CN106119383A - 脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其中试剂盒借助生物信息平台进行大规模基因组分析，根据脑膜败血伊丽莎白菌的DNA促旋酶基因设计了四条特异性引物，结合LAMP技术，针对脑膜败血伊丽莎白菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于临床、环境及食品等样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环介导恒温基因扩增（loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP）技术进行菌样快速检测的生物检测试剂，属于脑膜败血伊丽莎白菌的快速基因分子诊断试剂技术领域，具体涉及一种脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脑膜败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）是一种非发酵革兰氏阴性需氧杆菌，无鞭毛、无动力、无芽孢。脑膜败血伊丽莎白菌在自然界中分布广泛，可在河水、海水及土壤中检出。值得注意的是，该菌与医院环境密切相关，可在医院的水龙头、水池、氧气湿化瓶甚至消毒液等潮湿环境中定居，形成潜在的感染源。
脑膜败血伊丽莎白菌是威胁人类健康的条件致病菌之一。自1958年由脑膜败血伊丽莎白菌引起新生儿脑膜炎爆发流行以来，由该菌引起的爆发流行时有报道，严重时可导致新生儿的死亡。成年人被该菌感染多发生于年龄大、体弱、免疫力低下、有严重基础性疾病、大量广谱抗菌药物治疗、接受侵入性医疗操作的住院患者。此类人群的下呼吸道标本中通常可分离出脑膜败血伊丽莎白菌，症状表现为肺部感染，主要为导管相关性肺炎。另外，该菌还能引起感染性心内膜炎、蜂窝组织炎和社区获得性骨髓炎等。
资料显示，近年来由医院环境中脑膜败血伊丽莎白菌引起的菌血症、导管相关性肺炎、导管相关性血流感染呈现逐年上升的趋势，尤其是在重症加强护理病房（ICU）。脑膜败血伊丽莎白菌很容易在各种医疗器械及导管上形成生物被膜，难以清除。而且一旦形成生物被膜，该菌的致病性及对抗菌药物和宿主免疫系统的抵抗力均会增强，从而引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作及院内感染的发生。
因此，快速准确检测脑膜败血伊丽莎白菌对临床治疗该菌引起的相关感染具有重要的意义。目前针对脑膜败血伊丽莎白菌有多种检测方法。传统的生理生化鉴定方法耗时且结果可靠性不高；PCR方法和实时荧光定量PCR方法能够用于病原菌的检测，但对仪器设备和人员的专业技术水平要求较高，且操作复杂，耗时较长，限制了该技术的推广。
DNA环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低、特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种快速灵敏准确的脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成，引物序列如下：
外引物1：GTAAAATCCTGAACGTAGAGAA、
外引物2：GTTAGGATCAATGTGGAGATG、
内引物1：ACCCACACTTACACCTAAAGCAG-GTCAATGCTTCATAAAGTATACGA、
内引物2：GGACAGCAAGGCACTAAACCT-TGAGAACCATCCACATCG；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：10wt% SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
本发明所述的脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：
步骤（1），提取待检样品的基因组DNA
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA；
步骤（2），环介导恒温扩增反应
首先取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL Bst DNA聚合酶，再将配置好的反应体系于65℃扩增反应50-70min后取出待检；
步骤（3），分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
本发明根据脑膜败血伊丽莎白菌的DNA促旋酶基因gyrB设计了四条特异性引物，该基因序列为脑膜败血伊丽莎白菌所共有，以保证检测不同来源的脑膜败血伊丽莎白菌的可靠性。本发明采用LAMP技术，针对脑膜败血伊丽莎白菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低、操作简便等优点，可用于临床、环境及食品等样品的安全快速检测。
附图说明
图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图，其中2号反应管内样品为绿色，1和3-6号反应管内样品为橙色。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的建立
步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装：
本实施例确定用于检测的引物序列如下：
外引物1：GTAAAATCCTGAACGTAGAGAA、
外引物2：GTTAGGATCAATGTGGAGATG、
内引物1：ACCCACACTTACACCTAAAGCAG-GTCAATGCTTCATAAAGTATACGA、
内引物2：GGACAGCAAGGCACTAAACCT-TGAGAACCATCCACATCG。
在此基础上设计脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：10wt% SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤二，待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA：
检测菌株脑膜败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）来源于中国人民解放军海军总医院中心实验科。使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品基因组DNA。
步骤三，进行环介导恒温扩增反应：
首先取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL Bst DNA聚合酶；再将配置好的反应体系于65℃扩增反应50-70 min后取出待检。
步骤四，分析判断反应结果：
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检菌株为脑膜败血伊丽莎白菌。
实施例2
阴性对照
步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装：
本实施例确定用于检测的引物序列同实施例1。
在此基础上设计脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：10wt% SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤二，待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA：
使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取短黄杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA。
步骤三，进行环介导恒温扩增反应：
首先取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL Bst DNA聚合酶；将配置好的反应体系于65℃扩增反应50-70min后取出待检。
步骤四，分析判断反应结果：
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
如图1所示，编号为1-6的反应管分别对应短黄杆菌、脑膜败血伊丽莎白菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌。
所述实施例1与实施例2中各阴性对照组比较，实施例1中产生阳性扩增结果，如图1中2号反应管，而实施例2阴性对照菌株没有产生阳性扩增结果，如图1中1号和3-6号反应管，从而证明本试剂盒及检测方法具有较强的特异性，对其他菌株不会产生假阳性结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtaaaatcct gaacgtagag aa 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttaggatca atgtggagat g 21
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acccacactt acacctaaag caggtcaatg cttcataaag tatacga 47
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggacagcaag gcactaaacc ttgagaacca tccacatcg 39
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<400> 1
gtaaaatcct gaacgtagag aa 22
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acccacactt acacctaaag caggtcaatg cttcataaag tatacga 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggacagcaag gcactaaacc ttgagaacca tccacatcg 39
Claims (2)
1.脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：
外引物1：GTAAAATCCTGAACGTAGAGAA、
外引物2：GTTAGGATCAATGTGGAGATG、
内引物1：ACCCACACTTACACCTAAAGCAG-GTCAATGCTTCATAAAGTATACGA、
内引物2：GGACAGCAAGGCACTAAACCT-TGAGAACCATCCACATCG；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：10wt% SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。
2.一种权利要求1所述的脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：
步骤（1），提取待检样品的基因组DNA
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA；
步骤（2），环介导恒温扩增反应
首先取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL Bst DNA聚合酶，再将配置好的反应体系于65℃扩增反应50-70min后取出待检；
步骤（3），分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201610590277.3A CN106119383A (zh) | 2016-07-26 | 2016-07-26 | 脑膜败血伊丽莎白菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 |
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-
2016
- 2016-07-26 CN CN201610590277.3A patent/CN106119383A/zh active Pending
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Application publication date: 20161116 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |