WO2011115465A2 - 멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용한 여성 생식기 병원체 검출 방법 및 키트 - Google Patents

멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용한 여성 생식기 병원체 검출 방법 및 키트 Download PDF

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WO2011115465A2
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배수미
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Definitions

  • the present invention relates to a primer set for detecting female genital pathogen microorganisms, a method and kit for detecting female genital pathogen microorganisms using the primer set.
  • Inflammation of the genitourinary system in women is the most common disease, which ranges from bacterial to parasitic to viral, accompanied by pruritus, severe inflammation and odor, and severely infertility. Because it causes serious diseases, such as causing abnormalities, it is very important to prevent fatal complications as well as appropriate prevention and diagnosis as well as treatment.
  • Representative female genital infections include bacterial vaginosis trichomoniasis vaginitis, vulva and vaginal candidiasis, chronic vulvar candidiasis, general inflammatory vaginitis, atrophic vaginitis and cervical vaginitis.
  • STD sexually transmitted disease
  • STD pathogen-tested products approved by the US FDA are tested for only one or multiple STD pathogens (C. trachomatis, N. gonorrhoeae) as a method of PCR, hybrid capture, or hybridization protection assay. It is enough.
  • STD pathogens C. trachomatis, N. gonorrhoeae
  • other STDs or urogenital inflammation-causing agents other than these two species can also cause serious illnesses, such as infertility and genetic abnormalities in newborns, many of which are asymptomatic and 30% of infected people do not know they are infected.
  • a method of simultaneously examining as many pathogens as possible is urgently needed.
  • the present inventors have developed a primer set capable of analyzing the extent and extent of infection of 14 female genital pathogens, a method and kit for detecting female genital pathogen microorganisms using the primer set, and the urinary system comprising STD pathogens.
  • the present invention enables the rapid and simple detection of GAPDH, which is a major causative pathogen and a positive control group that causes reproductive inflammation, at the same time with high sensitivity and accuracy.
  • the present invention is to provide a primer set for detecting a female genital pathogen microorganism comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention is to provide a primer set for detecting a female genital pathogen microorganism comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention 1) a first PCR amplification of the female genital pathogen microorganism gene using a primer set comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from the sample to be analyzed; 2) second PCR amplification of said first PCR amplified product into a single strand of nucleic acid labeled with a marker using one of said primer sets; 3) hybridizing the secondary PCR amplified product with at least one female genital pathogen microorganism detection probe; 4) reacting the hybridization reactants with a specific binder of the marker to which the fluorescent substance is attached; And 5) detecting a female genital pathogen microorganism in a sample by measuring a fluorescence value.
  • the present invention provides a primer set comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a primer set comprising a primer of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • Ureaplasma urealyticum Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Clostridium innocum, Escherichia, each having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 7-20.
  • the present invention includes non gonococcal urethritis, ductility, acute sexually transmitted disease, purulent focal lymphadenitis, cervicitis and endocarditis, tubal inflammation and pelvic inflammatory disease, vulva and vaginal candidiasis, gonorrhea, urinary tract infection, pelvic inflammatory disease, syphilis, cervical dysplasia Samples of 14 pathogens that cause a variety of female genital diseases can be analyzed quickly, accurately and easily.
  • the technology and products according to the present invention can be widely used for the primary search or confirmation and determination of treatment policy, and replaces existing DNA test kits such as conventional culture or staining and single PCR or multiplex polymerase chain reaction. It can be used directly in the diagnosis of STD or urogenital disease-causing pathogens.
  • the technology according to the present invention will be applicable to the genetic diagnosis of infectious diseases and other diseases such as diabetes, cancer.
  • FIG. 1 schematically illustrates the basic principle of a multiplex bead array.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of nucleic acid bead binding.
  • Figure 3 shows the PCR conditions by electrophoresis of the PCR product for the standard sample (14 microorganism genomic DNA) on 1.5% agarose gel as a result of PCR.
  • the present invention provides a primer set for detecting a female genital pathogen microorganism comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the primer set is Ureaplasma urealyticum, Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus orares.
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus pyogenes
  • Clostridium perfringens Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae
  • Pseudomonas aeruginosa One or more pathogen microorganisms selected from the group consisting of Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae and Aeromonas hydrophila can be detected, and the microorganisms can be detected simultaneously.
  • the present invention also provides a primer set for detecting a female genital pathogen microorganism comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the primer set can detect one or more pathogen microorganisms selected from the group consisting of Candida albicans and Trichomonas vaginalis, and can also detect the microorganisms simultaneously.
  • the present invention provides a method for detecting a female genital pathogen microorganism comprising the following steps.
  • step 1) further using a primer set comprising a primer of the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer of the base sequence of SEQ ID NO: 4, and in step 2) of the primer of the base sequence of SEQ ID NO:
  • One primer of the primer set including the primer of the nucleotide sequence may be further used.
  • the method comprises ureaplasma urealyticum, Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus orares (Staphylococcus Saprophyticus) Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa (Staphylococcus aureus) Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae and Aeromonas hydrophila can detect one or more female genital pathogen microorganisms selected from the group consisting of primers and sequences of SEQ ID NO: 3 Further using a primer set containing a primer of the nucleotide sequence of the number 4, Rheaplasma urealyticum, Clostridium innocum, Escherichi
  • the ureaplasma urealyticum Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis Probes for the detection of Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae and Aeromonas hydrophila each detect the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7-20. It may be to have.
  • a primer set for detecting GAPDH gene further comprising a primer of nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer of nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and in step 2) of the primer set for detecting GAPDH gene
  • One more primer may be used, and the probe for detecting GAPDH gene may be further used in step 3).
  • the probe for detecting the GAPDH gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • Female genital pathogen microorganism detection method is characterized in that a series of processes proceed to step 1) to 5). According to the present invention, samples of 14 pathogens can be analyzed quickly, accurately and simply at a time.
  • Step 1) is a first PCR amplification of DNA in a sample using a primer set comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the female in the DNA in the sample Genes of genital pathogen microorganisms are exponentially amplified.
  • pathogen refers to a microorganism causing a disease, and includes bacteria, viruses, rickettsia, protozoa, spiroheta and fungi, preferably pathogenic bacteria or fungi, more preferably ureaplasma ureariumcum (Ureaplasma urealyticum), Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus saproticus Sapro ), Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae ), Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, and Neisseria gonorrhoeae) and Aeromonas hydrophila, including one or more of 14 pathogenic bacteria or fungi.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group, which may form complementary templates and base pairs and is a starting point for copying a template. By short nucleic acid sequence is meant to function. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization in the appropriate buffer and temperature.
  • Ureaplasma urealyticum Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas
  • the primers of SEQ ID NO: 1 and the reverse primers were SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the reverse primer was used as a primer of SEQ ID NO: 4.
  • the primer of the forward primer for the positive control GAPDH was SEQ ID NO: 5
  • the reverse primer was used in SEQ ID NO: 6 (Table 1).
  • Primers of the invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • PCR polymer chain reaction
  • Step 2) is a second PCR amplification with a primer that amplifies the species-specific amplified gene product in step 1) into strands complementary to the probe, and only the strands complementary to the probe are selectively amplified. Hybridization efficiency with the product is increased.
  • the term "labeler” is intended to label genes by marker by performing PCR in the presence of dNTP labeled with a marker-labelable labeling substance. As long as it can be used for gene labeling without interfering with the hybridization of probes and gene products, various materials known in the art can be used. In a specific embodiment of the present invention, biotin was used as a marker, and streptavidin was used as a specific binding agent for the marker, but the present invention is not limited thereto. It may be. Primers labeled with forward or reverse markers are used for amplification with strands labeled with markers. When the hybridizing probe is an antisense strand, the marker is labeled on the forward primer to amplify the sense strand. When the hybridizing probe is a sense strand, the antisense strand is labeled by labeling the marker on the reverse primer. In a specific embodiment of the present invention, a reverse primer was used.
  • a second single-strand PCR labeling method in order to solve the problem of a very low signal, a second single-strand PCR labeling method is introduced, so that the maximum value of mean fluorescence intensity (MFI) that can be obtained is increased. In contrast to about 100, a strong signal with an MFI of about 1,000 was obtained.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • An advantage of secondary single stranded PCR labeling is that there are more fluorescently labeled objects than those obtained from asymmetrical PCR. Both PCR methods are labeled by linear amplification, but in the case of asymmetric amplification, the labeled target can synthesize the double helix again, and the probability of binding to the actual bead array is drastically reduced.
  • Step 3 hybridizes the single-stranded gene product labeled with the second PCR amplified marker with the microsphere beads to which the 14 female genital pathogen detection probes are immobilized.
  • the type is not particularly limited and the bead array manufacturing is in accordance with general methods known in the art.
  • probe specifically binds to a nucleic acid having a complementary nucleotide sequence, and thus means a nucleic acid capable of informing the presence or absence of the nucleic acid according to whether it is bound.
  • Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. Probes of the present invention can be produced by a variety of methods known in the art, according to a specific embodiment of the present invention, based on the results of performing a multiple sequence alignment method for the 16S gene region of each pathogen.
  • ureaplasma urealyticum and Candida albicans Candida albicans (Candida albicans), Trichomonas vaginalis, Clostridium innocum, Escherichia coli, Staphylococcus Saprophyticus, Staphylococcus orares Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa (Staphylococcus aureus) Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae and Aeromonas hydrophila
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 20 were used (
  • the probe was provided in a chemically immobilized form on the microsphere beads so as to specifically react with a biotin-dCTP labeled gene.
  • 2 is a schematic diagram showing the principle of nucleic acid bead binding.
  • Buffer, time and temperature conditions used in the hybridization reaction can be adjusted, in the specific embodiment of the present invention used a buffer as a Hybrisol buffer, the reaction temperature is 5 minutes at 95 °C, 30 minutes at 40 °C It was.
  • Steps 4) and 5) are for confirming the degree of reaction between the probe and the sample prepared by the method as a fluorescence value.
  • the fluorescent material used in this step may preferably be fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde or fluorescamine.
  • phycoetrine was used.
  • the term "multiplex liquid array system” is a fluorescence value detection method for performing the method of the present invention, and the basic principle of the multiplex bead array is shown in FIG.
  • This suspension array is characterized by a three-dimensional method in which hybridization takes place in one tube, followed by simultaneous measurement of 532 nm and 633 nm wavelengths, for example in Luminex 100 ® (Luminex, USA). There is. Fluorescence values measured at 633 nm wavelength identify microsphere beads, and fluorescence values measured at 532 nm wavelength indicate that the PCR product reacted with each probe binds streptavidin-Cy3 or streptavidin-phycoerythrin.
  • the suspension array can be measured at high speed by using the Luminex 100 ® system using Fluorometry technology, and the maximum frequency of fluorescence values of 100-300 microsphere beads is confirmed in one measurement. Therefore, accurate analysis is possible, and the result of fluorescence reaction is shown as a numerical value, so that it is easy to apply quantitative analysis and automation system (Armstrong et al., Cytometry 40: 102-108,2000).
  • Luminex 100 ® a liquid fluorescence multiplex analysis device, has higher accuracy and sensitivity than conventional kits using PCR and hybridization techniques, and complementary to each pathogen-specific base sequence for up to 100 microsphere beads.
  • the detection of the number of pathogens up to 100 at the same time by detecting the combination of probes with This figure can be used to rule out errors caused by electrophoretic analysis, and can identify qualitative and quantitative analyzes as well as whether the infection is large or small.
  • the method of the present invention further uses a primer set for detecting the GAPDH gene comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in step 1), and the GAPDH gene for detecting the GAPDH gene in step 2)
  • a primer set for detecting the GAPDH gene comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in step 1)
  • One primer of the primer set may be further used, and in the step 3), a probe for detecting the GAPDH gene may be further used.
  • the probe for detecting the GAPDH gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the present invention uses the GAPDH gene as an internal control in the method of the present invention described above.
  • GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) is a gene located at human chromosome No. 12 and is an enzyme that is involved in glycolysis, an essential metabolic process in cells.
  • the GADPH primer is designed to specifically amplify the GADPH gene, which is always expressed as an endogenous gene in a sample, and the GAPDH gene detection probe for detecting the GADPH gene is simultaneously hybridized with the pathogen detection probe. This process can immediately determine whether the PCR reaction is successful in the bead array analyzer can significantly reduce the number of undetected cases due to PCR amplification failure.
  • the forward primer for the positive control GAPDH using SEQ ID NO: 5 the reverse primer using the primer of SEQ ID NO: 6
  • the forward probe for GAPDH is SEQ ID NO: 20
  • the present invention provides a primer set comprising a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a primer set comprising a primer of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • Ureaplasma urealyticum Candida albicans, Trichomonas vaginalis, Clostridium innocum, Escherichia, each having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7-20.
  • the kit for detecting pathogens which has a remarkable effect on assay sensitivity, measurement range, specificity, cross-reactivity, and reproducibility, can rapidly and accurately analyze samples of 14 pathogens at once. Anything already described and repetitive matters will be omitted to avoid repetition.
  • Genomic DNA was extracted from STD pathogens using G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (Cat. No. 17121) from Intron biotechnology.
  • Biotin-dCTP-labeled sample genes were dissolved in Hybrisol buffer and hybridized with probe-coupled microsphere beads (5 min at 95 ° C., 30 min at 40 ° C.).
  • microsphere beads were read with Luminex 100 ® and the MFI values of the microsphere beads determined the detection of each microorganism. Genotyping has been well done in several bead array kits, confirming that infection can be determined. 4 shows the conditions under which each bead array reacts.

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Abstract

본 발명은 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 비임균성 요도염, 연성하감, 급성 성병, 화농성 국소 림프절증, 자궁경관염 및 내막염, 난관염과 골반염, 외음부 및 질 칸디다증, 임질, 요로 감염, 골반염증, 매독, 자궁경부 이형증을 포함하는 다양한 여성 생식기 질환을 유발하는 원인 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기술 및 제품은 1차 검색 또는 확진 및 치료방침의 결정을 위해 널리 사용될 수 있으며, 기존의 배양 또는 염색 및 단일 PCR 또는 다중중합효소연쇄반응법 등 기존의 DNA검사 키트를 대체하여 STD 또는 비뇨 생식계 질환 유발 병원체의 진단에 직접적으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기술은 감염증 및 당뇨병, 암과 같은 다른 질병의 유전자 진단에도 응용이 가능할 것이다.

Description

멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용한 여성 생식기 병원체 검출 방법 및 키트
본 발명은 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
여성의 비뇨 생식계 염증은 가장 흔한 질환으로서 이러한 염증은 세균성에서부터 기생충, 바이러스에 이르기까지 매우 다양한데, 소양감, 심한 염증과 악취를 동반하며 심하게는 불임을 유발하며 임신 중의 이러한 감염은 유산 및 신생아의 유전적 이상을 초래하는 등 심각한 질병을 유발하므로 적절한 예방 및 진단은 물론, 치료로서 치명적 합병증을 막는 것이 매우 중요하다. 대표적인 여성 생식기(외음부, 질, 자궁경부 등)의 감염으로는 세균성 바지노시스(bacterial vaginosis) 트리코모나스 질염, 외음부 및 질 칸디다증, 만성 외음부 칸디다증, 일반 염증성 질염, 위축성 질염 및 자궁경 질염 등이 있다. 이러한 비뇨 생식계 염증은 성교를 통해 감염 (Sexually transmitted disease ; STD)되는 경우가 많아 성인의 약 50% 이상이 최소한 한번 이상 감염될 정도로 흔한 질병이므로 STD 병원체 검사 제품의 수요가 더욱 많아질 것으로 예상된다.
그러나, 현재 미국 FDA 승인을 받아 상용중인 STD 병원체 검사 제품들은 PCR방법이나 Hybrid capture, Hybridization protection assay의 방법으로서 단지 2종의 STD 병원체 (C. trachomatis, N. gonorrhoeae)에 대해 단일 또는 다중으로 검사하는 정도이다. 그러나 이 두 종 이외의 다른 STD 또는 비뇨생식계 염증 유발 병원체들 역시 불임증이나 신생아의 유전적 이상을 초래하는 등 심각한 질병을 유발할 수 있으며 상당수의 성병은 무증상이고 감염자의 30%가 감염 사실을 모른 채 생활하고 있기 때문에 병원체의 확산을 막고 적절한 치료를 하기 위해 가능한 많은 병원체를 동시에 검사하는 방법이 절실히 필요한 실정이다.
질환의 치료나 진단에 있어 증상별로 접근하는 것이 편리하기는 하나, 효과적인 치료를 위해서는 병원체를 정확히 동정하는 것이 필요하다. 임상소견으로 병원체를 진단하기도 하지만, 정확한 동정을 위하여 도말, 배양 등의 전통적인 방법, 당이용법, 면역형광법, 공응집법 (co-agglutination) 및 단일군 항체 검사법 등이 행하여지고 있다. 최근에는 병원체의 RNA 또는 DNA 등를 검출하는 방법이 개발되고 있다.
최근 국내 바이오벤처에서 멀티플렉스 PCR기법을 이용하여 4-9종의 STD 병원체에 대한 검사 키트를 개발하여 판매하고 있으나, 이들은 멀티플렉스 PCR을 한 후 전기영동으로 증폭된 밴드의 크기를 보고 감염 여부를 판별하여야 하기 때문에 멀티플렉스 PCR에 포함시킬 수 있는 병원체의 수가 제한적일 수밖에 없고 같은 크기로 증폭된 비특이적 산물과 특이적 산물과의 구별이 어려우며 분석시 비슷한 크기로 증폭이 될 경우 판독자의 오류가 생길 수도 있다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 14종의 여성 생식기 병원체의 감염 여부와 정도를 분석할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 방법 및 키트를 개발하여, STD 병원체를 포함하는 비뇨 생식계 염증을 유발하는 주요 원인 병원체 및 양성대조군인 GAPDH를 높은 민감도와 정확도로 동시에 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트를 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 여성 생식기 병원체 미생물 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계; 2) 상기 1차 PCR 증폭된 산물을 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 핵산으로 2차 PCR 증폭하는 단계; 3) 상기 2차 PCR 증폭된 산물을 1종 이상의 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계; 4) 상기 교잡 반응물을 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계; 및 5) 형광값을 측정하여 시료 내 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 단계를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 키트를 제공하고자 한다.
본 발명에 따르면 비임균성 요도염, 연성하감, 급성 성병, 화농성 국소 림프절증, 자궁경관염 및 내막염, 난관염과 골반염, 외음부 및 질 칸디다증, 임질, 요로 감염, 골반염증, 매독, 자궁경부 이형증을 포함하는 다양한 여성 생식기 질환을 유발하는 원인 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 기술 및 제품은 1차 검색 또는 확진 및 치료방침의 결정을 위해 널리 사용될 수 있으며, 기존의 배양 또는 염색 및 단일 PCR 또는 다중중합효소연쇄반응법 등 기존의 DNA검사 키트를 대체하여 STD 또는 비뇨 생식계 질환 유발 병원체의 진단에 직접적으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기술은 감염증 및 당뇨병, 암과 같은 다른 질병의 유전자 진단에도 응용이 가능할 것이다.
도 1은 멀티플렉스 비드 어레이의 기본원리를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 핵산 비드 결합의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 3은 PCR 기초실험 결과로서, 1.5% 아가로스 젤에 표준시료 (미생물 14종의 게놈 DNA)에 대한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 조건을 확인한 것이다.
도 4는 비드 어레이에서의 기초실험 결과로서, 각 비드 어레이가 반응하는 조건을 확인한 것이다.
일 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물을 검출할 수 있고, 또한, 상기 미생물을 동시에 검출할 수도 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물을 검출할 수 있고, 또한, 상기 미생물을 동시에 검출할 수도 있다.
다른 양태로서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법을 제공한다.
1) 분석하고자 하는 시료로부터 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 여성 생식기 병원체 미생물 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
2) 상기 1차 PCR 증폭된 산물을 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 핵산으로 2차 PCR 증폭하는 단계;
3) 상기 2차 PCR 증폭된 산물을 1종 이상의 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
4) 상기 교잡 반응물을 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계; 및
5) 형광값을 측정하여 시료 내 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 단계.
상기 1) 단계에서 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 더 사용하고, 상기 2) 단계에서 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 더 사용할 수 있다.
상기 방법은 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 여성 생식기 병원체 미생물을 검출할 수 있고, 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 더 사용하면, 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물을 검출할 수 있다.
상기 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브는 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 1) 단계에서 서열번호 5의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열의 프라이머를 포함하는 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트를 더 사용하고, 상기 2) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 더 사용하고, 상기 3) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프로브를 더 사용할 수 있다. 상기 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 서열번호 21의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법은 단계 1) 내지 5)로 진행되는 일련의 과정을 진행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다.
단계 1)은 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 시료 내 DNA를 1차 PCR 증폭하는 단계로, 이 단계에서 시료 내 DNA 중에 있는 여성 생식기 병원체 미생물의 유전자는 지수적으로(exponential) 증폭된다.
본 발명에서 용어, "병원체"는 병을 일으키는 미생물 등을 말하는 것으로 세균, 바이러스, 리케차, 원충, 스피로헤타 및 곰팡이 등을 포함하며, 바람직하게는 병원성 세균 또는 곰팡이, 보다 바람직하게는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도 모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)을 포함하는 14종의 병원성 세균 또는 곰팡이 중 하나 이상을 가리킨다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 검출하기 위한 순방향의 프라이머는 서열번호 1, 역방향의 프라이머는 서열번호 2의 프라이머를 사용하였고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)를 검출하기 위한 순방향의 프라이머는 서열번호 3, 역방향의 프라이머는 서열번호 4의 프라이머를 사용하였다. 특히 양성대조군인 GAPDH에 대한 순방향의 프라이머는 서열번호 5, 역방향의 프라이머는 서열번호 6의 프라이머를 사용하였다(표 1).
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 용어, "PCR(polymer chain reaction)"은 살아있는 유기체 없이 간단한 합성 효소 반응을 이용하여 주형이 되는 핵산으로부터 특정 DNA를 대량으로 증폭시키는 분자 기술로 정의된다. PCR은 주형이 되는 핵산, 프라이머, DNA 폴리머라제(DNA polymerase) 및 dNTP(Deoxynucleotide triphosphate)를 이용하여 핵산의 변성(denaturation), 프라이머의 결합(annealing) 및 DNA의 신장(extention)의 세 단계를 거쳐 진행된다. 각 단계에 적용되는 온도, 시간 및 반복 횟수는 PCR의 종류와 주형 DNA, 프라이머 또는 PCR 기기 등에 따라 달라질 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.
단계 2)는, 단계 1)에서 종 특이적으로 증폭된 유전자 산물을 프로브에 상보적인 가닥으로 증폭시키는 프라이머로 2차 PCR 증폭하는 단계로서, 프로브에 상보적인 가닥만이 선택적으로 증폭되므로 프로브와 유전자 산물과의 교잡 효율이 증가하게 된다.
본 발명에서 용어, "표지자"는 프라이머 표지 가능한 표지 물질로써 표지자가 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하여 유전자를 표지자로 표지하기 위한 것이다. 프로브와 유전자 산물과의 교잡을 방해하지 않고 유전자 표지를 위해 사용할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 표지자로서 바이오틴을 사용하였고, 표지자의 특이적 결합제로서 스트렙타비딘을 사용하였으나 이에 제한되지 않으며, 다양한 흡수 파장을 갖는 다양한 형광 표지자 외에 기타 다양한 방사성 반감기를 갖는 방사성 표지자가 사용될 수도 있다. 표지자로 표지된 가닥으로의 증폭을 위하여 순방향 또는 역방향의 표지자로 표지된 프라이머를 사용한다. 교잡반응을 하는 프로브가 안티센스 가닥일 경우 순방향의 프라이머에 표지자를 표지하여 센스 가닥을 증폭시키고, 교잡반응을 하는 프로브가 센스 가닥일 경우 역방향의 프라이머에 표지자를 표지하여 안티센스 가닥을 증폭시키도록 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 역방향 프라이머를 사용하였다.
특히, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 시그널이 매우 낮은 문제를 해결하기 위해 2차 단일 가닥 PCR 표지화(labeling) 방법을 도입하여, 기존에 얻을 수 있었던 최대 MFI (mean fluorescence intensity, 시그널의 정도)값이 약 100 정도였던 것에 반하여, MFI 값이 약 1,000정도의 강한 시그널을 얻을 수 있었다. 2차 단일 가닥 PCR 표지화의 장점은 형광으로 표지된 대상이 비대칭 PCR(asymmetrical PCR)에서 얻어지는 것보다 많다는 데 있다. 두 PCR 방법 모두 선형 증폭(linear amplification)에 의하여 표지가 되나 비대칭 증폭의 경우 표지된 대상이 다시 이중나선을 합성할 수 있으므로 실제 비드 어레이에 결합될 확률이 급격히 감소한다.
단계 3)은, 상기 2차 PCR 증폭된 표지자로 표지된 단일 가닥의 유전자 산물을 상기 14종의 여성 생식기 병원체 검출용 프로브가 고정된 마이크로스피어 비드와 교잡 반응하는 단계로서, 프로브가 고정되는 비드의 종류는 특별히 제한되지 않으며 비드 어레이 제조는 당 분야에 공지된 일반적인 방법에 따른다.
본 발명에서 용어, "프로브"는 상보적 염기서열을 가지는 핵산과 특이적으로 결합하므로 결합 여부에 따라 이로써 해당 핵산의 존재 여부를 알려줄 수 있는 핵산을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 프로브는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제작할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 각 병원체의 16S 유전자 부위에 대해 다중서열정렬 방법을 수행한 결과를 바탕으로 제작하였다. 상기 프로브를 사용하여 시료와 교잡 반응시, 14종의 여성 생식기 병원체를 특이적으로 검출할 수 있으면 어떤 서열의 프로브라도 모두 포함되며, 바람직하게는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브로서 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 사용하였다(표 2).
본 발명의 구체적인 실시예에서 프로브는 2차 PCR을 통해 바이오틴-dCTP로 표지된 시료 유전자와 특이적 반응을 할 수 있도록 마이크로스피어 비드에 화학적으로 고정된 형태로 제공되었다. 도 2는 핵산 비드 결합의 원리를 나타낸 모식도이다.
교잡 반응시 사용되는 버퍼, 시간 및 온도 조건은 조절될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서 버퍼는 Hybrisol 버퍼를 사용하였고, 반응 온도는 95℃에서 5분, 40℃에서 30분으로 교잡 반응을 하였다.
단계 4) 및 5)는, 상기 프로브와 상기 방법으로 준비된 시료와의 반응 정도를 형광값으로 확인하는 단계이다. 본 단계에 사용되는 형광물질은 바람직하게는, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 피코에트린을 사용하였다.
본 발명에서 용어 "멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템(multiplex liquid array system)"은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 형광값 검출 방법으로서, 도 1에 멀티플렉스 비드 어레이의 기본원리를 모식도로 나타내었다. 이러한 서스펜션 어레이의 특징은 한 튜브(Tube)안에서 교잡반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 예를 들어 Luminex 100® (Luminex사, 미국)시스템에서 동시에 532nm과 633nm파장을 측정함으로써 형광값을 얻는다는 데에 있다. 633nm 파장에서 측정된 형광 값은 마이크로스피어 비드(microsphere bead)를 식별하며, 532nm 파장에서 측정된 형광값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 스트렙타비딘-Cy3 또는 스트렙타비비딘-피코에리쓰린 결합으로 나타난 값이다 (Keji et al., Cytometry 33:31 8-323, 1998). 본 발명의 구체예에서 서스펜션 어레이는 프로우메트리(Fluorometry)기술을 이용한 Luminex 100® 시스템을 사용함으로써 고속측정이 가능하며, 1회 측정으로 100-300개의 마이크로스피어 비드의 형광값의 최대빈도를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하며, 형광반응의 결과가 수치로 나타남으로써 정량 분석 및 자동화 시스템 적용이 용이하다 (Armstrong et al., Cytometry 40:102- 108,2000). 즉, 형광 액상다중분석기기인 Luminex 100®　을 이용하면, PCR기법과 혼성화 기법을 이용한 기존의 키트에 비해 정확도와 민감도가 높으며, 마이크로스피어 비드 최대 100종에 각 병원체 특이적인 염기서열에 상보적인 염기서열을 가진 프로브를 결합시켜 검출하는 방식으로서 병원체 수를 최대 100 종류까지 동시에 검출 가능하므로 키트 내에 포함시킬 수 있는 병원체 수에 크게 제한을 받지 않고, 또한 소프트웨어 프로그램에 의해 지정된 마이크로스피어 비드 종류에 따라 형광 값이 수치로 표시되기 때문에 전기영동 사진 분석에 의한 오류를 배제시킬 수 있으며, 감염 여부뿐만 아니라 감염량의 많고 적음까지도 알 수 있기 때문에 정성 및 정량 분석도 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 종래 기술보다 특이도와 민감도가 높은 멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용하여 3차원적 교잡 반응 후에 Luminex 100®　으로 두 종류의 파장을 동시에 측정하여 형광값을 얻었다. 각각 마이크로스피어 비드를 식별하는 형광값 (633nm) 및 시료와 특이적 결합제와의 결합의 정도를 측정하는 형광값(532nm)을 고속으로 측정하여 정성 및 정량 분석하였다. 이에 따라 상기 14종의 여성 생식기 병원체 감염 여부를 판정할 수 있었다.
본 발명의 방법은 상기 1) 단계에서 서열번호 5의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열의 프라이머를 포함하는 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트를 더 사용하고, 상기 2) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 더 사용하고, 상기 3) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프로브를 더 사용할 수 있다. 상기 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 서열번호 21의 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 본 발명은 GAPDH유전자를 내부 대조군(internal control)로서 상기 기술한 본 발명의 방법에 사용한다.
GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 human chromosome 12번에 위치하는 유전자로서 세포에서 필수적인 대사과정인 glycolysis에 관여하는 효소이며, 세포내에서 항상 발현되면서 그 발현량이 잘 변하지 않는 유전자이다.
GADPH 프라이머는 시료 내의 내재 유전자로서 항상 발현되는 GADPH 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 고안된 것이며, GADPH 유전자를 검출하기 위한 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 상기 병원체 검출용 프로브와 동시에 교잡시킨다. 이 과정을 통해 PCR 반응이 성공적으로 일어나는지 여부를 비드 어레이 분석기 내에서 곧바로 확인할 수 있으므로 PCR 증폭 실패에 따른 불검출 경우의 수를 대폭 낮출 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 양성대조군인 GAPDH에 대한 순방향의 프라이머는 서열번호 5, 역방향의 프라이머는 서열번호 6의 프라이머를 사용하였고, GAPDH에 대한 순방향 프로브는 서열번호 20, 역방향 프로브는 서열번호 21의 프로브를 사용하였다.
또다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따라 분석감도, 측정범위, 특이도, 교차반응성, 및 재현성에 있어서 현저한 효과를 나타내는 병원체 검출용 키트는 병원체 14종의 검체를 한번에 신속하고 정확하며 간편하게 분석할 수 있다. 이미 기술한 내용과 반복되는 사항은 반복을 피하기 위하여 생략한다.
상기 방법의 다양한 변형 및 응용이 가능하고, 이는 본 발명의 범위에 포함된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 프라이머 및 프로브 제작
선정된 병원체의 특이적인 프라이머 및 프로브를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2011001934-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2011001934-appb-T000002
실시예 2. STD 병원체로부터의 게놈 DNA를 추출
Intron biotechnology사의 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (Cat. No. 17121)를 이용하여 STD 병원체로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
실시예 3. PCR을 통한 병원체 게놈 DNA 증폭
실시예 2에서 얻어진 주형 DNA 5 ul(2ng), 실시예 1에서 얻어진 프라이머 각각 0.5 uM, 2.5 mM dNTP mix, 7.5mM 10×PCR buffer (Ultratools, Spain) 5 ul, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U으로 준비된 PCR 반응혼합물을 95℃에서 5분 동안 변형(denature)시킨 후 95℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1분 동안 40번 반복하여 신장(extension)시키고, 72℃에서 7분간 최종 신장시켰다. 도 3은 1.5% 아가로스 젤에 표준시료 (미생물 14종의 게놈 DNA)에 대한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 조건을 확인한 것이다.
실시예 4. 바이오틴--dCTP를 이용한 2차 단일 가닥 PCR을 통해 상보적인 단일 가닥 형성
실시예 3에서 만들어진 PCR 산물을 주형으로 5 ul, 비드 어레이 프로브에 상보적인 가닥을 만드는 역방향 프라이머 (0.5 uM), 2.5 mM dATP, dGTP, dTTP mix, 0.4 mM biotin-dCTP (Invitrogen) 2 ul, 10×PCR buffer (Ultratools, Spain) 5 ul, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U으로 준비된 PCR 반응혼합물을 95℃에서 5분동안 변성시킨 후 94℃ 에서 30 초, 58℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 1분 동안 35번 반복하여 단일 가닥을 증폭했다.
실시예 5. 프로브가 고정된 마이크로스피어 비드의 제작
제작된 프로브 (GAPDH를 포함하여 총 15종)를 각각 100 uM씩 준비하고, 각 반응시키고자 하는 비드를 번호를 맞추어 잘 혼합한 후 40 ul(4~5×105 beads/ul)씩 취해 각 비드에 0.1 M MES (pH 4.5) 20 ul를 섞은 후, 준비된 프로브 20 uM을 덜어서 비드와 섞었다. 그 다음, 새로 만든 10 mg/ml EDC 용액 1 ul를 넣은 후 어두운 곳에서 약 30분간 잘 흔들어 반응시켰다. 여기에 10 mg/ml EDC 용액을 1 ul 더 추가로 넣은 후 어두운 곳에서 약 20분간 잘 흔들어 반응시켰다. 그 다음, 각 튜브에 500 ul의 0.02% Tween-20 용액을 넣어서 잘 섞어주고, 비드와 상층액을 원심분리하여 상층액을 제거했다. 다시 500ul 의 0.1% SDS 용액으로 잘 혼합하고, 비드와 상층액을 원심분리하여 상층액을 제거했다. 마지막으로, 150 ul의 TE(pH 8.0) 버퍼를 넣고 잘 섞은 후, 4℃ 암실에서 보관했다.
실시예 6. 마이크로스피어 비드와 교잡 반응
바이오틴-dCTP로 표지된 시료 유전자를 Hybrisol 버퍼에 녹인 후 프로브가 결합된 마이크로스피어 비드와 교잡반응을 (95℃ 에서 5분, 40℃ 에서 30분) 실시했다.
실시예 7. Luminex 100 ® 기계를 이용하여 시그널 검 출
Luminex 100®으로 총 14종류의 마이크로스피어 비드를 읽었으며, 마이크로스피어 비드의 MFI 값으로 각각의 미생물의 검출 여부를 결정했다. 여러 개의 비드 어레이 키트에서 유전형 분석이 잘 이루어지고 있으며, 이를 통해 감염 여부를 판정할 수 있음을 확인하였다. 도 4는 각 비드 어레이가 반응하는 조건을 확인한 것이다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는, 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물을 검출하는 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 동시에 검출하는 프라이머 세트.
  4. 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는, 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물을 검출하는 프라이머 세트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)를 동시에 검출하는 프라이머 세트.
  7. 1) 분석하고자 하는 시료로부터 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 여성 생식기 병원체 미생물 유전자를 1차 PCR 증폭하는 단계;
    2) 상기 1차 PCR 증폭된 산물을 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 사용하여 표지자로 표지된 단일 가닥의 핵산으로 2차 PCR 증폭하는 단계;
    3) 상기 2차 PCR 증폭된 산물을 1종 이상의 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 프로브와 교잡 반응하는 단계;
    4) 상기 교잡 반응물을 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계; 및
    5) 형광값을 측정하여 시료 내 여성 생식기 병원체 미생물을 검출하는 단계를 포함하는, 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 1) 단계에서 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 더 사용하고, 상기 2) 단계에서 서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 더 사용하는 것인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 2) 단계의 단일 가닥의 핵산의 표지자 표지를 위하여 표지자 표지된 dNTP 존재하에 PCR을 수행하는 것인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 표지자는 비오틴이고 상기 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 여성 생식기 병원체 미생물은 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 여성 생식기 병원체 미생물은 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원체 미생물인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브는 각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 것인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 프로브가 비드에 결합된 형태인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  15. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 1) 단계에서 서열번호 5의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열의 프라이머를 포함하는 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트를 더 사용하고, 상기 2) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프라이머 세트 중 하나의 프라이머를 더 사용하고, 상기 3) 단계에서 GAPDH 유전자 검출용 프로브를 더 사용하는 것인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 GAPDH 유전자 검출용 프로브는 서열번호 21의 염기서열을 가지는 것인 여성 생식기 병원체 미생물 검출 방법.
  17. 서열번호 1의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
    서열번호 3의 염기서열의 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및
    각각 서열번호 7 내지 20의 염기서열을 가지는 유레아플라스마 유레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코모나스 바지나리스(Trichomonas vaginalis), 클로스트리디엄 인노쿰(Clostridium innocum), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 사프로피티커스(Staphylococcus Saprophyticus), 스타필로코커스 오레어스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오제너스(Staphylococcus pyogenes), 클로스트리디엄 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae), 수도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 검출용 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 포함하는 여성 생식기 병원체 미생물 검출용 키트.
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