CN111088378A - 检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统、试剂盒及方法。首先，本发明公开了一种检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物探针系统的试剂盒，以及使用该引物探针系统或试剂盒进行病原菌检测的方法。本发明公开的试剂盒可快速、高效、灵敏地检测多种重症肺炎患者生物样本中常见病原微生物。本发明为临床感染的快速诊断提供了技术支持，进一步帮助临床医生对临床患者实现精准医疗。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统、试剂盒及方法。
背景技术
重症肺炎(severe pneumonia，SP)又称中毒性肺炎或暴发性肺炎，除具有肺炎常见呼吸系统症状外，尚有呼吸衰竭和其他系统明显受累的表现，即可发生于社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia，CAP)，亦可发生于医院获得性肺炎(hospitalacquiredpneumonia，HAP)。是由各种病原体(细菌、真菌、病毒及支原体、衣原体等微生物)所致肺实质性炎症，造成严重菌血症或毒血症，进而引起血压下降、休克、神志模糊、烦躁不安、谵望和昏迷，是严重危害人类健康，甚至危及生命的一种疾病。
重症肺炎诊断的主要标准有：1、需要机械通气；2、具有须使用血管升压类药物的感染性休克。其次要标准为：1、呼吸频率>30次/min；2、氧合指数(Pa02/Fi02) ≤250；3、多叶肺受累；4、意识障碍；5、尿毒血症(BUN≥7.1mmol/L)；6、白细胞(WBC)减少症(WBC计数<4×109/L)；7、血小板减少症(血小板计数<100× 109/L)；8、低体温(中心体温<36℃)；9、低血压需要液体复苏。其中如果临床患者符合1条主要标准或3条次要标准即可诊断为重症肺炎。
重症肺炎的治疗首先应选择广谱的强力抗菌药物，并应足量、联合用药。因为初始经验治疗不足或不合理，或而后根据病原学结果调整抗菌药物，其病死率均明显高于初始治疗正确者，因此快速、精准对患者病原菌的鉴定是至关重要的。
重症肺炎多由毒力极强的革兰阳性或阴性菌感染所致，病情严重，进展迅速。常发生各种严重并发症，如不及时救治，可危及生命。重症肺炎患者常见主要致病菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及白色念珠菌等。重症肺炎的治疗首先应选择广谱的强力抗菌药物，并应足量、联合用药。因为初始经验治疗不足或不合理，或而后根据病原学结果调整抗菌药物，其病死率均明显高于初始治疗正确者。因此致病菌的快速、精准检出可有助于降低临床患者病死率。
目前临床上，针对引起重症肺炎的病原微生物，多采用培养和生化鉴定等方法。随着感染性疾病的增多和病情严重程度的加剧，这些方法耗时长、操作危险性高，从一定程度上制约了临床诊断和治疗的效果，已经无法满足临床的需求。因此研究一套针对微生物准确高效的检测系统，不仅可以减轻临床医务工作者的辛苦和危险，同时也能为病人的早期诊断治疗起到及时有效的辅助诊断作用。
发明内容
本发明第一个目的在于提供一种检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统。
本发明第二个目的是提供包含上述引物探针系统的产品。
本发明第三个目的是提供一种利用上述引物探针系统或产品进行病原菌检测的方法。
本发明第四个目的是提供上述引物探针系统、产品或方法在临床领域的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
首先，本发明公开了一种检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统，包括：
用于检测肺炎链球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、 SEQ IDN0：2和SEQ ID N0：3所示；
用于检测流感嗜血杆菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、 SEQID N0：5和SEQ ID N0：6所示；
用于检测金黄色葡萄球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 7、SEQ ID N0：8和SEQ ID N0：9所示；
用于检测大肠埃希菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：10、 SEQID N0：11和SEQ ID N0：12所示；
用于检测肺炎克雷伯菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 13、SEQID N0：14和SEQ ID N0：15所示；
用于检测铜绿假单胞菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 16、SEQID N0：17和SEQ ID N0：18所示；
用于检测鲍曼不动杆菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 19、SEQID N0：20和SEQ ID N0：21所示；
用于嗜麦芽窄食单胞菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 22、SEQID N0：23和SEQ ID N0：24所示。
应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。
本发明还公开了由上述的引物探针系统制备的用于检测重症肺炎患者感染病原菌的产品。
进一步的，所述产品为试剂盒。根据本发明的教导，本领域技术人员可以选择其他的产品，而不限于所述试剂盒。
更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。
本发明还公开了一种检测病原菌的方法，所述方法使用上述的引物探针系统或上述的产品进行检测。
进一步的，基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。
术语“多重PCR”是指在同一PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针标记荧光的不同、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。
进一步的，上述方法包括以下步骤：
(1)提取生物样本中的核酸；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不限于如上描述的方案。
进一步的，检测样本为血液、胸水、肺泡灌洗液、痰液、下呼吸道分泌物等生物样品。通过常规试剂盒提取临床血浆中的游离核酸或其他生物样品的总核酸，并用液滴数字PCR系统检测样本中致病菌的种类和数量。
本发明还公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床领域中的应用。具体的，可应用于临床微生物的检测。
本发明利用多色数字PCR平台，配套自主设计并优化的多重引物探针对组合 (筛选到多个特异性核酸序列，通过后续的引物探针设计、多重组合并协调各引物探针的扩增效率、最终调整每个荧光通道的对比度和荧光值，完成最终优化工作)，可实现单一反应体系中的多个目标致病菌的检测功能，即本发明具有高效性；本发明试剂盒中的相关反应试剂，是我们多次筛选、并优化的可实现快速扩增反应的试剂，同时配套相关自动化提取和下游分析系统，可在3小时内完成样本的报告输出，即本发明的快速特性；多色数字PCR平台为液滴数字PCR平台，单位反应体系可生成2-3万微液滴，可极大限度降低PCR抑制剂的影响，保证低拷贝的阳性模板正常扩增。该发明试剂盒的检测灵敏度极高，可检测低至10拷贝以下的核酸模板；数字PCR平台可实现绝对定量功能，配套该发明试剂盒，不仅可以对多种临床常见的病原微生物的检测，而且通过定量检测病原菌的拷贝数变化，实现动态监控功能。使得临床医生可根据监测结果，及时调整临床用药方案，实现精准医疗的目的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
1、探针设计合理，利用多色多重PCR平台可进行多重PCR，一个反应体系中检测多个靶标；2、通过对该发明中试剂盒成分的优化，可快速完成目标分子的检测功能；3、该发明试剂盒在数字PCR平台既可以对多种临床常见的病原微生物的检测，又可以通过定量检测实现病原菌的动态监控功能；4、多色多重数字 PCR平台可对超微量核酸样本实现定性检测功能，检测灵敏度可低至10拷贝以下；5、通过试剂盒中添加内控，极大地降低临床样本的假阴性结果出现。
本发明试剂盒可快速、高效、灵敏地检测多种重症肺炎患者生物样本中常见病原微生物。本发明为临床感染的快速诊断提供了技术支持，进一步帮助临床医生对临床患者实现精准医疗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例首先采用QAIGEN-55114试剂盒提取血浆等临床样品游离核酸，接着用液滴多色数字PCR系统检测样品游离核酸中致病菌的种类和数量。
一、实验材料：
1、样本要求：离心后分离的血浆(24h内使用的样本4℃保存，1个月内使用的样本-20℃保存，3个月使用的样本-80℃保存；血浆超过3个月不能用于提取cfDNA)。
2、仪器设备与耗材如表1所示
表1仪器与设备表
3、其他试剂及耗材
3.1、试剂：无水乙醇、分析纯异丙醇等。
3.2、耗材：无RNase离心管、无DNase离心管、无菌离心管、低吸附离心管等。
二、实验流程：
医院取样及保存→血浆分离→血浆游离核酸提取→配置数字PCR反应液→液滴芯片生成→扩增→阅读→结果分析与报告输出。
三、实验步骤：
(一)血浆分离及游离核酸提取步骤
1、将临床全血样本(约10mL)1600g离心15min，取上层血浆于新的50mL 离心管中，注意不要吸到下层的血液，每管5mL血浆(以下试剂加入量按5ml 血浆计算，实际具体加入量视样品血浆量按比例调整)。
2、向分离出的血浆样品中加入500ul蛋白酶K和4mL的Buffer ACL以及 1ul 1ug/ul的Carrier RNA，涡旋30s，将离心管置于60℃水浴锅孵育30min。
3、加入9mL Buffer ACB，涡旋30s，冰浴5min(此步沉降核酸，可适当延长)。
4、使用真空泵将所有样品过柱，关掉真空泵，释放压力为0Mbar(注意保证真空压力泵＞70Mbar，过柱结束后盖好盖子，避免滤膜过分干燥)；
5、打开盖子加入600ul Buffer ACW1，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
6、加入750ul Buffer ACW2，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0 Mbar；
7、向加入750ul无水乙醇，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
8、取下吸附柱放入2mL收集管，14,000rpm(20,000g)常温离心3min；
9、将吸附柱放入新的1.5mL离心管，开盖，干燥10min；
10、加入50ul RNase-free ddH2O(56℃预热)，56℃孵育5min；
11、14,000rpm(20,000g)常温离心1min；
12、将离心下来的溶液再次上柱，二次洗脱，56℃孵育5min，14,000rpm (20,000g)常温离心1min；
13、产物24h内进行下游实验，可2-8℃保存，长时间请-25℃～-15℃保存。
(二)数字PCR检测流程(配置数字PCR反应液、液滴芯片生成及扩增过程)
1、配制15ul的液滴PCR检测体系，具体体系配方分别见表2；
2、将血浆提取的游离核酸模板及内参模板加入到不同体系中并混匀，模板加入量为5ul，同时配制实验的阳性对照和阴性对照；
3、按照SOP准备液滴芯片，并将反应体系加入到液滴芯片加样杯中。
4、将液滴芯片放入样本制备仪中，启动设备进行液滴生成。
5、将生成好的液滴芯片放入液滴芯片扩增仪中，按照表3设置液滴芯片扩增程序，并运行；
表2.PCR检测体系配方组分
| 组分 | 体积(μL) |
| 2x Taq Mix | 7.5 |
| Forward Primer(10μM) | 0.6*n |
| Reverse Primer(10μM) | 0.6*n |
| Probe(10μM) | 0.4*n |
| 核酸模板 | 1 |
| 总体积 | 超纯水补足至15微升 |
备注：表2中反应体系涉及多重反应，即引物、探针加入量由检测靶标而定，其中 n代表多重组合的靶标个数，理论上每个位点对应一对引物探针对，n为正整数。
表3.反应体系扩增程序
(三)液滴芯片阅读、结果分析及报告流程
1、扩增结束后，将芯片架拿出放至数字PCR阅读仪的芯片放置台上，打开 GenePMS软件，将芯片放置台的温度调至50℃，并设置软件相应参数；
2、芯片放置5分钟后，选择相应的荧光检测通道，开始芯片扫描并分析结果，得到液滴阴、阳性点对比度；
3、数据分析与报告输出。
其中具体重症肺炎常见病原菌的引物探针序列和部分试验数据如表4所示。
表4引物探针组合序列及部分试验数据
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院大学宁波华美医院
<120> 检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统、试剂盒及方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgcaatcta gcagatgaag ca 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgtgcgttt taattccagc t 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcttgata cagggag 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcgggaa catcaatga 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcatagga gggaaatggt t 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggtaattgg gatccat 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catgcaccac ctgtcacttt g 21
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagagccttc cccttcg 17
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggccttcggg ttgtaaagta c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcttctgcgg gtaacgtcaa t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagggagtaa agttaatacc 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcctgatgc agccatgc 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttagccggtg cttcttctgc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
taacctcatc gattgacg 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttcccgaag gcaccaatc 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttgacatg ctgagaac 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttcccgaag gcaccaatc 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccttgacata ctagaaactt 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgagcgaacg cggactag 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttctatggcc gctctttcca 20
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agctggattg gttctag 17
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcttcttgtg gagctcgaca a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccgtcagcaa cttcgttttc a 21
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgcgacggat ctacgtcaca gcg 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgcaatcta gcagatgaag ca 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcgtgcgttt taattccagc t 21
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgcttgata cagggag 17
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acaactctag agatagagcc ttccccttcg 30
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttgacatcca cggaagtttt 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggccttcggg ttgtaaagta c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcttctgcgg gtaacgtcaa t 21
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccgcataacg tcgcaaga 18
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaggcggtga ggtta 15
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttagccggtg cttcttctgc 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tagtccacgc cgtaaacgat g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gttgcgggac ttaacccaac a 21
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccttgacata ctagaaa 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcaacgcgaa gaaccttacc 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
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<400> 44
gttcccgaag gcaccaatc 19
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
accagacaac cgatagc 17
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ccgcacacta agcacgaaga c 21
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
catcaagtag cgcaggatcg ta 22
Claims (9)
1.一种用于检测重症肺炎常见病原菌的引物探针系统，其特征在于，包括：
用于检测肺炎链球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示；
用于检测流感嗜血杆菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、SEQ IDN0：5和SEQ ID N0：6所示；
用于检测金黄色葡萄球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7、SEQ IDN0：8和SEQ ID N0：9所示；
用于检测大肠埃希菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：10、SEQ ID N0：11和SEQ ID N0：12所示；
用于检测肺炎克雷伯菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13、SEQ IDN0：14和SEQ ID N0：15所示；
用于检测铜绿假单胞菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：16、SEQ IDN0：17和SEQ ID N0：18所示；
用于检测鲍曼不动杆菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：19、SEQ IDN0：20和SEQ ID N0：21所示；
用于嗜麦芽窄食单胞菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：22、SEQ IDN0：23和SEQ ID N0：24所示。
2.由权利要求1所述的引物探针系统制备的用于检测肺炎病原菌的产品。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂。
5.一种检测病原菌的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的引物探针系统或权利要求2-4所述的产品进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取病原菌基因组DNA；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测样本为血液、胸水、肺泡灌洗液、痰液、下呼吸道分泌物等生物样品。
9.根据权利要求1所述的引物探针系统、权利要求2-4所述的产品或权利要求5-8所述的方法在临床领域中的应用。
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