PT86204B - Metodo para a preparacao de sondas de acido nucleico para a deteccao e/ou quantificacao de organismos nao-virais - Google Patents

Metodo para a preparacao de sondas de acido nucleico para a deteccao e/ou quantificacao de organismos nao-virais Download PDF

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Description

presente invento diz respeito a um método para a preparação de sondas, bem como a várias sondas para uso em ensaios de hibridação qualitativos e quantitativos.
método consiste na construção de um oligonucleotídeo que é suficientemente complementar para hibridar para uma região de rRNA seleccionada para ser única para um organismo não-viral ou para um grupo de organismos não-virais que se pretende que sejam detectados, sendo a referida região de rRNA seleccionada por comparação de uma ou mais
JAMES JONH HOGAN; RICHARD DANA SMITH; JO ANN e SHERROL HOFFA MCDONOUGH
MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE SONDAS DE ACIDO NUCLEICO PARA A DETECÇÃO E/OU QUANTIFICAÇÃO DE ORGANISMOS NÃO-VIRAIS
sequências de rRNA de regiões variáveis do referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais com uma ou mais sequências de rRNA de regiões variáveis a partir de um ou mais organismos não-virais que se pretende que sejam distinguidos. São também reveladas sondas de ensaios de hibridação para Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, as bactérias do complexo Mycobacterium tubérculosis, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, E. coli Pseudomonas group I, Neisseria gonorrhoeae, bactérias e fungos .
Continuação-Em-Parte de Hogan et al., App. Ser. No. 083.542 entregue em 7 de Agosto de 1987 a qual é uma Continuação-Em-Parte de Hogan et al., App. Ser. No. 934.244 entregue em 24 de Novembro de 1986.
Fundamento do Invento
1. Campo do Invento
Os inventos aqui descritos e reivindicados estão relacionados com sondas e ensaios baseados na utilização de material genético como seja RNA. Mais particularmente, os inventos relacionam-se com o projecto e construção de sondas de ácido nucleico e hibridação de tais sondas com material genético de organismos alvo não-virais em ensaios para sua detecção e/ou quantificação em amostras a testar de, e.g. espectoração, urina, sangue e secções de tecidos, alimentos, solo e água.
2. Introdução
Duas cadeias simples de ácido nucleico, constituídas por nucleotídeos, podem associar-se (hibridar) para formar uma estrutura em dupla hélice em que as duas cadeias polinucleotídicas correm em direcções opostas são mantidas juntas por ligações de hidrogénio (uma forma fraca de ligação química) entre pares de compostos situados no centro que emparelham e conhecidos como bases. De um modo geral na estrutura de dupla hélice dos ácidos nucleicos, por exemplo, a base adenina está ligada por pontes de hidrogénio à base timina (T) ou uracilo (U) enquanto que a fase guanina (G) está ligada por pontes de hidrogénio à base citosina (C). Em qualquer ponto ao longo da cadeia pode-se portanto encontrar os pares de bases AT ou AU, TA ou UA, GC ou CG. Pode-se também encontrar pares de bases AG e GU além dos pares de bases tradicionais (canónicos). Assumindo que uma primeira cadeia simples de ácido nucleico é suficientemente complementar de uma segunda e que as duas são mantidas juntas em condições que
-4permitem a sua hibridação, resulta ácido nucleico de cadeia dupla. Em condições adequadas, podem formar-se híbridos de DNA/ /DNA, RNA/DNA ou RNA/RNA.
De um modo genérico, existem dois processos básicos de hibridação de ácidos nucleicos. Num, conhecido como hibridação em solução a sequência de ácido nucleico sonda e as moléculas de ácido nucleico de uma amostra a testar estão livres, em solução. No outro método, o ácido nucleico da amostra está geralmente imobilizado num suporte sólido e a sequência sonda está livre em solução.
Uma sonda pode ser uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples que é complementar num determinado grau particular das sequências de ácido nucleico que se pretendem detectar (sequências alvo). Ela pode também ser marcada. Uma descrição dos fundamentos da utilização da hibridação de ácido nucleico como processo para a detecção de sequências particulares de ácido nucleico, está descrito no Pedido U.S. NQ de Série 456.729, entitulado Method for Detection, Identification and Quantification of Non-Viral Organisms, entregue em 10 de Janeiro de 1983 (Kohne I) e Pedido U.S. Νθ. de Série 655.365, entitulado Method for Detecting, Identifying and Quantitating Organismes and Viruses entregue em 4 de Setembro de 1984 (Kohne II) ambos são aqui incluídos como referência, juntamente com outros pedidos aqui citados.
Também estão descritos naqueles pedidos métodos para a determinação da presença de organismos contendo RNA numa amostra que deverá conter tais organismos, compreendendo os passos de pôr em contacto quaisquer ácidos nucleicos de uma amostra e uma sonda compreendendo moléculas de ácido nucleico que são mais pequenas do que a sequência da subunidade de rRNA da qual derivou e que são suficientemente complementares para hibridar com o rRNA de um ou mais organismos não virais ou grupos de organismos não virais, incubação da mistura em condições de hibridação específica e testagem da mistura
resultante relativamente à hibridação da sonda e qualquer amostra de rRNA a testar. 0 invento é descrito de modo a incluir a utilização de uma sonda que detecta apenas subsequências da subunidade de rRNA que são as mesmas ou suficientemente semelhantes em organismos particulares ou grupos de organismos e que se diz detectar a presença ou ausência de qualquer um ou mais daqueles organismos particulares numa amostra, mesmo na presença de muitos organismos não relacionados.
Descobrimos e descrevemos aqui um novo método e meios para projectar e construir sondas de DNA para usar na detecção de sequências de rRNA únicas, num ensaio para a detecção e/ou quantificação de qualquer grupo de organismos não-virais. Algumas das sondas do invento aqui tratadas podem ser usadas para detectar e/ou quantificar uma espécie ou estir pe isolada de organismo não-viral e outras podem ser usadas para detectar e/ou quantificar membros de um género inteiro ou grupo filogenético pretendido.
Sumário do Invento
Num método de preparação e utilização de sondas usa-se um desoxirribonucleotídeo de cadeia simples de sequência particular e comprimento definido num ensaio de hibridação para determinar a presença ou quantidade de rRNA de organismos nãovirais alvo particulares para os distinguir dos seus vizinhos filogenéticos mais próximos conhecidos. São descritas e reivindicadas sequências de sondas que são específicas, respectivamente para subsequências variáveis de rRNA 16S de Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare e bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis e que não dão reacção cruzada com ácidos nucleicos de uns e de outros ou qualquer outra espécie bacteriana ou agente infeccioso das vias respiratórias. É também descrita e reivindicada uma sonda especifica para uma subsequência da região variável do rRNA 23S
das bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis tal como o são sondas das regiões variáveis de rRNA úteis em ensaios de hibridação para o género Mycobacterium (específica de rRNA 23S), Mycobacterium pneumoniae (rRNA específico de 5S e 16S), Chlamydia trachomatis (rRNA específico de 16S e 23S), Enterobacter cloacae (rRNA específico de 23S), Escherichia coli (rRNA específico de 16S), Legionella (rRNA específico de 16S e 23S), Salmonella (rRNA específico de 16S e 23S), Enterococci (rRNA específico de 16S), Neisseria gonorrhoeae (rRNA específico de 16S), Campylobacter (rRNA específico de 16S), Proteus mirabilis (rRNA específico de 23S), Pseudomonas (rRNA específico de 23S), fungos (rRNA específico de 18S e 28S) e bactérias (rRNA específico de 16S e 23S).
Numa execução do método de ensaio, uma amostra a testar é primeiro submetida a condições que libertam rRNA de qualquer organismo não virai presente na referida amos tra. 0 rRNA tem cadeia simples e portanto disponível para hibridação com material genético suficientemente complementar uma vez assim libertado. 0 contacto entre uma sonda que pode ser marcada e o rRNA alvo pode ser efectuado em solução em condições que promovam a hibridação entre as duas cadeias. A mistura de reacção é então testada quanto à presença da sonda hibridada. As numerosas vantagens do presente método para a detecção dos organismos não virais sobre técnicas anteriores será mais evidente a partir da descrição detalhada que se segue.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 é uma carta da estrutura primária do rRNA 16S bacteriano para Escherichia coli, descrevendo os números de referência convencionais para os pares de bases .
A Figura 2 é uma carta da estrutura primária do rRNA 23S bacteriano para Escherichia coli, descrevendo os números de referência convencionais para pares de bases.
A Figura 3 é uma carta da estrutura primária do rRNA 5S bacteriano para Escherichia coli, descrevendo os números de referência convencionais para pares de bases.
A Figura 4 é uma carta da estrutura primária para o rRNA 18S de Saccharomyces cerevisiae, descrevendo os números de referência convencionais para pares de bases.
A Figura 5 é uma carta da estrutura primária para o rRNA 28S de Saccharomyces cerevisiae, descrevendo os números de referência convencionais para pares de bases.
A Figura 6 é um diagrama mostrando as posições no rRNA 16S (usando números de referência de E. coli) que diferem entre 12 séries diferentes de organismos relacionados. No Exemplo 1, por exemplo, 99,7 refere-se à diferença no rRNA 16S entre Clostridium botuliriung e Clostridium subterminale.
A Figura 7 é um diagrama que mostra as posições nas primeiras 1500 bases do rRNA 23S (usando os números referência de E. coli) que diferem entre 12 séries diferentes de organismos relacionados.
A Figura 8 é um diagrama mostrando as posições nas bases terminais do rRNA 23S (usando números refe-8-
rência de E. coli) que diferem entre 12 séries diferentes de organismos relacionados.
A Figura 9 é uma representação esquemática da localização de sondas capazes de hibridar com as primeiras 1500 bases do rRNA 23S.
A Figura 11 é uma representação esquemática da localização de sondas capazes de hibridar com as bases terminais do rRNA 23S.
Descrição detalhada do invento
Definições
Os termos que se seguem, conforme usados nesta divulgação e reivindicações, definem-se como:
nucleotídeo: uma subunidade de um ácido nucleico consistindo num grupo fosfato, um açúcar com carbono 5' e uma base contendo azoto. No RNA o açúcar com carbono 5' é a ribose. No DNA é uma 2-desoxirribose. O termo também inclui análogos de tais subunidades.
polímero de nucleotídeos: pelo menos dois nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster.
oligonucleotídeo: um polímero de nucleotideos geralmente com cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, mas que pode ter mais de 100 nucleotídeos de comprimento.
sonda de ácido nucleico: uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples que se combinará com uma sequência de ácido nucleico alvo de cadeia simples complementar para formar uma molécula de cadeia dupla (híbrida). Uma sonda
-9de ácido nucleico pode ser um oligonucleotídeo ou um polímero de nucleotídeos.
híbrido: o complexo formado entre duas sequências de ácido nucleico de cadeia simples através de emparelhamento de bases de Watson-Crik ou emparelhamento de bases não canónicos entre as báses complementares.
hibridação: o processo pelo qual duas cadeias complementares de ácidos nucleicos se combinam para formar moléculas de cadeia dupla (híbridos).
complementaridade: uma propriedade conferida pela sequência de bases de uma cadeia simples de DNA ou RNA que pode formar um DNA:DNA, RNA:RNA ou DNA:RNA híbrido ou de cadeia dupla através de ligação de hidrogénio entre pares de bases de Watson-Crik nas respectivas cadeias. Adenina (A) geralmente complementa timina (T) ou Uracilo (U), enquanto que guanina (G) geralmente complementa citosina (C).
restringência: termo usado para descrever a temperatura e composição do solvente existentes durante a hibridação e nos passos de processamento subsequente. Em condições de restringência elevada apenas se formarão híbridos de ácidos nucleicos altamente homólogos; híbridos sem um grau suficiente de complementaridade não se formarão. Assim, a restringência das condições do ensaio determina a quantidade de complementaridade necessária entre as duas cadeias de ácido nucleico formadoras de um híbrido. A restringência é escolhida de modo a tornar máxima a diferença de estabilidade entre o alvo e o não-alvo.
especificidade da sonda: característico de uma sonda que descreve a sua capacidade para distinguir entre sequências alva e não-alvo. Dependente das sequências e condições do ensaio. A especificidade da sonda pode ser absoluta (i.e. sonda capaz de distinguir entre organismos alvo e
quaisquer organismos não-alvo) ou pode ser funcional (i.e., sonda capaz de distinguir entre o organismo alvo e qualquer outro organismo normalmente presente numa amostra particular).
Muitas sequências sonda podem ser usadas para especificidade larga ou estreita dependendo das condições de utilização.
região variável: polímero do nucleotídeos que diferem em pelo menos uma base entre o organismo alvo e os organismos não alvo contidos numa amostra.
região conservada: uma região que não é variável.
divergência de sequências: processo pelo qual os polímeros de nucleotídeos ficam menos semelhantes durante a evolução.
convergância de sequência: processo pelo qual polímeros de nucleotídeos se tornam mais semelhantes durante a evolução.
bactérias: membros do grupo filogenético eubacteria que é considerado um dos três reinos primários.
Tm: temperatura a que 50% da sonda é convertida da forma híbrida para a não hibrida.
estabilidade térmica: uma condição de incubação para hibridação ou para separação em que se formam híbridos sonda:alvo estáveis e em que não se podem formar híbridos sonda:alvo devido à sua instabilidade. Temperatura a que 50% dos híbridos sonda:alvo são convertidos na forma de cadeia simples. Os factores que afectam a estabilidade térmica podem afectar a especificidade da sonda e portanto devem ser controlados. A utilidade de uma sequência sonda para detectar apenas um tipo específico de microorganismos depende largamente da diferença de estabilidade térmica entre híbridos
-lide sonda:alvo (P:T) e híbridos de sonda:não-alvo (P:NT). Ao projectarem-se sondas Tm de P:T menos a Tm de P:NT deverá ser o maior possível.
Em adição a um novo método para selecção de sequências sonda, descobrimos que é possível criar uma sonda de DNA complementar de uma sequência de rRNA particular obtida a partir de um microorganismo alvo único e usar com suces so aquela sonda num ensaio de reacção não cruzada para a detec ção daquele microorganismo único, mesmo na presença dos seus vizinhos filogenéticos ou taxonómicos mais próximos. Com excepção dos vírus, todos os organismos procarióticos contem moléculas de rRNA incluindo rRNA 5S, rRNA 16S e uma molécula de rRNA maior conhecida como rRNA 13S. Sabe-se que os eucariotas têm moléculas de rRNA 5,OS, 5,8S, 18S e 28S ou estruturas análogas. (0 termo tipo 16S é por vezes usado para referir rRNA encontrando na subunidade ribossomal pequena, incluindo rRNA 18S e 17S. Igualmente o termo rRNA tipo 23S é por vezes usado para referir o rRNA que se encontra na subunidade ribossomal grande. 0 rRNA tipo 5S é por vezes usado para referir rRNA encontrado na subunidade da ribossomal grande. 0 rRNA 5,8S é equivalente ao extremo 5' do rRNA tipo 23S). Estas células de rRNA contêm sequências de nucleotídeos que são altamente conservadas entre todos os organismos até agora iden tifiçados. Existem métodos conhecidos que permitem a determinação de uma porção significativa destas sequências de rRNA. Por exemplo, iniciadora oligonucleotídeos complementares de cerca de 20-30 bases de comprimento podem ser hibridados com regiões universalmente conservadas em rRNA purificado que são específicos das subunidades 5S, 16S ou 23S e pronlogados com a enzima transcriptase reversa. Reacções de degradação química ou de sequênciação didesoxi podem ser usadas para determinar a sequência de nucleotídeos do produto prolongado. Lane, D.J. et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA 82, 6955-6959 (1985).
No nosso invento, a comparação de uma ou mais regiões variáveis de rRNA sequênciadas de um organis
-12mo alvo com uma ou mais sequências de regiões variáveis de rRNA de uma espécie bacteriana infimamente relacionada é utilizado para seleccionar uma sequência única para o rRNA do organismo alvo. O rRNA é preferível ao DNA como alvo de sonda devido à sua abundância relativa e estabilidade na célula e devido aos seus padrões de conservação filogenética.
Não obstante a natureza altamente conservada do rRNA descobrimos que uma série de regiões da molécula de rRNA que podem variar na sequência, podem variar mesmo entre espécies infimamente relacionadas e podem, portanto, ser utilizadas para distinguir tais organismos uns dos outros. As diferenças na molécula de rRNA não são distribuídas ao acaso ao longo de toda a molécula, mas antes estão agrupadas em regiões específicas, criando um padrão único des de RNA ribossomal. podem ser analisados de sondas de diagnóstico, de ser usado para seleccionar mais do que uma sequência que sejam únicas para rRNA de um organismo alvo.
O grau de conservação também varia de conservação ao longo das subunidaO grau de variação e sua distribuição modo a localizar os sítios alvo para Este método de selecção de sondas poque nós determinámos usando processos conhecomputador Sun Microsystems (TM), para aná0 compilador é capaz de manipular muitas
Os computadores deste tiIdentifiçámos regiões variáveis por análise comparativa das sequências de rRNA publicadas na literatura e sequências eidos. Usámos um lise comparativa, sequências de dados ao mesmo tempo, po e programas de computadores que podem ser usados ou adaptados para os fins aqui descritos podem ser adquiridos comercial mente.
De um modo geral, apenas algumas regiões são úteis para a distinção entre espécies muito próximas de um género filogenéticamente conservado, por exemplo, a região de 400-500 bases a partir do extremo 5' da molécula de rRNA 16S. Uma análise de organismos muito próximos (Figuras 6, 7 e 8)
-13V
revela as posições específicas (regiões variáveis) que variam entre organismos das moléculas de rRNA são os candidatos prováveis para a construção de sondas.
As Figuras 5, 6 e 7 mostram as variações nos rRNA de 16S e 23S entre duas bactérias diferentes com quantidades decrescentes de semelhança entre elas. Uma análise mais pormenorizada destas figuras revela alguns padrões subtis entre organismos estremamente relacionados. Em todos os casos estudados observámos variação suficiente entre o organismo alvo e o parente filogenético mais próximo presente na mesma amostra para projectar a sonda pretendida. Ainda, em todos os casos estudados até à data, a percentagem de semelhança entre o organismo alvo (ou organismos) e os organismos relacionados filogenéticamente mais próximos encontrados na mesma amostra foi entre 90% e 99%. É interessante que houve variação suficiente mesmo entre os rRNAs de Neisserias gonorrhoca e meningitidis (Ver Exemplo 21) para projectar sondas apesar do facto dos estudos de homologia de DNA:DNA sugerirem que estas duas espécies devem ser de facto uma só.
Estas figuras também mostram que as diferenças estão distribuídas ao longo de todos os rRNAs 16S e 23S. No entanto muitas das diferenças estão agrupadas nalgumas regiões. Estas posições no rRNA são bons candidatos para o projecto de sondas, com as novas condições de ensaio. Também notámos que as localizações destas densidades de aumento de variação geralmente estão situados nas mesmas regiões do rRNA 16S e 23S para valores de percentagem de semelhança comparáveis. Deste modo, observámos que certas regiões do rRNA 16S e 23S são os sítios mais prováveis em que existe variação significativa entre o organismo alvo e os parentes filogenéticos mais próximos encontrados numa amostra. Divulgámos e reivindicámos sondas específicas de espécie que hibridam nestas regiões de variação significativa entre o organismo alvo e o parente filogenético mais próximo encontrado numa amostra.
As Figuras 9, 10 e 11 são uma representação esquemática da localização de sondas aqui divulgadas e reivindicadas. Devido aos RNAs 16S e 23S não conterem regra geral sequências de duplicação maiores que seis nucleotídeos de comprimento, as sondas projectadas através destes métodos são específicas para uma ou algumas poucas posições no ácido nucleico alvo.
A evolução de sequências em cada uma das regiões variáveis (por exemplo, abrangendo um mínimo de 10 nucleotídeos) é para a maior parte divergente, não convergente. Assim podemos confiadamente projectar sondas baseadas em poucas sequências de rRNA que diferem entre o organismo alvo e os seus parentes filogenéticamente próximos. As restrições biológicas e estruturais na molécula de rRNA que mantêm as estruturas primárias, secundárias e terciária homólogas ao longo da evolução e a aplicação de restrições ao diagnóstico de sondas é o tema do estudo que se segue. Quanto maior a distância evolutiva entre os organismos, maior o número de regiões variáveis que pode ser usado para distinguir os organismos .
Uma vez identificadas as regiões variáveis, as sequências são alinhadas, para revelar áreas de homologia máxima ou emparelhamento. Neste ponto, as sequências são examinadas para identificar potenciais regiões sonda. Dois objectivos importantes ao projectar-se uma sonda são tornar máxima a homologia com aís) sequência(s) alvo (recomenda-se uma homologia superior a 90%) e minimizar a homologia com sequenciais) não-alvo (recomenda-se menos de 90% de não-homologia com os não-alvo).Identificámos as directrizes que se seguem úteis para projectar ondas com as caractéristicas pretendidas .
Primeiro, as sondas devem ser projectadas de modo a minimizar a estabilidade do híbrido sonda:ácido nucleico não-alvo. Isto pode ser conseguido minimizando o
comprimento de complementaridade perfeita com os organismos não-alvo, evitando regiões de homologia ticas em G e C com as sequências não-alvo e colocando a sonda de modo a abranger o máximo possível de desemparelhamentos destabilizadores (por exemplo, os pares de bases, dG:rU são menos estabilizadores do que outros).
Segundo, a estabilidade do híbrido sonda: ácido nucleico alvo deve ser máxima. Isto pode ser conseguido evitando longas sequências ricas em A e T, por terminação dos híbridos com pares de bases G:C e projectando a sonda como uma Tm adequada. 0 começo e o fim da sonda devem ser escolhidos de modo a que o comprimento, %G e %C resultem numa Tm de cerca de 2-10°C mais alto do que a temperatura a que o ensaio final será efectuado. A importância e o efeito das várias condições de ensaio serão ainda aqui melhor explicadas. Terceiro, as regiões do rRNA que se sabe formarem estruturas fortes inibidoras da hibridação são menos preferidas. Finalmente, devem ser evitados sondas com extensa auto-complementaridade .
Nalguns casos, pode haver várias sequências de uma região particular que darão sondas com as características de hibridação pretendidas. Noutros casos, uma sequência pode ser significativamente melhorada do que uma outra que difere meramente numa única base.
A carta que se segue indica como, para uma execução do invento útil na detecção de um ácido nucleico na presença de sequências de ácido nucleico estreitamento relacionado, podem ser seleccionadas sequências únicas. Neste exemplo determinaram-se sequências de rRNA para organismos A-E e as suas sequências representadas numéricamente foram alinhadas como se mostra. Vê-se que a sequência 1 é comum a todos os organismos A-E. As sequências 2-6 encontram-se apenas nos organismos A, B e C enquanto que as sequências 8, 9 e 10 são únicas para o organismo A. Portanto uma sonda comple-
mentar das sequências 8, 9 ou 10 hibridaria específicamente com o organismo A.
Padrão ilustrativo das relações de sequências entre bactérias relacionadas
Organismo Sequência de rRNA
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
B 1 2 3 4 5 6 7 11 12 13
C 1 2 3 4 5 6 14 15 16 17
D 1 18 19 20 21 22 23 24 25 26
E 1 18 19 20 21 27 28 29 30 31
Nos casos em que os padrões de variação
de uma macromolécula são conhecidos, por exemplo, rRNA, pode-se focar em regiões específicas como candidatos prováveis para o projecto de sonda. No entanto, não é sempre necessário determinar toda a sequência do ácido nucleico para se obter a sequência da sonda. A extensão a partir de qualquer iniciador oligonucleotídico isolado pode dar até 300-400 bases de sequência. Quando se usa um único iniciador para sequênciar parcialmente o rRNA do organismo alvo e dos organismos estreitamente relacionados com o alvo, pode-se fazer um alinhamento conforme descrito atrás. Claramente se se encontra uma sequência sonda útil não é necessário continuar a sequênciação do rRNA usando outros iniciadores. Se, por outro lado, não se obtiver uma sequência sonda útil a partir da sequenciação com um primeiro iniciador, ou se se pretender maior sensibilidade, pode-se usar outros iniciadores para se obter mais sequências. Nos casos em que os padrões de variação para uma molécula não são bem compreendidos, pode ser necessários mais resultados de sequênciação antes do projecto da sonda.
Assim, nos Exemplos 1-3 abaixo, usaram-se dois iniciadores derivados de 16S. O primeiro iniciador não deu sequências sonda que preenchessem os critérios aqui
enumerados. 0 segundo iniciador deu sequências sonda que foram determinadas como sendo úteis após caracterização e testagem relativamente à especificidade conforme descrito.No Exemplo 4 usaram-se seis iniciadores 23S antes da localização da sequência sonda estabelecida.
Uma vez identificada a presumível sequência única sintetizou-se um oligonucleotídeo de DNA complementar. Este oligonucleotídeo de cadeia simples servirá como sonda na reacção do ensaio de hibridação de DNA/rRNA. Oligonucleotídeos definidos podem ser sintetizados por qualquer um de vários métodos bem conhecidos, incluindo síntese química automatizada em fase sólida usando precursores cianoetilfosforamideto. Barone, A.D. et al., Nucleic Acids Research 12, 4051-4060 (1984). Neste método, os desoxioligonucleotídeos foram sintetizados em suportes de polímeros sólidos. A libertação do oligonucleotídeo do suporte é conseguida por tratamento com hidróxido de amónio a 60°C durante 16 horas. A solução é seca e o produto bruto dissolvido em água e separado em géis de poliacrilamida os quais podem variar de 10-20% dependendo do comprimento do fragmento. A banda principal que é visualizada por iluminação com luz ultravioleta foi cortada do gel com uma lâmina de barbear e extraída com acetato de amónio 0,lM, pH 7,0, à temperatura ambiente durante 8-12 horas. Após centrifugação o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,4 micron e retirado o sal numa coluna P-10 (Pharmacia). Podem certamente ser empregues outros métodos bem conhecidos para construção de oligonucleotídeos sintéticos.
Os sintetizadores de DNA correntes podem produzir grandes quantidades de DNA sintético. Depois da síntese, examina-se o tamanho do novo DNA feito por filtração em gel, detectando-se geralmente moléculas de tamanho vário. Algumas destas moléculas representam casos de síntese abortiva que ocorrem durante o processo de síntese. Como parte do processo pós-síntese o DNA sintético é geralmente fraccionado de
acordo com o tamanho e apenas as moléculas com o tamanho certo são mantidas. Assim, é possível obter uma população de moléculas de DNA sintético de tamanho uniforme.
No entanto de um modo geral assumiu-se que o DNA sintético é inerentemente composto por uma população uniforme de moléculas todas do mesmo tamanho e com a mesma sequência de bases e que as características de hibridação de cada uma das moléculas na preparação deverá ser a mesma. Na realidade, as preparações de moléculas de DNA sintético são heterogéneas e compostas por números significativos de moléculas que, apesar de terem o mesmo tamanho, são de algum modo diferentes umasdas outras e têm características de hibridação diferentes. Mesmo preparações diferentes da mesma sequência podem por vezes ter características de hibridação diferentes.
Assim, preparações da mesma sequência sonda sintética podem ter características de hibridação diferentes . Devido a isto a especificidade das moléculas sonda de diferentes preparações pode ser diferente. As características de hibridação de cada uma das preparações deverão ser examinadas de modo a determinar as condições de hibridação que devem ser usadas de modo a obter-se a especificidade de sonda pretendida. Por exemplo, a sonda sintética descrita no Exemplo 4 abaixo tem o perfil de especificidade descrito na Tabela 14. Este resultado foi obtido usando as condições de hibridação e ensaio descritas. Uma preparação separada desta sonda que tem características de hibridação diferentes pode não ter precisamente o mesmo perfil de especificidade quando testada nas condições apresentadas no Exemplo 4. Fizeram-se tais preparações de sondas. Para se obter a especificidade pretendida, estas sondas podem ser hibridadas e testadas em condições diferentes, incluindo concentrações salina e/ou temperatura. As condições em que a sonda deve ser usada tem de ser determinadas ou adaptadas às necessidades para cada lote de sonda uma vez que a arte de síntese de DNA é algo imperfei
-19ta.
Após sintese e purificação de uma sequência de oligonucleotídeos particular, podem ser usados vários processos para determinar a aceitação do produto final. 0 primeiro é electroforese em gel de poliacrilamida que é usado para determinar o tamanho. 0 oligonucleotídeo é marcado usando, por exemplo, P-ATP e polinucleotídeo cinase. A sonda marcada foi precipitada em etanol, centrifugada e o sedimento seco foi ressuspenso em tampão de aplicação (80% de formamida, 20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1% de azul de Bromofenol e 0,1% de xilenocianol). As amostras foram aquecidas durante cinco minutos a 90°C e aplicadas num gel desnaturante de poliacrilamida. A electroforese foi feita em tampão TBE (O,1M Tris HC1 pH 8,3, 0,08M ácido bórico, 0,002M EDTA) durante 1-2 horas a 1000 volts. Após electroforese do oligonucleotídeo o gel foi exposto a filme de raios X. O tamanho do oligonucleotídeo foi então calculado a partir da migração dos padrões oligonucleotídicos que correram simultâneamente.
A sequência do oligonucleotídeo sintético pode também ser testada através da sua marcação no extremo 5' com 32 -ATP e polinucleotídeo cinase de T4, submentendo-o às técnicas de degradação química convencionais, Maxam, A.M. e Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 (1980) e analisando os produtos em géis de poliacrilamida. De preferência a sequência de nucleotídeos da sonda é perfeitamente complementar da sequência de rRNA única préviamente identificada, se bem que não haja a necessidade de o ser.
O perfil de fusão, incluindo a temperatura de fusão (Tm) dos híbridos de oligonucleotídeo/rRNA devem igualmente ser determinados. Uma maneira de determinar 32
Tm é hibridar um oligonucleotídeo marcado com P com o seu ácido nucleico alvo complementar a 50°C em tampão fosfato 0,lM, pH 6,8. A mistura de hibridação foi diluida e passada numa coluna de 2 cm com hidroxiapatite a 50°C. Lavou-se a
coluna com tampão fosfato O,1M, 0,02% de SDS para eluir todas as sondas de cadeia simples não hibridadas. A temperatura da coluna foi baixada para 15°C e aumentada com aumentos discretos de 5°C até toda a sonda estar em cadeia simples. Em cada uma das temperaturas, a sonda não hibridada foi eluida e determinada as contagens por minuto (cpm) em cada fracção. O número de cpm ligado à hidroxiapatite dividido pelos cpm totais aplicados na coluna iguala a percentagem de hibridação da sonda com o ácido nucleico alvo.
Está descrito abaixo um método alternativo para determinação da estabilidade térmica de um hibrido. Uma amostra de ácido nucleico hibrido foi diluida com 1 ml de tampão fosfato 0,12M, 0,2% SCS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA ou um tampão de hibridação adequado. Seguiu-se aquecimento desta solução de 1 ml até 45 graus C durante 5 minutos e colocação da mesma num banho-Maria à temperatura ambiente para arrefecer durante 5 minutos. Testou-se este 1 ml de solução contendo os híbridos numa coluna de hidroxiapatite, colheu-se o híbrido e lavou-se à sonda não ligada. Se se usar uma solução de hibridação que não seja o tampão fosfato 0,12M, será então necessário fazer uma diluição da solução de hibridação no cocktail de tampão fosfato 0,12M para a ligação. Continuou-se a tirar amostras do híbrido pré-formado e a diluir em 1 ml de solução de hibridação ou na solução convencio nal de tampão fosfato 0,12M descrita acima levantando ao mesmo tempo a temperatura de aquecimento 5°C de cada vez. Continuou-se assim até todo o hibrido estar dissociado. O ponto em que metade do hibrido foi convertido na forma dissociada é considerado a Tm. A Tm para um determinado híbrido variará dependendo da solução de hibridação usada uma vez que a estabilidade térmica depende da concentração dos diferentes sais, detergentes e outros solutos que afectam a estabilidade relativa do hibrido nas condições de desnaturação térmica.
Devido ao facto do grau e especificidade das reacções de hibridação tais como as descritas aqui se-
rem afectados por uma série de factores, a manipulação de um ou mais destes factores determinará a sensibilidade exacta e especificidade de uma sonda particular, quer seja ou não perfeitamente complementar do seu alvo. Por exemplo, a composição de bases da sonda pode ser significativa porque os pares G-C apresentam maior estabilidade térmica do que os pares de bases A-T devido à ligação de hidrogénio adicional. Assim, a hibridação envolvendo ácidos nucleicos complementares com alto teor de G-C serão estáveis a temperaturas mais elevadas.
Descobrimos que o comprimento da sequência de ácido nucleico alvo, e, do mesmo modo, o comprimento da sequência sonda podem igualmente ser importantes. Se bem que seja possível a hibridação de ácidos nucleicos que não sejam perfeitamente complementares, será o segmento mais longo de sequências de bases perfeitamente homólogas que normalmente determinara a estabilidade do hibrido. Se bem que possam ser usadas sondas de oligonucleotídeos de diferentes comprimento e composição de bases, as sondas de oligonucleotídeos preferidas neste invento têm entre cerca de 15 e cerca de 50 bases de comprimento e são pelo menos 75-100% homólogas do ácido nucleico alvo. Para a maior parte das aplicações é preferível uma homologia de 95-100% com o ácido nucleico alvo.
A força iónica e temperatura de incubação também deverão ser levadas em consideração a construir-se uma sonda. Sabe-se que a velocidade de hibridação aumentará à medida que a força iónica da mistura de reacção aumenta e que a estabilidade térmica dos híbridos aumentará com o aumento da força iónica. Em geral, a hibridação óptima para sondas de oligonucleotídeos sintéticos com cerca de 15-50 bases de comprimento ocorre a aproximadamente 5°C abaixo da temperatura de fusão para uma determinada cadeia dupla. A incubação a temperaturas abaixo da óptima podem permitir a hibridação incorrecta de bases e pode resultar assim numa especificidade reduzida.
Relativamente à concentração de ácido nucleico é conhecido que a velocidade de hibridação é proporcional à concentração das duas espécies de ácido nucleico envolvidas. Assim, a presença de compostos tais como dextrano e dextransulfato parece aumentar a concentração local das espécies de ácido nucleico e resultar assim num aumento da taxa de hibridação. Outros agentes que resultam em taxas de hbridação aumentados estão especificados no Pedido U.S. N° de Série 627.795 entitulado 11 Accelerated Nucleic Acido Reassociation Method, entregue a 5 de Julho de 1984, sua Continuação-em-Parte, NQ de Série (ainda não atribuido), entregue a 4 de Junho de 1987 e Pedido U.S. NQ de Série 816.711, entitulado Accelerated Nucleic Acid Reassociation Method, entregue a 7 de Janeiro de 1986, ambos são aqui incluidos por referência . Por outro lado, os reagentes químicos que quebram as ligações de hidrogénio tais como formamida, ureia, DMSO e álcoois aumentarão a dificuldade da hibridação.
As sondas de oligonucleotídeos seleccionadas podem ser marcados por qualquer um de vários métodos conhecidos. As marcas úteis incluem radioisótopos assim como grupos não-radioactivos. As marcas isotópicas incluem H, 35g, 32p, 125cobalto e A maior parte dos métodos de marcação isotópica incluem o uso de enzimas e envolvem métodos conhecidos de mick-translation, marcação dos extremos, síntese da segunda cadeia e transcrição reversa. Quando se usa sondas marcadas radioactivamente, a hibridação pode ser detectada por autorradiografia, contagem por cintilação ou contagem de radiação gama. O método de detecção seleccionado dependerá das condições de hibridação e do radioisótopo particular usado para marcação.
Também podem ser usados materiais não isótopicos na marcação e podem ser introduzidos pela incorporação de nucleotídeos modificados através do uso de enzimas ou por modificação química da sonda, por exemplo, através do uso de grupos adaptadores não nucleotídicos. As marcas não
isotópicas incluem moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminosas, enzimas, cofactores, substratos de enzimas, haptenos ou outros ligandos. Normalmente preferimos os ésteres de acridínio.
Numa execução do ensaio de hibridação deDNA/rRNA do invento, uma sonda marcada e ácidos nucleicos alvo bacterianos são pontos a reagir em solução. 0 rRNA pode ser libertado das células bacterianas pelo método de rebentamento com ultra-sons descrito por Murphy, K.A. et al., Pedido U.S. N° de Série 841.860, entitulado Method for Releasing RNA and DNA From Cells, entregue a 20 de Março de 1986, que aqui é incluido por referência. Outros métodos conhecidos para rebentar células incluem o uso de enzimas, choque osmótico, tratamento químico e uso de vortex com contas de vidro. Simultaneamente ou após a libertação de rRNA, a sonda marcada pode ser adicionada na presença de agentes de aceleração e incubada à temperatura óptima de hibridação durante um período de tempo necessário para se conseguir reacção significa tiva. Após este período de incubação, a hidroxiapatite pode ser adicionada à mistura de reacção para separar os híbridos de sonda/rRNA das moléculas de sonda não hibridadas. O sedimento de hidroxiapatite é lavada, centrifugado de novo e os híbridos detectados através de meios adequados à marca usada.
Estão descritas abaixo vinte e uma execuções ilustrativas dos inventos reivindicados, em que é determinado uma sonda ou sondas sintéticas complementares de uma sequência de rRNA única de um organismo alvo ou grupo de organismos, construída e usada num ensaio de hibridação.
Descrição de execuções particulares
As microbactérias são bacilos ácido-resistentes, álcool-resistentes, aeróbicas não-móveis. 0 seu teor em lípidos é alto e o seu crescimento lento Mycobacterium avium e Mycobacterium intracellulore em conjunto são referidas como M. avium-intracellulare devido a serem muito dificeis de diferênciar. Recentemente, o complexo M. avium que inclui M. intracellulare verificou-se ser o segundo isolado mais vulgar de Mycobacterium com importância clínica. Good, R. C. et al., J. Infect. Pis. 146, 829-833 (1982). Evidência mais recente indica que estes organismos são uma causa vulgar da infecção oportunista em pacientes com SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida). Gill, V. J. et al.; J. Clin. Microbio. 22, 543-546 (1985). 0 tratamento de tais infecções em doentes com SIDA é dificil devido a estes organismos serem resistentes à maior parte das drogas antituberculose. Por vezes na terapia usa-se uma combinação de cinco drogas. A gravidade destas doenças também requere diagnóstico rápido que antes deste invento não era possível.
Os membros do complexo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) incluem Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum e Mycobacterium microti. Os três primeiros são patogénicos para os humanos enquanto que o último é um patogénico para animais. Estes organismos produzem granulomas de desenvolvimento lento na pele ou podem invadir orgãos internos. A tuberculose dos pulmões pode ser disseminada para outras partes do corpo pelo sistema circulatório, pelo sistema linfático ou pelo tracto intestinal. Apesar dos avanços na saúde pública e do advento de quimioterapia eficaz, as doenças provocadas por Micobactérias, tuberculose em particular, continuam a representar um dos principais problemas de saúde a nível mundial.
método clássico para detecção de bactérias numa amostra envolve cultura de amostra de modo a ex-25-
pandir o número de células bacterianas presentes em colónias observáveis que podem ser identificadas e enumeradas. Caso se pretenda, as culturas também podem ser sujeitas a testes adicionais de modo a determinar a susceptibilidade antimicrobaina. Normalmente, os processos mais vulgarmente usados para a detecção, isolamento e identificação das espécies de Mycobacterium são o esfregaço de bacilos acido-resistente (AFB) (usando as técnicas de Ziehl-Neelsen ou com fluorocromo), métodos de cultura usando meios de Lowenstein-Jensen e meios de Middlebrook e testes bioquímicos. 0 AFB fundamenta-se no elevado teor em lípidos de Mycobacterium que retêm corante após exposição a ácido-álcool. Ainda que o teste de esfegaço AFB seja relativamente rápido e simples de efectuar ele nem sempre detecta Mycobacteria e não permite diferênciar Mycobacterium avium e espécies não tuberculosas, Mycobacterium intracellulare e espécies não tuberculosas ou bacilos do complexo de Mycobacterium tuberculosa e espécies não tuberculosas. Para uma identificação precisa da espécie de Micobactéria causadora da infecção o clínico deve basear-se em resultados de cultura que podem requerer em qualquer sítio entre 3 a 8 semanas de crescimento seguido de testagem bioquímica extensiva. Foram desenvolvidos outros testes baseados na detecção de produtos metabólicos de Mycobacterium usando substratos marcados com Carbono 14. Em particular, o instrumento Bactec (TM) pode detectar a presença de Mycobacterium entre 6 e 10 dias a partir da altura da inoculação. Gill, V.J. supra. No entanto, o teste não distingue espécies de Mycobacterium . È por vezes importante fazer esta determinação de modo a que possam ser receitadas drogas particulares a que o organismo seja susceptível. Para métodos de cultura tradicionais, isto requere mais 2 a 3 semanas e para o método Bactec, mais 6 a 10 dias.
Adicionalmente nos exemplos que se seguem são descritos execuções específicas para Mycobacterium pneumoniae, bactérias do grupo das Mycobacterium, Llegionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter, Proteus mi-
rabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, E. coli, Pseudomonas Grupo I, fungos e Neisseria gonorrhoeae.
Conforme indicado pelos exemplos abaixo, o presente invento tem vantagens sigficativas sobre cada um dos métodos anteriores, não só pelo aumento de precisão, especificidade e simplicidade do teste, como também devido à redução enorme do tempo necessário ao diagnóstico. 0 invento torna possível um diagnóstico definitivo e o inicio de um tratamento eficaz no mesmo dia do teste.
Exemplo 1
Descreve-se abaixo a preparação de um desoxioligonucleotídeo de cadeia simples de sequência única e comprimento definido que foi marcado e usado como sonda um ensaio de hibridação em solução para detectar a presença de rRNA de Mycobacterium avium. Esta sequência única é específica para o rRNA de Mycobacterium avium e não dá reacção cruzada significativa nas condições de hibridação deste Exemplo, com ácidos nucleicos de qualquer outras espécie bacteriana ou agente infeccioso do sistema respiratório, incluindo Mycobacterium intracellulare que é uma espécie muito próxima. Esta sonda é capaz de distinguir as duas espécies apesar de cerca de 98% de homologia do rRNA entre as duas espécies. Neste Exemplo, assim como nos Exemplos 2 e 3, obtiveram-se as sequências para M. avium, complexo M. tuberculosis, M. intracellulare e organismos relacionados usando um iniciador específico de uma região altamente conservada no rRNA 16S. A sequência deste iniciador, derivada do rRNA de E. coli, era 51-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'. Misturou-se 5 nanogramas de iniciador com 1 micrograma de cada rRNA a ser sequênciado na presença de KC1 O,1M e 20 mM Tris-HCl pH 8,3 num volume final de 10 microlitros. As reacções foram aquecidas
min. a 45°C e depois colocadas em gelo. Adicionou-se 2,5 35 microlitros de S-dATP e o,5 microlitros de transcnptase reversa. A amostra foi dividida por 4 tubos, cada tubo contendo didesoxi A, G, T ou C. As concentrações destes nucleotideos estão estabelecidas em Lane et al., supra. As amostras foram incubadas a 40°C durante 30 minutos e foram então precipitadas em etanol, centrifugadas e os sedimentos liofilizados. Ressuspenderam-se os sedimentos em 10 microlitros de corante de formamida (100% de formamida, 0,1% de azul de bromofenol e 0,1% de xileno cianol) aplicados em géis de 8% de poliacrilamida com 80 cm. Os géis correram a 2000 volts durante 2-4 horas.
Deste modo, as sequências de nucleotídeos para o rRNA 16S de Mycobacterium avium e o que se considerou ser os seus vizinhos filogenéticos mais próximos, Mycobacterium intracellulare e Mycobacterium tuberculosis, foram determinadas pelo método de Lane, D.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:6955 (1985). Além da determinação das sequências de rRNA para os organismos referidos atrás, também se sequênciou um espectro de Mycobacterium com importância clínica. Estes incluem M. fortuitum, M. scrofulaceum e M. chelonae. Também foram sequênciados membros seleccionados de vários géneros estreitamente relacionados com Mycobacterium, incluindo Rhodococcus bronchialis, Corynebacterium xerosis e Norcadia asteroides.
Sequências parciais de rRNA dos organismos acima foram alinhadas para homologia máxima entre os nucleotídeos, usando programas de computador comercializados pela Intelligenetics, Inc., 1975 EI Camino Real West, Mountain View, Califórnia 94040-2216 (Programa IFIND). A partir deste alinhamento determinaram-se as regiões de sequência única de Mycobacterium avium. A sonda foi seleccionada de modo a ser perfeitamente complementar de uma sequência de ácido nucleico alvo e de modo a ter 10% ou mais de desemparelhamento com o rRNA alinhado do seu vizinho filogenético mais próximo. Esco28-
lheu-se uma sequência de 38 bases. 0 número de bases desemparelhadas relativamente à sequência de Mycobacterium avium foi o seguinte: Mycobacterium tuberculosis (8); Mycobacterium intracellulare (5); Mycobacterium scrofulaceum (6 ) ; Mycobacterium chelonae (12); e Mycobacterium fortuitum (10).
A sequência de cDNA que se segue foi caracterizado pelo critério do comprimento, Tm e análise de sequência conforme descrito nas páginas 7-8 acima e foi determinada como específica para o rRNA de Mycobacterium avium:.
ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG.
Esta sequência é complementar de um segmento único que se encontra no rRNA 16S de Mycobacterium avium. O tamanho da sonda é de 38 bases. A sonda tem uma Tm de 74°C e a análise de sequência pelo método de Maxam e Gilbert (1980), supra, confirmou que a sonda foi sintetizada correctamente. A sonda é capaz de hibridar com rRNA de M. avium na região correspondente às bases 185-225 do rRNA 16S de E. coli. I
Para demonstrar a reactividade desta sequência relativamente a Mycobacterium avium ela foi testada como sonda em reacções de hibridação nas condições que se seguem. Sondas de oligonucleotídeos marcados nos extremos com 32 -13
P foram misturados com 1 micrograma (7x10 moles) de rRNA purificado de Mycobacterium avium e postas a reagir em tampão de hibridação 0,12M PB (quantidades equimolares de Na2HPO^ e NaF^PO^), 1 mM EDTA e 0,02% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 65°C durante 60 minutos num volume final de 50 microlitros. Em tubos separados a sonda foi misturada com o tampão de hibridação com e sem alvo. Após separação em hidroxiapatite conforme descrito nos pedidos de patente identificados na página 2, supra, os hibridos foram quantificados por contagem de cintilação. Estes resultados estão apresentados na Tabela 1, mostrando que a sonda tem um elevado grau de reacção com o alvo homólogo e pouca ligação não específica à
hidroxiapatite.
Tabela 1
Hibridação da sonda de M. avium com rRNA alvo homólogo rRNA mais rRNA menos sonda de M. avium 85-95% 0,5% % Hibridação = cpm ligados à hidroxiapatite cpm totais adicionados à reacção
A especificidade da sonda de M. avium foi testada misturando a sonda marcada com P e rRNA libertado das células de outras 29 espécies de micobactérias por técnicas de rebentamento com ultra-sons descritos por Murphy et al. , Pedido U.S. N2 de Série 841 860. ΙχΙΟθ células foram suspensas em 0,1 ml de SDS a 5% e sonicadas durante 10 min. a 50-60°C. Adicionou-se 1,0 ml de tampão de hibridação (45% de diisobutilsulfossuccinato de sódio, tampão fosfato 40 mM pH 6,8 e 1 mM EDTA) e a mistura foi incubada durante 60 minutos a 72°C. Após incubação adicionou-se 4,0 ml de solução de hidroxiapatite (tampão fosfato de sódio 0,14M, pH 6,8, 0,02% de SDS e 1,0 gramas de hidroxiapatite por 50 mis de solução) e incubou-se durante 5 minutos a 72°C. A amostra foi centrifugada e o sobrenadante removido. Adicionou-se 4,0 ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,14M pH 6,8) e agitou-se a amostra com vortex, centrifugou-se e removeu-se o sobrenadante. A radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação. Os resultados estão apresentados na Tabela 2 e indicam que a sonda é específica para Mycobacterium avium e não reage com qualquer outra espécie micobacteriana, incluindo Mycobacterium intracellulare.
Tabela 2
Hibridação da sonda de M. avium Organismo para espécies ATCC# micobacterianas % Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 1,0
M. asiaticum 25276 1,2
M. avium 25291 87,6
M. bovis 19210 1,2
M. bovis (BCG) 19015 1,0
M. chelonae 14472 0,9
M. flavescens 14474 0,9
M. fortuitum 6841 1,0
! . gastri 15754 1,2
M. gordonae 14470 1,2
M. haemophilum 29548 1,3
M. intracallulare 13950 1,5
M. Kansasii 12478 1,2
M. malmoense 29571 1,2
M. marinum 827 1,2
M. nonchromogenicum 1930 1,1
M. phlei 11758 1,3
M. scrofulaceum 19981 1,2
M. shimoidei 27962 2,3
M. simiae 25275 1,2
M. smegmatis el4468 1,0
M. szulgai 23069 1,0
M. terrae 15755 1,2
M. thermoresistibile 19527 1,3
M. triviale 23292 1,2
M. tuberculosis (avirulenta) 25177 1,4
M. tuberculosis (virulenta) 27294 1,1
M. ulcerans 19423 1,4
M. vaccae 15483 1,2
M. xenopi 19971 1,5
31Como se mostra na Tabela 3 a sonda tam-
bém não reage com o rRNA de qualquer um dos agentes patogénicos do sistema respiratório que também foram testados pelo método acabado de descrever. A sonda também não reagiu com quaisquer outras espécies de bactérias estreitamente relacionadas ou filogenéticamente mais afastadas igualmente testadas por aquele método (Tabela 4).
Tabela 3
Hibridação da sonda de M. avium com patogé nios respiratórios
Organismo
Corynebacterium xerosis Fusobacterium nucleatum Haemophilum influenzae Klebsiella pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Neísseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Propionibacterium acnes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus
ATCC# % Sonda Ligada
373 0,7
25586 1,3
19418 1,3
23357 1,8
33152 0,0
15531 3,0
13090 o,o
25330 o,o
6919 1,1
6306 o,o
25923 1,5
Tabela 4
Hibridação da sonda de M. avium com uma secção transversal filogenética de espécies bacterianas
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,0
Branhamella catarrahalis 25238 0,6
Bacillus subtilis 6051 0,9
Bacteroides fragilis 23745 1,0
Campylobacter jejuni 33560 0,4
Chromobacterium Violaceum 29094 1,7
Clostridium perfringens 13124 2,1
Deinococcus radiodurans 35073 0,8
Derxia gummosa 15994 0,3
Enterobacter aerogenes 13048 0,6
Escherichia coli 11775 0,3
Mycobacterium gordonae 14470 1,9
Mycoplasma hominis 14027 3,3
Proteus mirabilis 29906 o,o
Psudomonas cepacia 11762 1,0
Rahnella aquatilis 33071 2,1
Rhodospirillum rubrum 11170 0,6
Streptococcus mitis 9811 0,9
Vibrio parahaemolyticus 17802 1,2
Yersinia enterocolitica 9610 0,4
Exemplo 2
Após o alinhamento descrito no Exemplo
1, a sequência que se segue foi caracterizada pelos critérios do comprimento, Tm e análise de sequências atrás referidos e foi determinada como sendo específico de Mycobacterium intracellulare:
ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG
A sequência é complementar de um segmento único encontrando no rRNA 16S de Mycobacterium intracellulare. 0 tamanho da sonda era de 38 horas. A sonda tinha uma Tm de 75°C e a análise da sequência confirmou que sonda foi correctamente sintetizada. A sonda híbrida com RNA de M. intracellulare na região correspondente às bases 185-225 do rRNA 16S de E. coli.
Para demonstrar a reactividade desta sequência relativamente a Mycobacterium intracellulare, a sonda foi testada em reacções de hibridação nas condições que se seguem. Misturou-se a sonda oligonucleotídica marcada nos ex32 -13 tremos com P com 1 micrograma (7x10 moles) de rRNA purificado de Mycobacterium intracellulare e reagiu-se em PB 0,10M (quantidades equimolares de Na2HPO4 e NaH2PO4), 1 mM EDTA e 0,2% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 65°C durante 60 minutos num volume final de 50 microlitros. Em tubos separados a sonda foi misturada com o tampão de hibridação com e sem rRNA alvo de Mycobacterium intracellulare. Após separação em hidroxiapatite conforme descrito préviamente os híbridos foram quantificados por contagem de cintilação líquida. Estes resultados estão apresentados na Tabela 5.
-34“t
TABELA 5
Hibridação da sonda de M. intracellure com rRNA alvo homologo /
Sonda de M. intracelluare rRNA mais
85-95% rRNA menos
0,5% % Hibridação = cpm ligado a hidroxiapatite_____ cpm totais adicionados à reacção
Estes resultados mostram que a sonda tem um grau elevado de reacção com o seu alvo homólogo e muito pouca ligação não específica com a hidroxiapatite.
A especificidade da sonda de Mycobacterium intracellulare foi testada misturando a sonda marcada com P com rRNA libertado das células de 29 outras espécies de micobactérias por técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas por Murphy et al. Pedido de Patente US NQ 841.860. Todos os ensaios de hibridação foram feitos como descrito no Exemplo 1. A Tabela 6 indica que a sonda é específica de Mycobacterium intracellulare e não reage com quaisquer outras espécies bacterianas, incluindo Mycobacterium avium. Estes resultados são importantes face a 98% de homologia com o rRNA de M. avium; 98% de homologia com M. Kansasii; 98% de homologia com M. asiaticum; e 97% de homologia com M. tuberculosis.
TABELA 6
Hibridação da sonda de M. intracellular com espécies micobacterianas
Organismo ATCC* % da sonda ligada
Mycobacterium africanum 25420 0,9
M. asiaticum 25276 1,1
M. avium 25291 1,3
M. bovis 19210 1,1
M. bovis (BCG) 19015 1,2
M. chelonae 14472 1,0
M. favescens 14474 1,2
M. fortuitum 6841 1,3
M. gastri 15754 1,3
M. gordonae 14470 1,3
M. haemophilum 29548 0,9
M. intracellulare 13950 78,8
M. Kansasii 12479 1,1
M. Malmoense 29571 1,0
M. marinum 827 0,9
M. nonchromogenicum 1930 1,0
M. phlei 11758 1,1
M. scrofulaceum 19981 1,0
M. shimoidei 27962 1,3
M. simiae 25275 1,1
M. smegmatis el4468 1,3
M. szulgai 23069 1,0
M. terrae 15755 1,4
M. thermoresistibile 19527 1,6
M. triviale 23292 1,3
M. tuberculosis (avirulent) 25177 1,2
M. tuberculosis (virulent) 27294 1,2
M. ulcerans 19423 1,1
M. vaccae 15483 1,0
M. xenopi 19971 1,2
-36Como se mostra na Tabela 7 a sonda não reage com o rRNA de qualquer um dos patogénicos respiratórios testados no ensaio de hibridação. Nem a sonda reage com qualquer outra espécie de bactérias estreitamente relacionada ou filogéneticamente mais afastada que foram testadas (Tabela 8).
Tabela 7
Hibridação da sonda de M. intracellulare
com patogénicos respiratórios % Sonda Ligada
Organismo ATCC#
Corynebacterium xerosis 373 2,2
Fusobacterium nucleotum 25586 1,5
Haemophilum influenzae 19418 1,3
Klebsiella pneumoniae 23357 1,2
Legionella pneumohila 33152 1,2
Mycoplasma pneumoniae 15531 3,2
Neisseria meningitidis 13090 1,1
Pseudomonas aeruginosa 25330 1,0
Propionibacterium acnes 6919 2,9
Streptococcus pneumoniae 6306 1,6
Staphylococcus aureus 25923 1,3
TABELA 8
Hibridação da sonda de M. intracellulare com uma filogética transversal de éspecies bacterianas
Organismo ATCC # % Sonda
Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,5
Branhamella catarrhalis 25238 1,8
Bacillus subtilis 6051 1,7
Bacteroides fragilis 23745 1,9
Campylobacter jejuni 33560 1,9
Chromobacterium Violaceum 29094 1,4
Clostridium perfringens 13124 2,1
Deinococcus radiodurans 35073 2,1
Derxia gummosa 15994 1,6
Enterobacter aerogenes 13048 1,3
Escherichia coli 11775 1,2
Mycobacterium gordonae 14470 2,3
Mycoplasma hominis 14027 2,6
Proteus mirabilis 29906 1,2
Pseudomonas cepacia 11762 1,7
Rahnella aquatilis 33071 1,5
Rhodospirillum rubrum 11170 1,4
Strptococcus mitis 9811 1,4
Vibrio parahaemolyticus 17802 2,5
Yersinia enterocolitica 9610 1,1
Exemplo 3
Após o alinhamento descrito no Exemplo
1, a sequência que se segue foi caracterizada pelos três critérios atrás referidos, tamanho, sequência e Tm, tendo-se determinado como específica do complexo Mtb de organismos, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis e Mycobacterium microte:
1. TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG
A sequência é complementar de um segmento único encontrado no rRNA 16S das bactérias do complexo Mtb. 0 tamanho da sonda é de 35 bases. A sonda tem um Tm de 72°C e a análise da sequência confirmou que a sonda foi correctamente sintetizada. Ela é capaz de hibridar na região correspondente às bases 185-225 do rRNA 16S de E. coli.
Para demonstrar a reactividade desta sequência com o complexo Mtb a sonda foi testada em reacções de hibridação nas condições que se seguem. Misturou-se a sonda de oligonucleotideo marcado nos extremos com P e 1 micro-13 grama (7x10 moles)de rRNA purificado a partir de Mycobacterium tuberculosis e reagiu-se em tampão de hibridação PB 0,12M (quantidades equimolares de NagHPO^ e Naf^PO^), 1 mM EDTA e 0,2% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 65°C durante 60 minutos num volume final de 50 microlitros. Em tubós separados misturou-se a sonda com o tampão de hibridação com e sem rRNA alvo de Mycobacterium tuberculosis. Após separação em hidroxiapatite conforme descrito atrás os hibridos foram quantificados por contagem de cintilações. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.
Hibridação da sonda
16S do complexo Mtb de DNA derivado do rRNA com rRNA alvo homologo / rRNA mais rRNA menos sonda do complexo Mtb
0,5% % Hibridação = cpms ligados a hidroxiapatite____ cpms totais adicionados à reacção
Estes resultados mostram que a sonda tem um elevado grau de reacção com o alvo homólogo e muito pouca ligação não específica com a hidroxiapatite.
A especificidade da sonda para o comple32 xo Mtb foi testada misturando a sonda marcada com P e o rRNA libertado das células de 4 bacilos do complexo Mtb e de 25 outras espécies micobacterianas por técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas em Murphy et al., Pedido de Patente U.S. N2 841.860. Todos os ensaios de hibridação foram efectuados como descrito no Exemplo 1. A Tabela 10 indica que a sonda é específica para organismos dentro do complexo Mtb e não reage com quaisquer outras espécies de micobactérias.
Tabela 10
Hibridação da sonda de DNA derivada do rRNA 16S do complexo Mtb com espécies micobacterianas
Organismo ATCC % Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 68,1
M. asiaticum 25276 3,4
M. avium 25291 0,9
M. bovis 19210 63,1
M. chelonae 14472 1,1
M. flavescens 14474 0,9
M. fortuitum 6841 1,1
M. gastri 15754 0,8
M. gordonae 14470 1,1
M. haemophilum 29548 0,8
M. intracallulare 13950 1,1
M. kansasii 12479 1,3
M. malmoense 29571 0,9
M. marinum 827 1,1
M. nonchromogenicum 1930 1,1
M. phlei 11758 1,3
M. scrofulaceum 19981 1,1
M. shimoidei 27962 1,0
M. simiae 25275 1,2
M. smegmatis el4468 0,9
M. szulgai 23069 1,1
M. terrae 15755 1,0
M. thermoresistibile 19527 1,0
M. triviale 23292 1,2
M. tuberculosis (avirulent) 25177 66,2
M. tuberculosis (virulent) 27294 62,4
M. ulcerans 19423 0,9
M. vaccae 15483 0,8
M. xenopi 19971 2,6
-41Como se mostra na Tabela 11 a sonda não
reage com o rRNA de qualquer um dos patogénicos respiratórios testados no ensaio de hibridação. Nem a sonda reage com qualquer outra bactéria testada (Tabela 12).
Tabela 11
Hibridação da sonda de DNA derivado do rRNA 16S do complexo Mtb com patogénios respiratórios
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Corynebacterium xerosis 373 1,3
Fusobacterium nucleatum 25586 1,0
Haemophilum influenzae 19418 1,6
Klebsiella pneumoniae 23357 1,2
Legionella pneumophila 33152 1,4
Mycoplasma pneumoniae 15531 1,1
Neisseria menigitidis 13090 1,0
Pseudomonas aeruginosa 25330 1,7
Propionibacterium acnes 6919 1,2
Streptococcus pneumoniae 25923 0,9
-42Tabela 12
Hibridação da sonda de DNA derivada de rRNA 16S do complexo Mtb com uma secção filogenética transversal das espécies bacterianas
Organismo ATCC# % Sonda
Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,3
Branhamella catarrhalis 25238 1,5
Bacillus subtilis 6051 1,3
Bacteroides fragilis 23745 1,3
Campylobacter jejuni 33560 1,1
Chromobacterium violaceum 29094 1,0
Clostridium perfringens 13124 1,2
Deinococcus radiodurans 35073 1,0
Derxia gummosa 15994 1,0
Enterobacter aerogenes 13048 1,0
Escherichia coli 11775 1,0
Mycobacterium gordonae 14470 1,3
Mycoplasma hominis 14027 0,5
Proteus mirabilis 29906 1,0
Pseudomonas cepacia 11762 2,6
Rahnella aquatilis 33071 1,9
Rhodospirillum rubrum 11170 1,0
Streptococcus mitis 9811 1,1
Vibrio parahaemolyticus 17802 0,9
Yersinia enterocolitica 9610 1,1
Fizeram-se e testaram-se dois derivados da sonda do Exemplo 3 (numeradas 2-3 em baixo):
2. CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG
3. ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC
As três sondas têm Tms similares (72°;
73,5° e 72,3°, respectivamente) e características de hibrida-43ção semelhantes.
A hibridação com organismos do complexo
Mycobacterium tuberculosis foi de 68-75% e a hibridação não específica com a hidroxiapatite foi inferior a 2%. Seguem-se os resultados dos ensaios de hibridação para estes derivados.
Tabela 13
Hibridação dos derivados 2 e 3 da sonda do
Exemplo 3 com espécies micobacterianas
Organismo ATCC % Sonda 1 do Exemplo Ligada % Sonda 2 Ligada % Sonda 3 Ligada
Mycobacterium africanum 25420 68,1 69,4 70,6
M. asiaticum 25274 3,4 5,3 1,8
M. avium 25291 0,9 1,6 1,4
M. bovis 19210 63,1 75,3 74
M. chelonae 14472 1,1 1,5 1,6
M. flavescens 14474 0,9 2,7 1,4
M. fortuitum 6841 1,1 3,6 1,5
M. gastri 15754 0,8 3,6 1,7
M. gordonae 14470 1,1 1,6 1,4
M. haemophilus 29548 0,8 3,2 1,7
M. intracellulare 13950 1,1 1,6 1,4
M. Kansasii 12478 1,3 2,1 2,0
M. malmoense 29571 0,9 2,8 1,5
M. marinum 827 1,1 2,1 1,5
M. nonchromogenicum 1930 1,1 3,0 1,5
M. phlei 11758 1,3 1,3 1,1
M. scrofulaceum 19981 1,1 3,4 1,6
M. shimoidei 27962 1,0 2,7 1,6
M. simiae 25275 1,2 2,9 1,8
M. smegmatis el4468 0,9 1,5 1,2
M. szulgai 23069 1,1 3,6 1,1
M. terrae 15755 1,0 3,7 2,0
M. thermoresistibile 19527 1,0 1,6 1,3
M. triviale 23292 1,2 1,6 2,0
M. tuberculosis
(avirulento) 25177 66,2 75 68
M. tuberculosis
(virulento) 27294 62,4 74 75
M. ulcerans 19423 0,9 1,7 3,0
M. vaccae 15483 0,8 1,4 1,2
M. xenopi 19971 2,6 1,4 1,2
Exemplo 4
A sonda específica para o rRNA do complexo M. tuberculosis obteve-se usando um iniciador complementar de uma região altamente conservada do rRNA 23S. A sequência deste iniciador, derivado do rRNA de E. coli, era 5'-AGG AAC CCT TGG GTC TTC GG-31. Misturou-se cinco nanogramas deste iniciador com 1 micrograma de rRNA de íd. tuberculosis e outra micobactéria estreitamente relacionada e seguiu-se o processo descrito para os Exemplos 1, 2 e 3. Após alinhamento como descrito no Exemplo 1, a sequência que se segue foi determinada como específica de organismos do complexo Mtb, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis e Mycobacterium microti:
TGCCCTACCCACACCCACCACAAGGTGATGT.
A sequência é complementar de um segmento único encontrado no rRNA 23S de bactérias do complexo Mtb. A sonda oligonucleotídica foi caracterizada como préviamente descrito pelos critérios de comprimento Tm e análise da sequência. 0 tamanho da sonda é de 31 bases. A sonda tem uma Tm de 72,5°C e a análise da sequência confirmou que a sonda foi correctamente sintetizada. Ela é capaz de hibridar na região correspondente às bases 1155-1190 do rRNA 23S de E. coli.
Para demonstrar a reactividade desta sequência para o complexo Mtb a sonda foi testada em reacções de hibridação nas condições que se seguem. Sondas de oligonucleo32 tídeos marcados nos extremos com P foram misturados com 1 mi-13 crograma (7x10 moles) de rRNA purificado derivado de Mycobacterium tuberculosis e reagiram em tampão de hibridação PB 0,12M (quantidades equimolares de NagHPO^ e NaHgPO^), 1 mM EDTA e 0,2% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 65°C durante 60 minutos num volume final de 50 microlitros. Em tubos separados misturou-se a sonda com o tampão de hibridação com e sem rRNA alvo de Mycobacterium tuberculosis. Após separação em hidroxiapatite conforme descrito atrás, os híbridos foram
-46quantificados por contagem de cintilação. Os resultados estão apresentados na Tabela 14.
Tabela 14
Hibridação da sonda de DNA derivado do rRNA 23S do complexo Mtb com rRNA alvo homólogo
Sonda de 23S do complexo Mtb rRNA mais
94% rRNA menos
1,2%
Estes resultados mostram que a sonda tem um elevado grau de reacção com o alvo homólogo e muito pouca ligação não específica com a hidroxiapatite.
A especificidade da sonda para o comple32 xo Mtb foi testada misturando a sonda marcada com P com rRNA libertado das células de quatro bacilos do complexo Mtb e de 25 outras espécies de micobactérias por técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas em Murphy et al., Pedido de Patente U. S. NS 841.860. Todos os ensaios de hibridação foram efectuados como descrito no Exemplo 1. A Tabela 14 indica que a sonda éespecífica de organismos dentro do complexo Mtb e não reage com qualquer outra espécie de micobactérias.
-47ç
Tabela 15
Hibridação da sonda do complexo Mtb com de DNA derivado do rRNA 23S espécies micobacterianas
Organismo ATCC# ? έ Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 33,6
M. asiaticum 25276 1,2
M. avium 25291 1,0
M. bovis 19210 32,0
M. chelonae 14472 1,2
M. flavescens 14474 1,2
M. fortuitum 6841 1,3
M . gastri 15754 1,1
M. gordonae 14470 1,2
M. haemophilum 29548 1,2
M. intracellulare 13950 1,1
M. kansasii 12479 1,3
M. malmoense 29571 1,3
M. marinum 827 1,2
M. nonchromogenicum 1930 1,0
M. phlei 11758 1,0
M. scrofulaceum 19981 1,1
M. shimoidei 27962 1,2
M. simiae 25275 1,3
M . smegmatis el4468 1,1
M. szulgai 23069 1,1
M. terrae 15755 1,0
M. thermoresistibile 19527 1,2
M. triviale 23292 1,0
M. tuberculosis (avirulento) 25177 33,7
M. tuberculosis (virulento) 27294 38,1
M. ulcerans 19423 1,3
M. vaccae 15483 1,0
M. xenopi 19971 1,3
Exemplo 5
Identificaram-se mais três sondas do complexo de Mycobacterium tuberculosis, Exemplos 5-7 aqui descritos, usando dois iniciadores únicos complementares de rRNA 23S. A primeira sequência é:
CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG.
A sequência deste Exemplo 5 foi obtida usando um iniciador 23S com a sequência 5'-GGC CAT TAG ATC ACT CC-31. Ela foi caracterizada e demonstrada como especifica de organismos do comple xo de Mycobacterium tuberculosis incluindo Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium africanum e Mycobacterium bovis. Esta sequência, derivada de rRNA 23S, tem 31 bases de comprimento e tem uma Tm de 72°C. Esta sonda é capaz de hibridar com rRNA dos organismos referidos na região correspondente às bases 540-475 do rRNA 23S de E. coli.
Para demonstrar a reactividade e especificidade desta sonda para o complexo de Mycobacterium tuberculosis, testou-se como sonda em reacções de hibridação nas condições que se seguem. A sonda de oligonucleotídeo marcado no extremo com P foi misturada com rRNA libertado das células de 30 espécies de micobacterias por técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas em Murphy et al., Pedido de Patente U. S. N° de Série 841.860. Suspenderam-se 3x10 células em 0,1 ml de 5% de SDS e sonicaram-se durante 15 minutos a 50-60°C. Adicionou-se um ml de tampão de hibridação (45% de diisobutilsulfo-succinato, tampão fosfato 40 mM pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) e incubou-se a mistura a 72°C durante 2 horas. Após incubação, adicionou-se 4 ml de 2% (p/v) de hidroxiapatite, tampão fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de SDS, 0,02% de azida de sódio e incubou-se a 72°C durante 5 minutos. A amostra foi centrifugada e removido o sobrenadante. Adicionou-se quatro ml de solução de lavagem (tampão fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de SDS, 0,02% de azida de sódio) e agitou-se a amostra com vortex, centrifugou-se e o sobrenadante foi
removido. A radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação. Os resultados estão apresentados na Tabela 16 e indicam que a sonda é específica para os organismos do complexo Mycobacterium tuberculosis.
Tabela 16
Hibridação da sonda do complexo M. tuberculosis do Exemplo 5 com espécies micobacterianas
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 18,0
M. asiaticum 25274 2,6
M. avium 25291 3,4
M. bovis 19210 21,7
M. bovis (BCG) 35734 35,3
M. chelonae 14472 3,8
M. flavescens 14474 2,3
M. fortuitum 6841 1,8
M. gastri 15754 2,2
M. gordonae 14470 2,8
M. haemophilum 29548 2,8
M. intracellulare 13950 2,1
M. kansasii 12478 1,6
M. malmoense 29571 2,3
M. marinum 827 2,1
M. nonchromogenicum 1930 2,3
M. phlei 11758 2,1
M. scrofulaceum 19981 2,2
M. shimoidei 27962 1,9
M. simiae 25275 2,2
M. smegmatis el4468 2,0
M. szulgai 23069 2,2
M. terrae 15755 2,2
M. thermoresistible 19527 2,2
M. triviale 23292 2,0
M. tuberculosis (avirulento) 25177 26,4
M. tuberculosis (virulento) 27294 36,6
Tabela 16 (Cont.)
Hibridação da sonda do complexo M. tuberculosis do Exemplo 5 com espécies micobacterianas
Organismo ATCC# %Sonda Ligada
M. ulcerans 19423 2,5
M. vaccae 15483 2,4
M. xenopi 19971 2,8
A Tabela 16 mostra que a sonda também não dá reacção cruzada com RNA de qualquer um dos organismos estreitamente relacionados testados pelo método acabado de descrever.
Tabela 17
Hibridação da sonda do complexo M. tuberculosis do Exemplo 5 com organismos filògenéticamente muito próximos
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Actinomadura madurae 19425 2,1
Actinoplanas italicus 10049 3,1
Arthrobacter oxidans 14358 2,1
Brevibacterium linens e9172 1,9
Corynebacterium xerosis 373 2,2
Dermatophilus congolensis 14367 2,2
Microbacterium lacticum 8180 2,1
Nocardia asteroides 19247 2,0
Nocardia brasiliensis 19296 2,2
Nocardia otitidis-caviarum 14629 2,0
Nocardioposis dassonvillei 23218 4,0
Oerskovia turbata 33225 2,2
Oerskovia xanthineolytica 27402 2,0
Rhodococcus aichiensis 33611 1,9
Rhodococcus aurantiacus 25938 2,0
Rhodococcus bronchialis 25592 2,1
Rhodococcus chubuensis 33609 2,3
Rhodococcus equi 6939 2,4
Rhodococcus obuensis 33610 2,2
Rhodococcus sputi 29627 2,3
Exemplo 6
A segunda sonda do complexo Mycobacterium tuberculosis foi obtida usando um iniciador 23S com a sequência 5' CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3'. A sequência é:
CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC.
Esta sequência, derivada de rRNA 23S, tem 38 bases de comprimento e tem uma Tm de 75°C. Ela hibrida na região correspondente às bases 2195-2235 do rRNA 23S de E. coli.
Tal como a sonda do complexo no Exemplo 5, esta sequência foi caracterizada e verificou-se ser especifica para organismos do complexo Mycobacterium tuberculosis incluindo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum e Mycobacterium bovis.
Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda deste Exemplo 6 para o complexo de Mycobacterium tuberculosis ela foi testada como tal em reacções de hibridação nas condições que se seguem descritas para a sonda no Exemplo 5. Os resultados estão apresentados na Tabela 18 e indicam que a sonda é específica para organismos do complexo Mycobacterium tuberculosis com excepção de Mycobacterium thermoresistibile, um isolado raro que não é patogénico para o homem.
53Tabela 18
Hibridação da sonda do Exemplo 6 para o complexo M. tuberculosis com espécies micobacterianas
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 56,0
M. asiaticum 25274 3,1
M. avium 25291 2,6
M. bovis 19210 48,0
M. bovis (BCG) 35734 63,0
M. chelonae 14472 2,8
M. flavescens 14474 2,8
M. fortuitum 6841 3,0
M. gastri 15754 3,2
M. gordonae 14470 3,0
M. haemophilum 29548 3,0
M. intracellulare 13950 3,6
M. Kansasii 12478 3,9
M. malmoense 29571 2,9
M. marinum 827 2,9
M. nonchromogenicum 1930 4,8
M. phlei 11758 2,9
M. scrofulaceum 19981 2,6
M. shimoidei 27962 3,6
M. simiae 25275 3,3
M. smegmatis el4468 3,0
M. szulgai 23069 2,8
M. terrae 15755 2,8
M. thermoresistibile 19527 11,7
M. triviale 23292 3,2
M. tuberculosis (avirulento) 25177 65,0
M. tuberculosis (virulento) 27294 53,0
M. ulcerans 19423 2,5
M. vaccae 15483 2,8
M. xenopi 19971 3,3
-54A Tabela 19 mostra que a sonda não reage cruzadamente com RNA de qualquer um dos organismos filogenéticamente muito próximos testados pelo método acabado de descrever.
Tabela 19
Hibridação da sonda do Exemplo 6 do complexo M. tuberculosis com organismos filogenéticamente muito próximos
Organismo ATCC# % Sonda
Actinomadura madurae 19425 1,3
Actinoplanes italicus 10049 0,6
Arthrobacter oxidans 14358 1,1
Brevibacterium linens e9172 0,8
Corynebacterium xerosis 373 1,0
Dermatophilus congolensis 14367 0,6
Microbacterium lacticum 8180 1,9
Nocardia asteroides 19247 0,9
Nocardia brasiliensis 19296 0,8
Nocardia otitidis-caviarum 14629 1,5
Nocardioposis dassonvillei 23218 0,5
Oerskovia turbata 33225 0,3
Oerskovia xanthineolytica 27402 0,8
Rhodococcus aichiensis 33611 1,6
Rhodococcus aurantiacus 25938 0,7
Rhodococcus bronchialis 25592 1,5
Rhodococcus chubuensis 33609 0,8
Rhodococcus equi 6939 0,3
Rhodococcus obuensis 33610 0,8
Rhodococcus sputi 29627 1,4
Exemplo 7
As sondas do complexo Mycobacterium tuberculosis adicionais que se seguem também foram identificadas usando um iniciador 23S com a mesma sequência do Exemplo 6, nomeadamente, 5 ' -CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G3' :
AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC.
Esta sequência, do rRNA 23S tem 31 bases de comprimento e tem uma Tm de 71°C. Ela hibrida na região correspondente às bases 2195-2235 do rRNA 23S de E. coli. Tal como acontece com as sondas do complexo Mycobacterium tuberculosis dos Exemplos 5 e 6 aqui descritos, esta sequência também foi caracterizada e verificou-se ser específica para organismos do complexo Mycobacterium tuberculosis, incluindo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum e Mycobacterium bovis.
Para demonstrar a reactividade e especificidade desta sonda para o complexo Mycobacterium tuberculosis, ela foi testada como tal em reacções de hibridação nas condições descritas para a sonda do Exemplo 5. A Tabela 20 mostra que a sonda é específica para organismos do complexo Mycobacterium tuberculosis.
Tabela 20
Hibridação da sonda do complexo Mycobacterium tuberculosis do Exemplo 7 com espécies micobacterianas
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Mycobacterium africanum 25420 43,0
M. asiaticum 25274 0,6
M. avium 25291 0,7
M. bovis 19210 43,0
M. bovis (BCG) 35734 46,0
M. chelonae 14472 0,6
M. flavescens 14474 0,6
M. fortuitum 6841 0,5
M. gastri 15754 0,9
M. gordonae 14470 0,7
M. haemophilum 29548 0,6
M. intracellulare 13950 0,6
M. Kansasii 12478 0,9
M. malmoense 29571 0,8
M. marinum 827 0,7
M. nonchromogenicum 1930 0,8
M. phlei 11758 0,6
M. scrofulaceum 19981 0,7
M. shimoidei 2 7962 0,8
M. simiae 25275 0,7
M. smegmatis el4468 0,6
M. szulgai 23069 0,6
M. terrae 15755 0,7
M. thermoresistibile 19527 0,9
M. triviale 23292 0,7
M. tuberculosis (avirulento) 25177 40,0
M. tuberculosis (virulento) 27294 50,0
M. ulcerans 19423 0,7
M. vaccae 15483 0,4
M. xenopi 19971 0,6
-57A Tabela 21 mostra que a sonda não só não reage com RNA de qualquer um dos organismos estreitamente relacionados testados pelo método acabado de descrever.
Tabela 21
Hibridação da sonda do complexo de M. tuberculosis do
Exemplo 7 com organismos filogenéticamente muito próximos
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Actinomadura madurae 19425 1,0
Actinoplanes italicus 10049 0,6
Arthrobacter oxidans 14358 0,4
Brevibacterium linens e9172 0,8
Corynebacterium xerosis 373 0,6
Dermatophilus congolensis 14367 0,8
Microbacterium lacticum 8180 0,5
Nocardia asteroides 19247 0,7
Nocardia brasiliensis 19296 0,5
Nocardia otitidis-caviarum 14629 0,6
Nocardioposis dassonvillei 23218 0,6
Oerskovia turbata 33225 0,8
Oerskovia xanthineolytica 27402 0,6
Rhodococcus aichiensis 33611 0,7
Rhodococcus aurantiacus 25938 0,7
Rhodococcus bronchialis 25592 0,6
Rhodococcus chubuensis 33609 0,6
Rhodococcus equi 6939 0,6
Rhodococcus obuensis 33610 0,6
Rhodococcus sputi 29627 0,9
Notávelmente, sondas sobreponíveis podem ter especificidade idêntica. Comparar por exemplo as sondas dos Exemplos 6 e 7:
Ex. 6 CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC
Ex. 7 AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC.
Pode haver várias sequências de uma região particular que darão sondas com as características de hibridação pretendidas. Noutros casos, uma sequência sonda pode ser significativamente melhor do que uma outra sonda diferindo numa única base. Em geral, quanto maior a diferença de sequências (% de desemparelhamento) entre um organismo alvo e não alvo, mais provável será poder-se alterar a sonda sem afectar a sua utilidade para uma aplicação específica. Este fenómeno também foi demonstrado pelas sondas derivadas de outra do Exemplo 3.
No Exemplo 7, adicionaram-se cinco bases ao extremo 5' da sonda no Exemplo 6 e removeram-se 12 bases do extremo 3'. As duas sondas têm essêncialmente características de hibridaçõa idênticas.
Exemplo 8 género Mycobacterium é particularmente difícil de distinguir de Nocardia, Corynebacterium e Rhodococcus. Estes genéros têm antigénios, precipitinas e contagens G & C comuns. Apesar do facto destes organismos também apresentarem 92-94% de homologia do rRNA com os organismos atrás referidos, projectámos sondas que detectam todos os membros do género Mycobacterium que não dão reacção cruzada com os géne ros relacionados.
Além das sondas das espécies de Mycobacterium já divulgadas identificaram-se quatro sondas específicas para membros do género Mycobacterium usando um iniciador complementar do rRNA 16S e um iniciador complementar do rRNA 23S. A sequência 1 foi obtida usando um iniciador 16S com a sequência 5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-31. As sequências 2, 3 e 4 foram obtidas usando um iniciador 23S com a sequência 5'-GTG TCG GTT TTG GGT ACG-3' . A sequência 1 e 'capaz de hibridar com RNA do género Mycobacterium na região correspondente às bases 1025-1060 do rRNA 16S de E. coli. As sequências 2-4 hibridam nas regiões correspondentes às bases que se seguem do rRNA 23S de E. coli no nosso sistema de numeração, (ver Figura 2); 1440-1475; 1515-1555; 1570-1610 ao nosso sistema de numeração.
As sequências que se seguem foram caracterizadas e verificou-se serem específicas do género Mycobacterium:
1. CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG
2. GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG
3. CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC
4. GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT A GA GGC
A sequência 1, do rRNA 16S , tem 30 bases
de comprimento e : tem i uma Tm de 73°C. A sequência 2, do rRNA
23S, tem 33 bases de comprimento e uma Tm de 75°C. A sequência 3, do rRNA 23S, tem 35 bases de comprimento e uma Tm de 76°C. A sequência 4 do rRNA 23S tem 33 bases de comprimento e uma Tm de 73°C.
Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda 1 para membros do género Mycobacterium, ela foi testada como sonda nas reacções de hibridação nas condições
125 que se seguem. Sondas de oligonucleotídeos marcadas com I foram misturadas com rRNA libertado de células de 30 espécies
de micobactérias através de técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas em Murphy et al., Pedido de Patente U.S. NP de
Série 841.860. Suspenderam-se 3x10 células em 0,1 ml de 5% de SDS e sonicaram-se durante 15 minutos a 50-60°C. Adicionou-se um ml de tampão de hibridação (diisobutilsulfo-succinato a 45%, fosfato de sódio 40 mM pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) e incubou-se a mistura a 72°C durante 2 horas. Após incubação, adicionou-se 2 g/1 de solução de separação (contendo 2,5 g/1 de microsferas magnéticas catiónicas, tampão fosfato de sódio 0,17M pH 6,8, 7,5% de Triton X-100 (TM), 0,02% de azida de sódio) e incubou-se a 72°C durante 5 minutos. Os hibridos RNA:sonda, ligados às partículas magnéticas, foram colhidos e removido o sobrenadante. Adicionou-se 1 ml de solução de lavagem (tampão fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 14% de diisobutilsulf o-succinato 5% de Triton X-100, 0,02% de azida de sódio), colheram-se as partículas e removeu-se o sobrenadante. Este passo foi repetido duas vezes. A radioactividade ligada às partículas magnéticas foi determinada num contador gama. Os resultados estão apresentados na Tabela 22 e indicam que as sondas hibridam com organismos do género Mycobacterium e que uma combinação de sondas detectará todos os membros do género. A Tabela 23 mostra que as sondas não reagem com outras bactérias estreitamente relacionadas.
Tabela 22
Hibridação das sondas 1-4 de Mycobacterium com espécies micobacterianas
Organismo ATCC# % Sonda 1 Ligada % Sonda 2 Ligada % Sonda 3 Ligada % Sond 4 Liga
Mycobacterium
africanum 25420 41,5 14,7 17,9 26,7
M. asiaticum 25274 31,8 20,2 7,9 0,1
M. avium 25291 11,7 34,7 10,1 1,6
M. bovis 19210 19,4 28,4 44,6 20,9
M. bovis (BCG) 35734 30,0 35,5 17,8 5,6
M. chelonae 14472 8,6 0,7 6,3 0,2
M. flavescens 14474 29,8 17,7 2,3 0,9
M. fortuitum 6841 34,7 2,2 4,8 0,2
M. gastri 15754 27,6 65,1 9,6 22,3
M. gordonae 14470 50,7 55,2 3,1 0,4
M. haemophilum 29548 40,7 60,7 0,4 12,4
M. intracellulare 13950 38,8 48,3 0,9 5,4
M. Kansasii 12478 53,4 27,3 24,5 27,8
M. malmoense 29571 3,1 38,4 0,8 1,5
M. marinum 827 41,7 4,1 4,8 0,1
M. non- 1930 35,0 42,9 0,5 16,4
chromogenicum
M. phlei 11758 23,7 0,6 1,8 0,6
M. scrofulaceum 19981 35,1 66,9 0,9 26,4
M. shimoidei 27962 34,6 1,4 1,3 4,8
M. simiae 25275 45,9 44,0 5,3 o,i
M. smegmatis el4468 31,3 4,0 5,6 0,1
M. szulgai 23069 19,4 22,3 1,5 3,0
M. terrae 15755 25,6 21,7 0,4 12,3
M. thermo- 19527 20,3 34,5 3,1 17,6
resistibile
M. triviale 23292 37,3 4,6 4,3 o,i
M. tuberculosis 25177 38,5 26,3 11,3 23,0
(avirulento)
62-
'T —
Tabela 22 (Cont. )
Hibridação das sondas 1-4 de Mycobacterium
com espécies micobacterianas
% Sonda 1 % Sonda 2 % Sonda 3 % Sonda
Organismo ATCC# Ligada Ligada Ligada 4 Ligada
M. tuberculosis 27294 13,8 12 f 4 38,4 22,3
(virulento)
M. ulcerans 19423 33,9 28,7 0,4 8,9
M. vaccae 15483 8,8 36,2 4,8 3,2
M. xenopi 19971 38,4 2,1 3,8 0,2
Tabela 23
Hibridação das sondas 1-4 de Mycobacterium com
organismos filogenéticamente muito próximos
% Sonda 1 % Sonda 2 % Sonda % Sonda 4
Organismo ATCC^ Ligada Ligada 3 Ligada Ligada
Actinomadura 19425 0,2 0,3 0,2 0,1
madurae
Actinoplanes 10049 0,4 0,5 0,3 0,2
italicus
Arthrobacter 14358 0,2 0,4 0,3 0,1
oxidans
Brevibacterium e9172 0,3 0,3 0,3 0,1
linens
Corynebacterium 373 0,4 0,3 0,3 0,1
xerosis
Dermatophilus 14367 0,4 0,6 0,3 0,2
congolensis
Microbacterium 8180 0,2 0,3 0,2 o,i
lacticum
Nocardia 19247 0,3 0,3 0,4 o,i
asteroides
Tabela 23 (Cont.)
Hibridação das sondas 1-4 de Mycobacterium com organismos filogenéticamente muito próximos
Organismo ATCC·^ % Sonda 1 Ligada % Sonda 2 Ligada % Sonda 3 Ligada % Sonda 4 Ligada
Nocardia 19296 0,4 0,3 0,6 0,1
brasiliensis Nocardia 14629 0,4 0,4 1,0 0,3
otitidiscaviarum Nocardioposis 23218 0,3 0,2 0,3 0,1
dassonvillei Oerskovia 33225 0,2 0,2 0,3 0,1
turbata Oerskovia 27402 0,2 0,3 0,3 0,1
xanthineolytica Rhodococcus 33611 0,4 0,2 0,3 0,2
aichiensis Rhodococcus 25938 0,3 0,4 0,3 0,2
aurantiacus Rhodococcus 25592 0,4 0,3 0,3 0,1
bronchialis Rhodococcus 33609 0,6 0,4 0,3 0,3
chubuensis Rhodococcus equi 6939 0,4 .0,4 0,4 0,5
Rhodococcus 33610 0,5 0,5 0,3 o,i
obuensis Rhodococcus sputi 29627 0,4 0,5 0,4 0,3
Exemplo 9
Os micoplasmas são pequenas bactérias aeróbicas sem parede celular. Calcula-se que o Mycoplasma pneumoniae causa anualmente 8-15 milhões de infecções. As infecções podem ser assintomáticas ou variar na gravidade entre bronquite e pneumonia ligeira até muito grave. Pensa-se que o microorganismo provoca cerca de 10% das pneumonias na população em geral e 10-50% das pneumonias de membros de grupos com contacto íntima e prolongado tais como estudantes de colégios e pessoal militar.
Até agora o diagnóstico necessitava do isolamento do organismo em cultura ou demonstração de um aumento do título de anticorpos. A cultura do organismo envolve inoculação de espécies do tracto respiratório em agar ou meio bifásico contendo inibidores de crescimento bacteriano. O exame do crescimento aos 3-4 e 7-10 dias é usado para estabelecer a presença ou ausência de qualquer micoplasma. O Mycoplasma pneumoniae deve ser então identificado por hemodsorção (a capacidade do M. pneumoniae em aderir a eritrócitos de carneiro ou de porquinho da índia), hemólise (a capacidade do M. pneumoniae em produzir beta hemólise de eritrócitos de carneiro ou de porquinho da índia em agar com sangue), inibição do crescimento por anticorpos específicos ou imunofluorescência com anticorpos específicos. O presente invento tem vantagens significativas sobre cada um destes métodos anteriores devido não só à simplicidade do teste como também ao tempo altamente reduzido necessário para se conseguir um diagnóstico.
Obteve-se uma sonda específica para rRNA
5S de M. pneumoniae por comparação de sequências de rRNA conhecidas. As sequências particulares alinhadas eram de M. pneumoniae , M. gallisepticum e Ureaplasma urealyticum (Rogers, M.J.
et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 82 (1160-1164), M. capricolum (Hori, H. et al 1981, Nucl. Acids Res. 9, 5407-5410) e
Spiroplasma sp (Walker, R.T. et al., 1982 Nucl. Acids Res. 10,
6363-6367). Os alinhamentos foram efectuados como descrito acima e esquematizados na página 6. O rRNA 5S pode ser isolado e sequênciado conforme descrito em Rogers et al., ou pode-se fazer um iniciador que seja complementar de uma região conservada no rRNA 5S e sequênciação efectuada como descrito nos Exemplos 1-4. A região conservada do rRNA 5S está documentada em Fox, G.E. e Woese, C.R., 1975, Nature 256:505-507. A sequência que se segue foi determinada como sendo específica para Mycoplasma pneumoniae:
GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC.
A sequência é complementar de um segmento único encontrado no rRNA 5S de Mycoplasma pneumoniae na região correspondente às bases 65-108 do rRNA 5S de E. coli e foi seleccionada por comparação com as sequências de rRNA 5S de Mycoplasma gallisepticum, Spiroplasma mirum e Ureaplasma urealyticum. A sonda oligonucleotídica foi caracterizada como descrito atrás. O tamanho da sonda é de 42 bases. A sonda tem um Tm de 71,5°C.
Para demonstrar a reactividade desta sequência para Mycoplasma pneumoniae, a sonda foi testada em reacções de hibridação nas condições que se seguem. A sonda z 32 oligonucleotídica marcada nos extremos com P foi misturada com 1 micrograma (7x10 moles) de rRNA purificado de Mycoplasma pneumoniae e feito reagir em PB 0,12M (quantidades equimolares de Na2HPO^ e Naf^PO^), EDTA 1 mM e 0,2% de SDS/dodecilsulfato de sódio) a 65°C durante 60 minutos num volume final de 50 microlitros. Em tubos separados a sonda foi misturada com tampão de hibridação com e sem rRNA alvo de Mycoplasma pneumoniae. Após separação em hidroxiapatite como descrito préviamente os híbridos foram quantificados por contagem de cintilação. Estes resultados estão apresentados na Tabela 24.
Tabela 24
Hibridação da sonda de DNA derivado do rRNA 5S de M. pneumoniae com rRNA /alvo homólogo
Sonda 5S de M. pneumoniae rRNA mais
85-95% rRNA menos
0,5% % Hibridação = cpms ligados à hidroxiapatite cpms totais adicionados à reacção
Estes resultados mostram que a sonda tem um elevado grau de reacção com o seu alvo homólogo e muito pouca ligação não específica à hidroxiapatite.
A especificidade da sonda 5S de M. pneu32 moniae foi testado misturando a sonda marcada com P com rRNA libertado das células de outras espécies de Mycoplasma. Todos os ensaios de hibridação foram efectuados como descrito no Exemplo 1. A Tabela 25 indica que a sonda é específica para Mycoplasma pneumoniae e não reage com qualquer outra espécie de Mycoplasma
Tabela 25
Hibridação da sonda de M. pneumoniae com
outras espécies de micoplasma
Acholeplasma laidlawii 14089 3,3
M. buccale 23636 1,7
M. capricolum 23205 2,4
M. columbinsale 33549 1,4
M. faucium 25293 1,4
M. fermentans 15474 1,0
M. gallisepticum 19610 Ι,θ
M. gallopavonis 33551 1,6
M. genitalium 3353c 1,7
M. hominis 14027 1,3
M. orale 23714 1,8
M. pneumoniae 15531 78,0
M. primatum 15497 1,6
M. salivarium 23064 0,6
Spiroplasma mirum 23064 2,3
Como se mostra na Tabela 26, a sonda não reage com quaisquer outras espécies de bactérias estreitamente relacionadas ou filogenéticamente afastadas.
Tabela 26
Hibridação da sonda de M. pneumoniae com uma secção filogenética transversal de bactérias
Organismo ATCC^ % Sonda Ligada
Corynebacterium xerosis 373 1,4
Haemophilus influenzae 19418 1,4
Klebsiella pneumoniae 23357 1,3
Legionella pneumophila 33152 1,8
Mycobacterium tuberculosis
(avir) 25177 1,6
Mycoplasma pneumoniae 15531 52
Neisseria meningitidis 13077 0,6
Propionibacterium acnes 6919 2,0
Pseudomonas aeruginosa 25330 1,6
Staphylococcus aureus 12598 2,0
Streptococcus pneumoniae C6306 1,9
Obtiveram-se quatro sequências sonda adicionais (numeradas 2-5 em baixo) específicas para Mycoplasma pneumoniae utilizando quatro iniciadores únicos complementa res de regiões conservadas do rRNA 16S. As regiões correspon dem, respectivamente, às bases 190-230; 450-490; 820-860 e
1255-1290 do rRNA 16S de E. coli. A sequência sonda jf 1 foi obtida usando um iniciador com a sequência
5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3’. A sequência sonda ^.2 foi obtida com um iniciador com a sequência
5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'. A sequência sonda $: 3 foi obti da com um iniciador com a sequência 5
-CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATIC
A sequência sonda $= 4 foi obtida usando um iniciador com a sequência 5'-CGATTACTAGCGATTCC-31. As reacções de sequênciação foram efectuadas conforme descrito nos exemplos anteriores.
As sequências de M. pneumoniae foram comparadas com sequências de Mycoplasma genitalium, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma
gallisepticum e Spiroplasma mirum.
Caracterizaram-se as sequências sonda que se seguem pelos critérios descritos no exemplo um e veri ficou-se serem específicas de Mycoplasma pneumoniae:
2. AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT
3. CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT
4. TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT
5. CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC.
6 7°C. A sonda rtf=. 3 tem 35 bases
66°C. A sonda ψ· 4 tem 30 bases
69°C. A sonda 44 5 tem 35 bases
66°C.
As sondas 2 tem 35 bases de comprimento e tem umà Tm de de comprimento e uma Tm de de comprimento e uma Tm de decomprimento e uma Tm de
Quando as quatro sondas foram misturadas e usadas em ensaios de hibridação a 60°C como descrito nos exemplos anteriores, verificou-se serem específicas para M. pneumoniae. As sondas não deram reacção cruzada com outros patogénios respiratórios ou qualguer outro organismo representante da árvore filogenética das bactérias (Tabela 28).
-70Tabela 27
Hibridação das sondas 2-5 de Mycoplasma pneumoniae com espécies de micoplasma
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acholeplasma axanthum 27378 0,34
Acholeplasma laidlawii 14089 0,30
Mycoplasma arginini 23838 0,20
Mycoplasma arthritidis 19611 0,49
Mycoplasma bovigenitalium 19852 0,18
Mycoplasma bovis 25523 0,43
Mycoplasma buccale 23636 0,37
Mycoplasma californicum 33451 0,79
Mycoplasma capricolum 23205 0,38
Mycoplasma columbinasale 33549 0,54
Mycoplasma columborale 29258 0,50
Mycoplasma faucium 25293 0,45
Mycoplasma fermentans 15474 0,27
Mycoplasma gallisepticum 19610 0,25
Mycoplasma gallopavonis 33551 0,47
Mycoplasma genitalium 33530 2,5
Mycoplasma hominis 14027 0,52
Mycoplasma hyorhinis 17981 0,46
Mycoplasma orale 23714 0,56
Mycoplasma pneumoniae 15531 34,0
Mycoplasma primatum 15497 0,71
Mycoplasma pulmonis 19612 0,68
Mycoplasma salivarium 23064 0,46
Spiroplasma citri 29416 0,60
Spiroplasma mirum 29335 0,52
Tabela 28
Hibridação das sondas 2-5 de Mycoplasma
pneumoniae com outras bactérias
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Actinomyces israelii 10049 1,0
Bacteroides fragilis 23745 1,4
Bifidobacterium breve 15700 1,0
Bordetella bronchiseptica 10580 0,9
Clostridium innocuum 14501 1,0
Clostridium pasterianum 6013 0,9
Clostridium perfringens 13124 1,1
Clostridium ramosum 25582 1,0
Corynebacterium xerosis 373 0,8
Erysipelothrix rhusiopathiae 19414 1,1
Escherichia coli 11775 1,0
Haemophilus influenzae 19418 0,9
Klebsiella pneumoniae 15531 1,0
Lactobacillus acidophilus 4356 1,4
Legionella pneumophila 33154 0,8
Listeria monocytogenes 15313 1,2
Moraxella osloensis 19976 1,1
Mycobacterium tuberculosis 25177 1,0
Neisseria meningitidis 13077 1,0
Pasteurella multocida 6529 1,6
Peptococcus magnus 14955 0,9
Propionibacterium acnes 6919 1,1
Pseudomonas aeruginosa 25330 1,0
Staphylococcus aureus 12600 1,0
Streptococcus faecalis 19433 1,5
Streptococcus mitis 9811 1,0
Streptococcus pneumoniae 6306 1,0
Streptococcus pyogenes 19615 1,1
Exemplo 10
O género Legionella contem 22 espécies que são todas potêncialmente patogénicas para o homem. Estes organismos provocam a doenças dos Legionários, uma pneumonia aguda, ou febre de Pontiac, uma doença aguda, não pneumónica e febril que não é fatal.
As espécies dç Legionella também se verificaram ser responsáveis por pneumonia nosoconial que surge predominantemente entre pacientes com deficiências imunes.
A legionelose, que inclui doença dos Legionários e febre de Pontiac, é diagnosticada com base em sintomas clínicos, testes de imunofluorescência directa ou indirecta e por cultura usando um agar com extrato de levedura em carvão tamponado (BCYE) contendo agentes antimicrobianos selectivos. Não existe um teste único definitivo para o género conhecido de trabalhos anteriores (Ver Bergey's Manual of Systematic Bacteriology na página 283, (ed. 1984)). Os testes com anticorpos fluorescentes não permitem identificar todas as espécies de Legionella, mas apenas aquelas para as quais existem anticorpos. O método de cultura não é um diagnóstico definivo para espécies de Legionella.
As sequências de oligonucleotídeos descritas abaixo, quando usadas como sondas num ensaio de hibridação de ácidos nucleicos, identifica com precisão todas as espécies de Legionella. Este ensaio é mais sensível do que a cultura ou testes com anticorpos e encurta significativamente o tempo de identificação e portanto o diagnóstico. O ensaio representa portanto uma melhoria significativa relativamente a métodos de diagnóstico anteriores.
Obtiveram-se três sequências sonda específicas para o género Legionella utilizando três iniciadores únicos complementares das regiões conservadas dos rRNAs 16S e
-7323S. A sequência 1 foi obtida usando um iniciador 16S com a sequência 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'. A sequência sonda 2 foi obtida com um iniciador de 23S com a sequência
5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'. A sequência sonda 3 foi
obtida com um iniciador de 16S tendo a sequência
5'GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC ACC AT-3'. A sequênciação com estes iniciadores foi efectuada conforme descrito nos exemplos anteriores.
As três sequências que se seguem foram caracterizadas pelos critérios descritos no Exemplo 1 e verificou-se serem específicos do género Legionella. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus e Acinetobacter calcoaceticus foram usados como comparação com as sequências das espécies de Legionella,
1. TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC
2. GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC
3. CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG.
A sequência 1, derivada do rRNA 16S, tem 40 bases de comprimento e uma Tm de 72°C. A sequência 2, derivada do rRNA 23S, tem 42 bases de comprimento e uma Tm de 73°C. A sequência, derivada do rRNA 16S, tem 40 bases de comprimento e uma Tm de 68°C. Estas sequências são capazes de hibridar com RNA do género Legionella nas regiões correspondendo respectivamente a, 630-675 do rRNA 16S de E. coli; 350-395 do rRNA 23S de E. coli; e 975-1020 do rRNA 16S de E. coli. Quando todas misturadas as sondas tem uma Tm média combinada de 73°C. A análise em géis de poliacrilamida mostrou que cada uma das sondas tinha o tamanho correcto e a análise de sequência demonstrou que cada uma delas é a sequência de bases correcta.
Quando as três sondas foram misturadas e usadas num ensaio de hibridação, verificou-se serem específicas para o género Legionella (Tabelas 29 e 30) e não deram
reacção cruzada com outros patogénicos respiratórios ou com qualquer organismo seleccionado da árvore filogenética (Tabelas 31 e 32). 0 uso de mais de uma sonda, i.e., uma mistura de sondas, pode resultar numa maior sensibilidade do ensaio e/ou num aumento do número de organismos não virais a ser detectados.
Tabela 29
Hibridação de sondas de Legionella com rRNA alvo homólogo rRNA mais rRNA menos sonda de Legionella
80%
1,0%
Tabela 30
Hibridação de sondas de Legionella com espécies de Legionella
Organismo ATCC # % Sonda Ligada
L. anisa 35292 42,0
L. bozemanii 33217 58,0
L. cherrii 35252 69,0
L. dumoffii 33279 57,0
L. erythra CDC &9P1W044C 26,0
L. feeleii 35303 59,0
L. hackeliae 35250 47,0
L. jamestowniensis 35298 20,0
L. jordanis 33623 50,6
L. longbeachae 33484 48,0
L. maceachernii 35300 25,0
L. micdadei 33704 38,0
L. oakridgensis 33761 44,0
L. parisiensis 9060 69,0
L. pneumophila 1 * 6736 75,0
II 2 64,0
11 3 73,0
II 4 73,0
II 5 78,0
li 6 75,0
II 7 73,0
II 8 63,0
11 75,0
L. rubrilucens 35304 12,0
L. sainthelensi 35248 61,0
L. sainticrucis 35301 24,0
L. spiritensis CDC MSH9 55,0
L. steigerwaltii 7430 56,0
L. wadsworthii 33877 37,0
Os números 1-8 e 11 são serotipos de L. pneumophila.
Hibridação das sondas de patogénios respiratórios Legionella com
Organismos ATCC# °/ á Sonda Ligada
Corynebacterium xerosis 373 2,1
Haemophilus influenzae 19418 2,3
Klebsiella pneumonia 23357 2,0
Mycoplasma pneumoniae 15531 2,3
Neisseria meningitidis 13090 2,2
Pseudomonas aeruginosa 25330 1,2
Propionibacterium acnes 6919 1,6
Streptococcus pneumoniae 6306 0,8
Staphylococcus aureus 25923 1,6
Tabela 32
Hibridação das sondas de Legionella com uma
secção filogenética transversal de espécies
bacterianas % Sonda Ligada
Organismos ATCC#
Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,4
Branhamella catarrahalis 25238 2,0
Bacillus subtilis 6051 1,9
Bacteroides fragillis 23745 2,2
Campylobacter jejuni 33560 1,2
Chromobacterium violaceum 29094 1,3
Clostridium perfringens 13124 1,9
Deinoccoccus radiodurans 35073 1,8
Derxia gummosa 15994 2,0
Enterobacter aerogenes 13048 1,4
Escherichia coli 11775 1,2
Mycoplasma hominis 14027 1,1
Tabela 32 (Cont.)
Hibridação das sondas de Legionella com uma secção filogenética transversal de espécies
bacterianas % Sonda Ligada
Organismos ATCC#
Proteus mirabilis 29906 1,4
Pseudomonas cepacia 11762 1,1
Rahnella aquatilis 33071 1,7
Rhodospirillum rubrum 11170 2,0
Streptococcus mitis 9811 2,0
Vibrio parahaemolyticus 17802 2,0
Yersinia enterocolitica 9610 1,2
Obtiveram-se três sequências sonda adicionais (numeradas 4-6) específicas do género Legionella utilizando dois iniciadores complementares das regiões conservadas do rRNA 23S. A sequência 4 foi feita a partir de um iniciador derivado de 23S com a sequência 5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3'. As sequências sonda 5 e 6 foram feitas a partir de um iniciador derivado de 23S com a sequência 5'-AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT TTT-31. A sequênciação com estes iniciadores foi efectuada como descrito nos exemplos anteriores.
As três sequências que se seguem foram caracterizadas pelos critérios préviamente descritos e verificou-se serem específicas para o género Legionella. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus e Actinetobacter calcoaceticus foram usados para comparações com sequências das espécies de Legionella.
4. GCG GTA CGG TTC TCT ATA AGT TAT GGC TAG C
5. GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T
6. CAC TCT TGG TAC GAT GTC CGA C
A sonda 4, complementar do rRNA 23S na região correspondente às bases 1585-1620 do rRNA 23S de E. coli, tem 31 bases de comprimento e uma Tm de 67°C. A sonda 5, complementar do rRNA 23S na região correspondente às bases 2280-2330 do rRNA 23S de E. coli, tem 22 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. A sonda 6, complementar do rRNA 23S na mesma região da Sonda 5 tem 22 bases de comprimento e uma Tm de 63°C.
Quando as três sondas foram misturadas com a sonda 3 acima e usadas num ensaio de hibridação como descrito para as sondas 1-3, verificou-se serem específicas do género Legionella (Tabela 33) e não deram reacção cruzada com outros patogénicos respiratórios ou com qualquer organismo seleccionado da árvore filogenética (Tabela 34 e 35). Usando mais de uma sonda, i.e. uma mistura de sondas, pode-se melhorar a sensibilidade do ensaio e/ou aumentar o número de organismos não virais detectados.
Hibridação de sondas de Legionella espécies de Legionella com
Organismo ATCC# 5 £ Sonda Ligada
L. anisa 35292 29,6
L. bozemanii 33217 35,5
L. cherrii 35252 29,2
L. dumoffii 33279 26,0
L. erythra 35303 32,0
L. feelii CDC #9P1WO44C 32,0
L. hackeliae 35250 39,0
L. jamestowniensis 35298 31,2
L. jordanis 33623 25,7
L. longbechae 33484 27,6
L. maceahernii 35300 39,3
L. micdadei 33204 31,0
L. oakridgensis 33761 24,4
L. parisiensi 35299 31,2
L. pneumophilia 1* 33153 40,0
2 33154 38,5
3 33155 44,6
4 33156 48,6
5 33216 32,0
6 33215 43,0
7 33823 29,5
8 35096 37,6
11 43130 44,5
L. rubrilucens 35304 30,1
L. sainthelensis 35248 27,0
L. sainticrucis 35301 22,0
L. spiritensis CDC#- MSH9 40,5
L. steigerwaltii 35302 31,7
L. wadsworthii 33877 30,0
Os números 1-8 e 11 são serotipos de L. pneumophilia.
Tabela 34
Hibridação das sondas de Legionella com patogénicos respiratórios
Organismo ATCCft % Sonda Ligada
Corynebacterium xerosis 373 0,13
Haemophilum influenzae 19418 0,12
Klebsiella pneumoniae 23357 0,13
Neisseria meningitidis 13090 0,14
Pseudomonas aeruginosa 25330 0,13
Propionibacterium acnes 6919 0,11
Streptococcus pneumoniae 6306 0,08
Staphylococcus aureus 25923 0,15
-81Tabela 35
Hibridação das sondas de Legionella com uma secção filogenética transversal de espécies bacterianas
Organismos ATCC^ % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,12
Branhamella catarrahalis 25238 0,13
Bacillus subtilis 6051 0,09
Bacteroides fragilis 23745 0,12
Campylobacter jejuni 33560 0,06
Chromobacterium violaceum 29094 0,33
Clostridium perfringens 13124 0,07
Deinococcus radiodurans 35073 o,ii
Derxia gummosa 15994 0,15
Enterobacter aerogenes 13048 0,26
Escherichia coli 11775 0,09
Mycoplasma hominis 14027 0,09
Proteus mirabilis 29906 0,09
Pseudomonas cepacia 17762 0,20
Rahnella aquatilis 33071 0,15
Rhodospirillum rubrum 11170 0,13
Streptococcus mitis 9811 0,07
Vibrio parahaemolyticus 17802 0,11
Yersinia enterocolitica 9610 0,19
Exemplo 11
As clamidias são bactérias intracelulares obrigatórias, gram-negativas sem mobilidade. A espécie
C. trachomatis está associada a tracoma endémico (a forma de cegueira a que mais vulgarmente se pode fazer prevenção), conjuntivite com inclusões e linfogranuloma venéreo (LGV). È uma das principais causas de uretrite não gonocóccica no homem e pode causar cervicite e salpingite aguda na mulher. A doença dos olhos ou pneumonia clamidial pode desenvolver-se nos recém-nascidos ao passarem através do canal de nascimento infectado .
Existem vários métodos conhecidos para identificação de C. trachomatis no tracto urogenital, por exemplo, por coloração por imunofluorescência directa ou imunoensaios com enzimas das espécies clínicas. No entanto o método de eleição é a cultura do organismo em células McCoy tratadas com ciclo-heximida. A cultura de células é seguida de coloração morfológica ou com anticorpos fluorescentes para confirmação da identidade do organismo.
As sequências de oligonucleotídeos do invento descritas abaixo quando usadas como sondas no ensaio de hibridação com ácidos nucleicos, identificam com precisão os isolados de Chlamydia trachomatis. Este ensaio é igual em sensibilidade aos testes de cultura ou com anticorpos e no caso da cultura, encurta significativamente o tempo de identificação e portanto de diagnóstico.
uso de sondas para identificar e distinguir entre membros das espécies é novo e portanto um invento. De facto, Kingsbury, D.T. e E. Weiss, 1968 J. Bacteriol
96: 1421-23 (1968); Moulder, J.W. ASM News, Vol. 50, N2 8, (1984) divulgaram um mero com 10% de homologia entre C. trachomatis e C. psittaci. Ainda, estas comunicações mostram que diferentes estirpes de C. trachomatis diferem na homologia do
DNA. Weisberg, W.G. et al., J. Bacteriol 167: 570-574 (1986) publicaram as sequências do rRNA 16S de C. psittaci e notaram que C. trachomatis e C. psittaci partilham mais de 95% de homologia do rRNA. A partir destas comunicações pode-se deduzir que deverá ser dificil inventar (1) sondas capazes de hibridar com todas as estirpes de C. trachomatis; e (2) sondas capazes de distinguir entre C. trachomatis e C. psittaci. As sondas que se seguem conseguiram ambos os objectivos.
Fizeram-se dez sequências sonda especificas de Chlamydia trachomatis usando sete iniciadores únicos complementares das regiões conservadas do rRNA 16S e 23S. A sequência sonda 1 foi obtida a partir de um iniciador derivado de 16S com a sequência 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3* . A sequência sonda 2 foi obtida com um iniciador de 16S com a sequência 51-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'. As sequências 3 e 4 foram obtidas usando um iniciador 16S com a sequência 51-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'. As sequências sonda 5 e 6 foram obtidas com um iniciador 23S tendo a sequência 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3'. As sequências sonda 7 e 8 foram obtidas com um iniciador 23S tendo a sequência 51-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-31. A sequência sonda 9 foi obtida com um iniciador de 23S tendo a sequência 5'-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT TC-3'. A sequência sonda 10 foi obtida com um iniciador tendo a sequência
5'-CTA CTT TCC TGC GTC A-3' .
As dez sequências que se seguem foram caracterizadas usando os critérios descritos no Exemplo 1 e verificou-se serem específicas para o rRNA de Chlamydia trachomatis . Usou-se o vizinho filogenéticamente mais próximo Chlamydia psittaci para comparação com a sequência de Chlamy dia trachomatis.
1. CCG ACT CGG GGT TGA GCC CAT CTT TGA CAA
2. TTA CGT CCG ACA CGG ATG GGG TTG A GA CCA TC
3. CCG CCA CTA AAC AAT CGT CGA AAC AAT TGC TCC GTT CGA
4. CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG
5. CAT CCA TCT TTC CAG ATG TGT TCA ACT AGG AGT CCT
GAT CC
6 . GAG GTC GGT CTT TCT CTC CTT TCG TCT ACG
7. CCG TTC TCA TCG CTC TAC GGA CTC TTC CAA TCG
8. CGA A GA TTC CCC TTG ATC GCG ACC TGA TCT
9. CCG GGG CTC CTA TCG TTC CAT AGT CAC CCT AAA AG
10. TAC CGC GTG TCT TAT CGA CAC ACC CGC G
A sequência 1, derivada de rRNA 16S, tem 30 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. A sequência 2, derivada de rRNA 16S, tem 32 bases de comprimento e uma Tm de 67°C. A sequência 3, derivada de rRNA 16S, tem 39 bases de comprimento e uma Tm de 70°C. A sequência 4, derivada de rRNA 16S, tem 33 bases de comprimento e uma Tm de 69°C. A sequência 5 derivada de rRNA 23S, tem 41 bases de comprimento e uma Tm de 71°C. A sequência 6, derivada de rRNA 23S, tem 30 bases de comprimento e uma Tm de 72°C. A sequência 7, derivada de rRNA 23S, tem 33 bases de comprimento e uma Tm de 72°C. A sequência 8, derivada de rRNA 23S, tem 30 bases de comprimen-
to e uma Tm de 71°C. A sequência 9, derivada de rRNA 23S tem
35 bases de comprimento e uma Tm de 74°C. A sequência 10 tem
28 bases de comprimento e uma Tm de 72°C.
A reactividade e especificidade das son-
das foi testada em ensaios de hibridação. As sondas de oli32 gonucleotídeos 1 e 2 marcadas nos extremos com P foram mis7 turadas com RNA purificado ou RNA libertado de pelo menos 10 organismos em 0,55ml de 41% de diisobutilsulfo-succinato, 3% de dodecilsulfato de sódio, fosfato de sódio 0,03M pH 6,8,
EDTA 1 mM, EGTA 1 mM a 60°C (sonda 1) ou 64°C (sonda 2) durante 1 hora. Os hibridos foram ligados a hidroxiapatite conforme descrito nos exemplos anteriores e a quantidade de radioactividade ligada foi determinada por contagem de cintilação. A Tabela 36 mostra que as sondas 1 e 2 hibridam bem com todos os serotipos de C. trachomatis testados. A sonda 1 não reage com qualquer estirpe de C. psittaci testada e a sonda 2 não reage com duas estirpes. A sonda 2 reage com a estirpe de po liartrite ovina de C. psittaci, um organismo que não se sabe que infecta humanos. A Tabela 37 demonstra a reactividade e
125 especificidade das sondas 3-9 quando marcadas com I e usadas numa mistura. Neste caso, os híbridos foram ligados a partículas magnéticas catiónicas conforme descrito em Arnold et al., Pedido de Patente U.S. NQ. de Série 020.866 e entregue a 2 de Março, 1987. Estas sondas hibridam bem com todas as estirpes de C. trachomatis testadas e não hibridam com quaisquer estirpes de C. psittaci. As sondas 3-9 foram ainda testadas contra um painel de organismos vulgarmente encontrados no tracto urogenital (Tabela 38) e contra uma secção filogenética transversal de organismos (Tabela 39). Em todos os casos, as sondas mostraram-se como específicas. A sonda 10 é 25% não-homóloga de C. psittaci e também deverá ser específica de C. trachomatis.
Tabela 36
Hibridação das sondas 1 e 2 de Chlamydia trachomatis com RNA de Chlamydia % Sonda Ligada
Organismo ATCC# Sonda 1 Sonda
Chlamydia trachomatis
serotipo C VR5 78 22 39
Chlamydia trachomatis
serotipo E VR348B 27 48
Chlamydia trachomatis
serotipo G VR878 20 44
Chlamydia trachomatis serotipo I VR880 20 42
Chlamydia trachomatis serotipo K VR887 28 45
Chlamydia psittaci estirpe da conjuntivite do porquinho da índia VR813 1,2 1,4
Chlamydia psittaci estirpe do aborto ovino VR656 1,0 3,0
Chlamydia psittaci estirpe da poliartrite ovina VR619 1,1 35,3
-87Tabela 37
Hibridação das sondas de Chlamydia trachomatis com rRNA de Chlamydia
Quocientes de contagem
Organismo Serovar ATCC 4- _______ligadas________
c. trachomatis A 689
c. trachomatis B 560
c. trachomatis Ba 1066
c. trachomatis C VR548 962
c. trachomatis D 1192
c. trachomatis E VR348 1022
c. trachomatis F 391
c. trachomatis G VR878 874
c. trachomatis H 954
c. trachomatis I VR880 943
c. trachomatis J 482
c. trachomatis K VR887 999
c. trachomatis LI 638
c. trachomatis L2 501
c. trachomatis L3 VR903 821
c. psittaci VR125 1,6
c. psittaci VR629 0,9
c. psittaci VR656 1,3
c. psittaci VR813 1,2
*
Quociente = contagens ligadas quando presente RNA contagens ligadas quando não está presente RNA
Tabela 38
Hibridação das sondas 3-9 de Chlamydia trachomatis organismos encontrados no tracto com urogenital
Quociente de ligadas
Organismo ATCC^f con- tagení
Achromobacter xylosoxidans 27061 1,9
Acinetobacter lwoffii 15309 1,2
Branhamella catarrhalis 25238 1,2
Candida albicans 18804 2,4
Flavobacterium meningosepticum 13253 1,1
Gardnerella vaginalis 14018 1,3
Lactobacillus acidophilus 4356 0,8
Listeria monocytogenes 15313 0,7
Mycobacterium smegmatis 14468 1,1
Moraxella osloensis 19976 1,3
Neisseria gonorrhoeae 19424 2,3
Pasteurella multocida 6529 1,0
Peptostreptococcus anaerobis 27337 1,2
Streptococcus agalactiae 13813 4,0
Streptococcus faecalis 19433 2,6
Quociente = contagens ligadas quando presente RNA
contagens ligadas quando não está presente RNA
-89Tabela 39
Hibridação das com organismos sondas 3-9 de Chlamydia trachomatis
filogenéticamente afastados
Organismo ATCcft Quociente de contagens ligadas
Bacillus subtilis 6051 2,2
Bacteroides fragilis 23745 1,6
Campylobacter jejuni 33560 1,4
Chromabacterium violaceum 29094 1,4
Deinococcus radiodurans 35073 1,8
Derxia gummosa 15994 1,3
Enterobacter aerogenes 13048 1,9
Escherichia coli 11775 1,9
Mycoplasma hominis 14027 1,3
Pseudomonas cepacia 17762 2,2
Proteus mirabilis 29906 2,2
Rahnella aquatilis 33071 1,9
Rhodospirillum rubrum 11170 1,9
Vibrio parahaemolyticus 17802 2,0
Yersinia enterocolitica 9610 2,5
*
Quociente = contagens ligadas quando presente RNA contagens ligadas quando não está presente RNA
Exemplo 12
As compilobactérias são bastonetes curvos, gram-negativos, microaerofilos e móveis. O género é muito diverso e distinto de outros géneros. Apesar do género ser bem definido está a dar-se alguma revisão ao nível das espécies (Romaniuk, P.J. et al., J. Bacteriol. 169: 2137-2141 (1987). Três espécies de campilobactérias, Campylobacter jejuni, C. coli e C. laridis provocam enterite em humanos. A doença inclui diarreia, febre, nausea, dores abdominais e nalguns casos vómitos. Estes organismos causam cerca de 2 milhões de infecções por ano nos Estados Unidos (cálculo baseado no número dos casos de diarreia provocados por Salmonella e Shigella). Outros membros do género provocam septicémias em humanos e abortos e infertilidade em ovinos e gado vacum.
O diagnóstico de enterite provocada por Campylobacter está normalmente dependente do crescimento e isolamento do organismo em cultura, seguido de uma série de testes bioquímicos. O crescimento óptimizado de Campylobacter requere condições especiais tais como baixa tensão de oxigénio e temperatura elevada (42°C). Não se recomenda uma série única de condições para o isolamento de todas as espécies de Campylobacter.
As sequências de oligonucleotídeos apresentadas abaixo, quando usadas num ensaio de hibridação, hibridam com o rRNA 16S das espécies de Campylobacter com interesse. O presente invento tem vantagens significativas relativamente a métodos anteriores de detecção de Campylobacter porque uma sonda pode detectar todas as compilabactérias com interesse; as outras duas sondas detectam as Compylobacter entéricas e uma pode detectar isolados humanos de Campylobacter. Em adição, as sondas têm vantagens sobre trabalhos anteriores em termos de facilidade de ensaio e tempo grandemente reduzido para identificação e portanto diagnóstico.
As quatro sondas que hibridam com o rRNA
16S das espécies de Campylobacter com interesse foram construídas usando três iniciadores únicos complementares do rRNA 16S. As sequências 1 e 2 foram feitas usando um iniciador 16S com as sequências 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3'. A sequência 3 foi feita usando um iniciador 16S com a sequência
5'-CCG CTT GTC CGC GCC CCC AAT TC-3'. A sequência 4 foi feita com um iniciador de 16S tendo a sequência
5’-GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT-3'.
As sequências que se seguem foram caracterizadas e verificou-se hibridarem com Campylobacterium jejuni, C. coli e C. laridis. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Vibrio parahaemolyticus e Wollinella succinogenes foram usados para comparação com as sequências de campilòbactérias.
CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC
CCT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC
GCC TTC GCA ATG GGT ATT CTT GGT G
GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG
A sequência 1, derivada de rRNA 16S, tem 23 bases de comprimento e uma Tm de 65°C. A sequência 2, derivada de rRNA 16S, tem 26 bases de comprimento e uma Tm de 64°C. A sequência 3, derivada de rRNA 16S, tem 25 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. A sequência 4, derivada do rRNA 16S, tem 24 bases de comprimento e uma Tm de 61°C. A sequência 1 é capaz de hibridar na região correspondente às bases 405-428 do rRNA 16S de E. coli; a sequência 2 é capaz de hibridar na região correspondente às bases 440-475 de rRNA 16S de E. coli; a sequência 3 é capaz de hibridar na região correspondente às bases 705-735 do rRNA 16S de E. coli; a sequência 4 é capaz de hibridar na região correspondente às bases 980-1010 do rRNA 16S de E. coli.
A reactividade e especificidade das sondas para campilobacter foi testada em ensaios de hibridação.
As sondas de oligonucleotídeos marcados nos extremos de P foram misturados com RNA purificado ou RNA libertado das células em 0,1% de dodecilsulfato de sódio. Adicionou-se 0,5 ml de solução de hibridação (41% de diisobutilsulfo-succinato , fosfato de sódio 30 mM, pH 6,8, 0,7% de dodecilsulfato de sódio, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM) e incubou-se a mistura a 60°C durante 1 a 1,5 horas. Após incubação adicionou-se 2 a 2,5 ml de solução de separação (2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio) e incubou-se a mistura a 60°C durante cinco minutos. A amostra foi centrifugada e removido o sobrenadante. Adicionou-se 2,5 ml da solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio), misturou-se a amostra, centrifugou-se e removeu-se o sobrenadante. Determinou-se a radioactividade ligada à hidroxiapatite por contagem em cintilação líquida.
A Tabela 40 indica que as sondas hibridam bem com as espécies de Campylobacter com interesse, C. jejuni, C. coli e C. laridis. A sonda 1 detecta todas as espécies de Campylobacter testadas, as sondas 2 e 4 detectam apenas as campilobactérias entéricas e a sonda 3 detecta todas as espécies de Campylobacter excepto C. sputorum, um organismo isolado a partir de gado vacum. Assim todas as sondas são úteis para a identificação de campilobactérias em amostras básicas. A escolha da sonda a usar para outras aplicações dependerá do nível de especificidade necessário (i.e., campilobactérias entéricas ou outras espécies de Campylobacter.
Tabela 40
Hibridação das sondas 1-4 de Campylobacter com espécies de Campylobacter % Sonda Ligada(*)
Organismo ATCC# 1 2 3 4
Campylobacter coli 33559 64 70 52 49
C. fetus subsp.
f etus 27374 68 0,1 66 0,5
C. fetus subsp.
venerealis 19438 66 0,7 54 1,2
C. jejuni 33560 63 76 51 56
C. laridis 35221 74 73 64 52
C. sputorum subsp.
bubulus 33562 71 3,0 2,5 0
(* ) % Sonda ligada = cpms ligados à hidroxiapatite-cpms ligados quando não está presente RNA (cpms totais usados no ensaio
A Tabela 41 mostra que as sondas não hibridam com organismos estreitamente relacionados ou organismos encontrados no tracto gastrointestinal.
Tabela 41
Hibridação das sondas de Campylobacter com organismos estreitamente relacionados e organismos presentes no tracto gastrointestinal % Sonda Ligada(*)
Organismo ATCC 4 1 2 3 4
Bacteroides fragilis 25285 0 0,2 0,7 0
Escherichia coli 11775 1,3 0,5 0,5 0
Salmonella typhimurium 14028 0 0 0,3 0
Shigella boydii 29929 0 0,2 0,5 0
Shigella dysenteriae 13313 0 0,7 0,2 0
Shigella flexneri 29903 0 0 0,5 0
Shigella sonnei 29930 0 0 o,i 0
Vibrio parahaemotyticus 17802 0 1,9 o,i 0
Wollinella succinogenes 29543 0,4 2,1 2,2 0
Yersinia pseudotuberculosis 29883 0,6 0,2 1,7 0,3
(# ) % Sonda ligada = cpms ligados à hidroxiapatite-cpm ligado quando não está RNA presente/cpms totais usados no ensaio
As sondas espécificas para bactérias Campylobacter entéricas, sondas 2 e 4, foram ainda testadas e verificou-se não reagirem com rRNAs de outros organismos encontrados no tracto gastrointestinal
Tabela 42
Hibridação das sondas 2 e 4 de Campylobacter com organismos encontrados no tracto gastrointestinal % Sonda ligada (*)
Organismo
Citrobacter diversus Clostridium perfringens Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis
Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus bovis
ATCC# Sonda 2 Sonda 4
27156 0 0
13124 0 0
13047 0 0
23357 0 0,5
25933 0 0
13880 0 0
el2600
14990 0 0,3
33317 0 0
% Sonda Ligada = cpm Ligados à hidroxiapatite-cpm Ligados quando não ha RNA/cpms totais usados no ensaio
Exemplo 13
Os estreptococus são bactérias cocóides, gram positivas e oxidase negativas. 0 género foi dividido em 18 grupos, A-R, com base em açucares específicos de grupo. Os estreptococus do grupo D são ainda subdivididos em enterococus (S^. f aecium, S^. f aecalis, avium e S^. gallinarum e não enterococus jS. bovis e S.. equinus. S^. faecium, faecalis e íS. avium são considerados enterococus médicamente importantes. Algumas espécies de estreptococus são patogénicas para o homom; outras são da floia normal da boca e intestino mas podem provocar doenças quando introduzidos noutros sítios. Dois exemplos são _S. faecium e faecalis que são normalmente en-96
contrados no intestino mas que se podem espalhar para causar bacteremia, infecções de feridas e e cerca de 10% das infecções das vias urinárias nos Estados Unidos.
Métodos correntes para detecção de enterococcus requerem a cultura do organismo durante 18-72 horas seguido de uma bateria de testes bioquímicos. A sequência de oligonucleotídeos apresentada abaixo, quando usada num ensaio de hibridação, detecta com precisão Streptococcus faecalis, S_. avium e Í5. faecium. A sonda do invento não dá reacção cruzada com outros Streptococci ou Staphylococci que estão muito estreitamente relacionados em homologia de DNA (Kiepper-Baez, 1981, 1982, Schliefer 1984). 0 presente invento também reduz o número de testes a efectuar numa amostra e reduz grandemente o tempo para a identificação e portanto o diagnóstico. Isto representa uma melhoria significativa relativamente a métodos anteriores.
A sequência sonda foi identificada usando um iniciador complementar do rRNA 16S com a sequência 51-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'. A sequência que se segue foi caracterizada e verificou-se ser específica para três enterococus , jS. f aecium, £. f aecalis e avium. 0 vizinho filogenéticamente mais próximos £!. agalactiae, Í3. bovis, S_. pneumoniae e Í5. pyogenes foram usados para comparação com as sequências de interesse.
1. TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA
A sequência tem 35 bases de comprimento e uma Tm de 72°C. Ela é capaz de hibridar na região correspondente às bases 825-860 do rRNA 16S de E. coli. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda ela foi usada num ensaio de hibridação com RNA purificado ou RNA libertado das cé7 lulas. Uma suspensão contendo pelo menos 10 células em 2% de dodecilsulfato de sódio foi agitado com vortex na presença de pérolas de vidro. Misturou-se 0,1 ml de suspensão com 0,1 ml de tampão de hibridação (fosfato de sódio 0,96M, pH 6,8, EDTA
0,002M, EGTA 0,002Μ) e incubou-se a 65°C durante 2 horas. Após incubação adicionou-se 5 ml de 2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio e a mistura foi incubada a 65°C durante 10 minutos. Centrifugou
-se a amostra e removeu-se o sobrenadante. Adicionou-se cinco ml da solução de lavagem (tampão fosfato 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio) e as amostras foram agitadas com vortex, centrifugadas e removido o sobrenadante. Determinou-se a quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite por contagem de cintilação. A Tabela 43 mostra que a sonda reage bem com S. faecium, S. faecalis e S_. avium e não reage com outros organismos estreitamente relacionados.
Tabela 43
Hibridação da sonda de enterococcus com organismos estreitamente relacionados
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Staphylococcus aureus 12600 1,4
Streptococcus agalactiae 13813 1,5
Streptococcus avium 14025 22,7
Streptococcus bovis 33317 1,4
Streptococcus faecalis 19433 45,3
Streptococcus faecium 19434 43,0
Streptococcus mitis 9811 1,5
Streptococcus pneumoniae 6306 1,5
Streptococcus pyogenes 19615 1,3
Exemplo 14
As pseudomonas são bacilos gram-negativos, não fermentativos e não esporuladores. As pseudomonas fazem parte do solo e da água e raramente infectam indivíduos saudáveis. Quando o organismo encontra um indivíduo já doente pode causar uma variedade de síndromas clínicos incluindo infecções de feridas, infecções pós-cirúrgicas, septicémia, diarreia e infecções das vias respiratórias e urinárias. Os membros do género Pseudomonas são particularmente importantes para identificar numa amostra clínica devido à resistência dos microorganismos aos antibióticos. Os estudos de homologia de ácidos nucleicos dividiram o género em cinco classes de homologia conhecidas como grupos de RNA I-V. Oitenta e três por cento dos isolados clínicos de Pseudomonas são do grupo I de RNA e Pseudomonas aeruginosa é de longe a espécie mais vulgarmente isolada.
Os métodos correntes para detecção de pseudomonas requerem cultura de uma amostra do paciente durante 24-72 horas, seguido de uma bateria de testes clínicos. A sequência de oligonucleotídeos abaixo quando usada num ensaio de hibridação, detecta o grupo I de pseudomonas clinicamente importantes. 0 presente invento reduz o número de testes que devem ser feitos a uma amostra e reduz o tempo de detecção. Isto representa uma melhoria significativa sobre métodos anteriores .
A sequência foi obtida com um iniciador complementar de uma região conservada do rRNA 23S tendo a sequência 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3'. A sequência que se segue verificou-se detectar o grupo I de pseudomonas:
1. CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT
A sonda tem 35 bases de comprimento e uma Tm de 70°c. Ela é capaz de hibridar com o RNA do grupo I
de Pseudomonas na região correspondente às bases 365-405 do rRNA 23S de E. coli. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda, ela foi usada num ensaio de hibridação. O oligonucleotídeo marcado nos extremos com P foi misturado com RNA libertado a partir de pelo menos 10 organismos por métodos conhecidos em fosfato de sódio 0,48M pH 6,8, 1% de dodecilsulfato de sódio, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA e incubado a 65°C durante duas horas. Após incubação os híbridos de RNA:DNA foram ligados a hidroxiapatite como descrito para os exemplos anteriores e a radioactividade ligada foi determinada por contagem de cintilação. A Tabela 44 demonstra que a sonda reagiu bem com as 8 espécies de pseudomonas do grupo I. A sonda não reagiu com RNA de organismos do grupo II ou do grupo V. Observou-se uma reacção fraca com Pseudomonas acidovorans, um organismo do grupo III que representa 4 1% de todos os isolados de bacilos não fermentativos das amostras clínicas. A Tabela 45 demonstra que a sonda não reage com outros organismos estreitamente relacionados que foram testados.
-100
Tabela 44
Hibridação da sonda do grupo I de Pseudomonas com RNAs de pseudomonas
Organismo Grupo ATCC# %Sonda Ligada
Pseudomonas alcaligenes I 14909 24
Pseudomonas aeruginosa I 10145 83
Ps eudomonas denitr if icans I 13867 83
Pseudomonas fluorescens I 13525 82
Pseudomonas mendocina I 25411 79
Pseudomonas pseudoalcali-
genes I 17440 78
Pseudomonas putida I 12633 80
Pseudomonas stutzeri I 17588 84
Pseudomonas cepacia II 25416 0
Pseudomonas pickettii II 27511 1,0
Pseudomonas acidovorans III 15668 11
Pseudomonas maltophilia V 13637 0,2
% Sonda Ligada = contagens ligadas quando está presente RNA-contagens ligadas quando não está presente RNA/contagens totais usadas no exemplo
-101-
Tabela 45
Hibridação da sonda do grupo I de Pseudomonas com RNAs de organismos estreitamente relacionados
Organismo ATCCfc % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 1,6
Legionella pneumohila 33155 0,6
Moraxella phenylpyruvica 23333 0,3
Morganella morganii 25830 0
Vibrio parahaemolyticus 17802 0,6
*% Sonda Ligada = contagens ligadas quando está presente RNA-contagens ligadas quando não está presente RNA/contagens totais usadas no ensaio
Exemplo 15
Os exemplos 15-18 divulgam sondas para as Enterobacteriaceae, todas elas altamente relacionadas a nível de DNA. Existem inclusivamente menos diferenças ao nível do rRNA. Por exemplo, o rRNA 16S de Proteus vulgaris tem 93% de homologia com o de E. coli. Estes factores ilustram as dificuldades associadas à produção de sondas de rRNA específicas para este grupo de organismos. No entanto, arranjámos sondas para Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Salmonella e E. coli.
Os membros do género Enterobacter são bacilos móveis, gram-negativos e não esporulados que pertencem à familía das Enterobacteriaceae. O género é um grupo grande e heterogéneo. Foram definidas oito espécies mas apenas 5 têm significado clínico. Enterobacter cloacae e E. aerogenes são os isolados mais comuns e estão associados às infecçÕes genito-urinárias, pulmonares, do sangue, do sistema nervoso
-102-
central e dos tecidos moles em humanos.
O método descrito para identificação de Enterobacter cloacae em amostras de pacientes envolve a cultura da amostra em placas de agar durante 18-24 horas, seguido de uma bateria de testes bioquímicos. A sequência de oligonucleotídeos descrita abaixo, quando usada como sonda num ensaio de hibridação de ácidos nucleicos, identifica com precisão Enterobacter cloacae. O presente invento reduz o número de testes que devem ser efectuados numa amostra, o tempo de identificação e portanto o diagnóstico e representa assim uma melhoria significativa relativamente a métodos anteriores.
A sonda específica para Enterobacter cloacae foi obtida com um iniciador complementar de uma região conservada do rRNA 23S, tendo a sequência 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'.
A sequência que se segue foi caracterizada e verificou-se ser específica para E. cloacae. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis e Citrobacter freundii foram usados como comparações com a sequência de E. cloacae.
1. GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC
A sonda tem 29 bases de comprimento e uma Tm de 68°C. Ela é capaz de hibridar com RNA de E. cloacae na região correspondente às bases 305-340 do rRNA 23S de E. coli. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda para E. cloacae ela foi usada num ensaio de hibridação. O oligonu32 cleotídeo sonda marcado nos extremos com P foi misturado com
RNA libertado de pelo menos 10 organismos em 1% de dodecilsulfato de sódio, fosfato de sódio 0,48M, pH 6,8 (0,2 ml de volume final) e incubado a 60°C durante 2 horas. Após incubação, adicionou-se 5 ml de 2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio
0,12M pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio e a mistura foi
103-
incubada a 60°C durante 10 minutos. Centrifugou-se a amostra e removeu-se o sobrenadante. Adicionou-se 5 ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio), agitou-se a amostra com vortex, centrifugou-se e removeu-se o sobrenadante. A quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação. Os resultados estão apresentados na Tabela 46 e demonstram que a sonda reage bem com E. cloacae e não reage com o RNA de organismos estreitamente relacionados.
Tabela 46
Hibridação da sonda de Enterobacter cloacae com organismos estreitamente relacionados
Nome do
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Citrobacter freundii 8090 1,8
Enterobacter aerogenes 13048 1,4
Enterobacter cloacae 13047 27
Escherichia coli 11775 1,0
Klebsiella pneumoniae 13883 1,7
Proteus mirabilis 29906 0,9
Proteus vulgaris 13315 0,6
Providencia stuartii 29914 1,1
A Tabela 47 mostra que a sonda não reage com o RNA do organismo encontrados na urina.
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Hibridação da sonda de Enterobacter cloacae com organismos presentes na urina
Nome dos Organismos ATCC# % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 0,8'
Candida Krusei 34135 0,8
Candida parapsilosis 22019 0,9
Candida tropicalis 750 1,1
Pseudomonas aeruginosa 10145 1,0
Serratia marcescens 13880 1,6
Staphylococcus aureus 12600 1,7
Staphylococcus epidermidis 14990 1,4
Streptococcus agalactiae 13813 2,5
Streptococcus faecium 19434 1,5
Torulopsis glabrata 2001 0,9
Exemplo 16
Os membros do género Proteus são bacilus móveis, gram-negativos e não esporulados que pertencem à família das Enterobacteriaceae. Foram descritos quatro espécies de Proteus e três deles, Proteus mirabilis, P. vulgaris e P. penneri provocam doenças em humanos.
O tipo mais comum de infecção por proteus envolve as vias urinárias mas pode também surgir septicémia, pneumonia e infecção de feridas. Proteus mirabilis é a espécie mais vulgarmente isolada e pode constituir até 10% de todas as infecções urinárias agudas não complicadas. Pretende-se mais a identificação ao nível da espécie do que ao nível do género do organismo responsável devido 'diferente susceptibilidade a antibióticos entre as espécies.
-105-
método corrente para a identificação de Proteus mirabilis em amostras de pacientes envolve a cultura da amostra em placas de agar durante 18-24 horas, seguido de uma bateria de teste bioquimicos. A sequência de oligonucleotídeos descrita abaixo, quando usada como sonda num ensaio de hibridação de ácidos nucleicos, identifica com precisão Proteus mirabilis. O presente invento reduz o número de testes que deve ser feito numa amostra, o tempo de identificação e portanto o diagnóstico e tratamento. Isto representa uma melhoria significativa relativamente a métodos anteriores.
A sonda específica para Proteus mirabilis foi obtida com um iniciador complementar de uma região conservada do rRNA 23S com a sequência 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'.
A sequência que se segue foi caracterizada e verificou-se ser específica para P. mirabilis. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris e Salmonella enteritidis foram usadas como comparações com a sequência de Proteus mirabilis .
1. CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC.
Esta sonda é capaz de hibridar com o RNA de P. mirabilis na região correspondente às bases 270-305 do rRNA 23S de E. coli. A sonda tem 33 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda para P. mirabilis ela foi usada num ensaio de hibridação. O oligonucleotídeo sonda marcado nos extremos
7 com P foi misturado com RNA libertado de pelo menos 10 organismos em 1% de dodecilsulfato de sódio, fosfato de sódio
0,48M, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (volume final de 0,2 ml) e incubado a 64°C durante 2 horas. Após incubação adicionou-se 5 ml de 2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M pH 6,8
0,02% de dodecilsulfato de sódio e a mistura foi incubada a
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64°C durante 10 minutos. Centrifugou-se a amostra e removeu-se o sobrenadante. Adicionou-se cinco ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio), a amostra foi agitada com vortex, centrifugada e removido o sobrenadante. A quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagens de cintilação. Os resultados estão apresentados na Tabela 48 e demonstram que a sonda reage bem com P. mirabilis e não reage com 27 outras bactérias estreitamente relacionadas. A Tabela 49 mostra que a sonda não reage com 24 outras bactérias filogenéticamente afastadas e com duas leveduras testadas do mesmo modo que os organismos na Tabela 48.
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Tabela 48
Hibridação da sonda de Proteus mirabilis com organismos estreitamente relacionados
Nome dos Organismos ATCCjp % Sonda Ligada
Citrobacter diversus 27156 1,1
Citrobacter freundii 8090 1,1
Citrobacter freundii 6750 1,0
Enterobacter aerogenes 13048 1,0
Enterobacter agglomerans 27155 1,0
Enterobacter cloacae e 13047 1,1
Enterobacter gergoviae 33028 1,0
Enterobacter sakazakii 29544 1,1
Escherichia coli 10798 1,2
Escherichia coli 11775 1,2
Escherichia coli 29417 1,2
Klebsiella oxytoca 13182 1,0
Klebsiella ozaenae 11296 1,1
Klebsiella planticola 33531 0,9
Klebsiella pneumoniae 13883 1,3
Klebsiella pneumoniae 23357 1,1
Klebsiella rhinoscleromatis 13884 1,2
Klebsiella terrigena 33257 1,1
Klebsiella trevisanii 33558 1,0
Kluyvera ascorbata 33433 0,9
Proteus mirabilis 25933 69,0
Proteus penneri 33519 2,5
Proteus vulgaris 13315 1,7
Providência alcalifaciens 9886 1,1
Providencia rettgeri 29944 1,3
Providencia stuartii 29914 1,1
Salmonella arizonae 29933 1,1
Salmonella enteritidis 13076 0,8
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Tabela 49
Hibridação de uma sonda de Proteus mirabilis com organismos filogenéticamente afastados
Nome do organismo ATCC$ % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 33604 0,8
Bacillus subtilis 6051 1,2
Bacteroides fragilis 23745 0,9
Branhamella catarrhalis 25238 0,7
Campylobacter jejuni 33560 1,0
Candida Krusei 34135 0,8
Chromobacterium violaceum 29094 1,1
Clostridium perfringens 13124 0,9
Deinococcus radiodurans 35073 0,8
Derxia gummosa 15994 0,8
Hafnia alvei 13337 0,9
Morganella morganii 25830 0,9
Pseudomonas aeruginosa 10145 1,0
Pseudomonas cepacia 17762 0,9
Ranhella aquatilis 33071 0,9
Rhodospirillum rubrum 11170 0,8
Serratia marcescens 13880 0,9
Serratia odorifera 33077 0,9
Staphylococcus aureus el2600 0,8
Staphylococcus epidermidis 14990 0,8
Streptococcus mitis 9811 0,8
Streptococcus pneumoniae e6306 0,9
Torulopsis glabrata 2001 0,9
Vibrio parahaemolyticus 17802 0,8
Xanthomonas maltophilia 13637 1,1
Yersinia enterocolitica 9610 0,8
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Exemplo 17
Os membros do género Salmonella são bacilos móveis, gram-negativos não esporulados pertencentes à familia das Enterobacteriaceae. Todas as salmonelas estão esteitamente relacionadas e alguns microbiologistas consideram-nas como uma só espécie. Foram identificados cinco subgrupos usando estudos de homologia de ácidos nucleicos e foram descritos cerca de 1400 serotipos diferentes. Todos os serotipos foram implicados em doenças entéricas humanas indo desde a gastroentrite auto-limitada com sintomas ligeiros, afe gastroentrite grave com bactéremia, até à febre tifoide, uma doença que pode ser fatal S. cholerasuis, £5. paratyphi A e £>. typhi são os serotipos mais vulgarmente associados a doenças graves e bacterémia. O diagnóstico da entrite induzida por Salmonella está dependente da detecção do organismo em de canilhas (spool). Uma vez que a infusão ocorre essêncialmente por ingestão de leite, alimentos e água contaminados são críticos os métodos para identificação de Salmonella nestes produtos antes de atingirem os consumidores.
Os métodos vulgares para detecção de membros do género Salmonella envolvem cultura da amostra durante 1-3 dias em meios selectivos seguido de uma bateria de testes bioquímicos. Por vezes é necessário um passo de enriquecimento para isolar salmonelas a partir de amostras clínicas e alimentares. As sequências de oligonucleotídeos apresentadas abaixo, quando usadas num ensaio de hibridação identificam com precisão membros do género Salmonella. As presentes sondas do invento são específicas para todos os membros do género e não reagem com os outros géneros de Enterobacteriaceae estreitamente relacionados. Estas sondas do invento reduzem o número de testes que devem ser feitos numa amostra e reduzem grandemente o tempo de identificação. Isto representa uma melhoria significativa relativamente a métodos anteriores.
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As sondas específicas para o género Salmonella foram obtidas com dois iniciadores complementares do rRNA 16S e 23S. A sequência 1 foi obtida usando um iniciador 16S com a sequência 5'TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA 3'. A sequência 2 foi obtida usando um iniciador de 23S com a sequência 5'CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT 3'. As sequências que se seguem foram caracterizadas e verificou-se serem específicas
para o género Salmonella:
1. CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC
2. CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A
A sequência 1, do rRNA 16S, tem 30 bases de comprimento e uma Tm de 73°C. A sequência 2, derivada do rRNA 23S, tem 34 bases de comprimento e uma Tm de 71°C. Estas sondas são capazes de hibridar nas regiões correspondentes às bases 1125-1155 do rRNA 16S de E. coli e 335-375 do rRNA 23S E. coli, respectivamente. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda 1 para membros do género Salmonella, o oligonucleotídeo marcado nos extremos com P foi testado como sonda numa reacção de hibridação. RNA purificado ou RNA libertado de pelo menos 10 organismos por métodos convencionais, foi misturado com 1 ml de tampão de hibridação (concentração final 43% de diisobutilsulfo-succinato, fosfato de sódio 60 mM pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) e incubado a 72°C durante 2-12 horas. Após incubação adicionou-se 5 ml de solução de separação (2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio) e a amostra foi misturada, incubada a 72°C durante 5 minutos, centrifugada e os sobrenadantes removidos. Adicionou-se quatro ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio) e as amostras foram agitadas com vortex, centrifugadas e removidas os sobrenadantes. A quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação. Os resultados apresentados na Tabela 50 indicam que uma combinação das duas sondas híbrida com os 5 subgrupos de Salmonella e com todos os outros 31 se rotipos que foram testados.
-111-
Tabela 50
Hibridação das sondas 1 e 2 de Salmonella com membros do género Salmonella % Sonda Ligada
Subgrupo Organismo ATCC Sonda 1 Sonda
I Salmonella choleraesuis 10780 24 40
I Salmonella enteritidis 13076 15 67
I Salmonella paratyphi A 9150 1,4 70
I Salmonella sp. serotipo 9270 40 26
I anatum Salmonella sp. serotipo cubana 12007 54 35
I Salmonella sp. serotipo give 9268 12 40
I Salmonella sp. serotipo heidelberg 8326 53 33
I Salmonella sp. serotipo illinois 11646 36 46
I Salmonella sp. serotipo montevideo 8387 35 32
I Salmonella sp. serotipo newington 29628 52 34
I Salmonella sp. serotipo newport 6962 3,4 36
I Salmonella sp. serotipo putten 15787 34 39
I Salmonella sp. serotipo saintpaul 9712 28 30
I Salmonella sp. serotipo senftenberg 8400 38 43
I Salmonella sp. serotipo simsbury 12004 29 29
I Salmonella sp. serotipo sloterdijk 15791 34 30
I Salmonella sp. serotipo thompson 8391 32 41
I Salmonella sp. serotipo vellore 15611 35 2,
I Salmonella typhi 19430 7,0 21
I Salmonella typhimurium 14028 69 69
II Salmonella salamae 6959 3,0 46
II Salmonella sp. serotipo maarssen 15793 6,6 30
-112-
Tabela 50 (Cont.)
Hibridação das sondas 1 e 2 de Salmonella com
membros do género Salmonella % Sonda Ligada
Subgrupo Organismo ATCC# Sonda 1 Sonda 2
III Salmonella arizonae 33952 2,9 38
III Salmonella arizonae 12324 5,5 42
III Salmonella arizonae 29933 2,3 62
III Salmonella arizonae 29934 63 12
III Salmonella arizonae 12323 4,0 39
III Salmonella arizonae 12325 51 1,9
IV Salmonella sp. serotipo
harmelen 15783 5,8 8,0
IV Salmonella sp. serotipo
ochsenzoll 29932 7,5 40
V Salmonella sp. serotipo
bongor cdcl319 60 1,8
A especificidade das sondas para membros do género Salmonella foi demonstrada com reacções de hibridação contendo RNA de organismos estreitamente relacionados com a Salmonella. Os resultados estão apresentados na Tabela 51.
-113-
Tabela 51
Hibridação das sondas 1 e 2 de Salmonella com RNA de organismos estreitamente relacionados
% Sonda Ligada
Organismo ATCC# Sonda 1 Sonda 2
Citrobacter freundi 6750 2,2 0
Edwardsiella tarda 15947 0 0
Enterobacter agglomerans 27155 0,6 0
Enterobacter cloacae 13047 0 0
Enterobacter sakazakii 29544 0 0
Escherichia coli 10798 0 0
Escherichia coli 29417 0 0
Klebsiella pneumoniae 23357 0,7 0
Kluyvera ascorbata 33433 0 0,5
Proteus mirabilis 25933 0,2 0
Shigella flexneri 29903 0 0
* % Sonda Ligada = contagens ligadas à hidroxiapatite-contagens ligados quando não está presente RNA/contagens totais usadas no ensaio
A Tabela 52 mostra que as sondas 1 e 2 de Salmonella não hi bridam com organismos filogenéticamente afastados.
-114Tabela 52
Hibridação das sondas 1 e 2 de Salmonella com RNA de uma secção filogenética transversal de organismos
Organismo ATCC # % Sonda Sonda 1 Ligada Sonda 2
Acinetobacter calcoaceticus 33604 1,1 0,1
Bacillus subtilis 6051 0 0,5
Bacteroides fragilis 23745 0,1 0
Branhamella catarrhalis 25238 0,9 0
Campylobacter jejuni 33560 0 0,2
Candida Krusei 34135 0,4 0,3
Chromobacterium violaceum 29094 1,7 0
Clostridium perfringens 13124 0,3 0
Deinococcus radiodurans 35073 1,6 0,1
Derxia gummosa 15994 1,2 0
Hafnia alvei 13337 1,8 0
Morganelli morganii 25830 0 1,1
Pseudomonas aeruginosa 10145 0,5 0,7
Pseudomonas cepacia 17762 0 0
Pseudomonas maltophilia 13637 1,9 0
Rahnella aquatilis 33071 1,2 0,3
Rhodospirillum rubrum 11170 0,9 0
Serratia marcenscens 13880 0 0
Serratia odorífera 33077 2,6 0,2
Stapylococcus aureus el2600 0,2 0
Staphylococcus epidermidis 14990 0 0
Streptococcus mitis 9811 1,2 0,7
Streptococcus pneumoniae e6306 0 0
Torulopsis glabrata 2001 0 0
Vibrio parahaemolyticus 17802 0 0,2
Yersinia enterocolitica 9610 0 0
* % Sonda Ligada = Contagens ligadas à hidroxiapatite -conta-
gens ligadas quando não está presente RNA/contagens tota:
usadas no ensaio
-115-
Exemplo 18
Escherichia coli é um bacilo gram-negativo não esporulador que pertence à família Enterobacteriaceae. Foram descritas cinco espécies de Escherichia: E. coli que constitui 99% dos isolados clínicos, E. hermanii, E. blattar, E. vulneris e E. fergusonii. E. coli é uma das principais causas de infecções das vias urinárias, bacterémia e meningite neonatal e pode provocar um tipo de gastroentrite conhecido como diarreia dos viajantes.
método corrente para identificação de E. coli em amostras de um paciente envolve cultura da amostra em placas de agar durante 18-72 horas seguido de uma bateria de testes bioquímicos em colónias isoladas. A sequência de oligonucleotídeos descrita abaixo, quando usada como sonda num ensaio de hibridação de ácidos nucleicos, detecta com precisão E. colimesmo na presença de outros organismos. 0 presente invento reduz o número de testes que devem ser feitos e reduz o tempo para a identificação e portanto diagnóstico e tratamento. Isto representa uma melhoria significativa sobre métodos anteriores.
A sonda específica para E. coli foi derivada da sequência de E. coli publicada (Brosius, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75: 4801-4805 (1978)), usando Proteus vulgaris (Carbon, et al., Nucl, Acids Res. 9: 2325-2333 (1981)), Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Enterobacter gergovine e Citrobacter freundii para comparação. A sequência sonda está apresentada em baixo.
1. GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG.
Ela hibrida com RNA de E. coli na região 995-1030 do rRNA 16S. A sonda tem 30 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. Para demonstrar a reactividade e especificidade da sonda para E. coli ela foi usada num ensaio de hibrio p dação. O oligonucleotídeo sonda marcado nos extremos com P foi misturado com dois oligonucleotídeos não marcados com a se116-
quência 51-TGG ATG TCA AGA CCA GGT AAG GTT CTT CGC GTT GCA TCG-3' e 5'-CTG ACG ACA GCC ATG CAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC CGA AGG CA-3 e com RNA purificado ou RNA libertado das células com detergente e calor, em 1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), fosfato de sódio 0,48M pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (0,2 ml de volume final) e incubado a 60°C durante 2 horas. Após incubação, adicionou-se 5 ml de 2% hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio e a mistura foi incubada a 60°C durante 10 minutos. A amostra foi centrifugada e removido o sobrenadante. Adicionou-se cinco ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulf ato de sódio), a amostra foi agitada com vortex, centrifugada e removido o sobrenadante. A quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação.
Um exemplo de uma utilização desta sonda seria para detectar E. coli em amostras de urina. A Tabela 53 mostra que a sonda detecta 7 de oito estirpes de E. coli testadas. A sonda também reage com E. fergusonii, um organismo que apenas raramente seria encontrado na urina.
A Tabela 54 mostra que a sonda não reage com qualquer outro género testado excepto Shigella, um outro organismo raramente isolado a partir da urina. Estes resultados mostram que a sonda será útil para detectar EL coli em amostras de urina.
Tabela 53
Hibridação de E. Organismo coli com espécies de Escherichia
ATCC# % Sonda Ligada
Escherichia coli 10798 70
E. coli 11775 67
E. coli 23722 58
E. coli 25404 68
E. coli 25922 55
E. coli 29417 72
E. coli 33780 0,8
E. coli 35150 45
E. fergusonii 35469 55
E. hermanii 33650 0,7
E. vulneris 33821 0,8
Tabela 54
Hibridação da sonda de E. coli com organismos estreita-
mente relacionados
Organismo ATCC^ % Sonda Ligada
Citrobacter freundii 6750 0,8
Citrobacter freundii 8090 0,9
Citrobacter freundii 29221 0,6
Citrobacter freundii 33128 0,6
Enterobacter aerogenes 13048 1,2
Enterobacter agglomerans 27155 0,9
Enterobacter cloacae 13047 0,9
Enterobacter gergoviae 33023 0,7
Enterobacter sakazakii 29544 0,6
Klebsiella oxytoca 13182 0,7
Klebsiella pneumoniae 13883 0,7
Proteus mirabilis 29906 0,7
Proteus vulgaris 13315 0,8
Shibella boydii 8700 76
Shigella dysenteriae 13313 0,8
-118-
Tabela 54 (Cont.)
Hibridação da sonda de E. coli com organismos tamente relacionados
Organismo
Shigella flexneri
Shigella sonnei
ATCCffi % Sonda Ligada
29903 71
29930 75
Exemplo 19
As bactérias englobam um grupo de organismos unicelulares morfologica e fisiologicamente muito diverso que ocupa a maior parte dos ecossistemas naturais. Apesar de muitas bactérias serem inofensivas ou benéficas para o seu ecossistema ou hospedeiro, algumas são prejudiciais e provocam doenças. A presença de quaisquer bactérias nalguns sítios é indesejável ou indicadora de doença (e.g. meios de cultura, produtos farmacêuticos, fluídos do corpo como seja sangue, urina ou líquido cerebrospiral e biópsias de tecidos). Noutros produtos, tais como água para beber e produtos alimentares , são considerados aceitáveis níveis baixos de bactérias. Assim, existe a necessidade de um meio para detectar e quantificar bactérias numa amostra.
O método corrente para detecção e quantificação de bactérias totais numa amostra requere a cultura em vários tipos de meios em diferentes condições, de temperatura e atmosfera. Até à data não existiam testes únicos para detectar ou quantificar todas as bactérias. As sequências de oligonucleotídeos apresentadas abaixo, quando usadas num ensaio de hibridação, detectam uma secção filogenética transversal larga de bactérias. O presente invento reduz o número de testes que é necessário efectuar e também reduz o tempo necessário para o ensaio. A comparação dos resultados de hibri119-
dação de uma amostra desconhecida com uma série de padrões permitirá alguma quantificação do número de bactérias presentes.
Isto representa uma melhoria significativa relativamente a outros métodos anteriores.
i
As sondas bacterianas foram projectadas após examinação das sequências publicadas de rRNA e desequências determinadas em Gen-Probe. As sequências usadas para a comparação incluem Agrobacterium tumefeciens (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 4443, (1985), Anacysti nidulans (Tomioka e Sugiura Mol. Gen. Genet. 191:46, (1983)), Douglas e Doolittle Nuc. Acids. Res 12: 3373, (1984), Bacillus subtilis (Green et al., Gene 37:261 (1985)), Bacillus stearothermophilus (Kop et al., DNA 3:347, (1984), Bacteroides fragilis (Weisburg et al., J- Bacteriol. 164:230 (1985); Chlamydia psittaci (Weisburg et al., J. Bacteriol. 167:570. (1986)),
Desulfovibrio desulfuricans (Oyaizu e Woese, System. Appl. Microbiol. 6:257, (1985); Escherichia coli, (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:201, (1980); Flavobacterium heparinum (Weisburg et al., J. Bacteriol. 164:230, (1985); Heliobacterium chlorum (Woese et al., Science 229:762, (1985); Mycoplasma PG50 (Frydenberg e Christiansen, DNA 4:127, (1985); Proteus vulgaris (Carbon et al., Nuc. Acids Res. 9:2325, (1981); Pseudomonas testosteroni (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:4443, (1985); Rochalimaea quintana (Weisburg et al., Sience 230:556, (1985); Saccharomyces cerevisiae (Rubstov et al., Nuc. Acids Res. 8:5779, (1980); Georgiev et al., Nuc. Acids Res. 9:6953, (1981); e humano (Torczynski et al., DNA 4:283, (1985); Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:7666, (1985)).
As sequências que se seguem verificou-se hibridarem com uma secção filogenéticatransversal larga de bactérias e não com rRNA de levedura ou humano.
1. CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC
2 . CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG
3. GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT
-120-
4 . GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG
5. GGC TGC TTC TAA GCC AAC A TC CTG
6. GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC
7. GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C
A sonda 1 tem 30 bases de comprimento
e uma Tm de 70c 5c. A sonda 2 tem 33 bases de comprimento e uma
Tm de 69 °C. A sonda 3 tem 26 bases de comprimento e uma Tm
de 67°C. A sonda 4 tem 27 bases de comprimento e uma Tm de 69°C. A sonda 5 tem 24 bases de comprimento e uma Tm de 66°C.
A sonda 6 tem 23 bases de comprimento e uma Tm de 62°C. A sonda 7 tem 34 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. Assondas 1-3 hibridam com rRNA 16S nas regiões que se seguem, respectivamente, (correspondendo a bases de E. coli) 330-365; 675-715; e 1080-1110. As sondas 4-7 hibridam com rRNA 23S nas regiões que se seguem, respectivamente correspondendo a bases de E. coli) 460-490; 1050-1080; e 1900-1960 (sondas 6 e 7). Os oligonucleotídeos interactuam com regiões no rRNA que são altamente conservadas entre as eubactérias. Isto significa que eles podem ser usados como sondas bacterianas em ensaios de hibridação. Uma segunda utilização é como meio para obtenção de sequências de rRNA. Por exemplo, um oligonucleotídeo pode ser hibridado com o rRNA de interesse e prolongado com transcriptase reversa. A sequência de DNA resultante pode ser determinada e usada para deduzir a sequência de rRNA complementar conforme descrito na Descrição Detalhada do Invento.
Uma aplicação do invento é para detectar bactérias na urina (bacteriúria). Para demonstrar a reactividade e especificidade das sondas para bactérias que se encontrem na urina, usaram-se tais sondas em ensaios de hibridação. As sondas de oligonucleotídeos marcados nos extremos com 32 125 ZP ou marcados com I foram misturadas com RNA libertado das células por métodos convencionais (e.g. técnicas de rebentamento com ultra-sons descritas por Murphy et al. , Pedido de
Patente U.S. N2 de Série 841.860, detergente com contas de vidro ou lise enzimática). A sonda foi misturada com RNA em fos-121-
fato de sódio 0,48M, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de dodecilsulfato de sódio (0,2 ml de volume final) e hibridada a 60°C durante 2 horas. Adicionou-se cinco ml de 2% de hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio e incubou-se a mistura a 60°C durante 10 minutos. A mistura foi centrifugada e o sobrenadante removido. Adicionou-se cinco ml da solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio) e misturou-se a amostra, centrifugou-se e removeu-se o sobrenadante. A quantidade de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada por contagem de cintilação. As Tabelas 55-68 demonstram a especifi cidade destas sondas e mostram que uma combinação de sondas pode ser usada para detectar todas as bactérias que foram testadas .
A Tabela 55 mostra que a sonda 1 híbrida com o RNA de bactérias vulgarmente isoladas a partir da urina e não detecta RNA de levedura. A Tabela 56 mostra que a sonda 1 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não hibrida com RNA humano.
Tabela 55
Hibridação da sonda bacteriana 1 com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC 4= % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 2,6
Candida Krusei 34135 2,2
Candida parapsilosis 22019 2,9
Candida tropicalis 750 2,5
Citrobacter freundii 8090 69
Enterobacter aerogenes 13048 70
Enterobacter cloacae 13047 71
Escherichia coli 11775 67
Klebsiella oxytoca 13182 70
Klebsiella pneumoniae 13883 72
Morganella morganii 25830 66
Proteus mirabilis 29906 71
Proteus vulgaris 13315 67
Providencia stuartii 29914 69
Pseudomonas aeruginosa 10145 76
Pseudomonas fluorescens 13525 73
Serratia marcenscens 13880 66
Staphylococcus aureus 12600 57
Staphylococcus epidermidis 14990 68
Streptococcus agalactiae 13813 68
Streptococcus faecalis 19433 51
Streptococcus faecium 19434 53
Torulopsis glabrata 2001 2,3
Ureaplasma urealyticum 27618 54
-123-
Hibridação das sondas uma secção transversal camente afastados bacterianas de organisr com RNAs de nos filogenét
Organismo ATCC # % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 65
Bacillus subtilis 6051 73
Bacteroides fragilis 23745 61
Branhamella catarrhalis 25238 72
Campylobacter jejuni 33560 64
Chlamydia trachomatis VR878 14
Chromabacterium violaceum 29094 71
Clostridium perfringens 13124 74
Corynebacterium xerosis 3 73 38
Deinococcus radiodurans 35073 47
Derxia gummosa 15994 65
Gardnerella vaginalis 14018 67
Hafnia alvei 13337 60
Lactobacillus acidophilus 4356 56
Moraxella osloensis 19976 61
Mycobacterium smegatis 14468 47
Mycoplasma hominis 14027 58
Neisseria gonorrhoeae 19424 58
Rahnella aquatilis 33071 74
Rhodospirillum rubrum 11170 73
Vibrio parahaemolyticus 17802 75
Humano 2,5
A Tabela 57 mostra que a Sonda 2 híbrida com o RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina excepto Ureaplasma urealycum e não hibrida com RNA de levedura.
-12 4Tabela 57
Hibridação da sonda 2 bacteriana com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 2,5
Candida Krusei 34135 1,8
Candida parapsilosis 22019 1,6
Candida tropicalis 750 1,4
Citrobacter freundii 8090 61
Enterobacter aerogenes 13048 57
Enterobacter cloacae 13047 61
Escherichia coli 11775 67
Klebsiella oxytoca 13182 67
Klebsiella pneumoniae 13883 51
Morganella morganii 25830 69
Proteus mirabilis 29906 69
Proteus vulgaris 13315 69
Providencia stuartii 29914 66
Pseudomonas aeruginosa 10145 59
Pseudomonas fluorescens 13525 58
Serratia marcenscens 13880 64
Staphylococcus aureus 12600 60
Stapylococcus epidermidis 14990 60
Streptococcus agalatiae 13813 54
Streptococcus faecalis 19433 37
Streptococcus faecium 19434 58
Torulopsis glabrata 2001 1,5
Ureaplasma urealyticum 27618 3,2
A Tabela 58 mostra que a sonda 2 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não hibrida com rRNA humano.
Tabela 58
Hibridação da sonda bacteriana 2 com RNAs transversal de organismos filogenéticamente afastados
Organismo ATCC# % Sonda L •igada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 76
Bacillus subtilis 6051 75
Bacteroides fragilis 23745 2, 0
Branhamella catarrhalis 25238 70
Campylobacter jejuni 33560 2, 5
Chlamydia trachomatis VR878 16
Chromobacterium violaceum 29094 61
Clostridium perfringens 13124 66
Corynebacterium xerosis 373 3, 8
Deinococcus radiodurans 35073 6, 0
Derxia gummosa 15994 61
Gardnerella vaginalis 14018 2, 0
Hafnia alvei 13337 72
Lactobacillus acidophilus 4356 50
Moraxella osloensis 19976 64
Mycobacterium smegatis 14468 19
Mycoplasma hominis 14027 34
Neisseria gonorrhoeae 19424 71
Rahnella aquatilis 33071 77
Rhodospirillum rubrum 11170 1, 5
Vibrio parahaemolyticus 17802 73
Yersinia enterocolitica 9610 76
Humano 2, 0
A Tabela 59 mostra que a sonda 3 hibrida com o RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina e não detecta rRNA de levedura.
-126-
Hibridação da sonda ganismos encontrados bacteriana 3 na urina com RNA de or-
Organismo ATCC^ ° í Sonda Ligada
Candida albicans 18804 1,4
Candida Hrusei 34135 1,5
Candida parapsilosis 22019 2,2
Candida tropicalis 750 2,6
Citrobacter freundii 8090 79
Enterobacter aerogenes 13048 40
Enterobacter cloacae 13047 44
Escherichia coli 11775 67
Klebsiella oxytoca 13182 38
Klebsiella pneumoniae 13883 45
Morganella morganii 25830 57
Proteus mirabilis 29906 40
Proteus vulgaris 13315 51
Providencia stuartii 29914 54
Pseudomonas aeruginosa 10145 61
Pseudomonas fluorescens 13525 56
Serratia marcescens 13880 54
Staphylococcus aureus 12600 37
Staphylococcus epidermidis 14990 20
Streptococcus agalactiae 13813 34
Streptococcus faecalis 19433 20
Streptococcus faecium 19434 47
Torulopsis glabrata 2001 1,9
Ureaplasma urealyticum 27618 26
A Tabela 60 mostra que a sonda 3 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não hibrida com rRNA humano.
-127Tabela 60
Hibridação da sonda bacteriana 3 com RNAs de uma secção trasversal de organismos filogenéticamente afastados
Nome do organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 69
Bacillus subtilis 6051 35
Bacteroides fragilis 23745 1,2
Branhamella catarrhalis 25238 43
Campylobacter jejuni 33560 55
Chlamydia trachomatis VR878 42
Chromobacterium violaceum 29094 69
Clostridium perfringens 13124 62
Corynebacterium xerosis 373 23
Deinococcus radiodurans 35073 30
Derxia gummosa 15994 67
Gardnerella vaginalis 14018 40
Hafnia alvei 13337 56
Lactobacillus acidophilus 4356 36
Moraxella osloensis 19976 64
Mycobacterium smegmatis 14468 77
Mycoplasma hominis 14027 1,5
Neisseria gonorrhoeae 19424 26
Rahnella aquatilis 33071 66
Rhodospirillum rubrum 11170 51
Vibrio parahaemolyticus 17802 68
Yersinia enterocolitica 9610 68
Humano 0,9
A Tabela 61 mostra que a sonda 4 hibrida com o RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina e não detecta rRNA de levedura.
-128-
Tabela 61
Hibridação da sonda bacteriana 4 com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 4,5
Candida Krusei 34135 2,5
Candida parapsilosis 22019 2,7
Candida tropicalis 750 2,5
Citrobacter freundii 8090 55
Enterobacter aerogenes 13048 52
Enterobacter cloacae 13047 57
Escherichia coli 11775 70
Klebsiella oxytoca 13182 70
Klebsiella pneumoniae 13883 43
Morganella morganii 25830 74
Proteus mirabilis 29906 74
Proteus vulgaris 13315 73
Providencia stuartii 29914 73
Pseudomonas aeruginosa 10145 76
Pseudomonas fluorescens 13525 79
Serratia marcescens 13880 74
Staphylococcus aureus 12600 73
Staphylococcus epidermidis 14990 73
Streptococcus agalactiae 13813 70
Streptococcus faecalis 19433 37
Streptococcus faecium 19434 63
Torulopsis glabrata 2001 2,2
Ureaplasma urealyticum 27618 43
A Tabela 62 mostra que a sonda 4 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não hibrida com rRNA humano.
Tabela 62
Hibridação da sonda bacteriana 4 com RNAs de uma secção transversal de organismos filogenéticamente afastados
Nome do
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 69
Bacillus subtilis 6051 55
Bacteroides fragilis 23745 3, 0
Branhamella catarrhalis 25238 59
Campylobacter jejuni 33560 65
Chlamydia trachomatis VR878 50
Chromobacterium violaceum 29094 61
Clostridium perfringens 13124 57
Corynebacterium xerosis 373 9, 5
Deinococcus radiodurans 35073 63
Derxia gummosa 15994 65
Gardnerella vaginalis 14018 57
Hafnia alvei 13337 67
Lactobacillús acidophilus 4356 68
Moraxella osloensis 19976 68
Mycobacterium smegmatis 14468 28
Mycoplasma hominis 14027 74
Neisseria gonorrhoeae 19424 76
Rahnella aquatilis 33071 68
Rhodospirillum rubrum 11170 59
Vibrio parahaemolyticus 17802 75
Yersinia enterocolitica 9610 74
Humano 2, 8
A Tabela 63 mostra que a sonda 5 hibrida com o RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina e não detecta rRNA de levedura.
Tabela 63
Hibridação da sonda bacteriana 5 com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC^ % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 1, 8
Candida Krusei 34135 1, 7
Candida parapsilosis 22019 2, 2
Candida tropicalis 750 1, 8
Citrobacter freundii 8090 39
Enterobacter aerogenes 13048 38
Enterobacter cloacae 13047 43
Escherichia coli 11775 31
Klebsiella oxytoca 13182 38
Klebsiella pneumoniae 13883 66
Morganella morganii 25830 50
Proteus mirabilis 29906 44
Proteus vulgaris 13315 52
Providencia stuartii 29914 44
Pseudomonas aeruginosa 10145 47
Pseudomonas fluorescens 13525 25
Serratia marcescens 13380 35
Staphylococcus aureus 12600 26
Staphylococcu.s epidermidis 14990 37
Streptococcus agalactiae 13813 29
Streptococcus faecalis 19433 14
Streptococcus faecium 19434 33
Torulopsis glabrata 2001 2, 2
Ureaplasma urealyticum 27618 73
A Tabela 64 mostra que a sonda 5 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não hibridam com RNA humano.
Tabela 64
Hibridação da sonda bacteriana 5 com RNAs de uma secção transversal de organismos filogenéticamente afastados
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 20
Bacillus subtilis 6051 53
Bacteroides fragilis 23745 44
Branhamella catarrhalis 25238 22
Campyclobacter jejuni 33560 35
Chromabacterium violaceum 29094 59
Clostridium perfringens 13124 63
Corynebacterium xerosis 373 1,7
Deinococcus radiodurans 35073 5,7
Derxia gummosa 15994 14
Gardnerella vaginalis 14018 1,6
Hafnia alvei 13337 44
Lactobacillus acidophilus 4356 1,5
Moraxella osloensis 19976 7,2
Mycobacterium smegmatis 14468 39
Mycoplasma hominis 14027 21
Neisseria gonorrhoeae 19424 40
Rahnella aquatilis 33071 55
Rhodospirillum rubrum 11170 17
Vibrio parahaemolyticus 17802 66
Yersinia enterocolitica 9610 64
Humano 1,6
A Tabela 65 mostra que a sonda 6 híbrida com o RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina e não detecta rRNA de levedura.
Tabela 65
Hibridação da sonda bacteriana 6 com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC # % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 3,0
Candida Krusei 34135 2,0
Candida parapsilosis 22019 2,2
Citrobacter freundii 8090 54
Enterobacter aerogenes 13048 50
Enterobacter cloacae 13047 58
Escherichia coli 11775 63
Klebsiella oxytoca 13182 54
Klebsiella pneumoniae 13883 55
Morganella morganii 25830 60
Proteus mirabilis 29906 64
Proteus vulgaris 13315 67
Providencia stuartii 29914 64
Pseudomonas aeruginosa 10145 65
Pseudomonas fluorescens 13525 31
Serratia marcescens 13880 67
Staphylococcus aureus 12600 53
Staphylococcus epidermidis 14990 34
Streptococcus agalactiae 13813 31
Streptococcus faecium 19434 18
Torulopsis glabrata 2001 2,5
A Tabela 66 mostra qua a sonda 6 detecta algumas bactérias filogenéticamente afastadas e não híbrida com rRNA humano.
-133-
Hibridação da sonda bacteriana uma secção transversal de orgar ticamente afastados 5 com íismos RNAs de filogené-
Organismo ATCC> % Sonda Liqada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 73
Bacteroides fragilis 23745 7,0
Branhamella catarrhalis 25238 4,0
Deinococcus radiodurans 35073 5,5
Derxia gummosa 15994 3,0
Gardnerella vaginalis 14018 2,0
Hafnia alvei 13337 3,5
Lactobacillus acidophilus 4356 17
Moraxella osloensis 19976 62
Mycoplasma hominis 14027 44
Rahnella aquatilis 33071 56
Yersinia enterocolitica 9610 50
Humano 4,0
A Tabela 67 mostra que a sonda 7 híbrida com RNA de bactérias vulgarmente encontradas na urina e não detecta rRNA de levedura .
-134Tabela 67
Hibridação da sonda bacteriana 7 com RNA de organismos encontrados na urina
Organismo ATCC* % Sonda Ligada
Candida albicans 18804 2,1
Candida Krusei 34135 2,0
Candida tropicalis 750 2,2
Cibrobacter freundii 8090 67
Enterobacter aerogenes 13048 69
Enterobacter cloacae 13047 78
Escherichia coli 11775 75
Klebsiella oxytoca 13882 79
Klebsiella pneumoniae 13883 77
Morganella morganii 25830 76
Proteus mirabilis 29906 77
Proteus vulgaris 13315 79
Providencia stuartii 29914 64
Pseudomonas aeruginosa 10145 76
Pseudomonas fluorescens 13525 78
Serratia marcescens 13880 66
Staphylococcus aureus 12600 71
Staphylococcus epidermidis 14990 75
Streptococcus agalactiae 13813 70
Streptococcus faecalis 19433 58
Streptococcus faecium 19434 68
Torulopsis glabrata 2001 2,4
Ureaplasma urealyticum 27618 21
A Tabela 68 mostra que a sonda 7 detecta bactérias filogenéticamente afastadas e não híbrida com rRNA humano.
-135Tabela 68
Hibridação da sonda bacteriana 7 com RNAs de uma secção transversal de organismos filogenéticamente afastados
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Acinetobacter calcoaceticus 23055 86
Bacillus subtilis 6051 83
Bacteroides fragilis 23745 69
Branhamella catarrhalis 25238 74
Campylobacter jejuni 33560 5, 3
Chlamydia trachomatis VR878 41
Chromobacterium violaceum 29094 69
Clostridium perfringens 13124 68
Corynebacterium xerosis 373 23
Deinococcus radiodurans 35073 70
Derxia gummosa 15994 69
Gardnerella vaginalis 14018 68
Hafnia alvei 13337 77
Moraxella osloensis 19976 68
Mycobacterium smegmatis 14468 64
Mycoplasma hominis 14027 4, 0
Neisseria gonorrhoeae 19424 53
Rahnella aquatilis 33071 72
Rhodospirillum rubrum 11170 73
Vibrio parahaemolyticus 17802 67
Yersinia enterocolitica 9610 66
Humano 2, 2
-136-
Exemplo 20
Os fungos incluem um grupo morfologica e fisiológicamente distinto de organismos eucarióticos simples. Calculámos, usando sequências publicadas de três fungos, Neuro-j i pora crassa, Podospora e Saccharomyces, que o rRNA dos fungos tem 58-60% de homologia com E. coli e 84-90% de homologia uns em relação aos outros. Alguns fungos crescem como células isoladas (leveduras), outros como filamentos multinucleares (bolores ) e ainda outros podem crescer como células isoladas ou filamentos multicelulares (fungos dimórficos). Apesar de muitos fungos serem habitantes inofensivos dos seus ambientes, outros são prejudiciais e provocam doenças. A presença de quaisquer fungos nalguns locais é indesejável e indicadora de doença (e.g. meios de cultura, produtos farmacêuticos, fluídos do corpo como sejam sangue, urina ou líquido cerebrospinal e biópsias de tecidos). Noutros produtos tais como água para beber e produtos alimentares são considerados aceitáveis níveis baixos de fungos. Isto criou a necessidade de um método para detectar e quantificar fungos numa amostra.
Os métodos vulgares para detectar e quantificar fungos envolvem exame microscópico das amostras e cultura em meios diferentes. Apesar da maior parte das leveduras poderem crescer a partir de amostras clinicas no decorrer de alguns dias, alguns fungos filamentos levam até quatro semanas de cultura após as quais são efectuadas processos de coloração especiais, análise bioquímica e testes antigénicos. As sequências de oligonucleotídeos abaixo, quando usadas num ensaio de hibridação detectam as cinco leveduras mais vulgarmente isoladas em casos clínicos, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis e Candida Krusei. Cinco outros fungos representando os géneros Trichosporon, Blastomyces, Cryptococcus e Saccharomyces foram também detectados. O presente invento permite a detecção, através de um único passo, destes organismos e em relação à cultura reduz o tempo de identificação ou eliminação destes
-137-
fungos causadores da infecção. Isto representa uma melhoria significativa relativamente a métodos anteriores.
As quatro sondas que hibridam com os organismos de interesse foram identificados usando 3 iniciadores complementares das regiões conservadas no rRNA 18S ou 28S. A sequência 1 foi obtida usando um iniciador 18S com asequência 5'-AGA ATT TCA CCT CTG-3'. A sequência 2 foi obtida usando um iniciador 28S com a sequência 5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3'. As sequências 3 e 4 foram obtidas com um iniciador 28S tendo a sequência 5'-TTC CGA CTT CCA TGG CCA CCG TCC-31. As sequências que se seguem foram caracterizadas e verificou-se hibridarem com o RNA fúngico. As seguências de rRNA de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Escherichia coli e rRNA humano foram usadas para comparação com as sequências de interesse.
1. CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG
2 . CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TGT GG
3. GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC AAC AAG G
4. GCT CTG CAT TCA AAC GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC AGG G
A sequência 1, do rRNA 18S, tem 30 bases de comprimento e uma Tm de 68°C. A sequência 2, do rRNA 23S, tem 32 bases de comprimento e uma Tm de 6 7°C. A sequência 3, do rRNA 23S, tem 40 bases de comprimento e uma Tm de 66°C. A sequência 4, de rRNA 23S, tem 40 bases de comprimento e uma Tm de 68°C. A sequência 1 hibrida na região correspondente à posição 845-880 de rRNA 18S de Saccharomyces cerevisiae. A sequência 2 hibrida na região correspondente à posição 1960-2000 do rRNA 28S de Saccharomyces cerevisiae e as sequências 3 e 4 hibridam na região de 1225-1270 do rRNA 28S.
Para demonstrar a reactividade e especificidade destas sondas para RNA fúngico, foram usadas em ensaios de hibridação. As sondas de oligonucleotídeos marcados o 2 1 9 R com ou 3I foram misturadas com RNA purificado ou RNA libertado das células por técnicas convencionais de lise em 0,2
-138-
ml de fosfato de sódio 0,48M, pH 6,8, 1% de dodecilsulfato de sódio, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA e incubado a 60°C durante 2 horas. Após incubação adicionou-se 5 ml de 2% hidroxiapatite,fosfato de sódio 0,12M, pH 6,8, 0,02% de dodecilsulfato de sódio e as amostras foram incubadas 10 minutos a 60°C. As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes removidos. Adicionou-se cinco ml de fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de dodecilsulf ato de sódio, as amostras foram misturadas, centrifugadas e os sobrenadantes removidos. Os resultados estão apresentados na Tabela 69. A sonda 1 detecta os dez fungos testados, a sonda 2 detecta as seis leveduras, a sonda 3 detecta cinco das seis leveduras e a sonda 4 detecta apenas C. Krusei. Assim, a sonda 4 poderá ser usada para detectar e identificar C. Krusei em amostras, as sondas 1, 2 ou combinação de 3 e 4 podem ser usados para detectar as leveduras e a sonda 1 pode ser usada para detectar qualquer um dos dez organismos descritos na Tabela 69.
Um potencial uso para estas sondas é para identificar leveduras em amostras de urina ou outros fluídos do corpo normalmente estéreis. As sondas foram hibridadas com um painel das bactérias mais vulgarmente isoladas a partir da urina e verificou-se não reagirem com elas (Tabela 70 ) . A Tabela 71 mostra que as sondas não hibridam com RNA de bactérias filogenéticamente afastadas ou humano.
-139-
Tabela 69
Hibridação das sondas de Organismo levedura com RNA de levedura
ATCC# % Sonda Ligada 4
1 2 3
Blastomyces dermatitidis C.I. 25 1,4 1,5 1,5
Candida albicans 18804 40 63 56 2,0
C. Krusei 34135 73 62 2,2 70
C. parapsilosis 22019 71 63 65 2,0
C. tropicalis 750 62 71 71 2,0
Cryptococcus laurentii C.I. 43 1,4 1,5 1,5
Cryptococcus neoformans C.I. 60 1,3 1,5 1,6
Torulopsis glabrata 2001 61 44 62 2,0
Trichosporon beigelii C.I. 57 1,3 2,1 1,5
Saccharomyces cerevisiae C.I. 41 67 53 1,9
C.I. = Isolado clinico
Tabela 70
Hibridação das sondas fúngicas 1-4 com RNA de organismos encontrados na urina % Sonda Ligada
Organismo ATCC# 1 2 3 4
Citrobacter freundii 8090 1,5 1,7 1,5 2,1
Enterobacter aerogenes 13048 2,5 1,9 2,0 2,0
Enterobacter cloacae 13047 2,5 1,6 2,6 2,0
Escherichia coli 11775 3,0 2,0 1,6 1,5
Klebsiella oxytoca 13182 2,5 2,2 2,5 2,0
Klebsiella pneumoniae 13883 2,5 2,2 2,1 2,0
Morganella morganii 25830 2,0 2,8 1,7 1,9
Proteus mirabilis 29906 2,5 1,9 2,3 2,0
Proteus vulgaris 13315 2,0 2,2 2,0 1,5
Providencia stuartii 29914 3,0 1,7 2,8 2,0
Pseudomonas aeruginosa 10145 2,0 1,9 1,3 2,0
Pseudomonas fluorescens 13525 2,5 2,7 2,1 2,0
Serratia marcescens 13880 2,5 1,7 1,8 2,0
Staphylococcus aureus 12600 2,0 1,7 1,8 2,0
Staphylococcus epidermidis 14990 3,0 1,5 1,3 2,0
Streptococcus agalactiae 13813 2,5 1,9 1,3 2,5
Streptococcus faecalis 19433 1,7 3,3 3,5 1,9
Streptococcus faecium 19434 2,0 2,9 2,1 1,5
Ureaplasma urealyticum 27618 2,1 3,1 2,4 1,8
Tabela 71
Hibridação das sondas fúngicas 1-4 com RNAs de uma secção transversal de organismos filogenéticamente afastados
Organismo ATCC £ % 1 Sonda Ligada 4
2 3
Acinetobacter calcoaceticus 23055 2,5 2,5 2,0 1,9
Bacillus subtilis 6051 2,0 2,8 2,4 2,4
Bacteroides fragilis 23745 2,0 2,2 2,5 2,3
Branhamella catarrhalis 25238 2,5 3,2 1,8 1,7
Campylobacter jejuni 33560 2,5 2,1 2,0 1,9
Chlamydia trachomatis VR878 3,1 3,1 1,8 2,7
Chromobacterium violaceum 29094 2,5 1,7 2,0 2,2
Clostridium perfringens 13124 1,9 2,3 1,8 1,8
Corynebacterium xerosis 373 1,6 4,8 1,8 1,1
Deinococcus radiodurans 35073 2,0 1,6 2,1 0,8
Derxia gummosa 15994 3,0 1,5 1,7 1,8
Gardnerella vaginalis 14018 2,0 2,2 1,3 1,2
Hafnia alvei 13337 1,0 2,5 1,7 1,6
Lactobacillus acidophilus 4356 2,0 2,7 2,0 1,9
Moraxella osloensis 19976 2,0 2,1 1,9 1,8
Mycobacterium smegmatis 14468 1,6 1,8 1,8 1,7
Mycoplasma hominis 14027 1,5 1,8 1,6 1,5
Neisseria gonorrhoeae 19424 2,0 2,7 1,6 1,6
Rahnella aguatilis 33071 2,0 2,7 2,3 2,1
Rhodospirillum rubrum 11170 2,0 1,8 1,6 1,5
Vibrio parahaemolyticus 17802 2,5 3,1 1,7 1,6
Yersinia enterocolitica 9610 2,0 1,8 2,3 2,2
Humano 2,0 1,8 2,1 3,0
-141-
Foram igualmente produzidos dois derivados desta sonda:
CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC
CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG primeiro derivado funciona bem a 65°C, o segundo a 60°C.
Exemplo 21
A gonorreia é uma das infecções bacterianas mais diagnosticadas nos Estados Unidos, sendo relatados anualmente cerca de dois milhões de casos. Esta doença transmitida sexualmente resulta geralmente em uretrite anterior nos homens e afecta o cervix das mulheres. Se bem que possam ocorrer complicações graves e mesmo esterilidade nos indivíduos não tratados, as infecções assintomáticas são vulgares , resultando em portadores que inconvenientemente espalham a doença.
agente causador, Neisseria gonorrhocae é um diplococus gram-negativos, oxidase positivo com condições de crescimento restrictas. 0 método usado para diagnóstico depende do local da infecção e dos sintomas do paciente. A uretrite gonocóccica nos homens é diagnosticada com uma boa sensibilidade e especificidade usando coloração de gram. A cultura, que requere 24-72 horas, deve geralmente ser efectuada para confirmar o diagnóstico de gonorreia em todas as mulheres e homens assintomáticos. Após a detecção do organismo a partir de crescimento em cultura, Neisseria gonorrhoea deve ser identificada com outros testes como sejam degradação de açúcares, coaglutinação, despiste com anticorpos fluorescentes ou ensaios com substractos enzimáticos cromogénicos.
A Neisseria gonorrhoeae é particularmente dificil de detectar e distinguir usando uma sonda de áci-142-
do nucleico porque está muito estreitamente relacionada com N. meningitidis, Os resultados publicados em Kingsbury, D.T., J. Bacteriol. 94:870-874 (1987) mostram uma homologia de DNA:DNA de aproximadamente 80-94% para as duas espécies. Sob as directrizes estabelecidas pelo Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics, Int11 J. System. Bacteriol 37:463-464 (1987), a definição filogenética de uma espécie geralmente significa 70% ou mais de homologia DNA:DNA. Apesar do facto destes organismos serem considerados com a mesma espécie de acordo com os princípios estabelecidos, nós fomos capazes de fazer sondas capazes de os distinguir .
Conforme esperado a homologia de rRNA entre N. gonorrhoca e N. meningitidis é mesmo superior devido à regiões conservadas conhecidas. Notámos uma diferença de 1,0% relativamente ao 16S e uma diferença de 1,1% entre as sequências de rRNA 23S de _N. gonorrhocae e _N. meningitidis usando os nossos resultados de sequênciação.
Fazer uma sonda para N. gonorrhocae foi complicado devido a nalguns sítios onde N. meningitidis e N. gonorrhoca diferiam, outras espécies de Neisseria eram semelhantes a N. gonorroecae. Os poucos desemparelhamentos que existem entre estas duas espécies são nas regiões mais variáveis, i.e., regiões que variam não só apenas entre espécies como também entre estirpes. Apesar de alguns autores pensarem que as espécies não se podem distinguir de todo e outros pensarem que o rRNA seria muito conservado para ser útil em diagnósticos com sondas, conseguimos fazer sondas capazes de diferênciar N. gonorrhocae e N. meningitidis.
presente invento tem vantagens significativas relativamente a cada um dos métodos anteriores; as sondas são mais específicas e mais rápidas do que os métodos de cultura. Também se pensa que as sondas são mais sensíveis, (i.e., capazes de detectar um número mais pequeno de organis-143mos numa amostra clínica) do que os métodos anteriores.
Os iniciadores usados para identificar estas sondas tinham as seguintes sequências:
1. GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT
2. GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC
3. GCTCGTTGCGGGACTTAACCCACCAT
Cada um dos sítios de rRNA escolhidos para detectar o alvo tinham pelo menos dois desemparalhamento com E. coli, N. meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N. mucosa e Kingella Kingae.
Os oligonucleotídeos complementares das sequências adjacentes às regiões sonda foram sintetizados e usados na mistura de hibridação de acordo com Kohme et al., Pedido de Patente U.S. Νθ de Série -------- (ainda não atribuído) a ser entregue em 24 de Novembro de 1987 (o pedido de patente auxiliar).
As sequências que se seguem foram caracterizadas e verificou-se serem específicas para Neisseria gonorrhoeae. Os vizinhos filogenéticamente mais próximos Neisseria meningitidis, N. lactamica, N. cinerea, N. mucosa e Kingella Kingae foram usadas para comparação com a sequência de N. gonorrocae.
1. CCG CCG CTA CCC GGT AC
2 . TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
3. GAG CAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA
A reactividade e especificidade das sonA sequência 1, complementar do rRNA 16S na região 125-150, tem bases de comprimento e uma Tm de 56°C. A sequência 2, complementar do rRNA 16S na região 455-485, tem 21 bases de comprimento e uma Tm de 63°C. A sequência 3, complementar do rRNA 16S na região 980-1015 tem 29 bases de comprimento e uma
Tm de 57°C.
-144-
das para Neisseria gonorrhocae foi demonstrada com um ensaio de hibridação. As três sondas de oligonucleotídeos foram iodinadas e misturadas com oligonucleotídeo não marcados tendo as sequências 5 ' -CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CGG TAT TAG CTG ATC TTT CG-3 1, 51-GCC TTT TCT TCC CTG ACA AAA GTC CTT TAC
AAC CCG-31, 51-GGC ACG TAG TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT AC-31 e 5'-GGT TCT TCG CGT TGC ATC GAA TTA ATC CAC ATC ATC CAC CGC-3‘ e com RNA purificado em fosfato de sódio 0,48M, pH 6,8, 0,5% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e incubado a 60°C durante uma hora. Após incubação, adicionou-se 4 ml de 2% hidroxiapatite, fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 0,02% de SDS e amistura foi incubada a 60°C durante 5 minutos. As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes removidos. Adicionou-se 5 ml de solução de lavagem (fosfato de sódio 0,12M pH 6,8, 2% de SDS) e misturaram-se as amostras, centrifugou-se e removeram-se os sobrenadantes. As quantidades de radioactividade ligada à hidroxiapatite foi determinada num contador gama.
A Tabela 72 mostra que as sondas hibridam bem com RNA de N. gonorrhocae e não hibridam com outras espécies testadas.
Tabela 72
Hibridação das sondas 1-3 de Neisseria gonorroeae com RNAs de Neisseria e Kingella
Organismo ATCC# % Sonda Ligada
Kingella Kingae 23332 0,09
Neisseria cinerea 14685 0,04
N. gonorrhoeae 19424 48,4
N. lactamica 23970 0,07
N. meningitidis serogroup A 13077 0,04
N. meningitidis serogroup B 13090 0,04
N. meningitidis serogroup C 13102 0,04
N. mucosa 19696 0,07
N. subflava 14799 0,05
-145-
Também foram feitos e usados os derivados das sondas de Neisseria que se seguem:
GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG
GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TAA
CCC GCT ACC CGG TAC GTT C
CCG CTA CCC GGT ACG TTC
******
Apesar dos exemplos de funcionamento atrás descritos e determinados usando o protocolo de ensaio convencional préviamente descrito, as sondas específicas podem ser usadas numa grande variedade de condições experimentais. Por exemplo, podem ser incluídos aditivos nas soluções de reacção para proporcionar condições de reacção óptimas para hibridação acelerada. Tais aditivos podem incluir tampões, quelantes, compostos orgânicos e agentes de precipitação de ácidos nucleicos tais como detergentes, di-hidroxibenzeno, dodecilsulf ato de sódio, diisobutilsulfo-succinato de sódio, tetradecilsulfato de sódio, sarcosil e sais de metais alcalinos e sais de amónio de SO-2^, PO-3^, (31-^ e HCOO-1. Tais aditivos podem ser utilizados por alguém familiarizado com a matéria para proporcionar condições óptimas para a reacção de hibridação se desenvolver. Estas condições para hibridação acelerada de moléculas de ácido nucleico de cadeia simples em moléculas de cadeia dupla são o tema do Pedido de Patente U.S.
Νθ de Série 627.795 entregue em 5 de Julho de 1984, a continuação entregue em 4 de Junho, 1987 (n° de série não atribuído ainda) e N2 de Série 816.711 entregue em 7 de Janeiro, 1986, que se entitulam ambas Método de Reassociação Acelerada de Ãcidos Nucleicos.
presente invento pode ser efectuado num organismo não virai a partir de amostras purificadas ou amostras clínicas contaminadas tais com sputum, fezes,tecidos, sangue, líquidos espinais ou sinoviais, soro, urina ou outros fluídos do corpo ou outras amostras tais como amostras do am-146-
biente ou de alimentos. Antes do rebentamento celular e hibridação as células podem ser suspensas ou colocadas em solução. No caso das amostras não purificadas referidas atrás, as células podem permanecer intactas e não tratadas no seu próprio ambiente biológico antes do ensaio.
As sondas do presente invento podem ser usadas num ensaio sozinhas ou em combinação com diferentes sondas. Várias sondas individuais também podem ser ligadas umas às outras durante a síntese dos ácidos nucleicos. Isto resulta numa molécula sonda que contem múltiplas sequências sonda e portanto, múltiplas especificidades. Por exemplo, uma única molécula de ácido nucleico pode ser sintetizada contendo sequências de Mycobacterium avium e de Mycobacterium intracellulare descritas nos Exemplos 1 e 2. Quando hibridada com rRNA de M. avium ou de M. intracellulare esta sonda hibrida totalmente. Se as duas sequências sonda foram combinadas separadamente num ensaio apenas metade das sondas individuais misturadas,hibridará com rRNA de M. avium ou de M. intracellulare. Podem igualmente ser realizadas outras execuções do âmbito das reivindicações. Por exemplo, as sondas podem ser marcadas usando uma variedade de marcas, como aqui descrito e podem ser incorporados em Kits de diagnóstico.
-147-

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES la. - Método para a produção de uma sonda para uso num ensaio de hibridação qualitativo e quantitativo caracterizado por compreender a construção de um oligonucleotídeo que é suficientemente complementar para hibridar com uma região de rRNA seleccionada para ser única para um organismo não-viral ou para um grupo de organismos não-virais que se pretende que sejam detectados, sendo a referida região de rRNA seleccionada por comparação de uma ou mais sequências de rRNA de regiões variáveis do referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais com uma ou mais sequências de rRNA de regiões variáveis derivadas de um ou mais organismos não-virais que se pretende que sejam distinguidos a partir daí.
  2. 2â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas sequências de rRNA de regiões variáveis de organismos não-virais que se pretende que sejam distinguidos, serem do organismo conhecido mais estreitamente relacionado com o referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende que sejam detectados.
  3. 3â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida região de rRNA ser seleccionada de modo a ter pelo menos cerca de uma diferença na seguência de bases relativamente à sequência de rRNA correspondente do organismo conhecido mais estreitamente relacionado com o referido organismo não-viral ou grupos de organismos não-virais que se pretende que sejam detectadas.
  4. 4ê. - Método de acordo com a reivindi cação 1, caracterizado por a referida região de rRNA, ser seleccionada de modo a ter uma diferença na sequência de bases
    -148de 10% ou superior relativamente à correspondente sequência de rRNA do organismo conhecido mais estreitamente relacionado com o referido organismo não virai ou grupo de organismos não-virais que se pretende que sejam detectados .
  5. 5a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida região de rRNA ser escolhida a partir do grupo que consiste em rRNA 5S, 16S e 23S.
  6. 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida região de rRNA ser escolhido a partir do grupo que consiste em rRNA 5,0S, 5,8S, 18S e 28S.
  7. 7a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento.
  8. 8a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 15 nucleotídeos de comprimento.
  9. 9a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.
  10. 10a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
  11. 11a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
  12. 12a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido oligonucleotídeo ter
    -149- pelo menos cerca de 30 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos .
  13. 13§. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento.
  14. 14a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 15 nucleotídeos de comprimento.
  15. 15a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.
  16. 16a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
  17. 17a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
  18. 18a. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 30 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos .
  19. 19a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento.
  20. 20a. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 15 nucleotídeos de comprimento.
    -150-
    215. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento.
    225. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
    235. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
    245. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter pelo menos cerca de 30 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos.
    255. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sonda ser pelo menos cerca de 75% complementar da referida região de rRNA.
    265. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida sonda ser pelo menos cerca de 75% complementar da referida região de rRNA.
    275. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida sonda ser pelo menos cerca de 75% complementar da referida região de rRNA.
    285. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sonda ser perfeitamente complementar da referida região de rRNA.
    295. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida sonda ser perfeitamente complementar da referida região de rRNA.
    -151-
    30â. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida sonda ser perfeitamente complementar da referida região de rRNA.
    31^. - Método para a produção de uma sonda de ensaio de hibridação para um organismo ou organismos não-virais caracterizado por se incluir na referida sonda um oligonucleotídeo de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento em que pelo menos cerca de 10 nucleotídeos contíguos são substâncialmente complementares de pelo menos uma região variável de ácido nucleico seleccionado para ser única para os referidos organismos ou organismos não-virais.
    32^. - Método para a produção de uma sonda de ensaio de hibridação para um organismo ou organismos não-virais caracterizado por se incluir na referida sonda um oligonucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento que é pelo menos cerca de 75% complementar de pelo menos uma região variável de ácido nucleico seleccionado para ser única para os referidos organismo ou organismos não-virais.
    33â. - Método para a produção da sonda de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por o referido ácido nucleico ser rRNA 5S, 16S ou 23S.
    34â. - Método para a produção da sonda de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por o referido ácido nucleico ser rRNA 5,OS, 5,8S, 18S ou 28S.
    35â. - Método para a produção da sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido organismo não-viral ser Mycobacterium avium.
    36ê. - Método para a produção da sonda de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCTCTTGAG.
    375. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se produzir um polímero capaz de hibridar com a sonda da reivindicação 36 ou com o seu complemento.
    385. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre o oligonucleotídeo que compreende a sequência
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG e uma sequência de ácido nucleico complementar do referido polímero.
    395. - Método para a produção deum polímero nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero da estrutura ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG e o complemento para o referido polímero.
    405. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA de espécies Mycobacterium avium na região correspondente às bases 185-225 de E. coli 16S rRNA.
    415. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido hibrido entre um polímero de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 40 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    425. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o organismo não virai ser Mycobacterium intracellular.
    435. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG:
    -153-
    44â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 43 ou com o seu compJenento.
    45â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo que compreende a sequência
    ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    46Q. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero da estrutura ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG e o complemento do referido polímero.
    47â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycobacterium intracellular na região correspondente às bases 185-125 de rRNA 16S de E. coli.
    48â. - Método para a produção de um híbrido de ácidos nucleicos caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 47 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    49â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não-virais serem bactérias do complexo
    Mycobacterium tuberculosis.
    50Q. - Método para a produção de uma son-154- da de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCCTG.
    51a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    TGCCCTACCCACACCCACCACCAGGTGATGT.
    52a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG.
    53a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC.
    54a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG.
    55a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG.
    56a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC.
    57a. - Método para a produção de um po-155- límero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda das reivindicações 50 ou
    51 ou 52 ou 53 ou 54 ou 55 ou 56 ou com os seus complementos.
    58^. _ Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo que compreende um membro do grupo que consiste de oligonucleotídeos de sequências
    TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG,
    TGCCCTACCCACACCCACCACAAGGTGATGT,
    CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG, CTGTCCCTAÀACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC, AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC, CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG, ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCÀCAAGACATGCATC ;
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar da referida sequência.
    59§. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero que compreende um membro do grupo que consiste em polímeros de nucleotídeos de estruturas
    -156-
    TAAAGCGCTTTCCACCACAÀGACATGCATCCCGTG,
    TGCCCTACCCACACCCACCACAAGGTGATGT,
    CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG, CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGÀGGTTAGATGC, AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC, CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAACACATGCATCCCG, ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    60â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o rRNA de espécies incluídas no complexo Mycobacterium tuberculosis na região correspondente às bases 185-225 do rRNA 16S de E. coli.
    61â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeo da reivindicação 60 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido ácido.
    62B. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um número capaz de hibridação com o RNA das espécies incluídas em complexo Mycobacterium tuberculosis na região correspondente às bases 540-575 do rRNA 23S de E. coli.
    63ê. Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referi-157do híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação
    62 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido ácido.
    64a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA de espécies incluídas no complexo Mycobacterium tuberculosis na região correspondente às bases 1155-1190 do rRNA 23S de E. coli.
    65a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 64 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido ácido.
    66a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA de espécies incluídas no complexo Mycobacterium tuberculosis na região correspondente às bases 2195-2235 do rRNA 23S de E. coli.
    67a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 66 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido ácido.
    68a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por o referido organismo não-viral ser o género Mycobacterium.
    69a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 68 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG:
    -158-
    70â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 68 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GGC TTG CCC
    I CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG.
    71â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 68 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC.
    72â. - Método para aprodução de uma sonda de acordo com a reivindicação 68 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GGG CTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC.
    73â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 69 ou 70, 71 ou 72 ou com os seus complementos.
    74ã. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo que consiste nos oligonucleotídeos de sequências
    CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG,
    GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG,
    CAC CGA ATT CGC' CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC,
    GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC;
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar da referida sequência.
    -159\ L ν Λ
    75a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo que consiste de polímeros de nucleotídeos de estruturas
    CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG,
    GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG,
    CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC,
    GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    76a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Mycobacterium na região correspondente às bases 1025-1060 do rRNA 16S de E. coli.
    77a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 76 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    78a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Mycobacterium na região correspondente às bases 1440-1475 do rRNA 23S de E. coli.
    79a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 78 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente comple-160- mentar do referido polímero.
    80a. _ Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Mycobacterium na região correspondente às bases 1515-1555 do rRNA 23S de E. col
    81ã. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 80 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    82â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Mycobacterium na região correspondente às bases 1570-1610 rRNA 23S de E. coli.
    83â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 82 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    84â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por o referido organismo não-viral ser Mycoplasma pneumoniae.
    85â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 84 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC.
    86â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 84 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência:
    AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT.
    -161-
    87a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 84 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT.
    88a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 84 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTACTAT.
    89a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 84, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC.
    90a. _ Método para a produção deum polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímerocapaz de hibridação com as sondas das reivindicações 85 ou 86 ou 87 ou 88 ou 89 ou com os seus complementos.
    91a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído por oligonucleotídeos da sequência:
    GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC,
    AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT,
    CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT,
    TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT, and
    CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC;
    -162e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    925. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituido por polímeros de nucleotídeos das estruturas,
    GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC,
    AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT, cagtcaaactctagccattacctgctaaagtcatt,
    TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT, and
    CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACÀAGCTGGCGAC;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    935. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycoplasma pneumoniae na região compreeendendo às bases 190-230 do rRNA 16S de E. coli.
    945. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 93 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    955. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycoplasma pneumoniae na região correspondente às bases 450-490 do rRNA 16S de E. coli.
    -163-
    96 a. - Método para a preparação de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 95 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    9 7a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycoplasma pneumoniae na região correspondente às bases 820-860 do rRNA 16S de E. coli.
    98a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 97 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    99a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycoplasma pneumoniae na região correspondente às bases 1255-1290 do rRNA 16S de E. coli.
    100a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 99 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    101a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Mycoplasma pneumoniae na região correspondente às bases 65-120 do rRNA 5S de E. coli.
    102a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 101 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    103â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por os referidos organismos não-virais serem do género Legionella.
    104a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC:
    105a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência:
    GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC:
    1061. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG
    1071. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GCGGTACGGTTCTCTATAAGTTATGGCTAGC
    108a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT
    109a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 103, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    -165
    CACTCTTGGTACGATGTCCGAC
    HOâ. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 104 ou 105 ou 106 ou 107 ou 108 ou 109 ou com os seus complementos.
    111a. - Método para a produção de um híbrido de ácidos nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituido por oligonucleotídeos das sequências taccctctcccatactcgagtcaaccagtattatctgacc, GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC, CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG, GCGGTACGGTTCTCTATAAGTTATGGCTAGC, GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT, CACTCTTGGTACGATGTCCGAC;
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    112^. _ Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituido por polímero de nucleotídeos com as estruturas
    -166-
    TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC,
    GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC,
    CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCÀAGGGTAGGTAAGG,
    GCTGTACGGTTCTCTATAATGTATGGCTAGC t
    GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT,
    CACTCTTGGTACGATGTCCGAC ,· e os complementos dos referidos polímeros.
    113a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o rRNA de género Legionella na região correspondente às bases 630-675 do rRNA 16S de E. coli.
    114ã. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 113 e uma sequência do ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    115â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Legionella na região correspondente às bases 975-1020 do rDNA 16S de E. coli.
    116a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação
    115 e uma seguência de áci^o nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    -167-
    117â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Legionella na região correspondente às bases 350-395 do rRNA 23S de E. coli.
    118a. _ Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 117 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    119a. _ Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Legionella na região correspondente às bases 1585-1620 do rRNA 23S de E. coli
    120â. _ Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 119 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    121â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Legionella na região correspondente às bases 2280-2330 do rRNA 23S de E. coli.
    122â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 121 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    123â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido organismo não virai ser Chlamydia trachomatis.
    -168
    124â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência.
    CCGACTCGGGGGTTGAGCCCATCTTTGACAA.
    125Q. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGACCATC.
    126â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTGCTCCGTTCGA
    127â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCATTCG.
    128ã. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC.
    129â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG.
    130â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    -169
    CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG.
    1315. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CGAAGATTCCCCCTTGATCGCGACCTGATCT.
    1325. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG.
    1335. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 123, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG.
    1345. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com as sondas, das reivindicações 124 ou 125 ou 126 ou 127 ou 128 ou 129 ou 130 ou 131 ou 132 ou 133 ou com os seus complementos.
    1355. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído pelos oligonucleotídeos da sequência.
    -170CCGACTCGGGGTTGAGCCCATCTTTGACAA,
    TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGÀCCATC, CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTGCTCCGTTCGA, CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCAGATTCG, CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC,
    GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG,
    CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG,
    CGAAGATTCCCCTTGATCGCGACCTGATCT,
    CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG, TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG;
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    136a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído pelos polímeros de nucleotídeos das estruturas
    -171TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGACCATÇ,
    CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTG CTCCGTTCGA,
    CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCACATTCG,
    CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC,
    GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG,
    CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG,
    CGAAGATTCCCCTTGATCGCGACCTGATCT,
    CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG,
    TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    1375. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 60-105 do rRNA 16S de E. coli.
    1385. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 137 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1395. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 175-210 do rRNA 16S de E. coli.
    1405. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido hibrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 139 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do refe-172-
    141a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 600-635 do RNA 16S de de E. coli.
    142a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 141 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polimero.
    143a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 830-870 do rRNA 16S de E. coli.
    144a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 143 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1453. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 275-320 do rRNA 23S de E. coli.
    146a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação
    145 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    -173-
    147§. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 330-365 do rRNA 23S de E. coli.
    1482. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 147 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1492. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Cglamydia trachomatis na região correspondente às bases 1160-1190 do rRNA 23S de E. coli.
    1502. - Método para a produção de um hibrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 149 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1512. - Método para a produçõa de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 1450-1490 do rRNA 23S de E. coli.
    1522. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação
    151 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1532. - Método para a produção de um
    -174- polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 1510-1545 do rRNA de E. coli.
    154a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 153 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    155a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Chlamydia trachomatis na região correspondente às bases 1710-1750 do rRNA de E. coli.
    156a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 155 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    157a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido organismo não virai ser Campylobacter.
    158a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 157, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC.
    159a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 157, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCTTAGGTACCGTCAGAATTCTTCCC.
    175160a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 157 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GCCTTCGCAATGGGTATTCTTGGTG.
    161â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 157, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG.
    162a. - Método para a produção de um polímero nucleotídeo caracterizado por se obter um polímmero capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 158 ou 159 ou 160 ou 161 ou com os seus complementos.
    163a. - Método para a produção de um hibrido de acido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreender um membro do grupo constituído por oligonucleotídeo da sequência
    CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC,
    CCT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC,
    GCCTTCGCAATGGGTATTCTTGGTG, and
    GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGGj e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    164a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído por polímeros de nucleotídeos das estruturas
    -176-
    CGC TCC GÀÃ AAG TGT CAT CCT CCr CGT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC, GCCTTCGCAATGGGTATTCTTGGTG, and GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    165a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Campylobacter na região correspondente às bases 405-428 do rRNA 16S de E. coli.
    166 a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 165 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    167a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Campylobacter na região correspondente às bases 440-475 do rRNA 16S de E. coli.
    168a. - Método para a produção de um hibrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 167 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    169a.'- Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero
    -177- capaz de hibridação com o RNA do género Campylobacter na região correspondente às bases 705-735 de rRNA 16S de E. coli.
    170â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 169 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    171â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Campylobacter na região correspondente às bases 980-1010 do rRNA 16S de E. coli.
    172a. _ Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeo da reivindicação 171 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    173â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não virais serem o grupo sub-genérico de Streptococci conhecido como enterococci.
    174a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 173, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA.
    175ê. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o complemento da sonda da reivindicação 174.
    176a. _ Método para a produção de um híbrido de acido nucleico caracterizado por se formar o referi-178- do híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo a sequência TGCAGCACTGGAGGGGGGAAACCCTCCAACACTTA e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo .
    1771. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero com a estrutura
    TGC AGC ACT GAA GGG GGG AAA CCC TCC AAC ACT TA e o complemento do referido polímero.
    1781. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo sub-genérico de Streptococci conhecido como enterococci na região corresponndente às bases 825-860 do rRNA 16S de E. coli.
    1791. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 178 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1801. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não virais serem o grupo sub-genérico conhecido como Pseudomonas do Grupo I.
    1811. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 180, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT.
    1821. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 181 ou com o seu complemento.
    -179-
    1835. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo a sequência CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    1845. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos da estrutura
    CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT e o complemento do referido polímero.
    1855. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo sub-genérico conhecido com Pseudomonas do grupo I na região corrrespondente às bases 365-405 do rRNA 23S de E. coli.
    1865. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 185 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1875. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido organismo não-viral ser Enterobacter cloacae.
    1885. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 187, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC.
    1895. - Método para a produção de polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 188 ou com o seu complemento.
    -180-
    1901. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído por oligonucleotídeo da sequência. GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    1911. - Método para a produção de um polímero de oligonucleotídeos caracterizado por se obter um polímero de estrutura GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC.
    e o complemento do referido polímero.
    1921. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Enterobacter cloacae na região correspondente às bases 305-340 do rRNA 23S de E. coli.
    1931. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 192 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    1941. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o organismo não-viral ser Proteus mirabilis.
    1951. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 194, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC.
    1961. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um políme-181I ro capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 195 ou com o seu complemento.
    197â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo a sequência CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC.
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    198a. „ Método para a produçõa de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero de estrutura
    CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC e o complemento do referido polímero.
    199â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Proteus mirabilis na região correspondente às bases 270-305 do rRNA 23S de E. coli.
    200â. _ Método para a produçõa de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 199 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    201^. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não-virais serem do género Salmonella.
    202â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 201, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC.
    203â. - Método para a produção de uma
    182sonda de acordo com a reivindicação 201, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A.
    204^. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 202 ou 203 ou com o seu complemento.
    205â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído por oligonucleotídeos da sequência. CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC
    CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A;
    e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    206â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído por polímeros de nucleofídeos das estruturas
    CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC
    CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A; e os complementos dos referidos polímeros.
    207â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Salmonella na região correspondente às bases 1125-1155 do rRNA 16S de E. coli.
    208â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação
    207 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    -183-
    2095. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do género Salmonella na região correspondente às bases 335-375 do rRNA 23S de E. coli.
    2105. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido, entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 209 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    211^. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido organismo não-viral ser Escherichia coli.
    2125. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 211, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG.
    2135. Método para a produção de um polímero caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com a sonda da reivindicação 212 ou com o seu complemento .
    2145. - Método para a produção de um hibrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo a sequência GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGC e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    2155. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero da estrutura
    GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG e o complemento do referido polímero.
    -184-
    216a. _ Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Escherichia coli na região correspondente às bases 995-1030 do rRNA 16S de E.
    coli.
    217a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 216 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complmentar do referido polímero.
    218a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não-virais serem do grupo filogenético das bactérias.
    219â. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCA TCG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC.
    220a. _ Método para a produçõa de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG.
    221a. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT.
    222a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG.
    -185-
    223^. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG.
    224a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GGA CGG TTA TAG TTA CGG CCG CC.
    225a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 218, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C.
    226®. _ Método para a produção de um polímero nucleotídico caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 219 ou 220 ou 221 ou 222 ou 223 ou 224 ou 225 ou com os seus complementos .
    227â. _ Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituido por oligonucleotídeo das sequências
    CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC, CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG, GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT, GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG, GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG, GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC,
    GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG, GAA TTT CGC TAC Cí
    -186- e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente similar relativamente ao referido híbrido.
    228a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído por polímeros de nucleotídeos das estruturas
    CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC, CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT, GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG, GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG, GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC, GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC
    e os complementos dos referidos polímeros.
    229a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético das bactérias na região correspondente às bases 330-365 de rRNA 16S de E. coli.
    230a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 229 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    231ê.„ - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero
    -187capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenetico das bactérias na região correspondente às bases 675-715 do rRNA 16S de E. coli.
    2325. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 231 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    2335. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenetico das bactérias na região correspondente às bases 1080-1110 do rRNA de E. coli.
    2345. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 233 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    2355. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético das bactérias na região correspondente às bases 460-490 do rRNA 23S de E. coli.
    2365. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 235 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    2375. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético das
    -188- bacterias na região correspondente às bases 1050-1080 do rRNA
  21. 23S de E. coli.
    2382. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 237 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    2392. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos, caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético das bactérias na região correspondente às bases 1900-1960 do rRNA 23S de E. coli.
    2402. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 239 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    2412. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos organismos não-virais serem fungos.
    2422. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG.
    2432. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCCGACCGTCCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC.
    2442. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241 caracterizado por o re-189- ferido oligonucleotídeo compreender a sequência CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG.
    245a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241 caracterizado por os referidos oligonucleotídeos compreendenrem a sequência CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TGT GG.
    246a. - Método paraa produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241, caracterizadopor o referido oligonucleotídeo compreender a sequência
    GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC AAC AAG G.
    247a. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 241, caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GCT CTG CAT TCA AAG GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC AGG G.
    248a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 242 ou 243 ou 244 ou 245 ou 246 ou 247, ou com os seus complementos .
    249a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico, caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído por oligonucleotídeos das sequências:
    CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG,
    CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC
    CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG
    CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TAT GG,
    GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC AAC AGGG,
    GCT CTG CAT TCA AAC GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC AGGG,
    -190- e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido oligonucleotídeo.
    250â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído por polímeros de nucleotídeos das estruturas
    CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG,
    CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC
    CCCGACCGTCCCTATTAATCÀTTACGATGG
    CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TAT GG,
    GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC ÀAC
    AGG G,
    CCT CTG CAT TCA AAC GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC e os complementos dos referidos polímeros.
    251â. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético dos Fungi na região correspondente à posição 845-880 do rRNA 18S de Saccharomyces cerevisiae.
    252â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 251 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    253a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero
    -1911 capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético dos Fungi na região correspondente à posição 1960-2000 do rRNA 28S de
    Saccharomyces cerevisiae.
    254â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 253, e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    255â. - Método para a produção de um polímero nucleotídico caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA do grupo filogenético dos Fungi na região correspondente â posição 1225-1270 do rRNA 28S de Saccharomyces cerevisiae.
    256â. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 255 e um ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    257â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por o organismo não virai ser Neisseria gonorrhocae.
    258§. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCG CCG CTA CCC GGT AC.
    259^. _ Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC.
    260â. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicaçõa 257 caracterizado por o
    -192- referido oligonucleotídeo compreender a sequência GAG CAT TCC
    GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA.
    2611. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG.
    2621. - Método para a produção de uma sonda deacordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TAA.
    2631. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCC GCT ACC CGG TAC GTT C.
    2641. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 257 caracterizado por o referido oligonucleotídeo compreender a sequência CCG CTA CCC GGTAC GTTC.
    2651. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero de nucleotídeos capaz de hibridação com as sondas das reivindicações 258 ou 259 ou 260 ou 261 ou 262 ou 263 ou 264 ou com os seus complementos.
    2661. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um oligonucleotídeo compreendendo um membro do grupo constituído por oligonucleotídeo das sequências.
    CCGCCGCTACCCGGTAC,
    TCATCGGCCGCCGATATTGGC,
    GAGCATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTA,
    GAGGATTCCGCACATGTCAAAACCAGG,
    GAGGATTCCGCACATGTCÀAAACCAGGTAA,
    CCCGCTACCCGGTACGTTC,
    CCGCTÀCCCGGTACGTTC í e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complemen tar do referido oligonucleotídeo.
    2675. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero compreendendo um membro do grupo constituído por políme ros de nucleotídeos das estruturas
    CCGCCGCTACCCGGTAC,
    TCATCGGCCGCCGATATTGGC,
    GAGCATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTA,
    GAGGATTCCGCACATGTCAAAACCAGG,
    GAGGATTCCGCÀCATGTCAAAACCAGGTAA,
    CCCGCTACCCGGTACGTTC,
    CCGCTÀCCCGGTACGTTC;
    e os complementos dos referidos polímeros.
    -194-
    268a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridaçõa com o RNA da espécie Neísseria gonorrhocae na região correspondente às bases 125-150 do rRNA
    16S de E. coli.
    269a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 268 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    270a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Neisseria gonorrhocae na região correspondente às bases 455-485 do rRNA 16S de E. coli.
    271a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 270 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    272a. - Método para a produção de um polímero de nucleotídeos caracterizado por se obter um polímero capaz de hibridação com o RNA da espécie Neisseria gonorrhocae na região correspondente às bases 980-1015 do rRNA 16S de E. coli.
    273a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 272 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    274â. - Método para a produção de uma
    -195- sonda de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por o refeido oligonucleotídeo ser perfeitamente complementar da referida região do rRNA.
    2751. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido oligonucleotídeo ter cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
    2761. - Método para a produção de uma sonda de acordo com a reivindicaçõa 31 caracterizado por o referido oligonucleotídeo ser pelo menos cerca de 95% complementar de uma região do rRNA.
    2771. - Método para a realização de um ensaio de hibridação caracterizado por compreender (1) reacção de qualquer rRNA de uma amostra a ser testada para um organismos ou organismos não-virais e uma sonda oligonucleotídica de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento que é pelo menos cerca de 75% complementar de uma região variável do rRNA seleccionada para ser única para o organismo ou organismos não-virais, (2) sob condições tais que possa ocorrer hibridação entre a sonda oligonucleotídica e qualquer amostra de rRNA suficientemente complmentar e (3) a observação e/ou a medição da referida hibridação.
    2781. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado pora referida hibridaçõa entre a sonda oligonucleotídica e qualquer rRNA alvo de amostra vai pelo menos de cerca de 10% até cerca de 100%.
    2791. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicaçõa 277 caracterizado por a referida sonda oligonucleotídica ser cDNA.
    2801. - Método para a realização de um
    -196- ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por as referidas condições incluírem uma temperatura entre cerca de
  22. 25° abaixo de Tm e cerca de 1°C abaixo de Tm.
    2815. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por compreender ainda o ensaio paralelo de uma temtemunha homóloga, positiva, ou de uma testemunha heteróloga ou de ambas.
    2825. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por compreender ainda o ensaio paralelo de uma testemunha negativa.
    2835. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicaçõa 277 caracterizado por as referidas condições incluírem agentes para taxas de hibridação melhoradas.
    - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por as referidas condições serem de modo a promover hibridação máxima entre a sonda oligonucleotídica e qualquer amostra de rRNA complementar e reactividade cruzada mínima entre a sonda oligonucleotídica e qualquer amostra de rRNA não complementar.
    2855. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicaçõa 277 caracterizado por a referida sonda oligonucleotídica ser marcada.
    2865. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 285 caracterizado por a referida sonda oligonucleotídica estar marcada com um traçador isotópico, não isotópico ou quimioluminescente.
    2875. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicaçõa 277 caracterizado por compreender ainda a libertação do rRNA a partir das células
    -197 do referido organismo ou organismos não-virais antes do passo de reacção.
    288§. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por os referidos organismos ou organismo não-virais são Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, as bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis género Mycobacterium,Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter, Proteus Mirabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, E. coli, grupo I de Pseudomonas, bactérias ou fungos.
    289ã. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por a referida sonda oligonucleotidica marcada tem cerca de 20 nucleotídéos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento.
    290^. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por a sonda oligonucleotidica marcada ser pelo menos cerca de 95% complementar da referida região variável do rRNA.
    291â. - Método para a realização de um ensaio de acordo com a reivindicação 277 caracterizado por compreender ainda o uso de uma ou mais sondas oligonucleotídicas adicionais de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento e que são pelo menos cerca de 75% complementares de uma ou mais regiões variáveis adicionais do rRNA seleccionadas para serem únicas para os referidos organismos não virais.
    292â. _ Método para a realização de um ensaio de acordocom a reivindicação 277 caracterizado por compreender ainda o uso de uma ou mais sondas adicionais que identificam um ou mais organismos não-virais adicionais, expandindo assim o grupo de organismos não-virais a serem testados.
    -198-
    293§. _ Método para a produção de uma sonda ou combinação de sondas para usar num ensaio de hibridação qualitativa ou quantitativo caracterizado por compreender a construçõa de um polímero de nucleotídeos que é suficientemente complementar para hibridar uma região de DNA ou rRNA seleccionado para distinguir um organismo ou grupo de organismos alvos não-virais que se pretende sejam detectados entre pelo menos um organismo ou grupos de organismos que não sendo alvos possam estar presentes numa amostra, sendo a referida região de DNA ou rRNA seleccionada por: comparação de uma ou mais sequências de DNA ou rRNA do referido organismo não-viral ou do grupo de organismos não-virais que se pretende sejam detectados com uma ou mais sequências de DNA ou rRNA dos referidos organismos ou grupo de organismos que não são alvos;
    alinhamento das sequências de DNA ou rRNA do referido organismos não-viral ou grupo de organismos não-virais para homologia com as referidas sequências de DNA ou de rRNA do referido organismo ou grupo de organismos que não são alvos de modo a identificar regiões de homologia;
    selecção do referido polímero de nucleotídeos tornando máxima a homologia do referido oligonucleotídeo sonda relativamente às regiões do referido DNA ou rRNA do referido organismos não-viral ou grupo de organismos nãovirais que se pretende sejam detectados ao mesmo tempo que minimiza a homologia do referido polímero de nucleotídeos relativamente a sequências de DNA ou de rRNA do referido organismo ou grupo de organismos não alvos que se pretende sejam distinguíveis deste modo.
    294â. - Método de acordo com a reivindicação 293 caracterizado por o referido organismo ou grupo de organismos não alvos serem familiares filogenéticos chegados do referido organismo ou grupo de organismos alvos.
    199-
    2955. - Método de acordo com a reivindicação 292 caracterizado por o referido polímero de nucleotídeos ser pelo menos cerca de 90% homólogo das regiões do referido DNA a rRNA do referido organismos não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende sejam distinguidos.
    2965. - Método de acordo com a reivindicação 292 caracterizado por o referido oligonucleotídeo sonda ser menos do que cerca de 90% homólogo das sequências de DNA ou rRNA dos referidos parentes filogenéticos chegados que se pretende sejam distinguidos a partir daqui.
    2975. - Método de acordo com a reivindicação 293 ou 294 ou 295 ou 295 ou 296 caracterizado por compreender ainda o outro passo de verificação da não reactividade cruzada com a sonda através de hibridação da referida sonda oligonucleotídica com um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende sejam distinguidos pela referida sonda.
    2985. - Método para a produção de uma sonda para uso num ensaio de hibridação gualitativo ou quantitativo caracterizado por compreender a construção de um oligonucleotídeo que é suficientemente complmentar para hibridar com uma região de DNA ou de rRNA seleccionada de modo a ser única para um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende que sejam detectados, sendo a referida região de DNA ou de rRNA seleccionada por: comparação de uma ou mais sequências de DNA ou rRNA do referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais gue se pretende sejam detectados com uma ou mais sequências de DNA ou rRNA dos seus parentes filogenéticamente mais próximos ;
    alinhamento das referidas sequências de DNA ou de rRNA do referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais para homologias com as referidas seguências de DNA ou rRNA dos referidos parentes filogenéticos mais próximos, de modo a
    -200- revelar as regiões hipervariáveis de DNA ou rRNA entre espécies ;
    selecção do referido oligonucleotídeo sonda na referida região hipervariável entre espécies tornando máxima a homologia do referido oligonucleotídeo sonda com as regiões do referido DNA ou rRNA do referido organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende sejam detectados ao mesmo tempo que se minimiza substâncialmente a homologia do referido oligonucleotídeo sonda com as sequências de DNA ou rRNA dos referidos parentes filogenéticos mais próximos que se pretende sejam distinguidos a partir daqui.
    299â. - Método de acordo com a reivindicação 298 caracterizado por a referida sonda oligonucleotídica ser pelo menos cerca de 90% homóloga das regiões da referida DNA ou rRNA do referido organismo não-viral ou grupos de organismos não-virais que se pretende sejam detectados.
    300^. - Método de acordo com a reivindicação 298 caracterizado por o referido oligonucleotídeo sonda ser menos de 90% das sequências de DNA ou rRNA dos referidos parentes filogenéticos mais próximos que se pretende sejam distinguidos a partir daqui.
    301â. - Método de acordo com a reivindicação 298 ou 299 ou 300 caracterizado por compreender ainda o passo de verificação de reactividade não cruzada da referida sonda por hibridação do referido oligonucleotídeo sonda com um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais que se pretende sejam distinguidos pela referida sonda.
    302â. - Método para a produção de uma sonda caracterizado por se incluir na referida sonda um polímero de nucleotídeos que é capaz de hibridação com o rRNA tipo 16S de um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais na região correspondente às bases 60-100 do rRNA 16S de E. coli.
    -201-
    3035. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 302 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    304.& - Método para a produção de uma sonda caracterizado por se incluir na referida sonda um polímero de nucleotídeos que é capaz de hibridação com o rRNA do tipo 16S de um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais na região correspondente às bases 120-150 do rRNA 16S de E. coli
    305a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 304 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    306a. _ Método para a produção de uma sonda caracterizado por se incluir na referida sonda um polímero de nucleotídeos que é capaz de hibridação com o rRNA do tipo 16S de um organismo não-viral ou grupo de organismos nãovirais na região correspondente às bases 170-230 do rRNA 16S de E. coli.
    307a. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 306 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    308â. - Método para a preparação de uma sonda caracterizado por se incluir na referida sonda um polímero de nucleotídeos que é capaz de hibridação com rRNA tipo
    16S de um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais na região correspondente às bases 405-480 do rRNA 16S de E. col:
    -202-
    3092. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 308 e uma sequência do ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
    3102. - Método para a produção de uma sonda caracterizado por se incluir na referida sonda um polímero de nucleotídeos que é capaz de hibridação com rRNA do tipo 16S de um organismo não-viral ou grupo de organismos não-virais na região correspondente às bases 600-670 do rRNA 16S de E. coli.
    3112. - Método para a produção de um híbrido de ácido nucleico caracterizado por se formar o referido híbrido entre um polímero de nucleotídeos da reivindicação 310 e uma sequência de ácido nucleico substâncialmente complementar do referido polímero.
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