CN111560476A - 母婴垂直传播的病原体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

母婴垂直传播的病原体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及母婴垂直传播的病原体检测试剂盒，试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，每个病原体PCR扩增引物中，与其探针互补的PCR引物为限速引物，另外一条与探针序列方向相同引物为过量引物，限速引物5’端加上胞嘧啶C和鸟嘌呤G，从而提供提高所述限速引物的Tm值，高于过量引物的Tm值2‑4℃；和同时保持限速引物：过量引物的摩尔分子比在1:20‑1:50之间。本发明的试剂盒可以最大程度的防止新生儿垂直传播病原体的漏检，有利于临床进行针对性的治疗；能高效地制备出单链PCR产物，使得每种病原体的检测灵敏度得到10倍以上的提升。

Description

母婴垂直传播的病原体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别涉及母婴垂直传播的病原体检测试剂盒及其应用。
背景技术
母婴垂直传播的病原体可分为经胎盘传播、上行性传播和分娩引起的传播三种。胎盘传播是指受感染的孕妇经胎盘血液将病原体传给胎儿引起宫内感染；上行性传播是指病原体从孕妇阴道到达绒毛膜或胎盘引起胎儿宫内感染；分娩时传播是指分娩过程中由于胎儿从无菌的羊膜腔内产出而暴露于严重感染的产道而致皮肤、黏膜、呼吸道或肠道等被感染。母婴垂直传播的病原体对产妇的临床症状影响不大，但会给新生儿造成严重感染。
悬浮微珠液相芯片和微阵列固相芯片属于基因芯片的范畴。两种技术的第一步都是需要通过多重PCR技术把目标基因片段有效地扩增出来。只是在后面的杂交过程种两者有区别。悬浮微珠液相芯片是以一种可以在液体中悬浮流动的编码微珠为介质来固定支持探针，探针就能随着微珠的流动方式和样本进行杂交，而微珠是有独特编码的，通过解析微珠的编码，就知道微珠上的探针对应的检测指标；而微阵列固相芯片是在玻璃平面或者尼龙膜平面上固定支持探针，通过规矩的行和列的位置关系就知道探针对应的检测指标。
悬浮液相芯片和微阵列固相芯片技术对于临床应用来说，都可以满足一次实验检测多个指标的需求。基因芯片的基本原理是先对靶目标片段进行PCR扩增，然后通过探针杂交来实现靶目标片段的识别。由于常规的PCR产物是双链，杂交的时候PCR产物的双链之间更容易相互发生结合，从而影响了PCR产物和探针的杂交。因此在基因芯片技术中，在PCR过程中产生较多的单链产物是提高杂交效率的一个关键环节。目前在单重的PCR扩增中，通过改变上下游的引物比例关系被广泛用于PCR单链产物的制备，但在多重PCR扩增中，由于存在多对引物，存在引物相互作用的可能性，只改变上下游引物比例关系很难提高杂交信号。
发明内容
本发明通过宏基因组测序方法，对出现了感染症状的新生儿进行分析，发现经过母婴垂直传播引发新生儿感染的病原体主要包括沙眼衣原体、解脲脲原体、细小支脲病原体、人型支原体、生殖道支原体、B族链球菌、淋球菌、大肠杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、肠道病毒。这种病原体比较集中的态势，就为研发一款集中覆盖以上常见母婴垂直传播病原体的基因芯片奠定了临床应用基础。
在一种实施方式中，本发明提供一种母婴垂直传播的病原体检测试剂盒，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，每个病原体PCR扩增引物中，与其探针互补的PCR引物为限速引物，另外一条与探针序列方向相同引物为过量引物，限速引物5’端加上胞嘧啶C和鸟嘌呤G，从而提供提高所述限速引物的Tm值，高于过量引物的Tm值2-4℃；和同时保持限速引物：过量引物的摩尔分子比在1:20-1:50之间。
在一种实施方式中，所述限速引物5’端加上ggcc。
在一种实施方式中，所述试剂盒检测的病原体是同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体、细小支脲病原体、人型支原体、生殖道支原体、B族链球菌、淋球菌、大肠杆菌、巨细胞病毒、EB病毒和肠道病毒。
在一种实施方式中，每个病原体引物如下表，其中每个病原体引物对中引物名称后缀“X”的表示过量引物，引物名称后缀“L”表示限速引物：
Figure BDA0002505636670000021
Figure BDA0002505636670000031
在一种实施方式中，检测每个病原体探针如下表所示，
Figure BDA0002505636670000032
在一种实施方式中，所述试剂盒是悬浮微珠液相芯片试剂盒或微阵列固相芯片试剂盒。
本发明根据以上发现的母婴垂直传播主要病原体的种类，采取多重PCR扩增结合基因芯片杂交技术，在一次测试中，在核酸水平对以上11种病原体同时进行检测。一方面简化了检测病原体的流程，另一方面也可以降低临床的检测费用。
同时，本发明通过对基因芯片检测的灵敏度进行了创造性改进。通过在和探针互补的PCR链序列相同的引物(本文称为限速引物，另外一条与探针序列方向相同引物称为过量引物)上加上胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)2个碱基提高限速引物的Tm值，高于过量引物2-4℃，同时保持限速引物：过量引物的摩尔分子比在1:20-1:50之间。通过这种引物设计和比例的安排，可以使得充分利用完限速引物保证PCR扩增效率，然后才能使用过量引物进行单引物扩增，同时制备出大量和探针互补的PCR单链，从而使得基因芯片检测的灵敏度增加。
本发明所描述的母婴垂直传播常见病原体的试剂盒包括：①在一次实验中就可以完成对3种病毒、8种细菌的检测，可以最大程度的防止新生儿垂直传播病原体的漏检，有利于临床进行针对性的治疗；②能高效地制备出单链PCR产物，使得每种病原体的检测灵敏度得到10倍以上的提升。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明的方法与其它不同方法的灵敏度比较结果图；
图2是本发明试剂盒检出样本中的细小支脲病原体感染的结果图，其中探针信号值超过500定义为阳性检出；
图3是本发明中不同上游:下游引物之间比例关系对于本发明试剂盒灵敏度影响的实验效果比较结果图；和
图4是本发明限速引物的Tm值与另一引物Tm值之间的温度差对于本发明的试剂盒灵敏度影响的实验效果比较结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一 本发明的母婴垂直传播的病原体的试剂盒的组成
1.多重PCR引物设计
本发明通过设计10种垂直传播的病原体基因芯片多重PCR扩增引物和探针，可以在一次实验中可实现对沙眼衣原体、解脲脲原体、细小支脲病原体、人型支原体、生殖道支原体、B族链球菌、淋球菌、大肠杆菌、肠道病毒、巨细胞病毒、EB病毒；共计3种病毒、8种细菌进行检测。由于肠道病毒是RNA病毒，因此需要进行反转录PCR，同时设计人的GAPDH基因的mRNA检测作为肠道病毒检测的内参基因，另外9种细菌病毒检测的是DNA片段，DNA也参与反转录反应并不会破坏DNA片段，因此9种细菌病毒的DNA也参与反转录反应，随后参与PCR扩增，这样10种病原体就可以设计在一管中完成反应。这10种对应的PCR限速引物(L)和过量引物(X)引物和人的内参基因GAPDH引物序列见表1。
表1.检测病原体的多重PCR引物序列
Figure BDA0002505636670000051
所有的过量X引物的5’标记生物素。限速引物L:过量引物X的皮摩尔数之比为1:20-1:50之间。表1中各限速引物的5’端加上ggcc的接头以提高退火温度，其Tm值高于过量引物2-4℃。
2.探针设计
本发明针对3种病毒、8种细菌和1个人的内参基因一共设计了12条探针，探针序列如表2。
Figure BDA0002505636670000052
Figure BDA0002505636670000061
所有的探针的5’带C18-NH2修饰，以便和悬浮微珠或者固相芯片进行偶联。
3、悬浮微珠阵列的制备：将荧光编码微球或者二维编码微球与所述的探针分别偶联，然后将偶联好探针的编码微球混合，得到悬浮微珠阵列。
4、微阵列固相芯片的制备：通过生物芯片机械手点样仪按照行与列规则排布，把上述探针点在经过醛基活化的玻璃片或者尼龙膜上。
5、标本检测：本发明所检测的标本类型包括新生儿咽拭子、肺泡灌洗液、胃液等临床样本，可采用不同公司的商业化试剂盒-病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒来提取临床标本中的总核酸。然后进行一步法反转录PCR扩增，程序如表3和表4。
表3.RT-PCR扩增RNA病毒的A反应体系
Figure BDA0002505636670000062
表4.一步法RT-PCR反应条件
Figure BDA0002505636670000071
本发明所描述的母婴垂直传播常见病原体的基因芯片系统优点包括：①在一次实验中就可以完成对3种病毒、8种细菌的检测，可以最大程度的防止新生儿垂直传播病原体的漏检，有利于临床进行针对性的治疗；②能高效地制备出单链PCR产物，使得每种病原体的检测灵敏度得到10倍以上的提升。
实施例二 本发明的母婴垂直传播的病原体的悬浮液相芯片试剂盒灵敏度比较实验
根据本发明所列出的引物(所比较的方法中限速引物不加ggcc碱基)探针序列和反应程序相同的情况，比较传统的对称PCR引物扩增(对称PCR)、单纯靠改变引物的配比扩增(单引物扩增)和本发明引物扩增，对垂直传播的11种病原体检测的灵敏度如图1。可以看到本发明检出的灵敏度为每个反应病原体的拷贝数为10的2次方，而单引物扩增和对称PCR扩增灵敏度分别为10的3次方，和10的4次方，图1中纵坐标是每个反应所含病原体的拷贝数)，横坐标是不同病原体类型；纵坐标数值越小表明检测灵敏度越高。
实施例三 本发明的悬浮液相芯片试剂盒的应用
一名出生27天的新生儿，出现肺炎、发热等症状。采集该患儿的咽拭子用本发明所描述的方法检测结果参见图2，检出微小脲原体感染。
实施例四 本发明试剂盒不同条件下比较试验
由于本发明的多重PCR扩增体系中，把上游引物设置为限速引物，额外增加了碱基提高Tm值，上游引物比下游引物Tm值高2-4℃；并使得限速引物的浓度只有下游引物的1/20-1/50，因此在PCR扩增中，能获得较多的下游引物制备的单链。传统的PCR制备单链的方法，一般就调整上游和下游引物的配比，只有当占比少的引物用完之后，才能在多余的引物上通过单引物扩增获得一定量的单链。本发明结合通过提高限速引物的退火温度，加上调整上下游引物的配比，能较传统制备单链方法在不损失PCR扩增效率的情况下，制备出更多的单链，从而使得探针的杂交信号较传统的多重单链制备PCR(每对引物仅调节上游:下游引物＝1/20-1/50)得到明显的提升，并且比较了上游:下游引物从比例1/1、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60和1/70各个比例的数据，发明人发现对于本发明上游:下游引物＝1/20-1/50时，提高了检测的灵敏度和特异性，具体结果如图3，横坐标是不同病原体的类型，纵坐标是检测信号值，图3中是本发明上游:下游引物＝1/20-1/50与对照组的实验效果比较结果图，其中。
表5.本发明方法与对照组的上游:下游引物的实验条件
病原体名称 本发明的上游:下游引物比例 对照组的上游:下游引物比例
沙眼病原体 1:20 1:1
解脲脲原体、 1:30 1:10
细小支脲病原体 1:40 1:50
人型支原体 1:20 1:60
生殖道支原体 1:30 1:70
B族链球菌、 1:40 1:10
淋球菌 1:20 1:50
大肠杆菌 1:30 1:60
肠道病毒 1:40 1:70
巨细胞病毒 1:20 1:1
EB病毒 1:30 1:10
在本发明中，限速引物的Tm值调整为高于另一引物2-4℃。我们发现当限速引物的Tm值较另一组引物不超过2℃时，单链制备的量并不明显，从而微珠上的探针杂交信号较本发明确定的高2-4℃效果要差，具体见图4；而当限速引物的Tm值较另一引物超过4℃时，又影响了PCR的扩增效率，也导致微珠上的探针杂交信号较本发明确定的高2-4℃效果要差，发明人比较了限速引物的Tm值较另一组引物高0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、4℃、5℃、6℃的数据，对于本发明发明人发现限速引物的Tm值调整为高于另一引物2-4℃时提高了检测的灵敏度和特异性，具体见图4，横坐标是不同病原体的类型，纵坐标是检测信号值；图4显示本发明与对照组的比较结果图，限速引物的Tm值调整为高于另一引物2-4℃时提高了检测的灵敏度和特异性，如果大于4℃或小于2℃灵敏度和特异性明显下降。
表6.本发明方法与对照组的上游比下游引物Tm值相差数值
Figure BDA0002505636670000091
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 广州奥百阕谱生物科技有限公司
<120> 母婴垂直传播的病原体检测试剂盒及其应用
<130> PF2011
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcccctgaa tgcggctaat cc 22
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaacacggac acccaaag 18
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccctgttgct gtagccaaat tcgt 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctgtccgtc tatcagcaca taacg 25
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tctttaacgt tactcggatg ccca 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atctgccctg ttggtaagcg tag 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcggtatgca agcactatcg caa 23
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acttcagcat tccctaactt gtcgtc 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttgcaacttc gccaatacgt ccc 23
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ataaactgtc tcagggttgg c 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
accatccatc acgatccgat tgc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagagtttga ccccatctac cca 23
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
accatgctgc acgaatacgt caga 24
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgcagcgga accgact 17

Claims (6)

1.母婴垂直传播的病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，每个病原体PCR扩增引物中，与其探针互补的PCR引物为限速引物，另外一条与探针序列方向相同引物为过量引物，限速引物5’端加上胞嘧啶C和鸟嘌呤G，从而提供提高所述限速引物的Tm值，高于过量引物的Tm值2-4℃；和同时保持限速引物：过量引物的摩尔分子比在1:20-1:50之间。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述限速引物5’端加上ggcc。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测的病原体是同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体、细小支脲病原体、人型支原体、生殖道支原体、B族链球菌、淋球菌、大肠杆菌、巨细胞病毒、EB病毒和肠道病毒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每个病原体引物如下表，其中每个病原体引物对中引物名称后缀“X”的表示过量引物，引物名称后缀“L”表示限速引物：
Figure FDA0002505636660000011
Figure FDA0002505636660000021
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，检测每个病原体探针如下表所示，
Figure FDA0002505636660000022
6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是悬浮微珠液相芯片试剂盒或微阵列固相芯片试剂盒。
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