CN106544432A - 一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法；本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：3对多重PCR扩增引物、2×PCR预混体系、灭菌双蒸水。spa基因上下游引物、mecA基因扩增上下游引物、pvl基因扩增上下游引物；该方法和试剂盒内含3对PCR引物，可以同时扩增金黄色葡萄球菌spa、mecA和pvl基因，用于检测临床样本中耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，并同时检测高毒力金黄色葡萄球菌，为临床金黄色葡萄球菌感染治疗提供依据。本发明建立了一套简便、快速、廉价的金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测方法，对于临床金黄色葡萄菌感染的治疗具有重要意义。

Description

一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于临床检验技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法及试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, Sa）是临床重要的致病菌之一，能够产生较多的毒力因子，引起感染者食物中毒、假膜性肠炎、烫伤样皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类健康造成极大的损害。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Multiple-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是金黄色葡萄球菌的一个独特菌株，能抵抗所有青霉素，包括甲氧西林及其他抗β-内酰胺酶的青霉素。MRSA首次发现于1961年的英国，目前已广泛散播，成为临床最严重的耐药菌之一。虽然金黄色葡萄球菌传统上被视为医院感染菌，但现时在社区中和家庭病房中流行的金黄色葡萄球菌和MRSA感染，可造成患者严重肺炎症状并危及生命，急需一种简单快速的方法检测MRSA菌并评估细菌毒力。

现有金黄色葡萄球菌鉴定方法包括将待检标本涂布于血平板上分离单个菌落，挑取单个菌落进行生化反应鉴定，对鉴定出的金黄色葡萄球菌再进行药物敏感性检测，整个过程至少需要3～5天时间，且现有的方法繁琐耗时耗力，不能满足社区中和家庭病房中快速检出MRSA菌的要求。此外，现有的金黄色葡萄球菌鉴定方法仅能开展细菌耐药性检测，无法进行细菌毒力检测。由于目前金黄色葡萄球菌，特别是MRSA菌在呼吸道黏膜表面定植现象的普遍性，开展金黄色葡萄球菌毒力检测更具有临床意义。

分子生物学技术（如PCR法）因其具有高灵敏度、高特异性以及操作简便迅速等特点，被认为是最具发展前景临床检验诊断技术。PCR法无需特意纯化细菌，而通过特异性引物扩增细菌的标志性基因以及各种特异性耐药基因和毒力基因，即可获得细菌种类、耐药性和毒力的相关信息。尤其适合于对从社区和家庭病房感染患者标本进行金黄色葡萄球菌筛检，并筛查细菌耐药性和毒力情况，为患者的进一步治疗提供指导，降低患者死亡率。

本发明中所涉及spa基因是金黄色葡萄球菌特有基因，该基因的检出意味着标本中含有金黄色葡萄球菌，并且不同株金黄色葡萄球菌spa基因扩增产物大小并不完全相同，可以用于对金黄色葡萄球菌开展初步鉴定分型。mecA基因是MRSA菌标志基因，该基因的检出是诊断MRSA菌的金标准；pvl基因是近年来新发现的金黄色葡萄球菌毒力因子，携带pvl基因的金黄色葡萄球菌致死率超过70%。本发明根据金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因序列，设计出一种多重PCR方法可以同时检测受测金黄色葡萄球菌菌株spa基因、mecA基因和pvl基因，为治疗社区和家庭病房患者的金黄色葡萄球菌感染提供一种快速检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺陷，提供了一种多重PCR方法，可以同时检测金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因，以达到快速筛查出金黄色葡萄球菌，并获得细菌耐药性和毒力的目的。

本发明首先提供一组检测金黄色葡萄球菌的引物，所述引物根据金黄色葡萄球菌spa基因（GeneBank: JQ066313.1）、mecA基因（GeneBank: GU227428.1）和pvl基因（GeneBank: HQ020552.1）序列合成，3对PCR引物序列如下：

spa基因扩增上游引物：5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’（SEQ ID NO.1），下游引物：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’ （SEQ ID NO.2）；

mecA基因扩增上游引物： 5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’ （SEQ ID NO.3），下游引物：5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’ （SEQ ID NO.4）；

pvl基因扩增上游引物：F:5’-GCTGGACAAAACTTCTTGGAATAT-3’ （SEQ ID NO.5），下游引物：5’-GATAGGACACCAATAAATTCTGGATTG-3’ （SEQ ID NO.6）。

本发明还提供上述引物在金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测中的应用。

本发明还提供一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测试剂盒，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR预混液，PCR反应管，灭菌双蒸水，上述检测金黄色葡萄球菌的引物，其中所述PCR预混液为市售常规实验用品。

本发明还提供一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测的方法，所述方法具体操作如下：

（1）配制反应体系：在PCR反应管中依次加入PCR预混液25 μL，上述spa基因引物各0.25μM，mecA基因引物各0.5 μM，pvl基因引物各1 μM，加入DNA模板2 μL，最终以灭菌双蒸水补足总体系至50 μL。

（2）多重PCR扩增：多重PCR扩增条件为94℃预变性10min，94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环后72℃延伸10 min。

（3）电泳检测：扩增完毕后PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后琼脂糖凝胶0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果，并照相记录。

与现有技术相比，本发明具备的有益效果如下：

本发明中采用多重PCR法，通过精确设计的3对引物扩增金黄色葡萄球菌的spa基因、mecA基因和pvl基因，仅需提取标本基因组DNA，无需对标本中细菌进行分离鉴定，可以实现在4～6小时内获知病人是否被金黄色葡萄球菌感染，并可同时获知所感染的金黄色葡萄球菌耐药性和毒力，极大地降低过度治疗的可能性，并提高高毒力金黄色葡萄球菌所致肺炎患者的存活率。

附图说明

图1 临床金黄色葡萄球菌标本多重PCR检测结果。图1a中1-10号样本为MRSA菌，图1b中1-7号样本为非MRSA菌。泳道M为DNA标准分子量标记。

图2 临床呼吸道常见菌多重PCR实验检测结果。泳道M为DNA标准分子量标记，泳道1的模板为大肠埃希菌（Escherichia coiL），泳道2的模板为肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），泳道3的模板为铜绿假单胞菌（Psudomonas aeruginosa），泳道4的模板为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），泳道5的模板MRSA菌，泳道6的模板为非MRSA菌，泳道7的模板为灭菌双蒸水（阴性对照）。

具体实施方式

实施例1：多重PCR法检测金黄色葡萄球菌携带spa基因、mecA基因和pvl基因

随机选取临床分离金黄色葡萄球菌17株（来源于江苏大学附属医院），其中MRSA菌10株，非MRSA菌7株。菌株的种类和耐药性均采用法国生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定及药敏仪鉴定。

用于实验的金黄色葡萄球菌接种于血琼脂平板，35℃培养16 h形成单个菌落后挑取单个菌落接种于MH培养基，37℃振摇培养24 h，吸取新鲜饱和菌液200 μL，12000 rpm离心2 min获得菌体沉淀用于细菌基因组DNA提取。

金黄色葡萄球菌基因组DNA提取步骤：

（1）在菌体沉淀中加入180 μL溶液1（含有25 mol/L三氨基甲烷，10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，50 mmol/L葡萄糖）并充分重悬，再加入20 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL），37℃孵育0.5h后备用。

（2）加入现配300 μL溶液2（含有0.2 mol/L 氢氧化钠和10%十二烷基硫酸钠），室温下反复上下颠倒10次并静置10 min，再加入300 μL溶液3（醋酸钾150 mg，冰醋酸11.5mL，加超纯水至100 mL），上下颠倒5次充分混匀后冰上放置5 min.

（3）上述溶液于12000 rpm离心5 min，取上清600 μL，加入异丙醇400 μL，室温下上下颠倒5次后静置沉淀基因组DNA，10 min后以12000 rpm离心5 min，弃去上清。

（4）沉淀中加入1mL 70%乙醇，上下颠倒2次后于12000rpm离心2 min并弃去上清，该操作重复1次。完全弃去乙醇，打开离心管盖，在室温下静置10 min除去残留乙醇。

（5）向离心管底白色沉淀中加50 μL灭菌蒸馏水重新溶解金黄色葡萄球菌基因组DNA，并保存于-20℃中用于后续PCR试验。

多重PCR扩增目的基因为金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因。针对金黄色葡萄球菌spa基因引物序列为：

spa-MF: 5'-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3'

spa-MR: 5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'

PCR产物预测长度为（170×n） bp（n为正整数）。

针对金黄色葡萄球菌mecA基因引物序列为：

mecA-MF: 5'-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3'

mecA-MR: 5'-CCACTTCATATCTTGTAACG-3'

PCR产物预测长度为162 bp。

针对金黄色葡萄球菌pvl基因引物序列为：

pvl-MF: 5'- GCTGGACAAAACTTCTTGGAATAT-3'

pvl-MR: 5'- GATAGGACACCAATAAATTCTGGATTG-3'

PCR产物预测长度为98 bp。

在一个容量200 μL PCR反应管中依次加入PCR预混液25 μL，spa基因引物各0.25μM，mecA基因引物各0.5 μM，pvl基因引物各1 μM，加入DNA模板2 μL，最终以灭菌双蒸水补足总体系至50 μL。多重PCR扩增条件设置为94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃退火60s，72℃延伸1 min，共进行30个循环后72℃延伸10 min。扩增完毕后取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后琼脂糖凝胶0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果，并照相记录。

琼脂糖凝胶电泳结果可见，17株金黄色葡萄球菌均扩增出spa基因条带，产物大小并不完全相同，但均为170 bp的整数倍，因为spa是金黄色葡萄球菌的的标志性基因，spa基因的扩增结果表明17株菌均为金黄色葡萄球菌。10株菌均扩增出mecA基因条带，表示上述10株金黄色葡萄球菌为MRSA菌。7株非MRSA菌未扩增出mecA基因条带，表明上述7株金黄色葡萄球菌为非MRSA菌。1株金黄色葡萄球菌扩增出pvl基因条带，表明该菌致病力强，临床医生需高度关注该患者。

实施例2：多重PCR法特异性检测

提取大肠埃希菌（美国模式菌种保藏中心，ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（美国模式菌种保藏中心，ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌（美国模式菌种保藏中心，ATCC 700603）、肺炎链球菌（美国模式菌种保藏中心，ATCC 496），上述菌均为购买获得。上述细菌的纯培养物用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司，DP302）提取其基因组DNA，提取的DNA直接用于多重PCR扩增。

针对金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和pvl基因的引物序列为实施例1中所述。

PCR反应总体系为50 μL，在PCR反应管中依次加入25 μL的2×PCR Mix预混液，spa基因引物各0.25 μM，mecA基因引物各0.5 μM，pvl基因引物各1 μM，加入细菌基因组DNA模板2 μL，最终以灭菌双蒸水补足总体系至50 μL。同时设阴性对照（双蒸水为模板）。

多重PCR扩增条件设置为94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环后72℃延伸10 min。扩增完毕后5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后琼脂糖凝胶0.5 mg/L溴化乙锭染色10 min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果，并照相记录。

琼脂糖凝胶电泳结果（图2）可见，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌基因组DNA均未扩增出任何条带，MRSA菌基因组DNA扩增后于出现spa和mecA基因2个条带，非MRSA菌基因组DNA扩增后出现spa基因1个条带。

表明临床呼吸道常见寄生菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌对该多重PCR法无干扰，该多重PCR法可以特异性扩增金黄色葡萄球菌spa、mecA和pvl基因，具备直接从患者痰液中特异性检测金黄色葡萄球菌感染的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法及试剂盒

<130> 一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力快速检测方法及试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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taaagacgat ccttcggtga gc 22

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cagcagtagt gccgtttgct t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccagattac aacttcacca gg 22

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<212> DNA

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ccacttcata tcttgtaacg 20

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gctggacaaa acttcttgga atat 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gataggacac caataaattc tggattg 27

Claims (7)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的引物，其特征在于，所述引物为3对特异性引物，3对PCR引物序列如下：

spa基因扩增上游引物：5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，下游引物：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’；

mecA基因扩增上游引物： 5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’，下游引物：5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’；

pvl基因扩增上游引物：F:5’-GCTGGACAAAACTTCTTGGAATAT-3’，下游引物：5’-GATAGGACACCAATAAATTCTGGATTG-3’。

2.权利要求1所述引物在金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测中的应用。

3.一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR预混液，PCR反应管，灭菌双蒸水，权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌的引物。

4.权利要求3所述的试剂盒在金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求3所述的试剂盒进行多重PCR检测。

5.一种金黄色葡萄球菌耐药性和毒力检测的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求3所述的试剂盒进行，具体操作为：利用权利要求1所述引物配制多重PCR反应体系；多重PCR扩增；电泳检测结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：

PCR预混液25 μL，spa基因上下游引物各0.25 μM，mecA基因上下游引物各0.5 μM，pvl基因上下游引物各1 μM，DNA模板2 μL，最终以灭菌双蒸水补足总体系至50 μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应的程序为

94℃预变性10min，94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环后72℃延伸10 min。