JPH06502305A - 腔感染症に関連する微生物を検出するために有用な方法及び薬学キット - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 腟感染症に関連する微生物を検出するために有用な方法及び薬学キット 技術分野 本発明は開業医又はより組織化された臨床環境、例えば病院、営利的臨床微生物 学研究所等において利用されつる細菌性肺病（ｖａｇｉｎｏｓｉｓ）を診断する ための方法に関連する。更に、生物学的サンプル中のガードネレラ　バギナリス （Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉ ｄａ）種、及びトリコモナス　バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉ ｎａｔｉｓ）の同時検出方法を提供する。

発明の背景 細菌性肺病（ＢＶ）は女性の腟領域の微生物叢（フローラ）の変化を特徴とする 。この変化は正常時に存在しているラクトバチリこの症状を解明する研究の試み の際に、この疾患の名称は進化を遂げている。２０世紀の最初の２５年の間はこ れは「帯下Ｊ　（ｌｅｕｋｏｒｒｈｅａ）と呼ばれていた。その後、医師はこの 疾患を「非特異的膣炎Ｊ　（ＮＳＶ）と呼ぶようになった。ＮＳＶなる語の散発 的な利用は未だ残っている。

１９５５年におけるＧａｒｄｎｅｒとＤｕｋｅｓによる研究の公開の後の数年間 にわたり、Ｇ　バギナリスが唯一のＢＶの原因であると信じられており、従って この疾患はガートネレラ　バギナリス腟炎として知られていた。しかしなからそ の後の研究は、Ｇ、バギナリスは正常な女性の１０〜５０％において、微生物培 養により検出されうることが急速に確証された。数人の頑固な著者は、且、バギ ナリスが唯一のＢＶの原因であるという信念に固執し、そして、Ｇ、バギナリス の存在が必ずしも疾患状態を指標するものではないという多量の証拠の公開にも かかわらずこの信念に適合する上記の語を利用し続けている。１９８０年代にお いて、「細菌性腟病」なる語が論文に記載され、そしてこの語は特に、この疾患 を診断するために現状類りにされている臨床的基準に関連付けされている。ＢＶ は単独の種類の生物に原因するのではなく、従って現状唯一の基準である微生物 培養によって診断されることはできない。更に、ＢＶの診断のための推奨されて いる臨床基準は培養を含んでいない。

ＢＶの臨床スペクトルは、無症候性から明かなる悪臭及び多量の分泌に至るまで に変化する。ＢＶの病的状態は最近まで、その身体的な病的状態よりはむしろ、 その症状の高い有病率及び関連する清心的窮迫により判断されていた。しかしな がら、ＢＶの結果としての細菌の上昇した腟内濃度及びより有害な微生物叢への 移行は、ＢＶ陽性女性かいくつかの有害な妊−結果、例えば絨毛性膵炎、羊水感 染症及び産褥感染病的状態にかかり易いことを示した。ＢＶは早産（即ち、予定 日の３〜５週間前での出産）、骨盤炎症病、分娩後子宮内膜炎、菌血症、卵管症 等にも関連する。これらの関連症状のうちのいくつか（例えば多微生物上部生殖 管感染症）は推測のままであり続けている）。

ＢＶは身体検査単独により、又は症状の説明との関連によっては正確に診断する ことかできない。ＢＶを診断する現状の「ゴールドスタンダード」法は４つの基 準の試験を含んでいる：ｌ）手がかりとなる（ｃｌｕｅ）細胞の存在（顕微鏡に より決定）、２）白色又は灰色の粘着性均質分泌物、３）膣液のｐＨ＞４．５、 及び ４）膣液を１０％の水酸カリウム（ＫＯＨ）と混ぜたときの生臭いアミン臭気。

これらの基準はＢＶを診断するため、種々の研究者により異なる手法で利用され ている。一つの手法において、手がかり細胞とその他の３つの指標のうちの２つ の存在が必要とされる。他の手法のもとで診断されたＢＶ患者はこの４つの指標 のうちの３つを示さなくては手かかりとなる細胞の同定は特別な技術を必要とし 、なぜならかかる細胞を、顕微鏡で観察されうる他のものと区別することは難し いからである。手がかり細胞は、大量の細菌がそれに結合している腕上皮細胞で あり、従ってこの手がかり細胞が顕微鏡のもとでぼやけて観察される。近年の研 究は、細菌、例えばＧ、バギナリス、及びモビルンカス（Ｍｏｂｉ　Ｉｕｎｃｕ ｓ）種を含む嫌気性種が腕上皮細胞に結合し、これにより手がかり細胞を形成す ることを提唱している。

腟のｐＨの上昇は種々の理由のために起こりうる。例えば、トリフ−ｖ−−ｒ、 ｔ　バギナリスによる感染症又は子宮順炎及びＢＶは、腟のｐＨ上昇をもたらし つる。ｐＨはあらゆる変化に大いに依存するための、これはＢＶに関する劣った 特異性を示す感受性パラメーターである。８ｖを診断するためにｐＨを単独で利 用することは、４７％ぐらいの高い偽陽性の率をもたらしつる。

実際、医師は一般に彼らの個人の診療室ではｐＩ（及びアミン臭気検査は行なっ ていない。更に、手かかりとなる細胞を正確に同定するのに必要な技術を有する 医師は稀である。従って、このゴールドスタンダード試験は個人の開業医におい てはほとんど利用されていない。

調査プロトコールにおいて主として利用されているＢＶを診断するだめの他の方 法はダラム染色である。この診断は実施するのか難しく、従って開業医における 利用には不適切である。ダラム染色の正確な解析は特別な訓練を必要とし、なぜ ならダラム染色分析は手かかり細胞と、前記した腟微生物表の移行の両方の観察 を含んでいるからである。更に、この技術は感度が悪く、且つゴールドスタンダ ード方法よりＢＶに対する特異性か低い。

現在、一部の医師は診療室での腟検査に関してウェットマウントを利用している 。患者の膣液より調製したスライドか医師により目視検査されている。このよう な難しい観察をするのに馴れた医師によりＢＶ陽性患者か検査されると、かかる スライドは大きな桿状であるラクトバチリの通常のレベルの非存在、並びにガー ドネレラ　バギナリス（ＧＶ）　、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ） 及びモビルンカス種を含む小さな桿状細菌の多量の存在か示すであろう。前者の ２種類の細菌は直線桿形態を有し、後者の細菌は曲線型環形態を示す。

一部の医師は、ウェットマウント分析を介して手がかり細胞か同定されうるもの と信じているが、しかしかかる同定の手段は一般に適切であると認められていな い。

はじめて単離された頃、Ｇ、バギナリスはへモフィルス　バギナ’）　７．　（ ｔ（ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｖａｇｉｒａｌｉｓ）と呼ばれていた。その後、旦 、とエナリスはコリネバクテリア　バギナリスに再分類された。最終的に、Ｇ、 バギナリスは新しい属ガードネレラの中に入れられ、なぜならこれは最初の２つ の分類のいづれにも適切に属さないからである。

サンプル中に存在しているＧ、バギナリスの量がＢＶの指標であるかを調べるた めのいくつかの研究か試まれでいる。彼らは、ＢＶ陽性の女性は平均してＢＶＩ Ｉ性の女性に比べて高いレベルのＧ、バギナリ存在していることが見い出され、 従ってＧ、バギナリスのｗ胞しベルは疾患状態の決定的な証拠とはならないこと になる。Ａ＋＋＋ｓｅｌ　ら著、もしＢＶ陽性女性が妊婦でないならば、ＢＶを 処置するのにメトロニダゾールか最もよく処方されている。メトロニダゾールを 利用する利点は、この医薬品がトリコモナス　バギナリスに対しても活性である ことにある。もしＢＶ陽性女性が妊婦であるならば、この患者か第一トリメスタ ーを経ている場合にメトロニダゾールを処方することができる。他方、タリンダ マイシンは妊婦中いつでも処方されうる。

ＢＶは腟の病気の一つの一般的な原因である。かかる症状に一般に関連するその 池の微生物はキャンディダ種及びトリコモナス　バギ発明の概要 本発明は迅速で正確なりＶを診断するための方法を提供し、これは結果を評価す るために手がかり細胞を同定する、ウェットマウントを評価する等における個人 の熟練を必要としない。本発明の方法は、腟のサンプルのｐＨを測定する：及び このサンプルの中に含まれている旦、バギナリス細胞のおよその数を測定するこ とを含み、ここで、ｐＨ値は約４．５より高く、そしてＧ、バギナリス細胞の数 が基準Ｇバギナリス細胞数より高い又は等しいとき、この患者がＢＶ陽性である ことを示唆する。これらの方法は手動で、又は自動化工程に組込むことができる 。

るための固相アッセイ技術も採用し、且、バギナリスの高いレベルは、約４．５ 以上の腟ｐＨと組合さって、Ｂｖ陽性状態を示す。かかる手順は約６時間又はそ れ以内において好適に成し遂げられる。

できる。更に、本発明のキットの９．バギナリス細胞しベル指示品はそれらに結 合していることができる。

好ましいＧ、バギナリス細胞数指示品は、診断用ディツプスティックである。こ のような９．バギナリス指示品は好ましくは、オリゴヌクレオチド又は抗体が結 合することのできる又は結合したビーズを含む。

本発明の第２の態様において、生物学的サンプル中のガードネレンブルの中に存 在しうる原核及び真核細胞を溶解溶液に暴露せしめることを含む。この溶液は単 独で、又は第１ハイブリダイゼーシヨン溶液と組合さって、標的核酸を遊離させ る。溶解溶液中のサンプルを第１ハイブリダイゼーシヨン溶液及びデイツブステ ィッつてあってそれに捕捉オリゴヌクレオチドコート化ビーズか結合しているも のと組合せる。このディツプスティックは、ガードネレラ　バギナリス、キャン ディダ種及びトリコモナス　バギナリスの核酸と特異的にハイブリダイズするこ とのできる少なくとも３種のビーズを含んでいる。このビーズ上に捕捉された標 的核酸を、この３種の標的微生物と特異的にハイブリダイズすることのできるシ グナルすりゴヌクレオチドを用いて検出する。ガードネレラ　バギナリス、キャ ンディダ種及びトリコモナス　バギナリスの同時検出のためのキットも提供する 。このキットはガードネレラ　バギナリス、キャン二工１種及びトリコモナス　 バギナリスの特異的捕促することのできるｌ又は複数のディツプスティック、並 びにこの３種の標的微生物に特異的にハイブリダイズすることのできる少なくと も２種のシグナルオリゴヌクレオチドを含んでいる容器を含んでいる。

発明の詳細な説明 本発明はＢＶの診断において有用な方法及びキットに関する。本発明の方法は、 患者から得られる腟のサンプルのｐＨを決定する、及びこのサンプル中に含まれ ているＧ、バギナリス細胞のおよその数を決定する段階を含む。４．５より高い ｐＨ値を、基準のＧ　バギナリス細胞数より多く又はそれに等しいＧ、バギナリ ス細胞数と共に存している患者のサンプルは、この患者がＢｖ陽性であることを 示す。

はとんとの場合において、ＢＶを伴う女性における腟のｐＨはｐｉ（４，５より 高く、他方ＢＶｉ、：（！Ｉシて臨床的に陰性である女性の腟ｐＩ（はほとんど 常に４．５以下である。しかしながら、ｐＨ単独ではＢＶに間して診断てきず、 その理由はその他の症状か高い腟ｐＨをもたらしうるがらである。ＢＶを存する 女性はその腟管に高いレベルのＧ、バギナリスを存するか、それを単独で採用す ることは、ＢＹの優れた指標とはいえず、その理由はＢＶ陰性女性がその腟にお いて高いレベルのＧ、バギｔ　＋Ｊ　ｙ、をよく存しているためである。本発明 は細菌性腟病の指標としての患者のサンプルにおけるｐＨ及びＧ、バギナリスの 迅速な測定を可能とする。

本発明は、腟サンプルにおける９Ｈ＞４．５と高いレベルのＧ、バギナリスとの 組合せか、たとえ単独で採用する各パラメーターか診断的でないにしても、ＢＶ に関して診断的であるという発見を利用している。ｐＨに関する関連のｐＨ（即 ち、ｐｆ（＞４．５）は、ｅＶの診断のための標準の推奨される臨床的基準の一 員である。ＢＶ陽性女性におけるＧ、バギナリスの従来の研究は主として生物の 存無を確認していた。

いくつかの研究は半定量的微生物学を利用して、Ｇ、バギナリス細胞数か一般的 に、ＢＶ陰性女性よりもｅＶ陽性女性において高いということを確立していた。

請求の範囲の方法及びキットは、患者サンプル中のＧ、バギナリス細胞数が基準 のＧ、バギナリス細胞数に対して高いか又は等しいかどうかを調べることを含む 。基準Ｇ、バギナリス細胞数は、ＢＶに定のサンプリング方法及びアッセイ手順 に対応する基準Ｇ、バギナリス細胞数をまず同定するため、ＢＶ陽性又はＢＶ陰 性として臨床的に診断された十分な人数の女性から検体を得るためのサンプリン グ方法を利用して臨床的Ｇ、バギナリス細胞数が確立されるであろう。

ＢＶ陽性女性の由来するＧ、バギナリス細胞数の範囲か決定され、そして基準の Ｇ、バギナリス細胞数はこの範囲の最低値を表わすであろう。この臨床的数値は 特定のサンプリング方法に結びついている。

基準Ｇ、バギナリス細胞数の決定はサンプル集取手順、例えば腟洗浄、腟スワブ （Ｓ＋ｖａｂ）　、又はその他のサンプル獲得手段、並びにそのサンプルの中に 存在するＧ、バギナリス細胞の数を６時間以内の時間において測定するのに利用 するアッセイに依存するであろう。

ギナリス細胞数もしくはＧ、バギナリス濃度に関連しうる任意のその他の方法に より測定されうる。基準Ｇ、バギナリス細胞数はサンプル集取及びＧ、バギナリ ス計数のために選んだ方法に依存しつるか、との特定のプロトコールに関しても 、この基準Ｇ、バギナリス細胞数は１０倍の範囲ｔこわたって一致するであろう 。

特定のサンプリング方法及びアッセイ手順を利用することにより、サンプルのＧ 　バギナリス細胞数が、患者試験結果を既知の数の、精製し、培養したＧ、バギ ナリスに由来する同時評価標準品により作製した標準曲線と対比させることによ り確立されるであろう。定量した、培養したＧ、バギナリスの希釈系列を患者サ ンプルと同じアッセイ手順にかける。各患者サンプルのシグナル強度を希釈標準 品のシグナル強度と対比させ、そしてこの患者サンプルは、整合する標準希釈品 におけるＧ、バギナリスの量に相当するそれに相関させることができる。

サンプルの結果との比較のための標準品として利用できる。例えば、もし１６ｓ 　ＲＮＡをアッセイの標的とするなら、精製１６Ｓ　ＲＮＡは既知数のＧ、バギ ナリス細胞に相当する一定量の１６Ｓ　ＲＮＡを有する標準品として働（ことが できる。この場合、患者サンプルの結果は１６Ｓ　ＲＮＡの分子に相当する単位 において表現されうる：Ｂｖ陽性及びＢＶ陰性女性は、そのサンプルの中にどの くらいの１６Ｓ　ｒＲＮＡ当量が存在しているかに従って特徴付けされる。この 手法は既知数のＧ、バギナリス細胞から得られたあらゆるその他の精製分子に関 して利用できつる。

所望するならば、別の実験でＧ、バギナリス細胞当りの１６Ｓ　ＲＮＡ分子の数 を決定し、その後に１６Ｓ　ＲＮＡ標準品を利用することができるりの標的分子 （例えば＋６Ｓ　ＲＮＡ）の数はＧ、バギナリス細胞増殖周期における種々の段 階の際に変動しつるため、細胞当たりの関連分子の数は対数増殖の中期にある既 知の数のＧ、バギナリス細胞を利用して確立するべきである。一貫性のため、こ の数値等価は、−回だけ決定し、その後、精製した標的分子、例えば１６ｓ　ｒ ＲＮＡを標準品として利用し、確立されたこの数値等価に従ってＧ、バギナリス 細胞の数へと変換することができる。

ＢＶ陽性及びＢＶ陰性グループに由来するサンプル当りのＧ、バギナ高いＧ、バ ギナリス細胞数を有すことがあるが、かかる女性はほぼ常に腟ｐＨ＜４．５を育 することが見い出されており、従って診断キット仕様に従うならＢＶ陰性として 診断されるであろう。

本発明において、基準Ｇ、バギナリス細胞数を決定するための上記した方法と類 似して、Ｇ、バギナリス以外の生物に関する基準細胞数を決定できつる。例えば 、カンシタ症を示す女性に関する基準細胞数を、腟において見い出せる固有キャ ンディダレベルに対して決定することかできる。

本発明の固相アッセイキットの反応成分の濃度は、もし存在しているＧ、バギナ リスの量か基準Ｇ、バギナリス細胞数に等しい又は高いときのみ、陽性シグナル が得られたことを確認するために調整されるであろう。この基準Ｇ、バギナリス 細胞数は一般に膣液のｍ１当り約５ＸＩＯ’〜約５ＸＩＯ’個細胞の範囲であり 、約８×１０″〜約１０”細胞／膣液のｍｌが好ましく、そして約２ＸＩＯ’細 胞／腟液のｍｌが特に好ましい。便宜上、「約２ＸＩＯ’細胞／腟液の１１１１ Ｊとは、約５Ｘ］Ｏ’細胞／ｍ１〜約５ＸＩＯ’細胞／＋ｎ！の範囲におけるＧ 、バギナリスレベルを意味する。

本発明に従って試験されうる膣液サンプルはあらゆる常用手段で獲得できつる。

典型的なサンプル獲得方法論は腟スワブ、腟洗浄技術等の利用を含む。

本発明の方法のｐＨ決定段階は常用の技術、例えばサンプル、例えば腟スワブ又 は腟鏡を、ｐＨ紙又はその他のｐＨ指示基体と接触させ、次いで関連のサンプル のｐＨの指標であるこの紙又は基体の色の変化を観察することにより行われうる 。このｐＨ指示品は本発明の診断キットの中に、独立の構造ユニットとして、又 は診断指標カードもしくはディツプスティックの構造部分として含ませることか できる。

更に、ｐＨは電極又は市販のｐＨ指示品により測定されることができる。

他方、既知のｐＨ指示品を固相支持体に固定化することができる。

同様に、旦、バギナリス細胞レベルは６時間以内において実施できるその正確な 測定値をもたらす任意の方法によって決定されつる。

従って、９．バギナリスＤＮＡ又はＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチド配列を 含むプローブ、旦、バギナリスに特異的な抗体等がこの目的のために利用できつ る。広バギナリス細胞レベルの決定を行うのに特異的ハイブリダイゼーションア ッセイ技術が利用されつる。

オリゴヌクレオチドプローブ又は抗体を採用するサンドイッチアッセイ技術が好 ましい。

本発明の他の態様において、腟の病気に関連する複数種の微生物を１つのサンプ ル調製品を利用して同時に、且つ、迅速に検出することができる。患者が腟の病 気を示す場合、かがる病状に一般に関与する微生物にはキャンディダ種、トリコ モナス　バギナリス及びガードネレラ　バギナリスが含まれる。従って、単一の 生物学的サンプルにおけるこれら３Ｎの生物の存在を迅速、容易、且つ同時に検 出することは有利であろう。請求の発明は、各微生物（原核及び真核細胞の両方 を代表する）に由来する標的核酸を遊離せしめるのに適する溶解条件を説明する 。遊離した核酸、そして好ましくは遊離したリポソームＲＮＡを、次に同時に処 理し、そしてサンドイッチアッセイにおいて検出する。

本発明は更に、患者がＢＶＩこ悩まされているかどうかを決定するための、ｐＨ を指標することのできる第１指示品：及び疾患状態に関連するＧ、バギナリス細 胞数又はレベルを指標することのできる第２指示品を含む診断キットも考慮して いる。その他の生物、例えばキ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ種 （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）等の存在の指示品も本発明のキットの中に含ませてよ い。これにより、本発明のキットはＢＶ、膣炎又は子宮頚炎を検査するのに採用 されうる。

特に、このキットはｐＨ指示紙のストリップ及び診断指標カード、例えばディツ プスティックを含みつる。細胞破壊緩衝液／ハイブリダイゼーション溶液又はリ ガンドインキュベーション溶液（任意的に適当なシグナル成分を含む）も、サン ドイッチアッセイ技術の採用を促進せしめるために本発明のキットの中に含ませ てよい。他方、ｐｌ指示品をＧ、バギナリス細胞数指標品に構造的に組込ませて よい。

このキットは手動又は半自動検査手順において利用でき、そして好ましくはサン ドイッチアッセイ技術を採用できるものである。

複数種の標的核酸の存在を同時に検定する場合、複数のパラメーターを考慮する 。例えば、各標的微生物から核酸を効率的に遊離せしめる溶解溶液を決定しなく てはならない。典型的な溶解溶液は緩衝液、清浄剤、酵素、還元剤、有機溶媒、 抗生物質、カオトロピック剤、陽イオン、キレート、防腐剤又はそれらの組合せ を含みうる。

好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは標的特異性及び固相サンドイッチアッセイ方 式における標的との二重鎖形成の両方のために選択される。この後者の特徴は標 的がリポソームＲＮＡのときに特に重要である。シグナルすりゴヌクレオチドは 広範囲の特異性から選ばれつる。即ち、シグナルオリゴヌクレオチドは原核標的 核酸もしくは真核標的核酸に対して特異的であるか、又は標的の属及び／もしく は種と特異的にハイブリダイズしつる。捕捉オリゴヌクレオチド、シグナルすり ゴヌクレオチド、溶解条件、ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドの濃度、ハイブ リダイゼーション条件、シグナル／検出系及び条件、並びにそれらの組合せは、 特定の微生物パネルの検出の感度及び選択性に影響しうる。ところで、核酸サン ドイッチハイブリダイゼーションの当業者は、特定の標的微生物パネルの同時検 出を最適化するこれらのパラメーターの改質又は調節を決定することができる。

オリゴヌクレオチドプローブ技術を包含する固相サンドイッチアッセイにおいて （一般にＤｕｎｎら著、Ｃｅ１ｌ　１２：２３−２６．１９７７に記述）、この 標的核酸は、通常標的微生物から溶液へと遊離する。次にこの標的核酸溶液を、 固相支持体へのハイブリダイゼーションが生じつる溶液条件に移す又はそれに調 節する。かかるアッセイ技術はある手段で操作された（即ち、精製、化学処理等 された）一部のオリジナルの患者サンプルに基づいて採用する二ともできる。

好ましい態様において、標的核酸は、固相支持体の表層上に共有的に固定化され 捕捉オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（即ち、相補塩基 の対合）により、オリジナルの患者サンプルから一般に封鎖（捕捉）される。こ の捕捉された標的核酸を次に、結合した検出可能ラベルを有する、又は結合した 検出可能ラベルを育する成分に結合する能力を育するシグナルオリゴヌクレ才チ ドブローブにハイブリダイズさせる。このシグナルプローブは標的核酸上の択一 的な部位に対して特異的である。他方、シグナルハイブリダイゼーションは、例 えばハイブリダイゼーション溶液の中にシグナルプローブを含ませることにより 、捕促ハイブリダイゼーションと同時に実施することができる。これは、捕捉オ リゴヌクレオチドプローブ：標的核酸：シグナルオリゴヌクレオチドプローブの ｒサンドイッチ」をもたらす。この固相支持体を洗ってハイブリダイズしていな い材料を除去し、次いでラベル化核酸をこのラベルの検出可能な特色に従って測 定する。

抗原／抗体技術を含むサンドイッチアッセイにおいて、抗原はオリジナルサンプ ル、それらより抽出したもの、又は細胞壁及び／もしくは膜を壊す試薬によって このオリジナルサンプルに含まれている生物から遊離せしめたもののいづれかに 存在している。抗原は、固相支持体上に共有的に固定化された抗原特異性抗体と の相互作用により、試験サンプルから封鎖（捕捉）される。この捕捉された標的 抗原を次に、結合した検出可能ラベルを有する、又は結合した検出可能ラベルを 有する成分に結合する能力を有するシグナル抗体とインキュベーションさせうる 。このシグナル抗体は標的抗体上の択一的な部位に対して特異的である。他方、 シグナル抗体結合は、例えばインキュベーション溶液の中にシグナル抗体を含ま せることにより、捕捉と同時に実施することができる。これは捕捉抗体：標的抗 原：シグナル抗体の「サンドイッチ］をもたらす。この固相支持体を法って結合 していないシグナル抗体を除去し、次いでこのラベルの検出可能な特色に従って ラベル化抗原を測定する。

上記のサンドイッチアッセイにおいて、ビオチン／アビジン又はビオチン／スト レプトアビジン技術も利用されうる。特に、より一般化された検出系をオリゴヌ クレオチドプローブ又は抗原／抗体サンドイッチアッセイに結合させるためにビ オチン／アビジン相互作用か利用できうる。例えば、サンドイッチアッセイのシ グナルプローブをビオチンに共有結合させてよい。このビオチンラベル化シグナ ルプローブを、次にその相補性リガンドであり、それに結合した検出可能ラベル を有するアビジン又はストレプトアビジンとインキュベートすることができる。

これは、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ：標的核酸：シグナルすりゴヌクレオ チドブローブ／ビオチン：アビジン／検出可能ラベルの「サンドイッチ」をもた らす。この態様において、アビジン／検出可能ラベルは大量スケールにおいて調 製されることかでき、そして種々のサンドイッチアッセイにおいてシグナル／ビ オチン成分と結合することができる。その他のリガンドのペアーも本発明の固相 アッセイにおいて有用である。かがる他のリガンドペアーの典型例はレクチン： 糖、ホルモン：ホルモンレセプター等である。

本発明の診断方法及びキットにおける利用にとって好ましい面相支持体は、活性 化可能なアミン基を有するポリマーコート化ビーズであり、これは同時係属特許 出願第４４４．７８２号及び５２２．４４２号に記述されている。本発明に関し て有用なビーズ固相支持体は、捕捉核酸配列を非共有結合させる既知の膜又はビ ーズ固相支持体よりも一定の利点を有している。標的核酸配列の捕捉速度は５− 〜２５倍向上する。事実上、固相支持体に結合している捕捉核酸配列の全てが相 補配列とのハイブリダイゼーションにとって有用である。更に、固相化捕捉核酸 の量は見かけ上の表面積を基礎として約２０倍上昇させることができる。好まし い固相支持体は、従来技術の対応物よりもより簡単に製造できつる。更に、かか るビーズは９０″Ｃ以上の変性温度において１０分以上耐えることのできる共存 的に固定化されだ捕捉核酸配列（オリゴヌクレオチド）を保有している。更に、 多数のビーズ固相支持体を採用している多重部位ディツプスティックを作製する ことができ、これはディツプスティック装置の縮小化、及び検出のために必要な サンプルの容量を減らすことをもたらす。これらの利点は、本発明に従ってｅＶ を診断するのにサンドイッチアンセイハイプリダイゼーシタン方式を利用すると き、感度を高めるのに貢献する。

固相支持体、好ましくはビーズ上でのオリゴヌクレオチドの共有固定化は以下の 手順により達成されうる・必要ならば、固相支持体を活性化剤で処理するコニの 処理化固相支持体をアミン含有ポリマーと反応させ、これによりポリマーをこの 固相支持体にコートする。

−価又は多価試薬、好ましくはホモ三価試薬、塩化シアヌル酸ですりゴヌクレオ チドを活性化させる：そしてこの活性化オリゴヌクレオチドをポリマーコート化 固相支持体に結合させる。この支持体表層上の未反応アミンを次にアンル化して 、この固相支持体表１に適切な表層電荷を授け、これにより核酸との非特異的相 互作用を最小にする。

便宜上、［核酸」なる語は、一本ｊ］ｌＤＮＡ及びＲＮＡ　、並びに二本鎖ＤＮ Ａ、　ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡバイブリドを含む。

便宜上、「溶解」なる語は、試薬サンプルに含まれている核酸又は抗原を、捕捉 プローブ又はリガンドに対して有効にすることを意味する。溶解剤により作用せ しめた細胞は、顕微鏡のもとての観察により検出可能な状態に構造変化されてい ても、されていなくてもよい。本発明の実施において有用な典型的な溶解溶液は 、清浄剤（例えば陰イオン、陽イオン及び／又は非イオン性）、カオトロピック 剤、酵素（例えば、プロテアーゼ、シアリダーゼ、グリコンダーゼ、グルカナー ゼ、キチナーゼ、リチカーゼ、リゾチーム、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ等）、 育成溶媒、還元剤（例えばジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等） 、キレート剤（例えばＥＤＴＡ、　ＥＧＴＡ等）、抗生物質等であって、単独又 は組合せて利用されるものを含む。本発明の一つの好ましい態様は、■又は複数 の酵素、育成溶媒、又は還元剤による、カオトロピック剤の添加前での予備処理 を含んている。溶解は周囲又は高い温度で実施されつる。

便宜上、「固相支持体」なる語は溶液から溶液へと移すことのでき、且つ、ビー ズを取付ける手段を有している任意の表層を意味する。例えば、固相支持体にお けるミシン目又はくぼみにビーズを取付けることができる。

便宜上、ｒビーズＪなる語はオリゴヌクレオチド−ベースアッセイを実施するた めの構造体を意味し、そしてビーズ、マイクロビーズ、粉末、膜、マイクロタイ ターウェル、ストリング、布帛、プラスチックストリップ、フィルム又は任意の 表層であって、その上に核酸又は抗原か固定化されうるちのを含む。本発明の実 施において有用な固相支持体は天然又は固有蛍光を示しうる。例えば、「ビーズ 」なる語はプラスチック、セラミック、金属、ナイロンもしくはポリマー材料よ り成るあらゆるタイプの固相もしくは中空球、ボール、ベアリング、シリンダー 、又はその他の類の形態であって、核酸もしくは抗原をその上に共有的に固定化 することのできるものを包括する。従って、この語はナイロンストリングも含む 。好ましくは、球形ナイロンビーズが本発明の方法およびキットにおいて採用す ることかできる。かかるビーズに関する好ましい直径の範囲は約０、Ｏ１〜約０ ．０５インチ、より好ましくは約０．０５〜約０．１インチ、そして最も好まし くは約０．０６インチ（市販の３／３２インチナイロンビーズに相当する）であ る。更に、ナイロンビーズはアルキル化剤で処理する前にみかく又は荒削りする ことか好ましい。

本発明の好ましい態様において、ナイロンビーズ（又は複数のビ−ズ又は任意の 組成又はナイロンの構造）は、このビーズをアルキル化剤で処理することによっ て活性化される。アルキル化剤はナイロンポリマーの中に存在しているアミドと 反応して反応性イミデートエステルを形成する。好ましいアルキル化剤には、ジ アルキルスルフェート、アルキルトリフレート、アルキルジフェニルスルホニウ ム塩、アルキルバークロレートが含まれるかそれらに限定されず、そしてより好 ましくはトリアルキルオキソニウム塩か含まれる。本発明におい有用な典型的な トリアルキルオキソニウム塩には、低級アルキル塩、例えばトリメチルオキソニ ウム及びトリエチルオキソニウム塩か含まれる。典型的な対イオンはへキサクロ ロアンチモネート、ヘキサフルオロホスフェート及びテトラフルオロボレートで あり、最後に挙げた対イオンが好ましい。

アルキル化手順の際にナイロンを溶かさない、又はナイロンを粘着性にしないア ルキル化剤を、本発明の診断方法及びキットにおいて有用な好ましいナイロン固 相支持体を活性化するうえにおいて採用することか好ましい。非求核性育成溶媒 、例えばジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン及びその 他か、この目的に採用されつる典型的な溶媒である。Ｎ−メチル−ピロリドンか 好ましく、その理由はこれはアルキル化を支持する溶媒であるからである。

生ずるビーズ表層イミデートエステルを次に適切な条件のもとてアミン含有ポリ マーと反応させ、これによりアミジン残基を生成させる。任意の第−又は第二ア ミン含有ポリマーかアミジン残基を生成せしめるのに採用することができ、これ によりビーズの表層上にポリマーを共有的に固定化させることができる。ポリ（ エチレンイミン）、ポリアリルアミン及びポリビニルアミンが好ましい例である 。ポリマーを活性化ナイロンビーズに結合せしめる際に、ポリマーを溶解せしめ るのに利用する好ましい溶媒はＮ−メチル−ピロリドンである。

他方、反応性アミン又はカルボキシル基（アミン−又はカルボキシル−含有ポリ マーとその後反応することができる）を生成せしめるようナイロンを部分的に加 水分解することもできる。これにより、反応性成分によりコートされた活性化固 相支持体を製造することができる。

ディツプスティックは本発明の方法及びキットにおいて好適に採用される。Ｑ、 バギナリスを指標する核酸ハイブリダイゼーションにおいて有用性を有し、且つ 、非孔質ビーズ支持体及びそれにビーズを取付けるための手段を含むディツプス ティックが利用される。

非孔質ビーズ支持体は当業界において知られている。非孔質ビーズ支持体へのビ ーズの取付けの例は、非孔質ビーズ支持体におけるミシン目（又はくぼみ）を包 括しており、この中にビーズを取付けることができる。好ましくは、ミシン目が 採用され、そしてビーズはかかるミシン目の周囲内に収まるように加圧により取 付ける。当業者は本発明の実施において有用なディツプスティックの製造におい てその他のビーズ取付は方法が採用されうることを理解するであろう。

本発明の方法及びキットにおいて利用されるディツプスティックは複数個のビー ズを含みつる。好ましくは、このディツプスティックは２〜１００個のビーズ、 そしてより好ましくは２〜ｉｏ個のビーズをそのそれぞれのミシン目の中に含み つる。より好ましくは、多数のビーズ含有ミシン目はディツプスティックの一端 に沿う列において配置されている。かかるディツプスティックは指標カードとし て機能できる。特に、異なる配列又は異なる特異性を育する共存的に固定化され だ捕捉オリゴヌクレオチドプローブ又は抗原を存する複数のビーズは多重部位デ ィツプスティック上に密接に並んでおり、これにより単一生物学的サンプル中の 多重の生物の検出か促進される。詳しくは、ビーズは複数の非同−性核酸配列（ 例えば近親生物の群に由来する配列）を示すオリゴヌクレオチドを含むことかで き、又はビーズは特定の核酸配列を有する同一のオリゴヌクレオチドを複数含む だけでもよい。

好ましくは、本発明の実施において有用なディツプスティックはＧ、バギナリス に特異的なビーズ、陽性コントロール、陰性コントロール及び任意的にｐｌ（指 示ビーズ又はストリップを含むであろう。

常用のｐＨ指示品は固相アッセイ方式の中に組込まれるよう、固相支持体に吸着 又は共存結合させることかできる。例えば、Ｂｅ１ｃｈｅｒら著　（纏）　ｒｒ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｅｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｉｎ 　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒＹ　Ｊ頁５Ｌ　Ｐｅｒｇａｗｏｎ出版 、１９７２のＩＴｎｄＩＣａｔＯｒＳＪ　ＢｊＳｌｌｏｌ）（纏）を参照のこと 。ところで、９）１指示ストリツプは独立した構造ユニットとしてキットの中に 含ませることもできる。むろん、試験サンプルのｐＨは、試験サンプルを本発明 の１又は複数種の溶液と組合せる前に決定されるであろう。

他の態様において、このディツプスティックはトリコモナス　バギナリス及び／ 又はキャンディダ種に特異的なビーズを、Ｇ、バギナリスに特異的なビーズ、手 順の（ｐｒｏｃｅｄｕｒａＩ’）陽性コントロール及び手順の陰性コントロール の他に含みつる。かかるディツプスティックはサンプル細胞数が、これら２つの 非ＢＶＩ！Ｉ連腟病原に関する基準細胞数よりも高いか又は等しいかどうかを示 し、そしてより包括的な診断手段を提供することかでき、なぜなら膣炎は本発明 のこの態様の実施を通じても検出される（そして原因の生物が認識される）から である。他の態様において、このディツプスティックはニーセリア　ゴノロエ、 クラミジア種、モビルンカス種、バクテロイデス種及び／又はマイクロプラズマ 種に特異的なビーズを、Ｇ、バ性コントロールの他に含みつる。かかるディツプ スティックはサンプル細胞数か、子宮頚炎又は潜伏性病原性腟惑染に関連する個 々の生＃Ｊ（ニーセリア　ゴルア、クラミジア種）についての基準細胞数と等し い又はそれを超えるかどうかを示すであろう。かかるディツプスティックは、本 発明のキットの捕獲及びシグナルプローブ成分とのハイブリダイゼーシヨンのた めの標的核酸配列を遊離せしめることのできる１又は複数の溶解試薬と共に包装 されつる。

複数種の標的核酸の存在を検出することのできるディツプスティックベースアッ セイの開発は３つの重要なパラメーターの認識を必要とする：（１）サンプルか らの標的核酸の溶解又は遊離；　（２）標的核酸の捕捉及び検出；並びに（３） アッセイ方式の試薬構成。

もしこの試薬構成が一定であり続けるなら（即ち、ハイブリダイゼーション条件 、洗浄溶液、検出酵素等）、当業者は標的核酸とのハイブリダイゼーションのた めの特定の捕捉及びシグナルすりゴヌクレオチドを同定且つ選択することかでき る。標的核酸の捕捉及び検出のための条件が規定されているとき、当業者か生物 学的サンプルからの標的核酸の遊離を可能とする溶解条件を決定することができ る。この溶解条件は各標的微生物に関して変えることができ、そして溶解条件の バランスは標的生物の同時検出を可能とする。これらのパラメーターか同定され たら、生物学的サンプルにおける各微生物に関する基準細胞数か決定されつる。

基準細胞数はサンプルを獲得するために用いた方法に従って変動することがあり 、従って疾患の症状の表示をもたらす細胞数として定義されつる。症状の表示は 、微生物の無圧性存在か考えられる場合の疾患に特に関連する。

請求の発明の更なる態様において、オリゴヌクレオチドコート化ビーズをマイク ロタイターウェル方式において採用することができる。この方式は大量の患者の サンプルをアッセイするときに育利に利用されうる。更に、マイクロタイターウ ェル方式は、可溶性反応生成物を通じて検出するシグナルプローブに匹敵する。

以下に記載の表１は典型的な溶解試薬を患者サンプルの存在下において表示の生 物とインキュベートしたときに得られる結果をまとめる。（］）で示す第１の方 法は、３Ｍのグアニジニウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）におけるサンプルの 直接な浸漬を包含する。第２の方法（２）はＩＢ／ｍｌのプロテイナーゼにの中 での６５℃までの加熱、それに続＜３Ｍの最終濃度までＧｕＳＣＮの添加を必要 とする。第３の方法は清浄剤を含む緩衝溶液中での８５℃での加熱、それに続く 最終濃度３ＭまでのＧｕＳＣＮの添加を必要とする。

表１ 溶解試薬 １　「スパイク」とは、Ｂν陰性女性からスワブを採取し、次いて約５Ｘ１０” 個の培養生物をこのスワブの上に直接載せることをいう。

このスワブを次に患者サンプルのように処理する。

プラスの記号は膣液サンプルの存在下における標的核酸の有効な検出を示す。こ れらの試薬を用い、患者サンプルをブロティナーゼにの中に集め、次いてＧｕＳ ＣＮ添加（方法（２））をキャンディダ（Ｉ））。他方、２つの患者のサンプル を同時に集めるか、又は１つの患者サンプルを小分けして、次いで５ＭのＧｕＳ ＣＮ及び１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼにの中でそれぞれインキュベートする。

この２つの溶液を次に最終ＧｕＳＣＮ　８度３Ｍとなるまで混ぜる。次にサンド イッチアッセイをこの混合物において実施する。更なる他の択一的な方法は、対 象の全ての生物に由来する核酸の遊離のために有用な溶解試薬の同定及び利用を 包含する（前記の方法３）。緩衝清浄溶液の成分、加熱温度及び加熱時間を、そ れぞれの生物に関し、又は組合せ生物に関して調節しうる。

主として核酸ハイブリダイゼーションアッセイに関して上記した説明にもかかわ らず、これらのディツプスティックについてのあらゆるその他の利用が考えられ ることが当業者にとって自明であろう。

リガンドベアーの任意の構成員をディツプスティックにおけるビーズに連結させ 、次いでこのディツプスティックを対応のリガンド構成員を同定するのに利用で きる。例えば、抗原又は抗体を前記の通りにディツプスティックにおけるビーズ に結合させ、その後対応の抗体又は抗原のそれぞれを同定することができる。類 似の手法において、その他のリガンド系、例えばビオチンとストレプトアビジン が利用されうる。

本発明の診断方法はＢＹの伝統的な臨床診断によく相関する。比較診断試験のた めに用いた例示の患者サンプルは、ワシントン大学のスチューデント　ヘルス　 クリニックの、２０代の独自の白人女性から採取した。「正常」　（即ち、ＢＶ 陰性）患者をルーチン検査に関するクリニックに受けさけ、モして膣炎の症状は 全つく示さなかった。

サンプルの採取時にｐＨを日常的に測定した。

これらの試験において、腟サンプルを採取し、次いで常用のＢＶ診オートラジオ グラフィーにより決定され、そしてサンプルと標準品及び９８．６％の特異性を 伴って検出される。これらの診断の比較結果を介して機能する。ハイブリダイゼ ーションは相補性核酸鎖の対合に基づく。相補性一本Ｍ！核酸を適切な緩衝溶液 及び条件の中でインキュベートすると、相補性ヌクレオチド配列のペアーは安定 な二本鎖分子を生成する（即ち、配列のハイブリダイズ）。

採用する特定のハイブリダイゼーション技術は本発明の方法及びキットにとって 本質的ではなく、そして当業者は種々のかかる技術を受け入れるであろう。ハイ ブリダイゼーション技術は一般にＨａｍｅｓら著（！ｉ）、　ｒＮｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　ｔ（ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ）ＩＲＬ出版、ニューヨーク、１９８５に記述されている。改良が ハイブリダイゼーション技術においてなされるに従い、それらは本発明に容易に 適用されつるであろう。更に、診断ディツプスティック及びイムノアッセイ技術 は種々の目的で当業界において知られ、且つ、採用されている。

標的核酸配列が捕促オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを 受けたなら、シグナルオリゴヌクレオチドプローブとの第２ハイブリダイゼーシ ヨンを起こさせねばならない。この手法において、捕促された標的核酸の存在が 確認され、そして捕促された標的核酸の量は定量されうる。有効又は有効でない ハイブリダイゼーションの検出は当業者に知られる方法に従って成し遂げられつ る。

間接的クエンチングフルオロイムノアッセイ、ダブルレセプターフルオロイムノ アッセイ又は保護フルオロイムノアッセイが、フルオロレッサーに対して特異的 な抗体を利用することで知られるアッセイ方式である。これらのアッセイは、抗 原特異性抗体とフルオロレッサー特異的抗体による、フルオロセッサーラベル化 抗原に対する競合に基づく。

同時係属米国特許出願第１４２．１０６号、４４８．８７２号、５２２．４４２ 号及び５７１．５６３号に記述の通り、ポリマーコート化ビーズ又は類似の構造 物上に共有的に固定化されたオリゴヌクレオチドは核酸プローブとして働きつる 。複合生物学的サンプル中の特定の標的核酸の存在を検出するハイブリダイゼー ションアッセイはかかる固定化オリゴヌクレオチドプローブを利用して実施され うる。

便宜上、Ｆオリゴヌクレオチドノなる語は長さにおいて約６〜１５０塩基である 短い核酸配列を意味する。かかるオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション アッセイにおける捕捉又はシグナルプローブとして利用でき、そして好ましくは 商業的に有用な方法及び装置を用いて化学合成される。例えば、固相ホスホラミ ジット法は１６．０００ダルトン以下の分子量を有する６〜１００塩基の短いプ ローブを作るために利用できる。オリゴヌクレオチドの合成に関しては、一般に Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ら著、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍ ｐ、　０ｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　４７　：４１１−１８．　１９８２．及びＡ ｄａｍら著、Ｊ、　Ａｒｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、１０５：　６６１．　１９ ８３を参照のこと。活性化オリゴヌクレオチドは一般に、化学化合物と反応させ られ、そして化学的に活性化されたオリゴヌクレオチドを意味する。便宜上、「 活性化されうる」とは、分子のポテンシャルが化学的に反応性にされうろことを 意味する。

特定の標的核酸、例えばＧ、バギナリスのＲＮＡ、　ＤＮＡ等の検出のためのオ リゴヌクレオチドプローブを合成する際、ヌクレオチド配列の選択がかかるプロ ーブを用いる試験の特異性を決定するであろう。

例えば、Ｇ、バギナリス単離体由来の核酸を比較することにより、タイプ特異性 、種特異性又は属特異性のいづれかであるＧ、バギナリス検出のためのオリゴヌ クレオチド配列を選ぶことができる。核酸領域と配列の比較は市販のコンピュー タープログラムを用いることにより実施できる。

本発明において有用なオリゴヌクレオチドプローブはＧ、バギナ核酸襟的であり 、その理由はこれは細胞当り数千のコピーの中に存在しているからである。しか しながら、Ｇ、バギナリスのゲノム又は旦、バギナリスのプラスミドにおける配 列に相補性のオリゴヌクレオチドも利用できる。更に、キャンディダ種及びトリ コモナスバギナリスに特異的な核酸配列とハイブリダイズすることのできるオリ ゴヌクレオチドを説明する。本発明の方法及びキットにおいて有用な典型的なオ リゴヌクレオチドプローブは本明細書の［材料」］　の章及び例６において提供 する。

本発明における利用にとって好ましい捕捉オリゴヌクレオチドは長さ約１５〜約 １００塩基の合成オリゴヌクレオチドである。プロットされたアミン基を含むス ペーサー（リンカ−）アーム（即ち、他の化学基に至る又は結合する′化学成分 であり、そして好ましくは約２〜約１２個の炭素原子、より好ましくは約６個の 炭素原子を含む炭素鎖である）は、常用の化学を利用するオリゴヌクレオチド合 成の際に、オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基に結合することができる 。第一アミンは一価又は多価試薬との反応に関する好ましい基であり、そしてヘ キシルアームを介するその結合が好ましい。第一アミンにおいて終結するスペー サーアームの結合にとって有用な試薬は市販されている。本発明に関する利用に とって適切な出発材料は当業界において知られている。

好ましくは、５′末端構造を保育するオリゴヌクレオチド、例えば、（式中、ｎ は１−１２であり（ｎ＝６が好ましい）；Ｘは−ＮＨ−又は−Ｎ）ＩＣ：　０（ Ｃ１（、）、　Ｎ）！−Ｃ式中、ｍは２−１２である〕であり：Ｙは４，６−ジ クロロトリアジン（好ましい）又はチオール（スルフヒドリル）−反応成分であ り；Ａは約９〜約１００の塩基、好ましくは約１５〜約３０の塩基の範囲のオリ ゴヌクレオチドである）であって、５′ヒドロキシルオリゴヌクレオチド成分の みが結合のための修飾を必要とするものである。他方、オリゴヌクレオチドの３ ′末端を同様に修飾して反応性基を含ませてよい。

次に特定のオリゴヌクレオチドを一価又は多価試薬により活性化させる。典型的 な試薬には、ホモ三価、ヘテロ三価、ホモ三価及びヘテロ二価試薬か含まれる。

特定のオリゴヌクレオチドを活性化させ、そして以下の化学に従ってポリマーコ ート化固相支持体に連結させることかできる。アミンテール化オリゴヌクレオチ ドを一価又は多価試薬によって（例えば塩化シアヌル酸）活性化することかでき る。活性化段階において生成したアルキルアミノジクロロトリアジンを、固相支 持体に結合させたアミン含有ポリマーと反応させる。

ホモ三価試薬である塩化シアヌル酸が好ましいにもかかわらず、その他の活性化 試薬が利用できる。例えば、Ｎ−スクシニミジル＝４−（ヨードアセトアミド） −安息香酸塩（ＳＩＡＢ）は安定なヘテロ二価試薬であり、そしてジスクシニミ ジルスベレートは適切なホモ二価試薬である。もし固相支持体カルボキシル基が 含まれているなら、ヘテロ二価試薬ｌ−エチル−５−（ジメチルアミノプロピル ）、カルボジイミドか利用できる。その他の類似の一価及び多価（ヘテロ多価及 びホモ多価）試薬が本発明の実施における利用にとって適切である。

オリゴヌクレオチド活性化及び結合化学は、オリゴヌクレオチドのプリン及びピ リミジン塩基の改質を全つく伴うことなく、オリゴヌクレオチド上のアミノ基の 特異的な活性化をもたらす。特に、好ましい化学は塩化シアヌル酸（２，４，６ −ドリクロロー１，３゜５−トリアジン）を採用する。５′又は３′チエーチル 化（ヘキシルアームを介する請求核アミン成分（又はピリミジンもしくはプリン 塩基上に置換した内部アミノアルキル基）を有するオリゴヌクレオチドを過剰の 、好ましくは５ｏ−〜２００倍の再結晶化塩化シアヌル酸と、好ましくは１９− ２５°Ｃで、部分有機溶媒、例えばＮ−メチルピロリドンの中で、１〜２時間に わたり反応させる。

未反応の塩化シアヌル酸は排除クロマトグラフィー又は限外濾過により除去でき る。次に処理した固相支持体と活性化オリゴヌクレオチドとを結合させる。詳し くは、これらを−緒に混ぜ合わせ、そして好ましくは約２０〜５０°Ｃで約１〜 ２４時間インキュベートする。ビーズ表層上の残留（未反応）アミンを試薬、例 えば無水コハク酸、好ましくはＮ−メチルピロリドンにより、適当な塩基、例え ば硼酸ナトリウムの存在下においてキャップ（ブロック）し、表層を核酸ハイブ リダイゼーションのために適合化（負荷電化）せしめた。固相支持体は正、負又 は中性表面電荷を提供するために化学的に修飾されつることに注目すべきである 。

標的核酸は通常、長さ約２０〜約２０．０００塩基又はヌクレオチドに範囲する 平均の長さを有するポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションにとって の適切な条件は塩対合の誤対合が最小又は存在しない緊張条件に相当する。許容 される誤対合の程度は当業者により認識される程度において必要とされる特異性 に依存する。

本発明の好ましい方法及びキットに関して有用なシグナルオリゴヌクレオチドプ ローブは検出可能ラベルと結合した又は結合できるオリゴヌクレオチドである。

種々のラベルが本発明のハイブリダイゼーションアッセイにおいて利用できる。

かかるラベルは標的核酸とその相補性シグナル配列との二重鎖形成を検出するた めのリポータ−基として働く。ここで用いるリポータ−基は、測定又は検出でき る物理的又は化学的特徴を有する基である。検出性は酵素活性、色調変化、ルミ ネッセンス、蛍光もしくは放射活性としてかかる特徴により提供されつるか、又 はリガンド認識部位として働くリポータ−基の能力により提供されうる。任意の ハブテン性又は抗原性化合物がこの目的のための適切にラベル化された抗体と組 合せて利用することかできる。

リポータ−基としての対象の典型的な酵素は特にホスファターゼ、エステラーゼ 、ウレアーゼ及びグリコシダーゼ、オキシドリダクターゼ、特にペルオキシダー ゼ等である。蛍光化合物にはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びそ の誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等か含まれる。ケミルミネッサーにはル シフェリン、ルミノール、オキセタンジオン等が含まれる。上記は例示にすぎず 、そしてラベルの選択は必要な感度、プローブとのフンジュゲーションのし易さ 、安定要件及び有用な装置に依存する。

ハイブリダイゼーションの程度は同時係属米国特許出願第５５８．９６７号に記 述の蛍光クエンチングの方法又は技術を利用して定量されつる。ディツプスティ ック（即ち、不溶性）診断方式蛍光クエンチング方式は、紫外光（２４０−４４ ０ナノメーター（ｎｍ））で照射せしめたときに蛍光を発する固相支持体、例え ばナイロンを採用する。好ましいアッセイ手順の際に固相支持体上に沈降する比 色的不溶性酵素生成物は固相支持体の蛍光を抑え、これにより市販のフルオロメ ーターを用いての生成物の量の定量の手段を提供する。本明細書に記述された固 相支持体は、それに結合させるべき複数の蛍光発色基を必要とせず、むしろ固相 支持体を形成するポリマー材料の固有又は自然蛍光を頼りにする。このタイプの 支持体を利用するハイブリダイゼーションアッセイ方法論における蛍光の照射及 び検出は紫外線は可視光の狭い又は特定の波長の利用にも依存しない。

例えば、標的核酸が固相支持体にハイブリダイズしたサンドイッチが形成されう る；次にシグナルビオチニル化オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズ させる；次いでストレプトアビジンにフンシュゲートせしめたリポータ−酵素を ビオチニル化オリゴヌクレオチドに結合させる。サンドイッチの形成後、リポー タ−酵素生成物を固相支持体の表層上に堆積又はＸ＊させる。はとんどの場合に おいて、生成される酵素生成物の量は捕捉された標的核酸の量に正比例する。こ の固相支持体を次いで紫外光源（２４０〜４００ｎｍ）で照射せしめ、次いで得 られる蛍光をフルオロメーターで測定する。測定される蛍光の強度は固相支持体 上に堆積した酵素生成物の量に反比例する。他方、もしこのリポータ−酵素生成 物が着色化されているなら、ビーズの表層上に堆積又は蓄積した生成物は定性的 及び／又は定量的に決定されうる。定量測定は目視により、又は色の等綴付けを 直接的にもしくは灰色の明暗の利用のいづれかによって分析及び／又は測定でき る装置によって実施されつる。かかる定量測定は一般に標準品との比較を含む。

蛍光クエンチング法を利用する場合、捕捉される標的核酸の量を定量することに おいて有用な酵素生成物の唯一要望される特性は、固相支持体の蛍光を消失又は マスクする能力にある。比色性生成物を生じせしめるあらゆるタイプの酵素が蛍 光クエンチングアッセイにおいて利用できる。典型的な酵素には西洋ワサビペル オキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）　、ベーターガラ クトシダーゼ等が含まれる。各典型酵素のための代表的な基質はそれぞれ、４− メトキシナフトール（４ＭＮ）、５−ブロモ−４−クロロインドイル−３−ホス ファターゼ／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、及び○−ニトロフェニル ーベーターＤ−ガラクトピラノシド（０ＮＧ）である。

生ずる酵素生成物の量が捕捉される標的核酸の量に比例し、そして着色生成物に よる蛍光の消失が生ずる生成物の量に比例しているため、捕捉される標的核酸の 定量測定がなされつる。はとんどの場合、捕捉される標的核酸と蛍光消失との関 係は直線的である。

この態様において、固相支持体は紫外光又は可視光により照射されたときに何種 かの蛍光を保有していることか必須である。蛍光は固相支持体を構成する材料に 独特もしくは固有てありうるか、又は蛍光化合物を固相支持体に製造もしくは誘 導工程の間に結合させることができる。典型的な蛍光化合物はフルオレセイン、 テキサスレッド、ローダミン等が含まれる。

本発明のディツプスティック方式診断は目視評価だけで評価されることかできる 。この！ｇ様においては、ビーズはその天然色から指示色、例えば青色へと変化 して陽性結果を指標しうる。例えば、ディツプスティックは十分量の標的核酸か 存在しているときに目に見える指示色へと変わるようにデザインされつる。本発 明のこの態様は紫外光によるサンプルの照射又はフルオロメーターによる検出を 必要としないであろう。

他方、酵素生成物の直接的な測定又は定量を本発明の可溶性検出方式（例えば９ ６穴方式）において採用することができる。しかしながら正確な結果を得るには 、蛍光酵素生成物は生成物又は蛍光自体を消失せしめない環境の中で測定すべき である。本明細書に記述の好ましい固相支持体はその天然状態において非常に高 い強度の蛍光を保有するため、好ましい固相支持体の存在下において蛍光可溶性 酵素生成物を正確に測定することは可能でない。従って正確な蛍光の検出を可能 とするために、かかる固相支持体を基質溶液又はデカントした溶液から取り出し 、次いで別の容器の中に入れるべきである。

他方、蛍光シグナル検出に関し、着色化又はコート化ポリマービーズが採用され つる。好ましい固相支持体を任意の色の色素で着色することは、その固有蛍光を 存意に下げる又は消失させる。コーティングは特定の固相支持体の全ての固有蛍 光をマスクするのに働く。

蛍光の低下は固相支持体が可溶性酵素生成物蛍光測定の際に存在していることを 許容し、これにより溶液又は固相支持体の移し換えを省略せしめる。

もしビーズ又は固相支持体（好ましくは染色化又は着色化されたちの）を蛍光シ グナル検出の際に溶液の中に残すなら、ビーズ間又は固相支持体間の蛍光は比較 的均一であるべきである。ビーズ間の固有蛍光の標準偏差は、蛍光基質のポテン シャルを完全に有用なものとするため、このアッセイ（典型的には１−１０％） 又は検出される蛍光の標準偏差（典型的には１〜５％）を超えるべきでない。こ の手順は本発明のマイクロタイターウェル方式において利用され、ここでは可溶 性蛍光生成物は着色ビーズの存在下において直接測定する。偏差が上記したもの より高いことが起きた場合、有意義でない測定値か得られてしまう。

本質的にジクロロトリアジン、アゾ又はその他の永久色素の任意の色はナイロン の固有蛍光を約５００分の１に下げるであろう。典型的な色素の色は黒、青、赤 、緑、黄、紫、橙等であり、色素の色に関する唯一の条件は、この色素が蛍光酵 素生成物と同じ波長で蛍光を発しないことＩこある。

好ましい固相支持体の自然蛍光を消失せしめることに加え、支持体の着色化は、 色によって区別できる異なる捕獲オリゴヌクレオチド又は異なる標的核酸特異性 を有する固相支持体の開発を可能にする。色によって異なる固相支持体を区別す る能力は以下の利点：ｌ）異なる特異性を保育する固相支持体か同定、且つ、区 別されうるため、品質管理が向上されうる；及び２）比色酵素生成物と固相支持 体の表層とのコントラストが最大となりつる、ことを有する。このことは、アッ セイ結果を目視により決定する場合により高レベルな感度の達成を可能とする。

本発明のキットは、本発明に従いＢＶ診断のための半自動化方法の一部として利 用されうる。かかるキットはＧ　バギナリスがＢＶの特徴的なレベルにて又はそ れより高く存在している場合のその存在の検出を提供し、そしてこれはサンプル 獲得手段、例えば腟スワブ：ｐＨ指示手段、例えばｐＨ紙；溶解緩衝液：及びＧ 、バギナリス細胞数指標手段、例えば診断ディツプスティックを含みつる。この キットはインキュベーション装置（例えば加熱ブロック）、自動化アッセイ装置 及び／又はビーズリーダーと一緒に利用される。

ＢＶの診断のために本発明の半自動化方法を利用する開業医は実質的に以下の手 順に従うであろう。

１）腟スワブを獲得し、次いでこのスワブを用意されたｐＨ紙に適用する。

２）このスワブを溶解溶液を含むチューブの中に挿入し、次いで約５分以内にわ たり浸漬する。

３）スワブを絞り、そして任意的にこのチューブを約６５°Ｃに加熱している加 熱ブロックのウェルの中に約５〜２０分量大れる。

４）５ＭのＧｕＳＣＮ溶液を最終濃度が３Ｍとなるまで加える。

５）この溶液を自動化ディツプスティックにおける第１サンプルウエルに移し、 これはアッセイの進行を約３０分において自動的に終了させる。

６）着色した物質がビーズ上に堆積しているかどうかも目視て決定する。

この半自動化方法論において、段階１は患者から得た腟サンプルのｐＨを決定す ることに相当する。段階２はブロティナーゼに溶解緩衝液を利用しつる。段Ｎ２ −６は基準Ｇ、バギナリス細胞数が患者サンプルに等しいか又は超えられている かとうかを決定することを構成する。

これらの方法及びキットは、高度に熟練された労力分析を必要とせずに正確なり Ｖ診断を迅速、且つ、再現性よく提供することにおいて有利である。本発明の方 法は６時間以内において成し遂げられ、そして好ましくは１時間以内において成 し遂げられつる。

更に、本発明の方法及びキットは手がかり細胞を同定する又はウェットマウント を評価するうえでの必要とされる技術をなくさせることかできる。従って、上記 の技術を尊さない個人により本発明の方法は実施され、且つ、本発明のキットは 利用されることができる。

詳しくは、研究技術者又は医師のアシスタントは本質的に特別なＩＩ＋練をする ことなく本発明の方法及びキットを採用することができる。

本発明の方法及びキットの利用の他の結果は、ウェットマウント及びグラム染色 分析に包括される主観性がより客観的な手順に置き換えられていることにある。

詳しくは、分析間の変動は本発明の利用を通じてなくなる。

医師の診療所の設備においては、医師の検査及びウェットマウントか主としてＢ Ｖの診断の基礎となっている。これらの方法論はゴールドスタンダード法はど正 確でないが、しかしながらゴールドスタンダード法は診療所の環境の中で実施す るには複雑すぎると一般に考えられている。本発明の方法及びキットは診療所の 設備において利用されて、ゴールドスタンダード法又は医師の検ｆ／ウェットマ ウント法により得られる診断結果に匹敵するそれを達成せしめることができる。

他の態様において、ガードネレラ　バギナリス、キャンディダ種及びトリコモナ ス　バギナリスの存在を同時検出するために患者サンプルを集め、処理し、次い で分析することができる。サンプル集成の数週間前において抗菌又は抗真菌医薬 品で処置されていなく、且つ、２４時間入浴していない、腟の病気を示す症候女 性がらサンプルを集める。

好ましい手順において、膣液サンプルを獲得するために無菌スワブを利用する。

プレスコアー（ｐｒｅｓｃｏｒｅｄ）ハンドルを有するダクロン製（Ｄａｃｒｏ ｎ）スワブがサンプル集成にとって特に好ましい。このスワブ全体が腟壁に接し ていることを確認しなから腟壁に対してこのスワブを２又は３回ひねる又は回転 させることによりサンプルを採取する。次にこのスワブをサンプル集取チューブ の中に入れ、二のスワブのプレスコアーハンドルを折り、そしてこのチューブを キャップをする。患者から潤滑させていない鏡（ｓｐｅｃｕｌｕｍ）を取り除き 、そしてｐＨ指示ストリップをこの鏡に接触させることによって腟のｐｈを決定 する。

迅速なサンプル準備のためのプロトコールにおいて、スワブ／サンプルを室温て 直ちに処理及び分析に移す。もしスワブ／サンプルを直ちに処理できないなら、 このスワブ／サンプルを０℃〜８℃で４時間又は室温で１時間保つ。

処理のため、溶解溶液をスワブ／サンプルに加え、これをこの溶解溶液の中て約 １０〜１５秒撹拌する。スワブ及び溶解溶液を含むチューブを８５°Ｃで５分間 熱し、次いでこのサンプルにハイブリダイゼーション溶液を混ぜる。この時点で 、サンプルは室温で２４時間まで保存することができる。

スワブの内容物はこのスワブをチューブの側面に沿って回転させることによって 抽出し、次いでこのチューブの中に残っている溶液を自動化装置で処理すること ができる。一般に、チューブの中に残っている溶液は更なる処理の前に濾過する 。好ましい態様においては、このサンプルを試薬カセット又は多穴容器の第１ウ エルの中に入れられ、次いで半自動化装置がこのカセットの各ウェルにわたりデ ィツプスティックを移動させ、これによるサンプルは処理される。

好ましいディツプスティックは５個ビーズ、即ち手順コントロール、陰性コント ロール、ガードネレラ　バギナリスー特異的捕捉プローブを有するビーズ、キャ ンディダ種−特異的捕捉ブローブを有するビーズ、及びトリコモナス　バギナリ スー特異的捕捉プローブを存するビーズ、を含む。これら３種の生物の検出は、 自動化サンプル処理終了時での試験ビーズ上の色の存在が、障的生物に由来する 検出可能なレベルの核酸の指標である比色シグナル系を介して達成されることか 好ましい。ビーズ上の色調の強度は目視により、又は測定装置、例えばイメージ アナライザーもしくはりフレクトメーターのいづれかにより評価されうる。手順 コントロールはこの手順が正し〈実施されたかを確認せしめ、そして試薬の品質 チェックとして働く。陰性コントロールはビーズに対する非特異的結合を評価さ せる。

以下の実験の章において、例１は蛍光クエンチング技術を利用する３／３２イン チのナイロンビーズ上での西洋ワサビベルオキシダーゼ不溶性生成物の定量を詳 細する。例２は蛍光クエンチング技術を利用する３／３２インチのナイロンビー ズ上でのアルカリホスファターゼ不溶性生成物の定量を詳細する。例３は黒色及 び天然色ナイロンビーズの存在下において不溶性４−メチル−ウンベリフェロン を用いる直接蛍光の比較を詳細する。例４は複数の異なる色でビーズを染色する ことによるナイロンビーズの蛍光の低下を詳細する。例５は本発明と常用のＢＶ 診断技術との実施において採用される診断基準の関係を例示す。例６は複合生物 学的サンプル中のガードネレラバギナリス、キャンディダ種及びトリコモナス　 バギナリス標的核酸の同時検出のための方法及びキットを詳細する。

以下の材料及び手順の章は上記で要約した例１−５に属する。

材料 ５關のＥＤＴＡ、及び０．５％（ｖ／ｖ）のツイーン（商標＞　２０である。

ＴＭＮＺ緩衝液は０．０５Ｍのトリス、ｐＨ９，５、ｌｄのＭｇＣｌ２、及び０ ，５ｍＭのＺｎＣ１，である。

ＦＷ（フィルター洗浄液）は０．０９Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス、 ｐｌ（７，６、及び２５１１１ＭのＥＤＴＡである。

ＳＤＳ　／ＦＷはＦＷ及び００１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ Ｓ）である。

ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）基質溶液は０．１Ｍのクエン酸ナトリウ ム、ｐｉ（６，５，０，２Ｍのリン酸ナトリウム、０．５ａ＋ｇ　／ｍｌの４− メドキシーｌ−ナフトール、０．０２ｍｇ／ｍｌの３−メチル−２−ベンゾチア ジンノンヒドラゾン及び０．０１３５％（Ｖ／Ｖ）の過酸化水素である。

ＡＰ（アルカリホスファターゼ）基質溶液は１ｍＭの５−ブロモ−４−クロロイ ンドイル−３−ホスフェート、ＩｍＭのニトロブルーテトラゾリウム、及びＴＭ ＮＺ中の０．０１％（Ｖ／Ｖ）のツイーン２０である。

５ＭのＧｕＳＣＮは５Ｍのグアニジニウムチオシアネート、８３．５ｄのトリス 、ｐＨ８，０、８，３５％のホルムアミド、及び１６．７ｍＭのＥＤＴＡである 。

３ＭのＧｕＳＣＮは３Ｍのグアニジニウムチオンアート、５０ｍＭのトリス、ｐ Ｈ８，０，５％のホルムアミド及び１０１１１ＭのＥＤＴＡである。

プロテイナーゼに溶解溶液は１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼに、０．５％（Ｗ／ Ｖ）のＳＯ３、及び５％のＮ−ラウロイルサルコシン（サルコシル）である。

溶解及びハイブリダイゼーション溶液は３Ｍのグアニジニウムチオシアネート（ ＧｕＳＣＮ）、５０ｄのトリス、ｐＨ７，６，２％のサルコシル及び２５ｍＭの ＥＤＴＡである。

ハイブリダイゼーション／スロットプロット溶液は９０ｍＭのトリス、１）Ｈ８ ，０、ｃｉ、ｅ　ＭのＮａＣ１，ｌ０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．５％のＳＤＳ、５ Ｘのダン／ｌｌ−７（ＩＸのデンハーツ＝０．０２％（ｗ／ｖ）のフィコール、 ０．０２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、及び０．０２％　（ｗ／　ｖ　 ）の牛血清アルブミン分画Ｖ）、３０％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌの ホモミックス（長さ一５〜１５塩基のｌ？ＮＡフラグメントをもたらす加水分解 化ＲＮＡ）。

ＣＡＰ緩衝液はＯ，ＩＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６，５及び０．２Ｍのリン 酸ナトリウムである。

アルカリホスファターゼのための蛍光基質は０．０２＋ｎＭの４−メチル−ウン ベリフェリルホスフェート、０．０５Ｍのトリス、ｐＨ９，５、ＩｍＭのＭｇＣ ＋、及び０．５［ＯＭのｚｎｃＩｔである。

オリゴヌクレオチド配列： ＧＶＯＯ３：　５　’　ＡＧＡ−ＣＧＧ−ＣＴＣ−ＣＡＴ−ＣＣＣ−ＡＡＡ−Ａ ＧＧ−ＧＴＴ　３　’Ｃａ１００４：　５’ＴＴＣ−ＣＴＣ−ＧＴＴ−ＡＡＧ− ＧＴＡ−４ＴＴ−ＡＣＡ−ＴＴＧ−ＴＡＣ３’［Ｊｐ３３：　５’ＧＡＡ−ＴＴ Ａ−ＣＣＧ−ＣＧＧ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−Ｇ３’Ｇｖ００９：　５’ＧＧＣ−ＣＣ Ｃ−ＡＣＡ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＣ−ＣＧＴ３’１ＪＰＯ４１：　５ ’ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＣＣＴ−ＣＣＣ−ＧＴＡ−ＧＧＡ−ＧＴ３’ＵＰＯＯ７：　 ５’ＧＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＧ−ＣＧＧ−ＣＴＧ−ＣＴＧ３’Ｔｒｖ１２：　５　 ’　ＡＴＣ−ＣＴＮ−ＡＡＡ−ＧＡＣ−ＣＣＧ−ＡＡＧ−ＣＣＴ−ＣＴＣ３’Ｕ Ｐ２８二　５　’　ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＴＧＴ−ＡＣＡ−Ａ　３ 　’配列Ｔｒｖ１２において、「Ｎ」はＡ、　Ｃ，ＧもしくはＴ／Ｕ、又は未知 もしくは他のヌクレオチドである。

ポリ（エチレンイミン）はポリサイエンス（つオーリングトン市、ＰＡ）より購 入できる。

研磨化又は研磨されていないナイロンビーズはプレシジョンポール社（シカゴ市 、ＩＬ）及びツーバーグループ（ソルトＳｔ、マリー市、Ｍｒ）より購入できる 。

トリエチルオキソニウムテトラフルオロボレート、ヘキサンジアミン、フェニレ ンジアミン、無水コハク酸、並びにＮ−メチル−ピロリドン、チバクロンブリリ アントレッド、チバクロンブリリアントイエロー、モーダントオレンジ、ファス トブルーＢＢ、　リアクティブブルー２、モーダンドブラウン４及びリアクティ ブブラックはアルドリッヒケミカル（ミルウオーキー市、Ｗｌ）より購入できる 。

Ｎ−スクシニミジル−４−（ヨードアセトアミド）−安息香酸塩（ＳｆＡＢ）及 びツイーン２０はピアース（ロックフォード市、ＩＬ）より購入できる。

グアニジニウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）はコダック（ロチニスター市、Ｎ Ｙ）より購入できる。

手順 成装置又は類似の装置を用い、ホスホラミジット化学を利用して合成する。この オリゴヌクレオチドは商社により供給される標準のホスホラミジット化学又はＨ −ホスホネート化学を利用して調製される。適切にブロックされたｄＡ、　ｄＧ 、　ｄＣ及びｄＴホスホラミジットはこのような形態において市販されており、 そして合成ヌクレオシドは容易に適切な形態へと変換されうる。オリゴヌクレオ チドは標準の方法の適用により精製される。５′〜トリチル基を有するオリゴヌ クレオチドを１２μｍの３００人レイしン（つオバーン市、ＭＡ）ダイナマック スＣ−８４，２Ｘ２５０＋１１０１逆泪カラムを利用し、０．ＩＮのＥｔ２ＮＨ ”０Ａｃ−、ｐＨ７，０１：おける１５％　〜５５！％　（７）ＭｅＣＮ（７） ２０分間＋、：　ゎた６勾配を用いるＨＰＬＣでクロマトグラフィーする。脱ト リチルを行うとき、ゲル排除クロマトグラフィーによりこのオリゴヌクレオチド を更に精製しておく。オリゴヌクレオチドの品質の分析チェックはアルカリ９Ｈ でのＴａ５ｏ−Ｈａａｓ　ＤＥＡε−ＮＰＩ？カラム及びポリアクリルアミド電 気泳動（ＰＡＧＥ）により実施した。

ポリマーコート化ナイロンビーズの調製：２５、０００個の径３／３２インチの 研磨していないナイロンビーズを、２００％の無水Ｎ−メチル−ピロリドン１８ ００岨を含むフラスコの中に入れ、そして周囲温度で５分間混ぜる。ジクロロメ タン中のＩモラーのトリエチルオキソニウムテトラフルオロボレー）　２００ｍ １を加え、次いでこの混合物を周囲温度で３０分間撹拌する。次にこのビーズを デカントし、そして１００％のＮ−メチル−ピロリドン５００ｍ１の４回の交換 で迅速に洗う。次にこのビーズを、Ｎ−メチル−ピロリドン中の、ポリ（エチレ ンイミン）の３０％の水溶液より調製した３％（Ｗ／Ｖ）の１０．　ＯＯＯＭＷ ポリ（エチレンイミン）より成る溶液に移し、そして周囲温度で１２〜２４時間 撹拌する。このビーズを２０００ｍ１のＮ−メチルピロリドン、ｌ０００［＋１ １のＳＤＳ　／ＦＷ、そして最後にユリツタ−の蒸留水で１０回洗う。次にこの ビーズを熱を利用せずに４〜５時間高真空のもとで乾かす。このビーズのアミン 含有量をピクリルスルホン酸との反応により決定する。

塩化シアヌル酸誘導化オリゴヌクレオチドの調製：１０−１０００μｇの５′− アミン−結合化オリゴヌクレオチドであって、３′末端にて１２Ｐによりラベル された、少量の同一のオリゴヌクレオチドによりスパイクされたものをアルカリ 性緩衝液（好ましくは９Ｈ８，３〜８．５）ｉ：おける１０％（ｗ／ｖ）のＮ− メチル−プロリドン中の過剰量の再結晶化塩化シアヌル酸と周囲温度で３０〜１ ２０分間反応させる。この最終反応条件は０．１５Ｍの硼酸ナトリウム、ｐＨ８ ，３，２ｍｇ／ｍｌの再結晶化塩化シアヌル酸及び５００μｇ／［Ｉｌｌの適切 なアミノへキシルオリゴヌクレオチドである。未反応塩化シアヌル酸をＧ−５０ セフアデツクス（開襟）カラム（ファルマシア、アップサラ市、スウエデン）上 でのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。

塩化シアヌル酸誘導化オリゴヌクレオチド及びポリ（エチレンイミン）コート化 ナイロンビーズ（前記）をビーズ容量と等しい容量の４°Ｃの０．１Ｍの硼酸ナ トリウム、ｐＨ８，３の中に入れる。精製塩化シアヌル酸誘導化オリゴヌクレオ チドを次にビーズに加え、そしてこの混合物を周囲温度で６０分間強く撹拌する 。次にこのビーズを０．ＩＭの硼酸ナトリウム（ｐＨ８，３）により２回洗う。

無水コハク酸を次に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ビーズ容量の３倍容量を有する９ ０％（ｗ／ｖ）のＮ−メチル−ピロリドン及び１０％（Ｗ／Ｖ）のＩＭの硼酸ナ トリウム（ｐＨ８，３）の中に加える。反応を周囲温度で１時間進行させる。

次にこのビーズを２５０ｍ　ｌの１００％（ｗ／ｖ）のＮ−メチル−ピロリドン で３回、蒸留水で２回、２５０ｍ１のＳＤＳ　／’ＦＷで５回、その後ｌリッタ ーの蒸留水で４回洗う。ビーズを乾燥させて、又は２５ｍＭのＥＤＴＡの中で保 存する。ビーズ当りの放射活性は液体シンチレーション計測により決定されるこ とができ、ビーズ当りの捕捉されたオリゴヌクレオチドの量か計算できるように なる。

解溶液と６５°Ｃて２０分間インキュベートする。二の調製品を次に１５０μｍ の５ＭのＧｕＳＣＮと合わせる。５〜８本の５倍系列希釈品を出発リゼートより 作る。このリゼートにビオチニル化プローブをｌｏＯｎｇ／ｍｌの最終濃度とな るように加える。次にこの溶液を誘導化ナイローブ（捕捉プローブ）により共有 的に固定されたもの）と、約ＩＯ分〜１時間、周囲温度にて、緩やかに撹拌しな からインキュベートする。この固相支持体を次にＳＯＳ　／ＦＷで２回洗う。Ｓ ＤＳ　／ＦＷにおいて最終濃度ｌμｇ／ｍｌ（ストレプトアビジンに基づく）と なるようにストレプトアビジン／ＨＲＰコンジュゲートを加え、次いで約５〜１ ５分、周囲温度で緩やかに撹拌しなからインキュベートする。このビーズをＳＯ Ｓ　／ＦＷで３回洗い、その後ＣＡＰ緩衝液で１回洗う。このビーズを０．３ｍ ｌの４−メトキシ−ナフトール基質溶液（前記）と合わせ、次いで反応を１５５ 分間周囲温で進行させる。この手順のこの段階にて、捕捉プローブビーズはもし Ｇ、バギナリス核酸が検出されるなら着色されるであろう。次にこのビーズをＳ ＤＳ　／ＦＷで直ちに１回、蒸留水で１回洗い、そして暗くして風乾させる。

３／３２インチのナイロンビーズである固相支持体上でのサンドイッチアッセイ 、及びＨＲＰ又はアルカリ性ホスファターゼによるビーズの表層上への不溶性着 色化基質生成物の堆積の後、捕捉された標的核酸の量を蛍光クエンチングにより 決定する。このビーズを周囲温度で１５〜３０分間乾かし、次いでそれぞれを、 丸底の不透明な白色マイクロタイタープレート（ダイナチックラボラドリース、 チャンチイリイー市、ＶＡ）の中に入れる。これらのビーズを次にフルオロメー ター（フルオロスカン■、フローラボラドリース、マツクリーン市、ＶＡ）又は 同等の装置を用いて測定し、ここで励起は３５０ｒ＋ａ＋にて、そして発光は４ ５６ｎｍとする。このビーズは約８００ＲＦＵの固有蛍光を有し、そして比色基 質生成物は固有蛍光を有効に消失させる。より低く示される蛍光はより大量の捕 捉された標的核酸に相関する。

例１は典型的なサンドイッチアッセイ方式におけるシグナルの定量を詳細し、こ こで標的核酸は封鎖され、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いて得られ る比色不溶性酵素生成物を利用して検出される。着色化生成物（即ち、結果）は ビーズの自然蛍光の消失を測定することにより評価されうる。

１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼに溶解溶液を１００μｌ容量において２０分間、 ６５°ＣでｌＸｌ０’個の９．バギナリス細胞を溶解せしめるのに用いる。この リセートを、１．５倍容量の５ＭのＧｕＳＣＮを加えることによって３ＭのＧｕ ＳＣＮへと調節する。細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡの保存領域に相補性なビオチニル 化２４−　ｍａｒオリゴヌクレオチドプローブ（シグナルプローブ）を１１００ ｎ　／ｍｌの最終濃度となるように加える。

このリゼートの５倍系列希釈品を、ビオチニル化シグナルオリゴヌクレオチドを 含む３ＭのＧｕＳＣＮ　ｔ＼イブリダイゼーション溶液を用いて作る。次に各希 釈品（２００μＩ）を周囲温度で３０分間、０．１　μｇのＧ、バギナリスー特 異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕捉プローブ）が共有的に固定化されている ３個の白色ナイロンビーズとインキュベートする。この固相支持体をＳＤＳ　／ ＦＷで周囲温度にて２回洗い、その後ＳＤＳ　／ＦＷ中の１〜２μｇ／ｍｌのス トレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ）コンジュゲー トと５分間周囲温度でインキュベートする。この固相支持体をＳＤＳ　／ＦＷで 洗い、その後、ペルオキシダーゼの存在を、このビーズを約１０−３０分間ＨＲ Ｐ基質溶液（４ＭＮ）とインキュベートして不溶性の青色生成物を生成させるこ とにより決定する。このビーズを次にＳＤＳ　／ＦＷで１回洗い、吸い取り乾燥 し、そして白色の丸底９６穴マイクロタイタープレート（ダイナチックラボラド リース、チャンチリ−市、ＶＡ）に入れる。このビーズは、励起が３５０ｎｍそ して発光が４５６ｎｍであるフルオロメーター（フルオロスカン■、フローラボ ラトリー、マ、ツクリーン市、ＶＡ）を用いて測定する。かかる試験の結果は、 細菌の細胞数の上昇に伴うＲＦＵにおける低下を示す。

例２ 例２は典型的なサンドイッチアッセイ方式におけるシグナルの定量を詳細し、こ こで標的核酸は封鎖され、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いて得られ る比色不溶性酵素生成物を利用して検出される。

プロテイナーゼに溶解溶液を２５０μｍ容量において２０分間、６５°ＣでｌＸ ｌ０’個のＧ、バギナリス細胞を溶解せしめるのに用いる。このリゼートを、１ ．５倍容量の５ＭのＧｕＳＣＮを加えることによって３ＭのＧｕＳＣＮへと調節 する。細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡの保存領域に相補性なビオチニル化２４−　ｍａ ｒオリゴヌクレオチドプローブ（シグナルプローブ）をｌｏｏｎｇ　／ｍｌの最 終濃度となるように加える。

このリゼートの５倍系列希釈品を、ビオチニル化シグナルオリゴヌクレオチドを 含む３ＭのＧｕＳＣＮハイブリダイゼーション溶液を用いて作る。次に各希釈品 を周囲温度で３０分間、０．１　μｇの旦、征エナリスー特異的オリゴヌクレオ チドプローブ（捕捉プローブ）が共有的に固定化されている３個のナイロンビー ズとインキュベートする。この固相支持体をＳＤＳ　／ＦＷで周囲温度にて２回 洗い、その後ＡＰＲ緩衝液中の１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン／アルカリ ホスファターゼ（ＳＡ／ＡＰ）コンジュゲートと５分間周囲温度でインキュベー トする。この固相支持体をＡＰＢ緩衝液で洗う。アルカリホスファターゼの存在 を、このビーズを約１〜４時間ＴＭＮＺ基質溶液とインキュベートして不溶性の ホルマザン生成物を生成させることにより決定する。このビーズを次にＳＤＳ　 ／ＦＷで１回洗い、吸い取り乾燥し、そして白色の丸底９６穴マイクロタイター プレート（ダイナテックラポラドリース、チャンチリ−市、ＶＡ）に入れる。こ のビーズは、励起が３５０ｒ＋ｍそして発光が４５６ｎｍであるフルオロメータ ー（フルオロスカン■、フローラボラトリー、マツクリーン市、ＶＡ）を用いて 測定する。かかる試験の結果は、細菌の細胞数の上昇に伴うＲＦＵにおける低下 を示す。

例３ 例３はサンドイッチアッセイ方式におけるナイロン固相支持体の利用を示し、こ こで標的核酸は封鎖され、次いでマイクロタイターウェル態様におけるビーズの 存在下において蛍光生成物の検出することを基礎とするアッセイ方式を利用して 検出される。

プロテイナーゼに溶解溶液を１００μｍ容量において２０分間、６５°ＣでｌＸ ｌ０’個のＧ、バギナリス細胞を溶解せしめるのに用いる。このリゼートを、１ ．５倍容量の５ＭのＧｕＳＣＮを加えることによって３ＭのＧｕＳＣＮへと調節 する。細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡの保存領域に相補性なビオチニル化２４−　ｒｎ ｅｒオリゴヌクレオチドプローブ（シグナルプローブ）を１１００ｎ　／ｍｌの 最終濃度となるように加える。

このリゼートの５倍系列希釈品を、ビオチニル化シグナルオリゴヌクレオチドを 含む３ＭのＧｕＳＣＮハイブリダイゼーション溶液を用いて作る。次に各希釈品 を周囲温度で３０分間、それぞれに０．１ＭｇのＧ、バギナリスー特異的オリゴ ヌクレオチドプローブ（捕捉プローブ）か共育的に固定化している、ツーバーグ ループ（サルトＳｔ。

マリー市、Ｍｌ）により作られた２個の黒色ナイロンビーズ及び２個の天然色ナ イロンビーズとインキュベートする。この面相支持体をＳＯＳ　／ＦＷで周囲温 度にて洗い、次いで０．１９６（ｖ／ｖ）のツイーン２０、ＩｍＭのＭｇＣＩｇ 　、０．０１Ｍのトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０（ＡＰＲ）で洗い、その後Ａ ＰＢ中の０．４μｇ／ｍｌのストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ（Ｓ Ａ／ＡＰ）コンジュゲートと５分間周囲温度でインキュベートする。この面相支 持体をＡＰＢで５回、ＴＭＮＺで１回洗い、その後、アルカリホスファターゼの 存在は、このナイロンビーズそれぞれを黒色マイクロタイターウェルストリップ （ダイナチックラボラドリース、チャンチリ−市、ＶＡ）の中で０．５−の４− メチル−ウンベリフェリルホスフェート（４−ヒドロキシメチル　クマリン）１ ５０μｍとインキュベートせしめることにより決定できる。インキュベーション は３７°Ｃで３０分間とする。このプレートを次に３６０ｎｍの励起波長及び４ ５６ｎｍの発光波長を利用するフルオロスヵン■フルオロメーター（フローラボ ラトリー、マツクリーン市、ＶＡ）を用いて直接測定する。

バージン（天然色）ナイロンビーズに関連する非常に高い強度の蛍光（８００− ９００ＲＦｔｌ）の結果、黒色ナイロンビーズを用いることにより高レベルの細 胞（標的核酸）か、天然色ナイロンビーズ固相支持体と比較して、ビーズの存在 下において定量を実施したときに検出されるであろう。低い固有蛍光を存する黒 色ナイロンビーズは蛍光ベースシグナル系を利用する旦、バギナリス　１６Ｓ　 ｒＲＮＡの声感度検出を可能にする。天然色ビーズを溶液から物理的に除去した コントロールを測定し、そしてこの溶液は黒色ビーズの存在下において測定され たときと同等の９．バギナリスの検出レベルを示すことが予測される。

興工 例４は複数種の色素による３７３２インチのナイロンビーズの着色又は染色、及 びナイロンビーズの固有蛍光の結果としての低下を詳細する。

約５００ｍｇのモーダントレッド、リアクティブブルー２、モーダンドブラウン ４、チバクロンブリリアントレッド、チバクロンブリリアントイエロー、リアク ティブブラック又はモーダントレッドを５０ｍ１の５０％（ｖ／ｖ）のＮ−メチ ル−ピロリドン及び０．２Ｍの硼酸ナトリウム（ｐＨ８，３）に溶かし、次いで １０００個の３／３２インチのナイロンビーズと周囲温度で２４時間及び６５° Ｃで１時間インキュベートする。次にこのビーズを５０［０１の１００％のＮ− メチル−ピロリドンの１０回交換及び５０ｍ１の蒸留水の５回交換により洗う。

このビーズを次に真空のもとて２５時間乾かす。各色のグループからの８個のビ ーズを丸底白色マイクロタイタープレートに入れる。

このプレートを次に３６０ｎｍの励起波長及び４５６ｎｍの発光波長を用いるフ ルオロスカン■フルオロメーター（フローラボラドリース、マツクリ−市、ＶＡ ）を用いて直接測定する。その結果を以下の表２染色化ビーズ及び蛍光シグナル 色　ｉ？ＦＵ 天然（白）　２０００ フアストブルー８８　１０ ナイロンビーズの着色はナイロンビーズの固有蛍光を存意に低め、従ってモーダ ンドブラウン、リアクティブブラック、ファストブルーＢＢ及びリアクティブブ ルーにより染色したときにビーズは蛍光ベースアッセイに適合するようになる。

例５ 例５は本発明と常用のＢＶ診断技術の実施において採用する診断基準との相関を 示す。

腟洗浄物を、標準臨床基準によりＢＶに関して陽性であると決定された４３人の 女性及び７０人のＢＶ陰性女性から集めた。これらのサンプルはワシントン大学 のスチューデント　ヘルス　クリニックに訪れた女性より獲得した。女性の９２ ％が白色人種であり、そして８％の東洋人であり、平均年齢は２３．８才であっ た。試験した女性のうちの８０％か未婚であった。妊婦はいなかった。この疾患 に関する現状のゴールドスタンダード診断を採用することにより、女性はＢＶに 関して陽性であａ定される。ＢＶ陰性女性はゴールドスタンダード基準１字に従 ってＢＶについて陰性であり、そして膣炎の明らかな徴候又は症状を有していな かった。

腟ｐＨは検査時に測定した。３ｍｌの無菌のハングのバランス塩溶液（フロー　 ラボラドリース、マツクリーン市、ＶＡ）を患者の腟の中に注射し、次いで無菌 試験管に戻した。この腟洗浄物０．２５ｍ１を０．５ｍｌの５ＭのＧｕＳＣＮに 加えた。

５０及びｌＯμｌの各リゼートのアリコートを３ＭのＧｕＳＣＮにおいて最終容 量２００μｍとなるように希釈し、次いでシュレイバー　アンド　シュレルミニ ホールド■スロットプロット鋳型を用いてニドランフイルター（シュレイバー　 アンド　シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ）、キーン市、Ｎ Ｈ）上に載せた。Ｇ、バギナリス由来の精製１６Ｓ　ｒＲＮＡの系列希釈品を各 ニドランフイルターの上に含ませ、定量のための標準品を得た。このフィルター を８０℃で２時間焼いてＧ。

バギナリス細胞を溶解させ、そして遊離化ＲＮＡをニドランフイルター上に固定 させた。次にこのフィルターをＩ　ｘ　ＩＯ’ｃｐｍ／ｌｎｌの３２Ｐ−ゴヌク レオチド（即ち、これは正常腟微生物表の他の７０種類以上の潜在的交差反応性 種を負荷したときに旦、バギナリスの１６Ｓ　ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイ ズする）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションはシール　ア　ミー ルバッグ（ディジー社）の中で、ハイブリダイゼーション／スロットプロット溶 液中で実施した。フィルターをＳＤＳ　／ＦＷで５５°Ｃで３回洗い、その後コ ダックＸ　−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムに暴露し、標準の方法によって現像した。

サンプル中に存在しているＧ、バギナリス細胞の量は、フィルター上の標準品か ら獲得されるシグナル強度と患者から獲得されるそれとを比較することにより定 量される。これらの比較結果は更なるスロットプロット実験の結果としての細胞 数で表現されうる。同じ１６Ｓ　ｒＲＮＡ標準品の系列希釈品をミニホールドゴ スロットプロット鋳型を用いてニドランフイルター上に載せた。既知の細胞数（ 前記した文献に記述されている微生物学的方法により測定）を有する３種の異な るＧ、バギナリス培養物に由来する系列希釈したリゼートもこのフィルター上に 載せた。このスロットプロットを８０℃で２時間べ−りし、そして２２ｐ−ラベ ル化Ｇ、バギナリスー特異性プローブ、ＧＶＯＯ３とハイブリダイズさせた。フ ィルターを洗い、次いでコダックＸ　−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムに暴露し、これ を標準の手順により現像した。得られるオートラジオグラムの目視検査は一定量 の１６３　ｒＲＮＡと既知数のＧ、バギナリス細胞との相関の表示を可能とする 。

この相関を患者サンプルスロットプロットのオートラジオグラムと組合せ、以下 の表３に記載の細胞数を得た。

表３ ＢＶ相　関 Ａ、ＢＶ−陽性患者： ２　５．３　２．４Ｘ１０”　＋ ３　５．０　９．６Ｘ１０”　＋ ４５．０３．３ｘｌＯ’　十 ５　５．０　４．２ＸｌＯ”　＋ ６　５．０　９ＸＩＯ’　＋ ７　５．０　２．４ＸＩＯ”　＋ ８　５．０　３ｘｌＯ’　＋ ９　４．７　６Ｘ１０”　＋ １０　５．３　３．９ｘｌＯ”　＋ １１　５．０　６．６ＸＩＯ’　＋ １２５．０１．２ＸＩＯ”　＋ １３５．３３．６ｘｌＯ’　十 １４　５．０　６ｘｌＯ’　十　− １５４，６９，６ＸＩ０７十 １６　５．３　９．６ｘｌＯ’　＋ １７４．７１．５Ｘ１０’　＋ １８５．３７．２ＸＩ０７十 １９４．７３ｘｌＯ’　＋ ２０５．０４．８ＸｌＯ’　＋ ２１４．７３．６Ｘ１０’　＋ ２２５．０３．６ｘｌＯ’　十 ２３　５．９　１．２ｘｌＯ’　＋ ２４５．３４．８ｘｌＯ”　＋ ２５５．０１．２ｘｌＯ’　＋ ２６４．７９．６Ｘ１０’　十 表　３（続き） ＢＶ相　関 ＢＶ−陽性患者（続き）： Ｂ、ＢＶ−陰性患者： ６　４．３　３．６ｘｌＯ”　− 表　３（続き） ＢＶ相　関 ＢＶ−陰性患者（続き）。

３２　４．０　＜１ｘｌＯ”　− 表　３（続き） ＢＶ相　関 ５８　４．０　１．２ＸＩＯ”　− 表　３（続き） ＢＶ相　関 このスロットプロット分析の検出下限界は、標準品より得られるシグナルを基礎 として約ｌＸｌ０’のＧ、バギナリス細胞数であった。

この結果はＢＶの臨床診断と、４．５より高い腟１）Ｈを有する女性における２ 　Ｘ　Ｘ　１０”の細胞／膣液ｌｎｌより高い又はそれに等しいＧ、　／＜’Ｆ ’ｆ−れた。トリコモナス症及び子宮頚炎を有する女性は腟ｐＨ＞４．５を示す が、Ｇ、バギナリス細胞数＜　２　Ｘ　１０”を示すものと予測されつる（即ち 、ＢＶ陰性として診断されるであろう）。

例６ 例６は複合生物学的サンプル、そして特に腟サンプル中のガードネレラ　バギナ リス、キャンディダ種及びトリコモナス　バギナリスの同時検出を詳細する。

ハイブリダイゼーションｒ溶液は８３ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ７，５；　１７ ｍＭのＥＤＴＡ　；　８．３５％（ｖ　／　ｖ　）のホルムアミド；　５　ＭＯ ）ＧｕＳＣＮ　；及びＶ）のＮ−ラウロイルサルコシン：０．５％（ｗ／ｖ）の ＳＤＳ　；及び０．１％のプロコリン（商標）（防腐剤）である。

基質溶液Ｂは１％（Ｗ／Ｖ）の４−メトキシナフトール；０，１％（Ｖ　／　Ｖ 　）の酢酸；及びイソプロパツールである。

ハイブリダイゼーシタン■溶液は３ＭのＧｕＳＣＮ；０．３Ｍのイミダゾール： ５％（ｖ／ｖ）のホルムアミド；　５０ｍＭのトリス−ＣＬ　ｐＨ８，５：手順 コントロールプローブ、１　ｔｔ　ｇ／ｍｌ　；　ＵＰＯ５３，５００μｇ／ｍ １．　Ｃａ　：ＴＰＶＯＩ７．５００　ａ　ｇ／ｍ１．　ＴＶ）である。

アッセイ洗浄溶液は９．ＩｍＭのトリス−ＣＬ　ｐＨ８，０；Ｎａ−ＥＤＴＡ； 　１％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシン；１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ　；及 び０．１９６（ｗ／ｖ）のブロクリン（防腐剤である）。

コンジュゲート溶液はストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼフンシ ュゲート、１〜３μｇＳＡ／ｍｌである。

基質溶液Ｉは１００＋＋＋ＭのＮａ　ＨｚＰＯ４，ｐＨ６，５；　１２ｍＭ（Ｄ クエン酸塩；及び１．８％（Ｖ　／　Ｖ　）の過酸化水素である。

オリゴヌクレオチドプローブ； ＣＡＬＯ１５：　５　’　ＴＴＧ−ＴＴＣ−ＣＴＣ−ＧＴＴ−ＡＡＧ−ＧＴＡ− ＴＴＴ−ＡＣＡ−ＴＴＧ−ＴＡＣ−Ｔｅ３　’ＴＲＶＯＩ５：　５　’　ＡＴＣ −ＣＴＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＣＣＧ−ＡＡＧ−ＣＣＴ−ＣＴＣ３’ＴＲＶＯ１７ ：　５　’　ＧＴＣ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＡＴＣ−ＴＧＧ−ＴＣＣ−ＴＧ Ｇ−ＴＡＡ−Ｇ３　’υＰＯ５３：　５　’　ＧＧＡ−ＡＴＴ−ＡＣＣ−ＧＣＧ −ＧＣＴ−ＧＣＴ−ＧＧＣ３’手順： 腟の病気を示す症候女性から患者サンプルを集めた。この患者は好ましくはサン プル集取の一週間前に抗細菌又は抗真菌薬品で処置されていなく、且つ、サンプ ル集取の２４時間以内に入浴していない。

ブレスコアーハンドルを有する無菌のダクロン製スワブを腟壁に対して２ないし ３回、このスワブ全体が腟壁に接触していることを確認しながらねじる又は回転 させることにより、膣液サンプルを得るのに用いた。次にこのスワブをサンプル 集取チューブに入れ、このスワブのフレスコアーハンドルを折り、そしてチュー ブをキャップした。患者より潤滑せしめていない鏡を取り除き、そしてｐＨ指示 ストリップをこの鏡に接触させることによって腟ｐＨを測定した。

このスワブ／サンプルは＝　（１）室温での迅速なる処理及び分析に移した：　 （２）処理及び分析前の４時間にわたり０°Ｃ〜８°Ｃに保った；又は（３）処 理及び分析前の１時間にわたり室温に保った；かのいづれかである。処理を開始 するため、０．３ｍｌの溶解溶液をスワブ／サンプルに加え、これを溶解溶液の 中で約１０〜１５秒間撹拌した。このスワブ及び溶解溶液を含むチューブを８５ °Ｃで約５分間（４−８分間）熱し、０．４５ｍ１のハイブリダイゼーションＩ 溶液をこのサンプルに加え、そしてこのチューブの内容物を指で１０回たたいて 混合した。この時点で、サンプルは室温で２４時間まで保存することがでつる。

このスワブ内容物をこのチューブの側面に沿ってこのスワブを回転させることに よって抽出させた。チューブに残っている溶液を半自動化装置で処理した。この サンプル溶液を７穴試薬カセツトの第１ウエルの中に濾過して入れた。５個のビ ーズ（即ち、手順コントロール、［コントロール、ガードネレラ　バギナリスー 特異的捕ツブスティックを抱え、そしてこのディツプスティックを、第１ウエル （サンプルリゼット溶液）から以下のウェル：ウェル２＝ハイブリダイゼーシヨ ン■溶液：ウエル３＝アッセイ洗浄溶液；ウェル４＝コンジュゲート溶液：ウェ ル５及び６＝アッセイ洗浄溶液：及びウェル７＝基質溶液■、にわたって移動さ せた。自動化サンプル処理の終了時での試験ビーズ上の青色の存在は標的生物に 由来する検出可能な核酸のレベルの指標である。アッセイ開蓋に関して、この手 順コントロールは青色に変わり、そして陰性コントロールビーズは無色のままで あるべきである。ビーズ上の青色の強度はイメージアナライザーを用いて評価さ れる。

国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．複合生物学的サンプル中のガードネレラ　バギナリス、キャンディダ種及び トリコモナス　バギナリスを同時検出するための方法であって： （ａ）サンプルと溶解溶液とを合わせ、これによりリゼートを形成せしめ； （ｂ）このリゼートを、第１ハイブリダイゼーション溶液と、並びに少なくとも ３種の捕促オリゴヌクレオチドコート化ビーズが結合して有している非孔質固相 支持体を含んで成るディップスティックと接触させ（ここで第１ビーズはガード ネレラ　バギナリス核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、第２ビーズ はキャンディダ種核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、そして第３ビ ーズはトリコモナス　バギナリス核酸に特異的にハイブリダイズすることができ る）； （ｃ）このディップスティックを、少なくとも２種類のシグナルオリゴヌクレオ チドを含む第２ハイブリダイゼーション溶液と接触させ（ここで第１シグナルオ リゴヌクレオチドは原核核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、第２シ グナルオリゴヌクレオチドは真核核酸に特異的にハイブリダイズすることができ る）；そして （ｄ）該ビーズに関連するシグナルを検出することによりサンプル中のガードネ レラ　バギナリス、キャンディダ種及び／又はトリコモナス　バギナリスの存在 を検出すること、を含んで成る方法。
2. ２．前記の第２ハイブリダイゼーシヨンが少なくとも３種のオリゴヌクレオチド を含み、ここで、第１シグナルオリゴヌクレオチドはガードネレラ　バギナリス 核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、第２シグナルオリゴヌクレオチ ドはキャノディダ種核酸に特異的にハイプリダイズすることができ、そして第３ シグナルオリゴヌクレオチドはトリコモナス　ハギナリスに特異的にハイブリダ イズすることができる、請求項１に記載の方法。
3. ３．サンプルのｐＨを決定する段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記リゼートをグアニジニウムチオシアネートの存在下において約８５℃で 約５分間熱することを更に含んで成る請求項１に記載の方法。
5. ５．前記捕促オリゴヌクレオチドが標的リボソームＲＮＡに相補性である、請求 項１に記載の方法。
6. ６．前記シグナルオリゴヌクレオチドが検出可能マーカーに結合している又は結 合することができる、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記シグナルオリゴヌクレオチドがビオチンに結合しており、そして前記検 出可能マーカーがアビジンに結合している、請求項６に記載の方法。
8. ８．ガードネレラ　バギナリス、キャンディダ種及びトリコモナス　バギナリス を同時検出するためのキットであって：（ａ）少なくとも３種の捕促オリゴヌク レオチドコート化ビーズが結合して有している非孔質固相支持体を含んで成るデ ィップスティック（ここで、第１ビーズはガードネレラ　バギナリス核酸に特異 的にハイブリダイズすることができ、第２ビーズはキャンディダ種核酸に特異的 にハイブリダイズすることができ、そして第３ビーズはトリコモナス　バギナリ スに特異的にハイブリダイズすることができる）：並びに （ｂ）少なくとも２種類のシグナルオリゴヌクレオチドを含む容器（ここで第１ シグナルオリゴヌクレオチドは原核核酸にハイブリダイズすることができ、そし て第２シグナルオリゴヌクレオチドは真核核酸にハイブリダイズすることができ る）；を含んで成るキット。
9. ９．前記容器が少なくとも３種のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第１シグ ナルオリゴヌクレオチドはガードネレラ　バギナリス核酸に特異的にハイブリダ イズすることができ、第２シグナルオリゴヌクレオチドはキャンディダ種核酸に 特異的にハイブリダイズすることができ、そして第３シグナルオリゴヌクレオチ ドはトリコモナス　バギナリスに特異的にハイブリダイズすることができる、請 求項８に記載のキット。
10. １０．試薬カセット又は多穴試薬容器を更に含んで成る請求項８に記載のキット 。
11. １１．溶解溶液を更に含んで成る請求項８に記載のキット。