens etwa 75% komplementär zu der rRNA-Region ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sonde vollständig komplementär zu der rRNA-Region ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde vollständig komplementär zu der rRNA-Region ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Sonde vollständig komplementär zu der rRNA-Region ist.
  30. Verfahren zur Herstellung einer Sonde oder einer Kombination von Sonden zur Verwendung in einem qualitativen oder quantitativen Hybridisierungsassay, welcher das Konstruieren eines Nukleotidpolymeren umfaßt, das ausreichend komplementär ist, um an eine Region von rDNA oder rRNA zu hybridisieren, die ausgewählt ist, um einen nicht-viralen Zielorganismus oder eine erste Gruppe nicht-viraler Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, von mindestens einem Nicht-Zielorganismus oder einer zweiten Gruppe von Nicht-Zielorganismen, welche in einer Probe vorhanden sein können, zu unterscheiden, wobei die Nicht-Zielorganismen oder die Gruppe von -organismen nahe phylogenetische Verwandte der Zielorganismen oder der Gruppe von -organismen sind und die rDNA- oder rRNA-Region ausgewählt wird durch: • Vergleichen einer oder mehrerer rDNA- oder rRNA-Nukieotidbasensequenzen des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe von nicht-viralen Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, mit einer oder mehreren rDNA- oder rRNA-Nukieotidbasensequenzen des Nicht-Zielorganismus oder der Gruppe von Nicht-Zielorganismen, • Anordnen mit maximaler Übereinstimmung bzw. Aligning der rDNA- oder rRNA-Nukleotidbasensequenzen des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe von nicht-viralen Organismen mit den rDNA- oder rRNA-Nukieotidbasensequenzen der Nicht-Zielorganismen oder -organismengruppe, so daß Homologieregionen identifiziert werden, und • Auswählen des Nukleotidpolymeren durch Maximieren der Homologie des Nukleotidpolymeren zu den Regionen der rDNA oder rRNA des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe von nicht-viralen Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, während des Minimierens der Homologie des Nukleotidpolymeren zu rDNA- oder rRNA-Sequenzen des Nicht-Zielorganismus oder der -organismengruppe, welche(r) davon unterschieden werden soll, wobei der/die nachzuweisende Organismus oder Organismengruppe aus einer oder mehreren Arten in einer Gattung oder einer oder mehreren Gattungen in einer Familie ausgewählt sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Nukleotidpolymer zu mindestens etwa 90% homolog zu den Regionen der rDNA oder rRNA des nachzuweisenden nicht-viralen Organismus oder der nachzuweisenden nicht-viralen Organismengruppe ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Sondenoligonukleotid weniger als etwa 90% homolog zu rDNA- oder rRNA-Sequenzen der nahen phylogenetischen Verwandten, welche davon unterschieden werden sollen, ist.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, umfassend den weiteren Schritt des Bestätigens der Nicht-Kreuzreaktivität der Sonde durch Hybridisieren des Sondenoligonukleotids mit nicht-viralen Organismen oder Gruppen von nicht-viralen Organismen, welche durch die Sonde unterschieden werden sollen.
  34. Verfahren zur Herstellung einer Sonde zur Verwendung in einem qualitativen oder quantitativen Hybridisierungsassay, welches das Konstruieren eines Oligonukleotids umfaßt, das ausreichend komplementär ist, um an eine Region von rDNA oder rRNA zu hybridisieren, die so ausgewählt ist, daß sie für einen nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe nicht-viraler Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, einzigartig ist, wobei die Region von rDNA oder rRNA ausgewählt wird durch: • Vergleichen einer oder mehrerer rDNA- oder rRNA-Nukleotidbaserisequenzen des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe von nicht-viralen Organismen, welche(r) nachgewiesen werden soll, mit einer oder mehreren rDNA- oder rRNA-Nukleotidbasensequenzen von dessen/deren nächsten phylogenetischen Verwandten, • Anordnen mit maximaler Übereinstimmung der rDNA- oder rRNA-Nukleotidbasensequenzen des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe nicht-viraler Organismen mit den rDNA- oder rRNA-Sequenzen der nächsten phylogenetischen Verwandten, so daß die zwischenartlichen hypervariablen rDNA- oder rRNA-Regionen enthüllt werden, • Auswählen des Sondenoligonukleotids in der zwischenartlich hypervariablen Region durch Maximieren der Homologie des Sondenoligonukleotids zu den Regionen der rDNA oder rRNA des nicht-viralen Organismus oder der nicht-viralen Organismengruppe, welche(r) nachgewiesen werden soll, während man die Homologie des Sondenoligonukleotids zu rDNA- oder rRNA-Sequenzen der davon zu unterscheidenden nächsten phylogenetischen Verwandten minimiert, wobei der nachzuweisende Organismus oder die nachzuweisende Organismengruppe aus einer oder mehreren Arten in einer Gattung oder einer oder mehreren Gattungen in einer Familie ausgewählt wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Sondenoligonukleotid zu mindestens etwa 90% homolog zu den Regionen der rDNA oder rRNA des nicht-viralen Organismus oder der nicht-viralen Organismengruppe, welche(r) nachgewiesen werden soll, ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Sondenoligonukleotid weniger als etwa 90% homolog zu rDNA- oder rRNA-Sequenzen der nächsten phylogenetischen Verwandten, welche davon unterschieden werden sollen, ist.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, umfassend den weiteren Schritt des Bestätigens der Nicht-Kreuzreaktivität der Sonde durch Hybridisieren des Sondenoligonukleotids mit nicht-viralen Organismen oder Gruppen von nicht-viralen Organismen, welche durch die Sonde unterschieden werden sollen.
  38. Nukleotidpolymer-Hybridisierungsassaysonde für einen nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe von nicht-viralen Organismen in einer im wesentlichen isolierten Form, welche ein Oligonukleotid von 10 bis 100 Nukleotiden umfaßt, das fähig ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an mindestens 10 Nukleotide in einer variablen Region von rRNA oder rDNA zu hybridisieren, welche so ausgewählt ist, daß sie für den nicht-viralen Organismus oder die Gruppe von nicht-viralen Organismen einzigartig ist, wobei die Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an Nukleinsäure aus einer Organismenart in einer Gattung hybridisiert und unter den Bedingungen darin fehlschlägt, an Nukleinsäure aus anderen Arten in der Gattung zu hybridisieren, oder wobei die Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an Nukleinsäure aus einem oder mehreren Vertreter(n) der Organismengruppe hybridisiert und darin fehlschlägt, an Nukleinsäure aus Organismen, welche nicht Vertreter der Gruppe sind, zu hybridisieren, wobei die variable Region einer Region entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: den Basen 60-100, 120-150, 600-670, 820-860, 980-1050 und 1250-1290 von E. coli 16S-rRNA, 270-390, 535-560, 1150-1200, 1440-1600, 1710-1750 und 2190-2330 von E. coli 23S-rRNA, den Basen 330-365 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 675-715 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 1080-1110 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 460-490 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 1050-1080 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 1900-1960 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Bakterien hybridisiert, den Basen 845-880 von S. cerevisiae 18-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Pilze hybridisiert, den Basen 1960-2000 von S. cerevisiae 28S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Pilze hybridisiert, den Basen 1225-1270 von S. cerevisiae 28S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der phylogenetischen Gruppe der Pilze hybridisiert, den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycobacterium avium hybridisiert, den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycobacterium intracellulare hybridisiert, den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes hybridisiert, den Basen 540-575 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes hybridisiert, den Basen 1155-1190 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes hybridisiert, den Basen 2195-2235 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes hybridisiert, den Basen 1025-1060 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Mycobacterium hybridisiert, den Basen 1440-1475 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Mycobacterium hybridisiert, den Basen 1515-1555 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Mycobacterium hybridisiert, den Basen 1570-1610 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Mycobacterium hybridisiert, den Basen 190-230 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, den Basen 450-490 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, den Basen 820-860 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, den Basen 1255-1290 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, den Basen 65-120 von E. coli 5S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Mycoplasma pneumoniae hybridisiert, den Basen 630-675 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Legionella hybridisiert, den Basen 975-1020 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Legionella hybridisiert, den Basen 350-395 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Legionella hybridisiert, den Basen 1585-1620 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Legionella hybridisiert, den Basen 2280-2330 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Legionella hybridisiert, den Basen 60-105 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 600-635 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 830-870 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 275-320 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 330-365 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 1160-1190 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 1450-1490 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 1510-1545 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 1710-1750 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Chlamydia trachomatis hybridisiert, den Basen 980-1010 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Campylobacter hybridisiert, den Basen 825-860 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der als Enterococci bekannten Untergruppe der Gattung Streptococci hybridisiert, den Basen 365-405 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der als Pseudomonas-Gruppe 1 bekannten Gattungsuntergruppe hybridisiert, den Basen 305-340 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Enterobacter cloacae hybridisiert, den Basen 270-305 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Proteus mirabilis hybridisiert, den Basen 1125-1155 von E. coli 16S-rRNA, wobei die Gruppe von Organismen der Gattung Salmonella angehört, den Basen 335-375 von E. coli 23S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Arten der Gattung Salmonella hybridisiert, den Basen 995-1030 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Escherichia coli hybridisiert, den Basen 125-150 von E. coli 16S-rRNA, wobei der Organismus Neisseria gonorrhoeae ist, den Basen 455-485 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Neisseria gonorrhoeae hybridisiert, den Basen 980-1015 von E. coli 16S-rRNA, wobei das Nukleotidpolymer unter stringenten Bedingungen an Neisseria gonorrhoeae hybridisiert, oder dem Komplement davon.
  39. Nukleotidpolymer-Hybridisierungsassaysonde für einen nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe von nicht-viralen Organismen in einer im wesentlichen isolierten Form, welche ein Oligonukleotid von 10 bis 100 Nukleotiden umfaßt, das fähig ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an mindestens 10 Nukleotide in einer variablen Region von rRNA oder rDNA zu hybridisieren, welche so ausgewählt ist, daß sie für den nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe von nicht-viralen Organismen einzigartig ist, wobei die Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an Nukleinsäure aus einer Organismenart in einer Gattung hybridisiert und unter den Bedingungen darin fehlschlägt, an Nukleinsäure aus anderen Arten in der Gattung zu hybridisieren, oder wobei die Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an Nukleinsäure aus einem oder mehreren Vertreter(n) der Organismengruppe hybridisiert und darin fehlschlägt; an Nukleinsäure aus Orga nismen, welche nicht Vertreter der Gruppe sind, zu hybridisieren, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt, den Sequenzen: CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC; CCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG; GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT; GGGGTTCTTTTCGCCTTTCCCTCACGG; GGCTGCTTCTAAGCCAACATCCTG; GGACCGTTATAGTTACGGCCGCC; GGTCGGAACTTACCCGACAAGGAATTTCGCTACC; wenn es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt, den Sequenzen: CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG; CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC; CGACTTGGCATGAAAACTATTCCTTCCTGTGG; GCTCTTCATTCAATTGTCCACGTTCAATTAAGCAACAAGG; GCTCTGCATTCAAAGGTCCGCGTTCAATAAAGAAACAGGG; wenn es sich bei dem Organismus um Mycobacterium avium handelt, der Sequenz: ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG; wenn es sich bei dem Organismus um Mycobacterium intracellulare handelt, der Sequenz: ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG; wenn es sich bei der Gruppe nicht-viraler Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt, den Sequenzen: TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG; TGCCCTACCCACACCCACCACCAGGTGATGT; CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG; CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC; AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC; CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG; ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC; wenn es sich bei der Gruppe nicht-viraler Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt, den Sequenzen: CCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGG; GGCTTGCCCCAGTATTACCACTGACTGGTACGG; CACCGAATTCGCCTCAACCGGCTATGCGTCACCTC; GGGGTACGGCCCGTGTGTGTGCTCGCTAGAGGC; wenn es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt, den Sequenzen: GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC; AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT; CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT; TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT; CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC; wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt, den Sequenzen: TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC; GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC; CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG; GCGGTACGGTTCTCTATAAGTTATGGCTAGC; GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT; CACTCTTGGTACGATGTCCGAC; wenn es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt, den Sequenzen: CCGACTCGGGGTTGAGCCCATCTTTGACAA; TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGACCATC; CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTGCTCCGTTCGA; CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCACATTCG; CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC; GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG; CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG; CGAAGATTCCCCTTGATCGCGACCTGATCT; CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG; TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG; wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Campylobacter handelt, der Sequenz: GGTTCTTAGGATATCAAGCCCAGG; wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Enterococci bekannte Untergruppe der Gattung Streptococci handelt, der Sequenz: TGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTA; wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Pseudomonas-Gruppe 1 bekannte Gattungsuntergruppe handelt, der Sequenz: CAGACAAAGTTTCTCGTGCTCCGTCCTACTCGATT; wenn es sich bei dem Organismus um Enterobacter cloacae handelt, der Sequenz: GTGTGTTTTCGTGTACGGGAGTTTCACCC; wenn es sich bei dem Organismus um Proteus mirabilis handelt, der Sequenz: CCGTTCTCCTGACACTGCTATTGATTAAGACTC; wenn es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Salmonella handelt, den Sequenzen: CTCCTTTGAGTTCCCGACCTAATCGCTGGC; CTCATCGAGCTCACAGCACATGCGCTTTGTGTA; wenn es sich bei dem Organismus um Escherichia coli handelt, der Sequenz: GCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGG; wenn es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt, den Sequenzen: CCGCCGCTACCCGGTAC; TCATCGGCCGCCGATATTGGC; GAGCATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTA; GAGATTCCGCACATGTCAAAACCAGG; GAGGATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTAA; CCCGCTACCCGGTACGTTC; CCGCTACCCGGTACGTTC.
  40. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC
  41. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG
  42. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT
  43. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGGGTTCTTTTCGCCTTTCCCTCACGG
  44. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGCTGCTTCTAAGCCAACATCCTG
  45. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGACCGTTATAGTTACGGCCGCC
  46. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGTCGGAACTTACCCGACAAGGAATTTCGCTACC
  47. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 330-365 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  48. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 675-715 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  49. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 1080-1110 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  50. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 460-490 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  51. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 1050-1080 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  52. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Bakterien handelt und die variable Region den Basen 1900-1960 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  53. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und die variable Region den Basen 845-880 von S. cerevisiae 18S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  54. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und die variable Region den Basen 1960-2000 von S. cerevisiae 28S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  55. Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und die variable Region den Basen 1225-1270 von S. cerevisiae 28S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  56. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG
  57. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC.
  58. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CGACTTGGCATGAAAACTATTCCTTCCTGTGG
  59. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GCTCTTCATTCAATTGTCCACGTTCAATTAAGCAACAAGG
  60. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die phylogenetische Gruppe der Pilze handelt und das Oligonukieotid die folgende Sequenz umfaßt: GCTCTGCATTCAAAGGTCCGCGTTCAATAAAGAAACAGGG
  61. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycobacterium avium handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG
  62. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycobacterium avium handelt und die variable Region den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  63. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycobacterium intracellulare handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG
  64. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei der Organismus Mycobacterium intracellulare ist und die variable Region den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  65. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG
  66. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TGCCCTACCCACACCCACCACCAGGTGATGT
  67. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG.
  68. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC
  69. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC.
  70. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG.
  71. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC
  72. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und die variable Region den Basen 185-225 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  73. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und die variable Region den Basen 540-575 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  74. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und die variable Region den Basen 1155-1190 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  75. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von nicht-viralen Organismen um die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes handelt und die variable Region den Basen 2195-2235 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  76. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGG.
  77. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGCTTGCCCCAGTATTACCACTGACTGGTACGG
  78. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CACCGAATTCGCCTCAACCGGCTATGCGTCACCTC.
  79. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGGGTACGGCCCGTGTGTGTGCTCGCTAGAGGC
  80. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und die variable Region den Basen 1025-1060 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  81. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und die variable Region den Basen 1440-1475 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  82. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und die variable Region den Basen 1515-1555 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  83. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Mycobacterium handelt und die variable Region den Basen 1570-1610 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  84. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC
  85. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT
  86. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT
  87. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT
  88. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC
  89. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und die variable Region den Basen 190-230 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  90. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und die variable Region den Basen 450-490 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  91. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und die variable Region den Basen 820-860 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  92. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und die variable Region den Basen 1255-1290 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  93. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Mycoplasma pneumoniae handelt und die variable Region den Basen 65-120 von E. coli 5S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  94. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC
  95. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC.
  96. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG
  97. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GCGGTACGGTTCTCTATAAGTTATGGCTAGC
  98. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT
  99. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CACTCTTGGTACGATGTCCGAC
  100. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und die variable Region den Basen 630-675 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  101. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und die variable Region den Basen 975-1020 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  102. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und die variable Region den Basen 350-395 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  103. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und die variable Region den Basen 1585-1620 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  104. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Legionella handelt und die variable Region den Basen 2280-2330 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  105. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGACTCGGGGTTGAGCCCATCTTTGACAA
  106. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGACCATC
  107. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTGCTCCGTTCGA
  108. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCACATTCG
  109. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC
  110. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG
  111. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG
  112. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CGAAGATTCCCCTTGATCGCGACCTGATCT
  113. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG
  114. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und das Oligonukieotid die folgende Sequenz umfaßt: TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG
  115. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 60-105 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  116. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 600-635 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  117. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 830-870 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  118. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 275-320 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  119. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 330-365 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  120. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 1160-1190 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  121. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 1450-1490 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  122. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 1510-1545 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  123. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Chlamydia trachomatis handelt und die variable Region den Basen 1710-1750 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  124. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Campylobacter handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GGTTCTTAGGATATCAAGCCCAGG
  125. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Campylobacter handelt und die variable Region den Basen 980-1010 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  126. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Enterococci bekannte Untergruppe der Gattung Streptococci handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTA
  127. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Enterococci bekannte Untergruppe der Gattung Streptococci handelt und die variable Region den Basen 825-860 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  128. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Pseudomonas-Gruppe 1 bekannte Gattungsuntergruppe handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CAGACAAAGTTTCTCGTGCTCCGTCCTACTCGATT
  129. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die als Pseudomonas-Gruppe 1 bekannte Gattungsuntergruppe handelt und die variable Region den Basen 365-405 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  130. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Enterobacter cloacae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GTGTGTTTTCGTGTACGGGAGTTTCACCC
  131. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Enterobacter cloacae handelt und die variable Region den Basen 305-340 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  132. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Proteus mirabilis handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGTTCTCCTGACACTGCTATTGATTAAGACTC
  133. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Proteus mirabilis handelt und die variable Region den Basen 270-305 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  134. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Salmonella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CTCCTTTGAGTTCCCGACCTAATCGCTGGC
  135. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Salmonella handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CTCATCGAGCTCACAOCACATGCGCTTTTGTGTA
  136. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Salmonella handelt und die variable Region den Basen 1125-1155 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  137. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei der Gruppe von Organismen um die Gattung Salmonella handelt und die variable Region den Basen 335-375 von E. coli 23S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  138. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Escherichia coli handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGG
  139. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Escherichia coli handelt und die variable Region den Basen 995-1030 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  140. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGCCGCTACCCGGTAC
  141. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: TCATCGGCCGCCGATATTGGC
  142. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GAGCATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTA
  143. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GAGATTCCGCACATGTCAAAACCAGG
  144. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: GAGGATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTAA
  145. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCCGCTACCCGGTACGTTC.
  146. Sonde nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und das Oligonukleotid die folgende Sequenz umfaßt: CCGCTACCCGGTACGTTC
  147. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und die variable Region den Basen 125-150 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  148. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und die variable Region den Basen 455-485 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  149. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 oder Sonde nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Organismus um Neisseria gonorrhoeae handelt und die variable Region den Basen 980-1015 von E. coli 16S-rRNA oder dem Komplement davon entspricht.
  150. Nukleinsäurehybrid, gebildet zwischen einem Nukleotidpolymer oder Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 47-56, 62, 64, 72-75, 80-83, 89-93, 100-104, 115-123, 125, 127, 129, 131, 133, 136, 137, 139 und 147-149 und einer dazu komplementären Nukleinsäure.
  151. Nukleotidpolymer, welches unter stringenten Bedingungen an eine Sonde nach einem der Ansprüche 40-46, 56-61, 63, 65-71, 76-79, 84-88, 94-99, 105-114, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 138 und 140-146 oder das Komplement davon hybridisiert.
  152. Nukleinsäurehybrid nach Anspruch 150, gebildet zwischen einem Oligonukleotid und einer dazu komplementären Nukleinsäure.
  153. Komplement zu dem Nukleotidpolymer nach Anspruch 151.
  154. Hybridisierungsassay, welcher das Miteinander-Umsetzen jeglicher rRNA oder des Komplements davon aus einer hinsichtlich eines nicht-viralen Organismus oder einer Gruppe von nicht-viralen Organismen zu testenden Probe mit einer Sonde nach einem der Ansprüche 39 bis 149, wobei die Sonde zu mindestens etwa 75% komplementär zu einer variablen Region von rRNA oder rDNA ist, welche so ausgewählt ist, daß sie für den nicht-viralen Organismus oder eine Gruppe von nicht-viralen Organismen einzigartig ist, unter solchen Bedingungen, daß die Hybridisierung zwischen der Oligonukleotidsonde oder dem Nukleotidpolymer und irgendeiner ausreichend komplementären Proben-rRNA oder dem Komplement davon stattfinden kann, und das Beobachten und/oder Messen der Hybridisierung umfaßt.
  155. Assay nach Anspruch 154, wobei die Hybridisierung zwischen der Oligonukleotidsonde und jeglicher Ziel-Proben-rRNA sich auf mindestens etwa 10% bis etwa 100% beläuft.
  156. Assay nach Anspruch 154, wobei die Oligonukleotidsonde cDNA ist.
  157. Assay nach Anspruch 154, wobei die Bedingungen eine Temperatur von etwa 25°C unterhalb der Tm bis etwa 1 °C unterhalb der Tm umfassen.
  158. Assay nach Anspruch 154, der ferner den Parallelassay einer homologen Positivkontrolle oder einer heterologen Positivkontrolle oder beides umfaßt.
  159. Assay nach Anspruch 154, der ferner den Parallelassay einer Negativkontrolle umfaßt.
  160. Assay nach Anspruch 154, wobei die Bedingungen Mittel für gesteigerte Hybridisierungsraten umfassen.
  161. Assay nach Anspruch 154, wobei die Bedingungen so sind, daß die maximale Hybridisierung zwischen der Oligonukleotidsonde und irgendeiner komplementären Proben-rRNA und eine minimale Kreuzreaktivität zwischen der Oligonukleotidsonde und irgendeiner nicht-komplementären Proben-rRNA gefördert wird.
  162. Assay nach Anspruch 154, wobei die Oligonukleotidsonde markiert ist.
  163. Assay nach Anspruch 154, wobei die Oligonukleotidsonde mit einer Isotop-, Nicht-Isotop- oder Chemolumineszenz-Markierung markiert ist.
  164. Assay nach Anspruch 154, der ferner die Freisetzung von rRNA aus den Zellen des nicht-viralen Organismus oder der Gruppe nicht-viraler Organismen vor dem Schritt des Miteinander-Umsetzens umfaßt.
  165. Assay nach Anspruch 154, wobei es sich bei dem nicht-viralen Organismus oder der Gruppe nicht-viraler Organismen um Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, die Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes, die Gattung Mycobacterium, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter, Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas-Gruppe 1, Bakterien oder Pilze handelt.
  166. Assay nach Anspruch 162, wobei die markierte Oligonukleotidsonde etwa 20 Nukleotide bis etwa 50 Nukleotide lang ist.
  167. Assay nach Anspruch 162, wobei die markierte Oligonukleotidsonde zu mindestens etwa 95% komplementär zu der variablen rRNA-Region ist.
  168. Assay nach Anspruch 154, der ferner die Verwendung einer oder mehrerer zusätzlicher Oligonukleotidsonden von mindestens etwa 10 Nukleotiden Länge umfaßt, welche zu mindestens etwa 75% komplementär zu einer oder mehreren zusätzlichen variablen Region(en) von rRNA sind, die ausgewählt sind, um für die nicht-viralen Organismen einzigartig zu sein.
  169. Assay nach Anspruch 154, der ferner die Verwendung einer oder mehrerer zusätzlicher Sonden umfaßt, die einen oder mehrere zusätzliche nicht-virale Organismen identifizieren, wodurch die Gruppe der zu testenden nicht-viralen Organismen erweitert wird.
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