CN106755540A - 抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其中试剂盒借助生物信息平台进行大规模基因组分析，根据抗生素溶杆菌的吩嗪合成基因phzF设计了四条特异性引物，结合LAMP技术，针对抗生素溶杆菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低、操作简便等优点，可用于抗生素溶杆菌的快速检测。

Description

抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导恒温基因扩增（loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP）技术进行菌样快速检测的试剂盒，具体涉及一种抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
农作物病害是制约农业生产的一个重要因素，生产中主要通过选育抗病品种和化学农药防治。但由于化学农药的非生物源性容易使有害生物产生抗性，再加上滥用化学农药，导致了化学农药在自然界和食物链中长期残留造成了环境污染、生态平衡破坏、社会公害等严重后果。而微生物农药具有对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点， 在控制植物病害方面倍受青睐。抗生素是微生物的天然代谢产物。溶杆菌属细菌是一类重要的微生物资源，已成为各国开发新型抗生素的重要来源。在国外该属细菌产生的抗生素在医学和农业病害控制方面都有一定的研究。
溶杆菌（Lysobacte）革兰氏染色阴性，杆状，两端钝圆，单生，无鞭毛，滑行运动，好气性，代谢为呼吸型，无芽孢，氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，G+C含量为65.4%-70.1%。在自然界，从海洋到河流、土壤中广泛分布，为腐生性，通过降解有机物和其他微生物获取营养来生存。溶杆菌属共有4个种，分别为产酶溶杆菌、抗生素溶杆菌、变棕溶杆菌和胶状溶杆菌。溶杆菌对多种病原真菌、细菌和线虫具有溶菌活性等典型特征。抗生素溶杆菌（Lysobater antibioticus）对多种植物病原菌具有明显抑制作用，同时在田间对多种细菌病害表现出良好的防病效果。通过进一步研究，有望开发为一种能防治植物病害的新型微生物农药。
目前针对抗生素溶杆菌有多种检测方法。传统的增菌培养方法一般需要10天以上，周期较长，并且需要使用实验动物，成本较高；免疫学检测（Immunoassay，IA）是一种根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知抗体或利用已知的抗体检测未知抗原的技术，主要包括酶联免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向间接血凝法（RPHA）和反向乳胶凝集实验（RPLA）等，此类方法周期短，一次可检测大量样本，并且不需实验动物，但其缺点是必须有高亲和性的抗体；实时荧光定量PCR方法能够用于病原菌的检测，但对仪器设备和人员的专业技术水平要求较高，并且操作复杂，耗时较长，限制了该技术的推广。
DNA环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低和特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。目前，还没有专门针对抗生素溶杆菌的环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的相关记载。
发明内容
本发明的目的是提供了一种快速灵敏准确的抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案：抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
内引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
内引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。
本发明所述的抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：
步骤（1），提取待检样品基因组DNA，采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA；
步骤（2），环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，将配制好的反应体系在65℃扩增反应50-70min后取出待检；
步骤（3），分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
本发明根据抗生素溶杆菌的吩嗪合成基因phz F设计了四条特异性引物，该基因序列为抗生素溶杆菌所共有，以保证检测不同来源的抗生素溶杆菌的可靠性。本发明采用LAMP技术，针对抗生素溶杆菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其它任何分析设备，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于抗生素溶杆菌的快速检测。
附图说明
图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图，其中1号反应管内样品为绿色，2-7号反应管内样品为橙色。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明中试剂盒及检测方法的建立和应用作进一步说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。
实施例1
抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的建立
步骤（1），引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
内引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
内引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
在此基础上设计用于抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5 mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤（2），待检样品的制备
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA
检测菌种抗生素溶杆菌（Lysobater antibioticus）来源于北纳生物，编号BNCC222260。使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品基因组DNA。
步骤（3），进行环介导恒温扩增反应
（1）取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL BstDNA聚合酶；
（2）将配制好的反应体系在65℃扩增反应50min后取出待检。
步骤（4），分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检菌株为抗生素溶杆菌。
实施例2
阴性对照
步骤（1），引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列同实施例1。
在此基础上设计用于抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH2O）组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH2O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。
步骤（2），待检样品的制备
采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA
使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取产酶溶杆菌、变棕溶杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等6种细菌的基因组DNA。
步骤（3），进行环介导恒温扩增反应
（1）取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2、1μL 8U/μL BstDNA聚合酶；
（2）将配制好的反应体系在65℃扩增反应50min后取出待检。
步骤（4），分析判断反应结果
在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
如图1所示，编号为1-7的反应管分别对应抗生素溶杆菌、产酶溶杆菌、变棕溶杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌。
实施例1与实施例2中各阴性对照组比较，实施例1中产生阳性扩增结果，如图1中1号反应管，而不携带phz F基因的实施例2阴性对照菌株没有产生阳性扩增结果，如图1中2-7号反应管，从而证明本试剂盒及检测方法具有较强的特异性，对不携带phz F基因的其它菌株不会产生假阳性结果。
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgagcatgc agcagc 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcaaggtcg cgaggat 17
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccggcaag gtcgacgagg cgattccggc ctggga 36
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgccatgt cttcgtgggg cgcaggtcgg gtttca 36

Claims (2)

1.抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；
（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
内引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
内引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。
2.一种权利要求1所述的抗生素溶杆菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：
步骤（1），提取待检样品基因组DNA，采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA；
步骤（2），环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品基因组DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，将配制好的反应体系在65℃扩增反应50-70min后取出待检；
步骤（3），分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
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